Методы оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D): современное состояние проблемы

Резюме

Препараты иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) - уникальные средства специфической перинатальной профилактики резус-иммунизации женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови. Фармакологическое действие препаратов реализуется посредством антирезус Rho(D) IgG-антител (Ат) (анти-D-Аг), способных нейтрализовать резус-положительные эритроциты плода, попавшие в кровоток матери. Клиническая эффективность препаратов определяется специфической активностью иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) - содержанием анти-D-Ат. Выбор метода оценки специфической активности препаратов играет ключевую роль в обеспечении их потенциальной терапевтической эффективности. Методы автоматизированной гемагглютинации, иммуноферментного анализа и проточной цитофлуориметрии используются в мировой практике для оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D), тогда как в нашей стране указанные методы не внедрены на отечественных производствах иммунобиологических лекарственных средств. В настоящем исследовании проанализированы этапы совершенствования методов оценки специфической активности, особенности их воспроизведения, а также преимущества и недостатки. Установлено, что количественная оценка содержания анти-D-Ат в Международных единицах активности или микрограммах в сравнении с Международным стандартным образцом активности иммуноглобулина антирезус инструментальным методом является необходимым условием получения качественных препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D). В обсуждении приведены полученные на текущий момент знания, по результатам их анализа обоснован вывод о необходимости совершенствования методов оценки специфической активности отечественных препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) в соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к биоаналитическим методам испытаний. Для поиска литературы использовались базы данных Scopus, Web of Science, Pubmed, WHO, Global Health, elibrary, EMA, FDA, а также Государственная фармакопея Российской Федерации.

Ключевые слова:иммуноглобулин человека антирезус Rho(D); современные методы количественной оценки; специфическая активность; фенотип эритроцитов; анти-D-антитела

Для цитирования: Шведова Е.В., Кудашева Э.Ю., Климов В.И. Методы оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D): современное состояние проблемы. Иммунология. 2020, 41 (3): 256-261. DOI: 10.33029/0206-4952-2020-41-3-256-261

Финансирование. Работа выполнена в рамках государственного задания ФГБУ "НЦЭСМП" Минздрава России № 056-00003-20-00 на проведение прикладных научных исследований (номер государственного учета НИР AAAA-A18-118021590046-9).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Введение

Среди иммунологически обусловленных осложнений беременности ведущее место занимает гемолитическая болезнь плода и новорожденного, которая развивается вследствие несовместимости крови матери и плода по различным эритроцитарным антигенам (Аг) [1]. Среди Аг эритроцитов системы резус наиболее иммуногенным является Аг D, способный даже в малых дозах вызывать образование иммунных антител (Ат), которые являются причиной тяжелой гемолитической болезни [2].

Препараты иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) являются единственными лекарственными средствами, используемыми для специфической перинатальной профилактики резус-иммунизации женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови. Они представляют собой концентраты антирезус Rho(D) IgG-Ат, полученные из плазмы крови здоровых доноров, иммунизированных D-Аг эритроцитов человека. Фармакологическое действие препаратов реализуется посредством антирезус-RhoD) IgG-Ат (анти-D-Ат), способных нейтрализовать резус-положительные эритроциты плода, попавшие в кровоток матери. Клинически подтверждено, что введение рассчитанных доз препарата иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) снижает вероятность развития резус-иммунизации женщин приблизительно в 100 раз [3]. Неадекватная доза введения может привести к анафилактическим реакциям, гемолизу или не сможет обеспечить предотвращение изоиммунизации [4-7]. Таким образом, выбор метода оценки содержания анти-D-Ат в препаратах иммуноглобулинов человека играет ключевую роль в обеспечении их потенциальной терапевтической эффективности.

Цель работы - провести анализ методов оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D), используемых в мировой практике для разработки и внедрения перспективных подходов к количественному определению содержания антирезус Rho(D) IgG-Ат в препаратах отечественного производства.

Метод гемагглютинации

Структурно анти-D-Ат являются неполными, что в отличие от полных Ат (полимерных молекул иммуноглобулина изотипа М, некоторых A и G) частично препятствует их визуализации в реакции преципитации [8, 9]. Причинами этого явления может быть экранирование одного из Аг-связывающих центров молекулы иммуноглобулина, а также недостаточное число или малая доступность антигенных детерминант в структуре белка [10, 11]. Поэтому в начале 1960-х годов для оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) был предложен метод непрямой (пассивной) гемагглютинации (непрямая проба Кумбса), основанный на реакции агглютинации резус-положительных эритроцитов, обработанных папаином, и антиглобулиновой сыворотки с анти-D-Ат в препарате. Для воспроизведения метода использовали D-положительные эритроциты I(0) группы крови человека любого фенотипа [12].

