Неоднозначное влияние рекомбинантного интерферона α2b на нетрансформированный и трансформированный фенотип функционально значимых субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов в эксперименте in vitro

Резюме

Введение. Современные исследования многофункциональности нейтрофильных гранулоцитов (НГ) свидетельствуют о наличии различных субпопуляций НГ, каждая из них характеризуется своими фенотипическими и функциональными особенностями. Субпопуляции НГ обладают пластичностью и могут изменять свой фенотип в зависимости от микроокружения, оказывая позитивное, а при определенной трансформации и негативное (супрессирующее, повреждающее) воздействие на течение инфекционно-воспалительного процесса.

Целью настоящего исследования стало определение возможности экспериментального перепрограммирования трансформированного фенотипа функционально значимых субпопуляций НГ у детей с малой гнойной инфекцией (МГИ) под влиянием субстанции рекомбинантного интерферона α2b (рИФНα2b) в системе in vitro.

Материал и методы. Исследованы образцы периферической крови (ПК) 12 детей обоего пола в возрасте 2-4 лет с острой малой гнойной инфекцией (МГИ) (группа исследования) и 7 условно здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту (группа сравнения). Методом проточной цитометрии проводили оценку численности субпопуляций НГ СD64-CD16+CD32+CD11b+, СD64+CD16+CD32+CD11b+, CD62L+СD63-, CD62L+СD63+ с уточнением их фенотипа по плотности экспрессии каждой изучаемой мембранной молекулы по MFI. Исследовали фагоцитарную и микробицидную функции НГ у детей исследуемых групп. В системе in vitro ПК детей исследуемой группы и группы сравнения инкубировали в течение 1 ч при 37 ºС с субстанцией рИФНα2b в конечной концентрации 10-6 г/л, после чего контролировали особенности трансформации фенотипа субпопуляций НГ в обеих группах детей.

Результаты. Установлены варианты негативной трансформации фенотипов функционально значимых субпопуляций НГ: увеличение количества активированных CD62LdimCD63mid-НГ, СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ на фоне снижения уровня мажорной субпопуляции СD64-CD16midCD32dimCD11bbright-НГ и нарушения фагоцитарной и микробицидной функций НГ. Выявлена субпопуляция СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ, обладающая неадекватными провоспалительными свойствами. Уточнены возможности перепрограммирования фенотипа различных субпопуляций НГ при МГИ под влиянием рИФНα2b, что способствовало позитивной регуляции функциональной активности клеток.

Заключение. Получены новые данные о различных субпопуляциях НГ, негативной трансформации фенотипа функционально значимых субпопуляций НГ при МГИ у детей. Установлены иммуномодулирующие эффекты рИФНα2b на негативно трансформированный фенотип НГ при локальном гнойном процессе, проявляющийся в переключении НГ с провоспалительного фенотипа в противовоспалительный.

Ключевые слова:нейтрофильные гранулоциты; субпопуляции; фенотип; гнойная инфекции

Для цитирования: Нестерова И.В., Чудилова Г.А., Ковалева С.В., Русинова Т.В., Павленко В.Н., Тараканов В.А., Барова Н.К., Малиновская В.В. Неоднозначное влияние рекомбинантного интерферона α2b на нетрансформированный и трансформированный фенотип функционально значимых субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов в эксперименте in vitro. Иммунология. 2020; 41 (2): 112-124. DOI: 10.33029/0206-4952-2020-41-2-112-124

Финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации №АААА-А18-118122690053-0 и при частичной финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 19-415-230001р_а.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Введение

Современные фундаментальные исследования убедительно свидетельствуют о том, что нейтрофильные гранулоциты (НГ) являются ключевыми эффекторными и регуляторными клетками как врожденного, так и адаптивного иммунитета, и играют решающую роль в иммунопатогенезе широкого спектра заболеваний [1-3]. Отсутствие адекватного реагирования или блокада функций НГ приводит к развитию нетипично протекающих острых, хронических и вялотекущих инфекционно-воспалительных заболеваний, тяжело протекающих инфекционных болезней и гнойно-воспалительных процессов, не отвечающих на традиционную терапию. В то же время гиперактивация НГ оказывает повреждающее воздействие на клетки и ткани при аутоиммунных заболеваниях, сепсисе, остром гематогенном остеомиелите, деструктивной пневмонии, хронических заболеваниях, иммунозависимых процессах [3-6]. Сегодня уже не вызывает сомнений, что НГ пластичны и способны изменять свои свойства под влиянием различных иммунотропных субстанций, трансформируясь в субпопуляции как с позитивным, так и с негативным - супрессирующим - потенциалом [7-13]. Известно, что различные фенотипические профили и уровень оснащенности поверхностными рецепторами связаны с морфологическими особенностями и определяют функциональный потенциал НГ - цитокинопродукцию, трансэндотелиальную миграцию, внутриклеточный и внеклеточный киллинг, образование NET [5, 14-19]. Продемонстрировано существование достаточно большого количества субпопуляций НГ, обладающих различными возможностями. НГ, получающие комплексные цитокиновые влияния, не только приобретают новые черты, но и проходят различные стадии активации и дифференцировки, экспрессируя при этом антигены MHC класса II, CD80, CD86, ICAM-1, LFA-1 [20]. В наших более ранних работах были идентифицированы следующие субпопуляции НГ: регуляторные; супрессорные; провоспалительные - инициирующие воспалительную реакцию; воспалительные с позитивным микробицидным потенциалом (антибактериальным, противовирусным, противогрибковым); воспалительные с негативным цитотоксическим потенциалом - "агрессивные"; противовоспалительные - pегулирующие регрессию воспаления; противоопухолевые - TAN1; проопухолевые - TAN2, гибридные [21]. Большую диагностическую и прогностическую значимость имеют выявленные нами варианты ремоделирования фенотипа НГ, одновременно экспрессирующих CD64, CD32, CD11b и CD16 - рецепторы, функционально значимые при инфекционно-воспалительных заболеваниях, в том числе у новорожденных различного гестационного возраста [22-23], у пациентов с неопластическими процессами [23-24]. Активация CD64-, CD32-, CD16- и CD11b-рецепторов приводит к таким сложным процессам клеточной активации и элиминации, как фагоцитоз, экзоцитоз внутриклеточных гранул, продуцирование активных форм кислорода (ROS), антителозависимая клеточная цитотоксичность (АЗКЦ), высвобождение внеклеточных ловушек НГ (NETs), а также дополнительным ответам, в том числе хемотаксической миграции или выделению хемокинов и цитокинов [25, 26].

