Метаболическое репрограммирование макрофагов при их активации агонистом рецептора NOD1

• Муругина Нина Евгеньевна
• Балясова Л.С.
• Будихина Анна Сергеевна
• Максимчик Полина Валентиновна
• Дагиль Ю.А.
• Муругин Владимир Владимирович
• Чкадуа Г.З.
• Пинегин Борис Владимирович
• Пащенков Михаил Владимирович

Резюме

Активация клеток иммунной системы сопровождается перестройкой их метаболизма, или метаболическим репрограммированием. Мурамилпептиды - фрагменты пептидогликана бактерий -активируют клетки врожденной иммунной системы через рецепторы NOD1 и/или NOD2. В работе впервые охарактеризованы изменения углеводного и энергетического метаболизма макрофагов человека, активированных агонистом NOD1 - №ацетил-Э-мурамил-Г-аланил-Э-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновой кислотой (М-триДАП), в сравнении с эффектами агониста рецептора TLR4 -липополисахаридом (ЛПС). По данным анализа метаболизма в реальном времени, оба агониста в течение 1 ч после добавления к клеткам вызывали усиление гликолиза наряду с незначительным снижением потребления кислорода. Влияние обоих агонистов на гликолиз блокировалось ингибитором киназы Akt, но не зависело от активности киназного комплекса mTORC1 и от повышения экспрессии ферментов гликолиза. В отличие от ЛПС М-триДАП практически не индуцировал экспрессию аконитатдекарбоксилазы-1 - фермента, разобщающего цикл Кребса. Влияние 2-дезоксиглюкозы (конкурентного ингибитора гликолиза) и ингибитора Akt на экспрессию цитокинов, индуцированную М-триДАП, было неоднозначным: ингибитор Akt уменьшал экспрессию фактора некроза опухоли (TNF), ИЛ-6 и ИЛ-1β, тогда как 2-дезоксиглюкоза подавляла экспрессию TNF и ИЛ-6 на ранней стадии (1 ч), но усиливала ее на поздней стадии (4-9 ч) после добавления М-триДАП. Обсуждаются возможные механизмы действия указанных ингибиторов на экспрессию и продукцию цитокинов.

Ключевые слова:макрофаги; метаболическое репрограммирование; гликолиз; мурамилпептиды; NOD1

При активации клеток врожденной иммунной системы происходит масштабная перестройка их метаболизма, или метаболическое репрограммирование, которое является базисом для других процессов, протекающих в активированных клетках, таких как синтез цитокинов и эффекторных молекул, пролиферация, миграция и т. д. [1, 2]. При этом конкретные характеристики метаболического репрограммирования зависят от вида активирующего стимула. Так, в покоящихся макрофагах основным источником энергии является окислительное фосфорилирование (ОФ). Активация макрофагов по провоспалительному M1-типу, индуцируемая агонистами паттерн-распознающих рецепторов (ПРР) и интерфероном-γ, сопровождается переходом клеток на так называемый аэробный гликолиз [1], разобщением цикла Кребса [3] и угнетением ОФ [4]. Активация макрофагов по противовоспалительному M2-типу, индуцируемая интерлейкином-4 (ИЛ-4), характеризуется усилением глутаминолиза и β-окисления жирных кислот [3, 5]. Высказываются предположения, что тип метаболизма не только обеспечивает конкретные функциональные потребности клеток, но и в известной мере определяет направление их активации и дифференцировки [6]. Таким образом появляется возможность воздействовать на ход иммунного ответа, влияя на метаболизм клеток иммунной системы [7, 8].