В 1968 г. в результате анализа данных, полученных при использовании указанного метода, было установлено, что титры антирезус Rho(D) Ат варьировали в широком диапазоне (до 500 раз) [13]. Поэтому в 1978 г. экспертная комиссия ВОЗ по стандартизации биологических препаратов инициировала глобальные исследования по разработке и аттестации Международного стандартного образца (МСО) содержания антирезус Rho(D) IgG-Ат с участием 24 лабораторий в 21 стране. Для определения содержания анти-D-Ат в МСО использовали метод изотопной маркировки, который позволил определить количественное содержание анти-D-Ат в микрограммах. Впоследствии МСО были присвоены международные единицы дозы вещества - МЕ (эквиваленты биологической активности). Установлено, что метод непрямой гемагглютинации в сравнении с МСО при параллельных постановках наиболее воспроизводим [14, 15]. В дальнейшем с целью минимизации субъективности оценки результатов, получаемых при использовании реакции гемагглютинации, было предложено применение автоматизированных систем оценки результатов.

При визуальном определении путем сравнения со стандартным образцом, результат оценивают по наличию агглютинации в гемолизате, образованном при добавлении эритроцитов и антиглобулиновой сыворотки в каждое последовательное разведение испытуемого и стандартного образцов. Последнее разведение, в котором наблюдается агглютинация, принимают за титр анти-D-Ат. Если агглютинация эритроцитов наблюдается во всех разведениях исследуемого образца, то титр Ат выше, чем полученные разведения. В этих случаях повторяют титрование, приготовив еще большие разведения исследуемого препарата [16]. При использовании прибора для автоматического анализа регистрируют оптическую плотность гемолизата, полученного в результате реакции гемагглютинации. По результатам измерений разведений стандартного образца строят калибровочный график зависимости значений оптической плотности от содержания анти-D-Ат и в линейном диапазоне определяют специфическую активность испытуемого образца [17].

Метод гемагглютинации имеет ряд существенных недостатков. Субъективная интерпретация результатов при визуальном полуколичественном определении в титрах не позволяет в полной мере охарактеризовать специфическую активность и может помешать адекватному расчету дозы введения. Отсутствие стандартизации фенотипов эритроцитов может влиять на правильность получаемых результатов как при визуальном, так и при автоматизированном контроле, поскольку различные Аг на поверхности клеточной мембраны могут оказывать влияние на связывание с анти-D-Ат. Это связано с неодинаковой экспрессией Аг D у различных индивидов с фенотипами эритроцитов, имеющими в своем составе набор резус-Аг СDe и сDE. В частности, полипептиды Се и се, переплетающиеся в оболочке эритроцита с полипептидами D, затрудняют доступ анти-D-Ат к участкам D-Аг, в результате чего создается видимость слабого реагирования D-положительных эритроцитов c анти-D-сыворотками. При отсутствии полипептидов Се и се в оболочке эритроцитов связыванию D-Аг с анти-D-Ат ничто не мешает, и реакция выглядит более сильной, хотя на тех и на других эритроцитах могло присутствовать одинаковое количество антигенных детерминант [18]. Антиглобулиновая сыворотка, используемая в методе, содержит множество компонентов, среди которых антикомплементарные Ат, в частности к С3d-, C3c-, C4c- и С4d-компонентам комплемента, которые адсорбируются на поверхности эритроцитов и создают видимость положительного результата [19]. Также возможно получение результата отсутствия агглютинации, связанное с низкой аффинностью Ат сыворотки, сенсибилизирующих эритроциты [20]. Поэтому дальнейшие исследования были направлены на совершенствование количественного определения специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) с использованием более чувствительных и точных инструментальных методов.

Успехи в развитии иммунохимических методов исследований, молекулярно-генетических технологий, в частности создание моноклональных Ат позволили разработать новые специфичные методы, такие как метод конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) и метод проточной цитофлуориметрии.