Низкоаффинные CD16(FcγRIII) и CD32(FCγRII) играют важную роль во взаимодействии НГ с иммунными комплексами [27]. FcγRIIIB осуществляют начальный контакт и связывание иммунных комплексов in vivo [28], затем происходит полная активация НГ посредством синергического лигирования как FcγRIIA, так и FcγRIIIB. Чтобы получить полное ингибирование ответов НГ необходимо удалить или заблокировать оба рецептора. Высокоаффинный рецептор CD64 (FcγRI), способен связывать IgG1, IgG3 и IgG4 человека в мономерной форме на ранних стадиях гранулопоэза, а на зрелых НГ в норме он представлен на очень низком уровне (~1400 рецепторов на клетку). Экспрессия рецептора CD64 на поверхности НГ индуцируется в ответ на взаимодействие с компонентами микробной стенки (LPS), компонентами комплемента и некоторыми цитокинами: ИФН-γ, ФНОα, ИЛ8, ИЛ12 и т.д., повышение уровня которых сопровождает развитие бактериальных инфекций [26-28].

CD11b (рецептор комплемента 3, CR3) связывает большое количество физиологических лигандов и участвует в многочисленных функциях НГ. Функционально CD11b (в присутствии субъединицы CD18) регулирует адгезию и миграцию НГ, является рецептором для C3bi, опосредующим поглощение и фагоцитоз и воспалительный ответ. Использование антител против CD11b позволило идентифицировать CD11b в качестве рецептора γ-цепи фибриногена, фактора Х и ICAM1, что доказывает участие в клеточно-опосредованной цитотоксичности, хемотаксисе и фагоцитозе [29].

Так как регуляция процессов адгезии, миграции и хемотаксиса играет важную роль в активации и полноценном функционировании НГ, оценка уровня экспрессии CD62L и CD63 на CD16+-НГ позволяет получить представление о способности клетки к роллингу, миграции и готовности включения микробицидного арсенала. Рецептор адгезии CD62L отвечает за миграцию НГ к очагу воспаления. При этом CD63 играют роль белков-посредников при передаче сигналов, выполняя важную регуляторную функцию, влияя на развитие НГ, их активацию, рост и подвижность. Экспрессия CD63 на мембране НГ - кратковременный сигнал активации, оказывающий регуляторное воздействие на адгезионную активность CD11/CD18. Кроме того, CD63 является маркером азурофильных гранул, по уровню экспрессии которого можно судить об интенсивности активности миелопероксидазы (МП).

Дефекты функционирования НГ сопровождаются различными гнойно-воспалительными заболеваниями, имеющими упорно-рецидивирующее течение. Проблема нетипично протекающей малой гнойной инфекции (МГИ) мягких тканей является весьма актуальна в связи с ростом гнойно-воспалительных заболеваний и послеоперационных осложнений [30-33]. Одна из основных особенностей МГИ, включая флегмоны и абсцессы, - расширение спектра возбудителей, относящихся к условно-патогенным микроорганизмам, что в первую очередь связано со снижением иммунной реактивности организма и негативными изменениями в составе симбионтной микрофлоры кожи в условиях ухудшающейся экологии и селективного воздействия антибиотиков [34]. Прогрессированию воспаления при МГИ способствует снижение общей резистентности организма и особенно функций НГ [35]. Для решения данной проблемы необходимо разработать методы контролируемой коррекции в системе НГ при инфекционно-воспалительных заболеваниях, в том числе МГИ, с помощью иммунотропных препаратов различной природы, так как субпопуляции НГ демонстрируют высокую степень пластичности и функциональную гетерогенность в зависимости от особенностей течения патологического сценария иммунного ответа.

Цель исследования - выявить возможности экспериментального перепрограммирования трансформированного фенотипа функционально значимых субпопуляций НГ у детей с МГИ под влиянием субстанции рекомбинантного интерферона α2b (рИФНα2b) в системе in vitro.

Материал и методы

Для изучения возможности модулирования трансформированного фенотипа НГ исследованы образцы периферической крови (ПК) детей 2-4 лет (n = 12) с острыми гнойно-воспалительными заболеваниями (абсцессы, флегмоны - МГИ) до хирургического вмешательства (группа исследования) и 7 условно здоровых детей, сопоставимых по полу и возрасту (группа сравнения).

Методом проточной цитометрии (FC500, Beckman Coulter, США) с МкАТ (Beckman Coulter International S.A., Франция) тестировали одномоментное несение функционально значимых мембранных рецепторов CD16, CD64, CD32, CD11b и CD62L, СD63. При этом проводили оценку количества субпопуляций НГ СD64-CD16+CD32+CD11b+, СD64+CD16+CD32+CD11b+, CD62L+СD63-, CD62L+СD63+ с уточнением плотности экспрессии каждой изучаемой мембранной молекулы на поверхности НГ по MFI. Такой подход позволил выявлять особенности фенотипа изучаемых функционально значимых субпопопуляций НГ и контролировать изменения динамики экспрессии каждой мембранной молекулы.