Под аэробным гликолизом понимают такое состояние метаболизма, при котором, несмотря на достаточное поступление кислорода в клетку, основным источником энергии является гликолиз (не требующий присутствия кислорода). Хотя при гликолизе образуются лишь 2 молекулы аденозинтрифосфата (АТФ) на 1 молекулу глюкозы (в отличие от 30-36 молекул АТФ при окислительном фосфорилировании), АТФ генерируется при гликолизе быстрее, чем при окислительном фосфорилировании, что компенсирует низкую энергоэффективность [9, 10]. Кроме того, продукты гликолиза являются исходным материалом в биосинтетических процессах, интенсивно протекающих в активированных клетках иммунной системы [9]. Переход клеток с ОФ на аэробный гликолиз сопровождается увеличением потребления глюкозы и образования лактата - побочного продукта гликолиза. Перестройка метаболизма глюкозы при активации клеток обеспечивается как минимум двумя механизмами: быстрым, связанным с внутриклеточным перераспределением ферментов гликолиза, и медленным, связанным с активацией транскрипции генов, кодирующих ферменты гликолиза [11-13]. Аэробный гликолиз рассматривается как метаболическая основа воспаления [1].

Из всего многообразия микробных соединений - агонистов ПРР - для изучения метаболического репрограммирования клеток врожденного иммунитета в основном используется липополисахарид (ЛПС), агонист рецептора TLR4 [3, 12, 14-16]. Гораздо меньше известно о перестройке метаболизма под действием агонистов других ПРР. В частности, не изучено метаболическое репрограммирование при активации рецепторов NOD1 и NOD2, агонистами которых являются мура-милпептиды - фрагменты пептидогликана бактерий [17, 18]. Изучение этого вопроса представляет интерес, поскольку мурамилпептиды и их производные являются перспективными иммуностимуляторами и иммунологическими адъювантами.

Мы впервые изучили метаболическое репрограммирование макрофагов, индуцированное веществом мурамилпептидной природы. В работе использовался мурамилпептид М-триДАП (N-ацетил-Э-мурамил-L-аланил-Э-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота), который является сильным агонистом NOD1 с небольшой активностью в отношении NOD2 [19, 20]. Веществом сравнения служил ЛПС.

Материал и методы

Реактивы. Рекомбинантный человеческий грануло-цитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) был закуплен у фирмы Miltenyi Biotec (ФРГ), М-триДАП - у Invivogen (США), ЛПС E. coli O111:B4, 2-дезоксиглюкоза (2-ДГ) и олигомицин -у Sigma (США), рапамицин - у Merck Millipore (Франция), ингибиторы Akt-I-1/2, PFK-15 и AZ PFKFB3 67 - у Tocris (США). Полная культуральная среда (ПКС) представляла собой RPMI-1640 (Life Technologies, Великобритания) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Life Technologies) и 10% фетальной телячьей сыворотки (PAA, Австрия).

Получение и стимуляция макрофагов. Культуры макрофагов были получены путем 6-суточного культивирования моноцитов крови доноров с ГМ-КСФ, как было описано ранее [21]. По истечении 6 сут клетки рипсинизировали, отмывали, подсчитывали и помещали в 24-луночные планшеты (SPL Life Sciences, Республика Корея) в количестве 250 тыс. клеток в 500 мкл ПКС на лунку. Рабочие растворы М-триДАП и ЛПС готовили на ПКС, и по 25 мкл этих растворов добавляли в лунки. Конечная концентрация М-триДАП составляла 10 мкг/мл (данная концентрация определена как оптимальная по результатам более ранних опытов [20, 21]). Конечная концентрация ЛПС составляла 100 нг/мл. В лунки отрицательного контроля добавляли 25 мкл чистой ПКС. Если использовались ингибиторы ферментов, их вносили за 30 мин до добавления стимуляторов. Планшеты инкубировали 24 ч при +37 °C в атмосфере 5% CO₂, после чего собирали супернатанты для определения концентраций глюкозы, лактата и фактора некроза опухоли (TNF).

Исследование потребления глюкозы, высвобождения лактата и TNF. Концентрацию глюкозы в культуральных супернатантах и в ПКС определяли на биохимическом анализаторе Synchron CX5 Pro (Beckman Coulter, США). Потребление глюкозы (ПГ) одной клеткой за 24 ч рассчитывали по формуле:

ПГ = (C_ПКС − C_{супернатант}) 5 · 10⁻⁴ / 250 000,

где 5 · 10⁻⁴ - объем культуры (в литрах), 25 0000 - количество клеток в культуре.