Метод конкурентного иммуноферментного анализа

Метод конкурентного ИФА для оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) был предложен S.J. Thorpe и коллегами в 2000 г. [21]. Метод основан на конкуренции меченых биотинилированных моноклональных анти-D-Ат к специфическому эпитопу D с немеченными (исследуемыми) Ат препарата за связывание с D-Аг эритроцитов, адсорбированными на твердой фазе. Количество меченых Ат, присоединившихся к эритроцитам, уменьшится пропорционально содержанию в смеси исследуемых Ат. Связывание с конъюгатом для последующего выявления присоединившихся Ат достигается за счет использования системы "биотин-авидин-стрептавидин". Молекулы кофермента биотина конъюгируют с моноклональными анти-D-Ат при помощи биотинил-N-гидроксисукцимида. Затем биотин связывается с белковым комплексом авидин-стрептавидин, конъюгированным с щелочной фосфатазой. Аффинность связи между авидином и биотином высокая, константа диссоциации лиганда - 10-15 М, что обеспечивает высокую стабильность образовавшегося комплекса [22]. Стрептавидин используется для исключения неспецифической сорбции авидина на других молекулах. Конъюгат авидин-стрептавидин прочно фиксируется на комплексе, образованном биотинилированными моноклональными анти-D-Ат и Аг эритроцитов. После добавления субстрата (паранитрофенилфосфата) проводят определение продуктов реакции с использованием спектрофотометра. Для воспроизведения метода используют D-положительные эритроциты I(0) группы крови человека определенного фенотипа - R2R2, собранные не менее чем от 3 доноров. Значения активности определяют в МЕ в сравнении с МСО содержания антирезус Rho(D) IgG-Ат человека при построении графика зависимости концентрации и оптической плотности по данным, полученным из серии стандартных растворов. Высокая специфичность метода достигается за счет использования меченых Ат, поскольку конкуренция между ними и исследуемым образцом происходит только за специфический эпитоп D-Аг эритроцитов, что исключает неспецифическое связывание [23]. Высокая чувствительность, воспроизводимость и точность, производительность за счет использования многолуночных полистироловых планшетов, отсутствие зависимости от дорогостоящего оборудования делают метод наиболее универсальным. К недостаткам метода следует отнести высокую стоимость реагентов.

Метод проточной цитофлуориметрии

С начала 2000 г. для количественного определения специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) применяется высокочувствительный инструментальный метод с использованием проточного цитофлуориметра. Метод основан на измерении интенсивности флуоресценции комплекса, образованного специфическим связыванием D-положительных эритроцитов с анти-D-Ат, которые в свою очередь связываются с флуоресцентно-мечеными Ат к антирезус Rho(D) IgG-Ат (вторичными антителами) [24]. При этом значения активности получают в МЕ в сравнении с МСО содержания антирезус Rho(D) IgG-Ат человека при построении графика зависимости логарифма концентрации и интенсивности флуоресценции по данным, полученным из серии стандартных растворов. Для воспроизведения метода используют Б-положительные эритроциты I(0) группы крови человека фенотипа R1R1, собранные не менее чем от 3 доноров.

К недостаткам метода можно отнести возможное влияние различных Аг эритроцитов (Аг системы резус С, Сw а также Аг системы Кell), которые могут создавать эффект интерференции, что может влиять на правильность получаемых результатов [25, 26]. Использование специального дорогостоящего оборудования и реагентов не всегда доступно для некоторых лабораторий, кроме того, предъявляются высокие требования к квалификации персонала [27].

Обсуждение

В первых разработанных препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) содержание специфических Ат оценивали в титрах в реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации (непрямой пробе Кумбса), что не позволяло количественно оценить содержание антирезус Rho(D) IgG-Ат, способных нейтрализовать резус-положительные эритроциты плода.

В результате разработки МСО содержания антирезус Rho(D) IgG-Ат и внедрения современных иммунохимических методов стало возможным проводить оценку специфической активности препаратов иммуноглобулинов антирезус Rho(D) количественно в МЕ или в мкг по отношению к МСО (1 мкг = 5 МЕ) [28]. Профилактическую дозу препарата рассчитывают после подсчета количества эритроцитов плода, попавших в кровоток матери, с использованием лабораторных методов анализа, например, модифицированным методом кислотного вымывания-окрашивания по Кляйхауэру и Бетке [29-31]. Установлено, что 10 мкг (50 МЕ) антирезус Rho(D) IgG-Ат нейтрализует 0,5 мл резус-положительных эритроцитов плода (или 1 мл цельной крови) [32]. Для обеспечения правильности и удобства расчета профилактических доз введения содержание специфических Ат в современных препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) может быть 125 мкг (625 МЕ), 150 мкг (750 МЕ), 250 мкг (1250 МЕ), 300 мкг (1500 МЕ).