Кроме того, у исследуемых групп тестировали фагоцитарную и микробицидную функции НГ. Оценивали содержание активно фагоцитирующих НГ - (%ФАН), объем захваченного бактериального материала - фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ); активность переваривания - по проценту и индексу переваривания (%П; ИП). Активность NADРН-оксидазы определялась в нагрузочных тестах в системе in vitro с St.aureus (NBT-тест). В зависимости от уровня спонтанной и стимулированной активности определяли средний цитохимический индекс - СЦИ, рассчитывали коэффициент мобилизации (КМ) - СЦИст/СЦИсп для NADРН-оксидаз [22].

С целью уточнения возможности перепрограммирования фенотипа функционально значимых субпопуляций НГ и коррекции их фагоцитарной и микробицидной функции ПК детей исследуемой группы (дети с МГИ) и группы сравнения инкубировали в течение 1 ч при 37 ºС с рИФНα2b в конечной концентрации 10-6 г/л, которая была любезно предоставлена ФГУП "Гос.НИИ ОЧБ" ФМБА России. После инкубации контролировали особенности трансформации фенотипа исследуемых субпопуляций НГ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью компьютерных программ Microsoft Excel 2016, StatPlus 2009 с применением непараметрических тестов Вилкоксона и Манна-Уитни. Результаты представляли в виде медианы (верхний и нижний квартиль) - Me (Q1; Q3). Различия определяли значимыми при p < 0,05.

Результаты

Анализ полученных результатов позволил выявить неадекватное реагирование НГ ПК на локальный гнойный инфекционный процесс у детей с МГИ. Так, в группе исследования относительное количество НГ в остром периоде МГИ достоверно не отличалось от такового в группе сравнения 39,5 (27,55; 47,5)% против 41,0 (37,0; 47,0)% (р > 0,05). На этом фоне уровень лейкоцитов повысился незначительно и составил лишь 8,75 (8,11; 9,23) × 109/л против 7,25 (6,67; 8,25) × 109/л (р > 0,05) в группе сравнения (рис. 1).

Рис. 1. Содержание общего числа лейкоцитов (Л) и количества НГ периферической крови у детей 2-4 лет с острыми гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей

При проведении тестирования поверхностных мембранных рецепторов НГ CD62L и CD63 было показано, что у условно здоровых детей 2-4 лет 89,45 (81,48; 96,8)% НГ представлены субпопуляцией с фенотипом CD62LmidCD63- с плотностью экспрессии рецепторов по MFI: CD62L - 7,08 (5,44; 11,3) и отсутствием молекул CD63 на поверхностной мембране НГ. Другая субпопуляция НГ обнаруживалась у 7,55 (0,31; 8,65)% условно здоровых детей и характеризовалась другим фенотипом - CD62LdimCD63mid, имеющим более низкую плотность рецепторов CD62L - 4,55(3,54; 8,85), и наличием молекулы CD63 средней плотности экспрессии по MFI - 2,19 (1,68; 3,20) (табл. 1).

Таблица 1. Влияние рИФНα2b на фенотип субпопуляций CD62LmidCD63-НГ и CD62LdimCD63midНГ условно здоровых детей, Me (Q1; Q3)

НГ группы сравнения

CD62LmidCD63-

НГ,%

MFI CD62L

CD62LdimCD63mid

НГ,%

MFI

CD62L

MF I

CD63

89,45

(81,48; 96,8)

7,08

(5,44; 11,3)

7,55

(0,31; 8,65)

4,55

(3,54; 8,85)

2,19

(1,68; 3,20)

НГ группы сравнения + рИФНα2b

CD62LbrightCD63-

НГ,%

MFI CD62L

CD62LbrightCD63dim

НГ,%

MFI

CD62L

MFI

CD63

65,95*

(39,93; 80,8)

10,99

(5,49; 15,5)

32,96*

(11,59; 51,7)

9,85

(4,93; 14,3)

1,85

(1,64; 1,96)

Примечание. Здесь и в табл. 2-4: * - различия показателей по сравнению с фоновыми значениями условно здоровых детей p < 0,05; ^ - различия показателей между исследуемыми группами с нагрузками.

Культивирование НГ условно здоровых детей с рИФНα2b, связывающимся с рецептором IFNα/βR на поверхностной мембране НГ, позволило выявить особенности его влияния на трансформацию фенотипа субпопуляций CD62LmidCD63--НГ и CD62LdimCD63mid-НГ. Значительно изменилась субпопуляция CD62LmidCD63--НГ, которая трансформировалась в CD62LbrightCD63--НГ. Количество НГ этой субпопуляции, несущей только молекулу CD62L, уменьшилось с 89,45 (81,48; 96,8) до 65,95 (39,93; 80,8) (р < 0,05), но при этом увеличилась плотность экспрессии (см. табл. 1). Увеличение уровня экспрессии молекул CD62L на мембране НГ необходимо для усиления процессов миграции, в том числе к очагу воспаления.

В системе in vitro рИФНα2b способствовал значительной трансформации фенотипа субпопуляции CD62LdimCD63mid-НГ, которая у условно здоровых детей встречалась в 7,55 (0,31; 8,65)% случаев. Под влиянием рИФНα2b отмечено увеличение до 32,96 (11,59; 51,7)% (р < 0,05) количества НГ с фенотипом CD62LbrightCD63dim-НГ, с высоким (в 2,2 раза) MFI CD62L-рецептора. В тоже время выявлена тенденция к умеренному снижению уровня мембранной экспрессии молекулы CD63, что, вероятно, позволяет предохранить НГ от усиления преждевременной спонтанной дегрануляции (см. табл. 1).