Результаты нормализовали по количеству клеточного белка, принимая количество белка в нестимулированной лунке в данном опыте за 100%. Концентрации лактата измеряли колориметрическим методом с помощью набора реактивов фирмы Biovision (США). Высвобождение лактата в расчете на клетку вычисляли аналогично потреблению глюкозы. Уровни TNF в супернатантах определяли с помощью иммуноферментного анализа, используя наборы реактивов фирмы "Цитокин" (Санкт-Петербург, Россия).

Анализ клеточного метаболизма в реальном времени. Скорость закисления внеклеточной среды (extracellular acidification rate - ECAR) и скорость потребления кислорода (oxygen consumption rate - OCR) измеряли на приборе Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent Technologies, США). ECAR и OCR отражают интенсивность, соответственно, гликолиза и митохондриального дыхания. Изменения pH и содержания кислорода фиксируются чувствительными датчиками в тонком слое среды, прилегающем к клеточному монослою. Макрофаги высевали в планшеты Seahorse XF96 (Agilent) в количестве 16 000 клеток на лунку в 80 мкл ПКС. Наутро производили замену ПКС на специальную среду, представляющую собой XF base medium (Agilent) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 11 мМ D-глюкозы (Sigma) и 10% фетальной телячьей сыворотки. После уравновешивания pH в инкубаторе с атмосферным воздухом планшеты переносили в прибор. ECAR и OCR измеряли каждые 9 мин (продолжительность измерений 3 мин). После 3 базальных измерений впрыскивали стимуляторы (растворы М-триДАП, ЛПС или среды) и делали еще 22 измерения. Ингибиторы ферментов впрыскивали после 3 базальных измерений, после чего делали еще 3-6 измерений, а затем впрыскивали стимуляторы. Результаты нормализовали по клеточному белку. Вычисляли площади под кривыми "время-ответ" (AUC) после добавления стимулов.

Исследование экспрессии генов с помощью полимеразной цепной реакции обратного транскрипта в реальном времени. Экспрессию генов в М-триДАП-и ЛПС-стимулированных макрофагах анализировали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени, как было описано ранее [22]. Дизайн праймеров осуществляли с помощью онлайн-сервиса Primer-BLAST. Относительную экспрессию (ОЭ) генов рассчитывали по методу 2^-ΔΔCt. Референс-образцом, в котором ОЭ всех генов равнялась 1, служили нестимулированные клетки данного донора. В качестве нормировочного гена использовали GAPDH, экспрессия которого была наименее вариабельной из всех исследованных генов. Коэффициент вариации порогового цикла (Ct) для GAPDH в рамках опыта составил 2,18 ± 0,65% (по данным 6 независимых опытов); для сравнения, коэффициент вариации Ct ACTB - другого часто используемого нормировочного гена - составил 3,67 ± 0,6%. Относительную экспрессию самого GAPDH вычисляли по методу 2^-ΔCt (без нормировки).

Вестерн-блоттинг. Методика подробно была описана ранее [22]. Для определения киназы Akt, фосфо-рилированных форм Akt (p-T308 и p-S473) и аконитат-декарбоксилазы-1 (ACOD1) использовали поликлональные кроличьи антитела производства Cell Signaling Technologies (США), для определения α-тубулина - мышиные моноклональные антитела (клон DM1A) производства Novus Biologicals (США).

Статистика. Все значения p получены с помощью парного t-теста. Для статистической обработки использовали программу GraphPad Instat 3.06 (GraphPad Software, США).

Результаты

Экспрессия TNF, ИЛ-6, ИЛ-1 β при стимуляции макрофагов М-триДАП и липополисахаридом. М-триДАП и ЛПС вызывали мощную, примерно сопоставимую секрецию TNF макрофагами (рис. 1, А). Оба стимула индуцировали экспрессию мРНК TNF с максимумом в точке 1 ч, а также мРНК ИЛ-6 и ИЛ-1β с максимумом в точке 4 ч (рис. 1, Б-Г).