Методы непрямой гемагглютинации с использованием автоматизированных систем оценки результатов ИФА и проточной цитофлуориметрии для оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) представлены в Европейской фармакопее 9.0. В нашей стране указанные методы отсутствуют в структуре Государственной фармакопеи Российской Федерации и не внедрены на отечественных производствах иммунобиологических лекарственных средств [33].

Таким образом, разработка и внедрение отечественных методик количественного определения содержания антирезус Rho(D) IgG-Ат в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) в соответствии с современными требованиями, предъявляемыми к биоаналитическим методам испытаний, является перспективным направлением совершенствования качества указанной группы препаратов крови человека [34, 35].

Заключение

Препараты иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) применяются для специфической перинатальной профилактики резус-иммунизации женщин с резус-отрицательной принадлежностью крови. Степень реализации фармакологического действия препаратов зависит от содержания в них специфических антирезус Rho(D) IgG-Ат (анти-D-Ат), способных нейтрализовать резус-положительные эритроциты плода, попавшие в кровоток матери. Количественное определение содержания анти-D-Ат в МЕ активности или микрограммах в сравнении с МСО активности антирезус-иммуноглобулина инструментальными методами является необходимым условием получения качественных препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D). Успехи в развитии иммунохимических методов исследований, молекулярно-генетических технологий, в частности создание моноклональных Ат, позволили разработать в дополнении к традиционно используемому методу гемагглютинации новые альтернативные методы конкурентного ИФА и проточной цитофлуориметрии. В настоящее время специалисты ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России проводят экспериментальные исследования по разработке методик оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) с целью их внедрения в практику.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования: Кудашева Е.В., Климов В.И. Сбор и обработка материала: Шведова Е.В. Написание текста: Шведова Е.В., Кудашева Э.Ю. Редактирование: Климов В.И.

Литература

1. Савельева Г.М., Курцер М.А., Панина О.Б., Сичинава Л.Г., Клименко П.А., Коноплянников А.Г., Алексеенкова М.В. Диагностика, лечение, профилактика гемолитической болезни плода при резус-сенсибилизации. Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2006; 6: 73-8.

2. Scott M.L. The complexities of the Rh system. Vox Sang. 2004; 87: 58-62.

3. Резус-сенсибилизация. Гемолитическая болезнь плода. Клинические рекомендации. Письмо от 18 мая 2017 г № 15-4/10/2-3300 МЗ РФ. М., 2017.

4. Guideline on the clinical investigation of human anti-D immunoglobulin for intravenous and/or intramuscular use: EMA/CPMP/BPWG/575/99, rev. 1 URL: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500003334.pdf.

5. MacKenzie I.Z., Roseman F., Thompson K. The kinetics of routine antenatal prophylactic intramuscular injections of polyclonal anti-D immunoglobulin. BJOG. 2006; 113: 96-8.

6. Hannafin B., Lovecchio F., Blackburn P. Do Rh-nagative women with first trimester spontaneous abortions need Rh immune globulin? Emerg. Med. J. 2006; 24: 487-90.

7. Connan K. IVIG - is it the answer? Maternal administration of immunoglobulin for severe red cell alloimmunization during pregnancy: a case series. Obstet. Anesth. Digest. 2011; 31 (1): 43-5.

8. Поляк Р., Кату Р., Каруш Ф. Иммуноглобулины. Москва : Мир, 1981. 495 с.

9. Фримель Х. Иммунологические методы. Москва : Мир, 1979. 518 с.

10. Givol D., Reisfeld R.A., Mandy W.J. Structural analysis of antibody combining site. In: Contemporary Topics in Molecular Immunology. Vol. 2. New York : Plenum Press, 1973: 27-50.

11. Хаитов Р.М. Иммунология : учебник. 2-е изд. Москва : Медицина, 2002: 536 с.

12. Донсков С.И. Группы крови системы Rhesus. Теория и практика. Москва : ВИНИТ и РАН, 2005: 392 с.