Сравнительный анализ субпопуляций CD62LmidCD63--НГ и CD62LdimCD63mid‑НГ у условно здоровых детей и у детей с МГИ выявил значительное (в 3,1 раза) уменьшение количества НГ субпопуляции CD62LmidCD63- с 89,45 (81,48; 96,8)% в группе сравнения до 28,8 (2,2; 57,8)% у детей с МГИ. В тоже время при МГИ в 8,5 раза увеличилось количество НГ субпопуляции CD62LdimCD63mid по сравнению с таковым в группе условно здоровых детей, соответственно с 7,55 (0,31; 8,65) до 63,95 (17,25; 74,1) (р < 0,05) (табл. 2).

Таблица 2. Влияние рИФНα2b на трансформацию фенотипа субпопуляций CD62LmidCD63--НГ и CD62LdimCD63mid-НГ детей с малой гнойной инфекцией в эксперименте in vitro, Me (Q1; Q3)

Группа сравнения (условно здоровые дети)

CD62LmidCD63--НГ, %

MFI CD62L

CD62LdimCD63mid-НГ, %

MFI CD62L

MFI CD63

89,45

(81,48; 96,8)

7,08

(5,44; 11,3)

7,55

(0,31; 8,65)

4,55

(3,54; 8,85)

2,19

(1,68; 3,20)

Группа исследования: НГ детей с МГИ

CD62LmidCD63--НГ, %

MFI CD62L

CD62LdimCD63mid-НГ, %

MFI CD62L

MFI CD63

28,8*

(6,63; 62,75)

5,72

(4,92; 8,77)

63,95*

(17,25; 74,1)

5,64

(4,38; 6,77)

2,22

(1,83; 2,63)

МГИ +рИФНα2b

CD62LmidCD63--НГ, %

MFI CD62L

CD62LdimCD63mid-НГ, %

MFI CD62L

MFI CD63

25,45*

(2,20; 57,8)

5,8

(5,04; 9,3)

69,0*

(36,99; 79,1)

6,59

(4,92; 8,83)

2,08

(1,75; 3,54)

При этом проявилась пластичность НГ, о чем свидетельствует факт самостоятельного перепрограммирования под влиянием бактериальных АГ у пациентов с МГИ 35,5% НГ субпопуляции CD62LmidCD63- в субпопуляцию с фенотипом CD62LdimCD63mid, то есть в ПК пациентов с МГИ появилось большое количество НГ субпопуляции CD62LdimCD63mid, где достаточно высока экспрессия рецепторов CD63, активирующих процессы дегрануляции НГ, что имеет существенное значение для реализации процессов завершенности фагоцитоза при МГИ. При этом уровень экспрессии поверхностных рецепторов CD62L и CD63, определяемый в субпопуляциях CD62LmidCD63--НГ и CD62LdimCD63mid-НГ, у пациентов с МГИ статистически значимо не отличался от показателей группы сравнения (см. табл. 2).

Установлено отсутствие влияния рИФНα2b в системе in vitro на трансформированный фенотип субпопуляций CD62LmidCD63--НГ и CD62LdimCD63mid-НГ у пациентов с МГИ в отличие от позитивных эффектов рИФНα2b, выявленных у условно здоровых детей (рис. 2).

Рис. 2. Влияние рИФНα2b на фенотип субпопуляций CD62LmidCD63--НГ и CD62LdimCD63mid-НГ у детей с МГИ

Анализ данных, полученных при изучении НГ, экспрессирующих рецепторы CD64, CD16, CD32, CD11b, продемонстрировал, что у условно здоровых детей НГ ПК представлены двумя субпопуляциями: мажорной - СD64-CD16brightCD32dimCD11bbright и минорной - СD64midCD16midCD32dimCD11bmid. Мажорная субпопуляция

СD64-CD16
brightCD32dimCD11bbright присутствует в 97,98 (96,88; 98,74)% случаев, в то время как минорная выявляется лишь у 1,30 (0,18; 0,35)% условно здоровых детей. Мажорная субпопуляция характеризуется различным уровнем плотности экспрессии каждого из оцениваемых рецепторов: СD64 - нет экспрессии, MFI CD16 - 129,50 (115,75; 131,75), MFI CD11b - 19,40 (16,66; 20,93) и MFI CD32 - 5,73 (4,76; 6,11). Минорная субпопуляция СD64midCD16midCD32dimCD11bmid, в отличие от мажорной, характеризуется появлением активационного маркера CD64, с MFI 7,92 (5,25; 12,20). При этом отмечаются более низкие значения MFI CD16 - 79,43 (65,13; 79,62) (в 1,8 раза меньше) (р < 0,05) и CD11b - 15,39 (4,87; 25,90) (р > 0,05), а MFI CD32 составил 5,50 (5,2; 6,31) и практически не отличался от экспрессии в мажорной субпопуляции (р > 0,05) (табл. 3).

При изучении влияния рИФНα2b на фенотип мажорной субпопуляции

СD64-CD16
brightCD32dimCD11bbright-НГ условно здоровых детей (группа сравнения) в эксперименте in vitro установлено, что на фоне сохраняющегося ее количественного состава происходит значительная трансформация фенотипа СD64-CD16brightCD32dimCD11bbright. Наблюдается тенденция к увеличению плотности экспрессии CD16 (р > 0,05), происходит статистически значимое увеличение MFI СD32 (р < 0,05) и снижение MFI CD11b (р > 0,05). Эти изменения свидетельствуют о трансформации мажорной субпопуляции в сторону фенотипа СD64-CD16brightCD32midCD11bmid (см. табл. 3).