Изменения метаболизма глюкозы при стимуляции М-триДАП и липополисахаридом. В процессе гликолиза 1 молекула глюкозы расщепляется до 2 молекул пирувата, при этом образуется 2 молекулы АТФ и потребляются (восстанавливаются) 2 молекулы NAD⁺. Запасы NAD⁺ восстанавливаются двумя путями: 1) путем отдачи электронов в митохондриальную дыхательную цепь; 2) в реакции превращения пирувата в лактат, который высвобождается из клетки и приводит к закислению среды. М-триДАП и ЛПС вызывали сопоставимое по величине повышение скорости закисления среды (ECAR) (рис. 2, А, Б). Это повышение начиналось в течение 1 ч после впрыска стимуляторов и достигало максимума примерно в течение 2 ч с последующим более плавным снижением (см. рис. 2, А). В качестве положительного контроля использовали олигомицин - ингибитор митохондриальной АТФ-синтазы, заставляющий клетку максимально задействовать свой гликолитический резерв. Олигомицин вызывал более быстрое повышение ECAR с выходом на верхнее плато в течение 30-40 мин (см. рис. 2, А). Как видно из рис. 2, А, на пике ответа на М-триДАП и ЛПС клетки практически полностью задействовали гликолитический резерв. В период между 3 и 20 ч после начала стимуляции ECAR не измеряли, однако в макрофагах, исследованных через 20 ч после стимуляции М-триДАП, ECAR оставалась достоверно повышенной, тогда как ЛПС-стимулированные макрофаги по этому показателю не отличались от нестимулированных клеток (рис. 2, В).

Так, OCR в первые часы после стимуляции М-триДАП и ЛПС незначительно падала (рис. 2, Г, Д), тогда как в присутствии олигомицина она падала более чем на % (см. рис. 2, Д). Через 20 ч после начала стимуляции М-триДАП-стимулированные макрофаги характеризовались повышенным OCR по сравнению с контрольными нестимулированными клетками, тогда как у ЛПС-стимулированных макрофагов этот показатель не отличался от контроля (рис. 2, Е).

Чтобы подтвердить, что повышение ECAR при стимуляции клеток обусловлено именно приростом гликолиза, использовали конкурентный ингибитор гликолиза - 2-ДГ. Добавление 2-ДГ в концентрации 50 мМ (5-кратный избыток по отношению к концентрации глюкозы в культуральной среде) приводило к снижению базальной ECAR и полной отмене повышения ECAR в М-триДАП и ЛПС-стимулированных клетках (рис. 2, Ж). Кроме того, и М-триДАП, и ЛПС вызывали повышение суточного потребления глюкозы примерно на 40% (рис. 2, З), что тоже указывает на интенсификацию гликолиза и согласуется с изменениями ECAR. При этом высвобождение лактата достоверно повышалось только при стимуляции ЛПС (рис. 2, И). В ходе гликолиза из 1 моля глюкозы может образоваться 2 моля лактата. Соотношение измеренного количества лактата (см. рис. 2, И) к рассчитанному, исходя из данных по потреблению глюкозы (рис. 2, З) составило 74,5 ± 15,8% у нестимулированных, 63 ± 17,9% у М-триДАП-стимулированных и 87,1 ± 24,6% у ЛПС-стимулированных клеток. Хотя эти различия не были статистически достоверными, наблюдается тенденция к занижению измеренных уровней лактата по сравнению с расчетными при стимуляции М-триДАП. Известно, что лактат может реутилизироваться клетками с превращением в пируват [23, 24]. Поскольку М-триДАП и ЛПС вызывали сопоставимое повышение ECAR (т. е. сопоставимое высвобождение лактата; см. рис. 2, А, Б), можно предположить, что у макрофагов, стимулированных М-триДАП, имеется тенденция к повышению утилизации лактата.