13. WHO: 28th report. Expert Committee on Biological Standardization. WHO Tech. Rep. Ser. 1977; 610: 29-31.

14. Paul E.B. Standardization of US reference Rho(D) immune globulin by quantitative automated hemagglutination. J. Biol. Stand. 1986; 14: 121-25.

15. Trope S.J., Sands D., Fox B., Behr-Gross M.-E. A global standard for anti-D immunoglobulin: international collaborative study to evaluate a candidate preparation. Vox Sang. 2003; 85 (4): 313-21.

16. Herbert W.J. Passive hemagglutination. In: D.M. Weir (ed.). Handbook of Experimental Immunology. Oxford; Edinburgh : Blackwell Scientific Publications, 1967.

17. Assay of Human Anti-D Immunoglobulin: European Pharmacopoeia. 9th ed. Strasboung : Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe.

18. Донсков С.И. Экспресиия антигена D. В кн.: Группы крови человека : руководство по иммуносерологии. Москва : ИП Скороходов В.А., 2011: 1016 с.

19. Жибурт Е.Б. Иммунологические основы переливания крови. В кн.: Трансфузиология : учебник. Санкт-Петербург : Питер, 2002: 736 с.

20. Trope S.J., Sands D., Rautmann. International collaborative study to evaluate methods for quantification of anti-D in immunoglobulin preparations. Vox Sang. 2002; 83: 42-9.

21. Trope S.J., Fox B., Turner C. Competitive enzyme-linked immunoassay of monoclonal immunoglobulin G anti-D preparations. Transfus. Med. 2003; 13 (3): 209-12.

22. Dmitriev D.A., Massino Yu.S., Segal O.L. Kinetic analysis of interactions between bispecific monoclonal antibodies and immobilized antigens using a resonant mirror biosensor. J. Immunol. Methods. 2003; 280: 183-99.

23. Trope S.J., Fox B., Sands D. A stable lyophilized reagent for use in a potential reference assay for quantitation of anti-D in immunoglobulin products. Biologicals. 2002; 30: 315-21.

24. Schaffner G., Kayser T., Tonjes A. Validation of flow cytometry to quantify the potency of anti-D immunoglobulin preparations. Vox Sang. 2003; 84: 129-36.

25. Austin E.B., McIntosh Y., Hodson C. Anti-D quantitation by flow cytometry: an alternative to the Autoanalyzer? Transfus. Med. 1995; 5: 203-10.

26. Дубинкин И.В., Донсков С.И., Пискунова Т.М. Серологическая характеристика моноклональных антител к антигенам Rh-Hr, Kell. В кн.: Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины : материалы конференции. Киров, 2005: 156-7.

27. Трусов Г.А., Чапленко А.А., Семенова И.С. Применение проточной цитометрии для оценки качества биомедицинских клеточных продуктов. Биопрепараты. 2018; 18 (1): 16-4.

28. International collaborative study to calibrate proposed 3rd WHO International Standard for anti-D Immunoglobulin. WHO Expert Committee on Biological Standardization. WHO/BS/2018.2332 URL: https://www.who.int/biologicals/BS.2018.2332_3rd_IS_ANTI-D.pdf.

29. Манылова Н.А., Логинова И.И. Использование теста Клейхауэра-Бетке для выявления фето-материнской трансфузии и определение факторов риска развития анемии у новорожденных первой недели жизни. Системный анализ и управление в биомедицинских системах. 2008; 7 (1): 142-4.

30. Манылова Н.А., Логвинова И.И., Крутских Е.Л., Карамова Л.Н., Гудкова А.Н. Исследование крови родильниц на фетальные эритроциты для диагностики фето-материнских трансфузии. В кн.: Материалы 2-й научно-практической конференции, посвященной 120-летию родильного дома № 10. Воронеж, 2008: 42-7.

31. Курцер М.А. Профилактика гемолитической болезни. Вестник РГМУ. 2008; 6: 43-7.

32. American College of Obstetricians and Gynecologists. Management of alloimmunization. ACOG Pract. Bull. 2006; 5.

33. Иммуноглобулины человека: ОФС 1.8.1.003.15. Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV изд. Том II. URL: http://resource.rucml.ru/feml/pharmacopia/14_2/HTML/1271/index.html.

34. Bioanalytical method validation guidance for industry. U.S. Biopharmaceutics, May 2018. URL: http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htm.

35. Руководства ICH для фармацевтической отрасли. Качество. Береговых В.В. (ред.). Санкт-Петербург : Профессия, 2017: 768 с.


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»