Таблица 3. Влияние рИФНα2b в эксперименте in vitro на фенотип субпопуляций

С
D64-CD16brightCD32dimCD11bbright-НГ и СD64midCD16midCD32dimCD11bmid-НГ условно здоровых детей, Me (Q1; Q3)

%СD64-СD16+CD32+CD11b+

Группа сравнения

НГ, %

СD64-CD16brightCD32dimCD11bbright

MFI СD16

MFI CD32

MFI CD11b

97,98

(96,88; 98,74)

129,50

(115,7; 131,75)

5,73

(4,76; 6,11)

19,40

(16,66; 20,93)

Группа сравнения +рИФНα2b

98,28

(97,49; 98,63)

СD64-CD16brightCD32midCD11bmid

138,50

(107,8; 144,75)

10,55*

(8,51; 11,63)

16,33

(9,58; 25,20)

%СD64+СD16+CD32+CD11b+

НГ, %

СD64midCD16midCD32dimCD11bmid

MFI CD64

MFI CD16

MFICD32

MFI CD11b

Группа сравнения

1,30

(0,18; 0,35)

7,92

(5,25; 11,20)

79,43

(65,13; 79,62)

5,50

(5,2; 6,31)

15,39

(14,87; 15,90)

СD64brightCD16dimCD32dimCD11bbright

Группа сравнения +рИФНα2b

0,15

(0,10; 0,41)

12,10*

(12,0; 12,58)

8,68*

(6,13; 10,50)

6,97

(6,2; 7,56)

22,75*

(18,65;24,25)

Под влиянием рИФНα2b не менялось количество НГ минорной субпопуляции СD64midCD16midCD32dimCD11bmid-НГ (р > 0,05). При этом выявлено значимое усиление экспрессии молекул CD64 (р < 0,05) и CD11b (р < 0,05), наблюдалась тенденция к умеренному увеличению MFI CD32 (р > 0,05) и значительное снижение (в 9,15 раз) плотности экспрессируемых молекул CD16 (р < 0,05). Эти изменения свидетельствовали о перестройки под влиянием рИФНα2b фенотипа покоящейся минорной субпопуляции СD64midCD16midCD32dimCD11bmid-НГ в сторону активного воспалительного фенотипа СD64brightCD16dimCD32dimCD11bbright-НГ с выраженными протективными свойствами, но с минимизацией цитотоксических свойств, о чем свидетельствует значительное снижение экспрессии молекул CD16 на поверхностной мембране НГ (см. табл. 3).

У пациентов с МГИ отмечались снижение количества НГ субпопуляции

С
D64-CD16+CD32+CD11b+ до 86,45 (80,49; 96,08)% против 97,98 (96,88; 98,74)% НГ в группе сравнения (р < 0,05). При этом отмечалась и трансформация фенотипа

СD64-CD16
brightCD32dimCD11bbright-НГ, выявляемого у условно здоровых детей, в фенотип СD64-CD16midCD32dimCD11bbright, характерный для НГ при МГИ. Отмечалось значимое снижение плотности экспрессии CD16 в 1,58 раз до 81,5 (64,90; 97,3) против 129,50 (115,75; 131,75) в группе сравнения (p < 0,05), выявлена тенденция к повышению MFI CD11b (p > 0,05), при уровне экспрессии CD32, не отличающемся от группы сравнения (p > 0,05).

Отмечено, что у детей группы исследования с МГИ на фоне появления субпопуляции СD64-CD16midCD32dimCD11bbright-НГ с трансформированным фенотипом наблюдается значительное увеличение %НГ субпопуляции СD64+CD16+CD32+CD11b- - в 11,1 раза до 14,45 (5,58; 15,71)% против 1,30 (0,18; 0,35)% по сравнению с показателями группы условно здоровых детей. Также при МГИ установлена трансформация фенотипа этой субпопуляции в СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ в отличие от фенотипа СD64midCD16midCD32dimCD11bmid-НГ в группе сравнения. Субпопуляция с фенотипом СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ у пациентов с МГИ имела одинаковую экспрессию рецепторов CD16, CD32, CD11b по сравнению с мажорной субпопуляцией СD64-CD16midCD32dimCD11bbrightНГ при МГИ (табл. 4).

Таблица 4. Влияние рИФНα2b в эксперименте in vitro на фенотип субпопуляций

С
D64-CD16brightCD32dimCD11bbright-НГ и СD64midCD16midCD32dimCD11bmid-НГ детей с МГИ, Me (Q1; Q3)

СD64-СD16+CD32+CD11b+

НГ, %

СD64-CD16brightCD32dimCD11bbright

MFI СD16

MFI CD32

MFI CD11b

Группа сравнения

97,98

(96,88; 98,74)

129,50

(115,7; 131,75)

5,73

(4,76; 6,11)

19,40

(16,66; 20,93)

МГИ

86,45*

(80,49; 96,38)

СD64-CD16midCD32dimCD11bbright

81,5

(64,90; 97,3)*

5,31

(3,95; 5,95)

16,40

(12,88; 28,9)

СD64-CD16midCD32dimCD11bdim

МГИ+ рИФНα2b

95,48

(85,82; 96,06)

87,7

(72,15; 95,55)

4,18

(3,93; 4,66)

9,51*

(9,17; 15,00)

СD64+СD16+CD32+CD11b+

НГ, %

СD64brightCD16midCD32dimCD11bmid

MFI CD64

MFI CD16

MFI CD32

MFI CD11b

Группа сравнения

1,30

(0,38; 1,35)

7,92

(5,25; 12,20)

79,43

(65,13; 79,62)

5,50

(5,2; 6,31)

15,39

(14,87; 15,90)

СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright

МГИ

14,45*

(5,58; 15,71)

3,36*

(2,19; 4,72)

71,2

(60,20; 98,18)

6,06

(5,02; 7,56)

24,6*

(17,68; 37,12)

СD64midCD16dimCD32dimCD11bmid

МГИ+ рИФНα2b

3,80*^

(3,63; 5,45)

5,32

(2,78; 16,65)

52,1*

(41,55; 64,00)

5,43

(4,84; 6,71)

13,6

(12,28; 18,75)

Следует отметить, что несмотря на значительное увеличение в 11,1 раза количества НГ субпопуляции СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ у детей с МГИ, уровни экспрессии изучаемых рецепторов отличались от значений, регистрируемых в группе условно здоровых детей. Так, показана более низкая, в 2,3 раза меньше, плотность экспрессии молекул CD64 - 3,36 (2,19; 4,72) против 7,92 (5,25; 12,20) в группе сравнения (p < 0,05), в то время как MFI CD11b была в 1,6 раза выше - 24,6 (17,68; 37,12) против 15,39 (14,87; 15,90) в группе сравнения (p < 0,05), при этом уровни MFI мембранных молекул CD32 и CD16 статистически значимо не отличались от таковых в группе сравнения (p1 > 0,05; p2 > 0,05) (см. табл. 4).

Значимое увеличение субпопуляции СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ при МГИ, с одной стороны, свидетельствует о появлении большего количества НГ, несущих активационную молекулу CD64, являющуюся маркером бактериальной инфекции. С другой стороны, эта субпопуляция характеризуется повышенной экспрессией молекул адгезии CD11b, влияющей на запуск процессов фагоцитоза, но при неменяющемся уровне экспрессии CD32 и CD16. Полагаем, что субпопуляция СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ является воспалительной субпопуляций (НГ1), обладающей провоспалительными свойствами и участвующей в инициировании процесса гнойного воспаления. Ее увеличение на фоне манифестирования МГИ у детей может свидетельствовать о неполноценности эффекторных функций НГ, не предотвративших возникновение гнойного процесса, и может расцениваться как прогностически неблагоприятный признак.

Культивирование НГ ПК детей с МГИ в системе in vitro с рИФНα2b позволило выявить модулирующие эффекты рИФНα2b, проявляющиеся в снижении в 4,7 раз количества НГ минорной субпопуляции СD64+CD16+CD32+CD11b+-НГ на фоне увеличения субпопуляции СD64-CD16+CD32+CD11b+-НГ (см. табл. 4). При этом следует отметить, что рИФНα2b приводит к незначительному повышению уровня экспрессии CD16 (p > 0,05) и статистически значимому снижению MFI CD11b (р < 0,05) мажорной субпопуляции СD64-CD16brightCD32dimCD11bbright-НГ. В минорной субпопуляции под влиянием рИФНα2b происходит изменение фенотипа с СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ на СD64midCD16dimCD32dimCD11bmid-НГ и выявляется умеренная тенденция повышения уровня экспрессии CD64 на фоне достоверного снижения плотности экспрессии молекулы CD16 (p < 0,05) и MFI CD11b (р > 0,05) (см. табл. 4).

Исследование влияния рИФНα2b на фагоцитарную и микробицидную NADPH- зависимую функцию позволило выявить эффекты, связанные с модулированием рецепторного аппарата.

Так, под воздействием рИФНα2b на НГ группы сравнения при неменяющемся количестве активно фагоцитирующих НГ происходит усиление процессов захвата бактериального антигена (ФЧ и ФИ) и его переваривания (ИП). Также выявлено усиление микробицидной активности с сохранением потенциала ответа на дополнительную антигенную нагрузку в системе in vitro (рис. 3).

Рис. 3. Эффекты рИФНα2b на фагоцитарную и микробицидную NADPH- зависимую функцию нейтрофильных гранулоцитов группы условно здоровых детей

При исследовании фагоцитарной функции НГ у детей с МГИ отмечался количественный дефицит активно фагоцитирующих НГ [%ФАГ 49,00 (39,26; 53,00) против 55,25 (54,0; 57,0) в группе сравнения, р < 0,05]. При этом были увеличены показатели поглотительной способности НГ: ФЧ - 5,17 (3,92; 5,57) против 4,1 (3,72; 5,7) в группе сравнения (р > 0,05) и ФИ 2,69 (1,8; 3,55) против 2,46 (1,77; 3,25) в группе сравнения (р > 0,05). Также выявлено снижение процессов переваривания: % П - 53,13 (42,5; 57,72) против 61,62 (57,9; 62,92)% в группе сравнения, ИП - 1,27 (0,65; 1,35) против 1,57 (1,37; 1,88) в группе сравнения (p1 < 0,05, p2 < 0,05). В то же время в группе с МГИ отмечалось значительное увеличение спонтанной и индуцированной активности NADPH-оксидаз (р < 0,05) без сохранения резервного микробицидного потенциала, о чем свидетельствует низкий КМ (р < 0,05) (рис. 4).

Рис. 4. Эффекты рИФНα2b на фагоцитарную и микробицидную NADPH- зависимую функцию нейтрофильных гранулоцитов группы детей с малой гнойной инфекцией

Эффекты рИФНα2b, направленные на восстановление %ФАГ, функций переваривания и поддержания напряженности NADPH-оксидаз, необходимых для реализации ответа на инфекционный процесс, различались по интенсивности воздействий (см. рис. 4). Так, под влиянием рИФНα2b фагоцитарная активность НГ имела тенденцию к восстановлению, но показатели всех исследуемых параметров оставались ниже соответствующих значений в группе сравнения: %ФАН (р < 0,05), ФЧ (р < 0,05), ФИ (р < 0,05), ИП (р < 0,05). При этом, резервная NADPH-оксидазная активность повысилась в 2 раза по КМ по сравнению с исходными данными, что было выше соответствующих значений в группе сравнения (р1 < 0,05 и р2 < 0,05, соответственно) (рис. 4).

Обсуждение

Таким образом, в результате исследования установлены варианты негативной трансформации фенотипов функционально-значимых субпопуляций НГ: увеличение количества активированных CD62LdimCD63mid-НГ и СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ на фоне снижения уровня мажорной субпопуляции СD64-CD16midCD32dimCD11bbright, не позволяющие НГ эффективно осуществлять фагоцитарную и микробицидную функции. Выявлена субпопуляция СD64dimCD16midCD32dimCD11bbright-НГ, обладающая неадекватными провоспалительными свойствами, повышение численности которой может расцениваться как прогностически неблагоприятный признак течения МГИ.

При экспериментальном исследовании в системе in vitro установлены иммуномодулирующие эффекты рИФНα2b на негативно трансформированный фенотип НГ при локальном гнойном процессе проявляющийся в переориентации НГ с провоспалительного фенотипа в противовоспалительный. Так, установлено, что под влиянием рИФНα2b происходит снижение количества НГ субпопуляции CD64+CD32+CD16+CD11b+-НГ с параллельным увеличением количества НГ субпопуляции CD64-CD32+CD16+CD11b+‑НГ. Иными словами, рИФНα2b способствует перепрограммированию негативно трансформированного при гнойно-воспалительном процессе фенотипа минорной субпопуляции в фенотип мажорной субпопуляции, что обеспечивает перестройку НГ с воспалительного фенотипа на противовоспалительный. При этом параллельно происходит усиление функциональной активности НГ и развивается адекватный ответ этих клеток на инфекционно-воспалительный процесс.

Таким образом, получены абсолютно новые данные о различных субпопуляциях НГ и негативной трансформации фенотипа функционально значимых субпопуляций НГ при МГИ у детей. Уточнены возможности перепрограммирования фенотипа различных субпопуляций НГ с помощью рИФНα2b, которое способствует позитивной регуляции функциональной активности клеток. Новые знания об особенностях неадекватного реагирования субпопуляций НГ при МГИ у детей, а также полученные данные о возможности коррекции негативно трансформированных функций НГ, являются, с нашей точки зрения, многообещающими и могут использоваться, с одной стороны, для иммунодиагностики дефектов функционирования НГ при иммунозависимых инфекционно-воспалительных заболеваниях, а с другой стороны - способствовать разработке новых иммунотерапевтических подходов, улучающих эффективность проводимого комплексного лечения.

Литература

1. Cortjens B., Ingelse S.A., Calis J.C., Vlaar A.P., Koenderman L., Bem R.A. et al. Neutrophil subset responses in infants with severe viral respiratory infection. Clinical immunology. 2017; 176: 100-6. DOI: 10.1016/j.clim.2016.12.012.

2. Балмасова И.П., Сепиашвили Р.И., Малова Е.С., Ефратова Е.П., Ющук Н.Д. Коинфекция вирусами иммунодефицита человека и гепатита С как модель иммунного ответа на патогены иммунотропного действия. Аллергология и иммунология. 2019; 20 (1): 5-9.

3. Нестерова И.В., Ковалева С.В., Чудилова Г.А., Ломтатидзе Л.В., Евглевский А.А. Двойственная роль нейтрофильных гранулоцитов в реализации противоопухолевой защиты. Иммунология. 2012; 33 (5): 281-8.

4. Hong C.W. Current Understanding in Neutrophil Differentiation and Heterogeneity. Immune Netw. 2017;17 (5): 298-306. URL: https://doi.org/10.4110/in.2017.17.5.298. (дата обращения: 22.09.2017)

5. Долгушин И.И., Мезенцева Е.А., Савочкина А.Ю., Кузнецова Е.К. Нейтрофил как "многонациональное" устройство иммунной системы. Инфекции и иммунитет. 2019; 9 (1): 9-38.

6. Долгушин И.И. Нейтрофильные гранулоциты: новые лица старых знакомых. Бюллетень сибирской медицины. 2019; 18 (1): 30-7.

7. Beyrau M., Bodkin J.V., Nourshargh S. Neutrophil heterogeneity in health and disease: a revitalized avenue in inflammation and immunity. Open Biol. 2012; 2: 120-34. DOI: 10.1098/rsob.120134.

8. Carmona-Rivera C., Kaplan M.J. Low-density granulocytes: a distinct class of neutrophils in systemic autoimmunity. Semin. Immunopathol. 2013; 35: 455-63. DOI: 10.1007/s00281-013-0375-7.

9. Scapini P., Cassatella M.A. Social networking of human neutrophils within the immune system. Blood. 2014; 124: 710-9. DOI: 10.1182/blood-2014-03-453217.

10. Sagiv J.Y., Michaeli J., Assi S., Mishalian I., Kisos H., Levy L. et al. Phenotypic diversity and plasticity in circulating neutrophil subpopulations in cancer. Cell Rep. 2015; 10 (4): 562-73. DOI: 10.1016/j.celrep.2014.12.039.

11. Silvestre-Roig C., Hidalgo A., Soehnlein O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. 2016; 127: 2173-81. DOI: 10.1182/blood-2016-01-68888.

12. Scapini P., Marini O., Tecchio C. Cassatella M.A. Human neutrophils in the saga of cellular heterogeneity: insights and open questions. Immunological reviews. 2016; 273: 48-60. URL: https://doi.org/10.1111/imr.12448.

13. Zhong M., Yang H., Xu Y., Mao S. Examining the utility of the CD64 index compared with other conventional indices for early diagnosis of neonatal infection. Sci. Rep. 2018; 3, 8 (1): 9994. URL: https://doi.org/10.1038/s41598-018-28352-7. (дата обращения: 20.06.2018)

14. Moses K., Brandau S. Human neutrophils: Their role in cancer and relation to myeloid-derived suppressor cells. Semin. Immunol. 2016; 28 (2): 187-96. DOI: 10.1016/j.smim.2016.03.018

15. Tamassia N., Cassatella M.A., Bazzoni F. Fast and accurate quantitative analysis of cytokine gene expression in human neutrophils. Methods Mol. Biol. 2014; 1124: 451-67. DOI: 10.1007/978-1-62703-845-4-279

16. Tamassia N., Bianchetto-Aguilera F., Arruda-Silva F., Gardiman E., Gasperini S., Calzetti F. et al. Cytokine production by human neutrophils: "Revisiting the dark side of the moon". European journal of clinical investigation. 2018; 48: e12952. URL: https://doi.org/10.1111/eci.12952. (дата обращения: 17.05.2018)

17. Зурочка А.В., Зурочка В.А., Добрынина М.А., Фомина Л.О., Файзуллина А.И., Гриценко В.А. Нейтрофилы как цитокинопродуцирующие клетки. Российский иммунологический журнал. 2019; 22 (4): 1469-71.

18. Papayannopoulos V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature reviews. Immunology. 2018; 18 (2): 134-47. DOI:10.1038/nri.2017.105.

19. Симбирцев А.С. Цитокины в патогенезе и лечении заболеваний человека. Санкт-Петербург: Фолиант, 2018: 512 с.

20. Lin A., Lore K. Granulocytes: new members of the antigen-presenting cell family. Frontiers in Immunology. 2017; 11. URL: https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.01781. (дата обращения: 28.10.2017)

21. Mishalian I., Granot Z., Fridlender Z.G. The diversity of circulating neutrophils in cancer. Immunobiology. 2017; 222: 82-8. URL: https://doi.org/10.1016/j.imbio.2016.02.001. (дата обращения 01.02.2016)

22. Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., Ломтатидзе Л.В., Ковалева С.В., Евглевский А.А., Нгуен Т.З.Л. Новый взгляд на нейтрофильные гранулоциты: переосмысление старых догм (Часть 1). Инфекция и иммунитет. 2017; 7 (3): 219-30. DOI: 10.15789/2220-7619-2017-3-219-230.

23. Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., Ломтатидзе Л.В., Ковалева С.В., Евглевский А.А., Нгуен Т.З.Л. Новый взгляд на нейтрофильные гранулоциты: переосмысление старых догм (Часть 2). Инфекция и иммунитет. 2018; 8 (1): 7-18. DOI: 10.15789/2220-7619-2018-1-7-18.

24. Нестерова И.В., Колесникова Н.В., Чудилова Г.А., Ломтатидзе Л.В., Ковалева С.В., Евглевский А.А. Нейтрофильные гранулоциты: новый взгляд на "старых игроков" на иммунологическом поле. Иммунология. 2015; 36 (4): 257-65.

25. Pincetic A., Bournazos S., DiLillo D.J., Maamary J., Wang T.T., Dahan R. et. al. Type I and type II Fc receptors regulate innate and adaptive immunity. Nature immunology. 2014; 15: 707-16. DOI: 10.1038/ni.2939.

26. Bournazos S., Wang T.T., Ravetch J.V. The role and function of Fcγ receptors on myeloid cells. Microbiology spectrum. 2016; 4 (6): 10. DOI: 10.1128/microbiolspec.

27. Jakus Z., Németh T., Verbeek J.S., Mócsai A. Critical but overlapping role of FcγRIII and FcγRIV in activation of murine neutrophils by immobilized immune complexes. J Immunol. 2008; 180: 618-29. URL: https://doi.org/10.4049/jimmunol.180.1.618. (дата обращения 22.09.2007).

28. Coxon A., Cullere X., Knight S., Sethi S., Wakelin M.W., Stavrakis G. FcγRIII mediates neutrophil recruitment to immune complexes. A mechanism for neutrophil accumulation in immune-mediated inflammation. Immunity. 2001; 14: 693-704. URL: https://doi.org/10.1016/S1074-7613(01)00150-9. (дата обращения 22.06.2001)

29. Bournazos S., Wang T.T., Ravetch J.V. The Role and Function of Fcγ Receptors on Myeloid Cells. Microbiology spectrum. 2016; 4 (6). URL: https://doi.org/10.1128/9781555819194.ch22.

30. Bartlett J.G. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections. Topics in HIV medicine: a publication of the International AIDS Society, USA. 2008; 16 (5): 151-5.

31. Fournier B., Philpott D.J. Recognition of Staphylococcus aureus by the innate immune system. Clinical microbiology reviews. 2005; 18: 521-40. doi: 10.1128/CMR.18.3.521-540.2005.

32. Owens C.D., Stoessel K. Surgical site infections: epidemiology, microbiology and prevention. The Journal of hospital infection. 2008; 70 (2): 3-10. URL: https://doi.org/10.1016/S0195-6701(08)60017-1. (дата обращения: 18.10.2008)

33. Whitman T.J. Community-associated methicillinresistant Staphylococcus aureus skin and soft tissue infections. Disease-a-month: DM. 2008; 54 (12): 780-6.

34. Шмагель К.В., Зубарева Н.А., Ренжин А.В. Местный иммунитет гнойных ран. Медицинская иммунология. 2010; 12 (4-5): 393-8.

35. Потапнев М.П., Гущина Л.М., Мороз Л.А. Фенотипическая и функциональная гетерогенность субпопуляций нейтрофилов в норме и при патологии. Иммунология. 2019; 40 (5): 84-96.


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»