Роль киназы Akt и комплекса mTORCl в изменениях метаболизма глюкозы при стимуляции М-триДАП и липополисахаридом. Наблюдаемая по данным ECAR интенсификация гликолиза при стимуляции макрофагов, развивается достаточно быстро, и, видимо, она не связана с изменениями экспрессии генов, по крайней мере на раннем этапе. Быстрое усиление гликолиза в дендритных клетках при стимуляции ЛПС связывают с перераспределением гексокиназы-II из цитозоля на наружную мембрану митохондрий, где этот фермент, катализирующий первую реакцию гликолиза, становится полностью активным [25]. Для связывания гексокиназы-II с митохондриями необходимо ее фосфорилирование по треонину-473, которое осуществляется киназой Akt [12, 26]. По данным вестерн-блоттинга, в макрофагах, стимулированных М-триДАП и ЛПС, происходило повышение уровня фосфорилирования Akt по треонину-308 и серину-473 примерно через 0,5-1 ч после начала стимуляции (рис. 3, А), что совпадает по времени с началом роста ECAR (рис. 3, Б). Специфический ингибитор Akt (Akt-I-1/2 [27]) подавлял как базальные показатели гликолиза макрофагов, так и их повышение при добавлении М-триДАП и ЛПС (рис. 3, Б-Д). В целом, эффекты ингибитора Akt на гликолиз в макрофагах аналогичны эффектам 2-ДГ.

Более медленный механизм гликолитического репрограммирования основан на повышении экспрессии генов, кодирующих ферменты гликолиза. В этом механизме тоже участвует Akt, которая активирует киназный комплекс mTORC1 с последующей активацией фактора транскрипции HIF-1a, регулирующего экспрессию указанных генов [13]. Мы изучили экспрессию мРНК ряда ферментов, которые либо являются узкими местами гликолитического каскада, либо подвержены транскрипционной регуляции при активации клеток [13]. Экспрессия генов гексокиназ (HK1, HK2, HK3), L- и M-субъединиц фосфофруктокиназы-1 (PFKL, PFKM), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), M1-M2-изоформ пируваткиназы (PKM1 и PKM2), а также M-субъединицы лактатдегидрогеназы (LDHA) после 1, 10 и 24 ч стимуляции макрофагов М-триДАП и ЛПС не изменялась (данные не показаны). Кроме того, рапамицин - специфический ингибитор mTORC1 - не влиял на базальные и стимулированные параметры гликолиза (рис. 3, В-Д), что исключает роль сигнального пути Akt - mTORC1 - HIF-1α в изменениях гликолиза, наблюдаемых при стимуляции макрофагов в наших экспериментах.

Роль фермента PFKFB3 в изменениях метаболизма глюкозы. По данным литературы, существенную роль в метаболическом репрограммировании играет фермент PFKFB3, или индуцибельная 6-фосфофрукто-2-киназа/фруктозо-2,6-бисфосфатаза [11, 28]. Этот фермент не участвует в основном гликолитическом каскаде, но катализирует превращение фруктозо-6-фосфата (одного из промежуточных продуктов гликолиза) во фруктозо-2,6-бисфосфат; последний аллостерически активирует фосфофруктоки-назу-1 - третий фермент гликолитического каскада, что приводит к стимуляции гликолиза. В наших экспериментах достоверное повышение экспрессии PFKFB3 в М-триДАП-стимулированных клетках отмечалось в точке 1 ч, а в ЛПС-стимулированных - в точках 1 и 10 ч (рис. 3, Е). Однако два высокоспецифичных ингибитора PFKFB3 (AZ PFKFB3 67 и PFK15 [29, 30]) не повлияли на ECAR (данные не показаны), а один из ингибиторов даже повысил потребление глюкозы макрофагами в базальных условиях и при стимуляции М-триДАП (рис. 3, Ж). Таким образом, роль PFKFB3 в гликолитическом репрограммировании макрофагов остается неясной.

Влияние 2-ДГ и ингибитора Akt на экспрессию провоспалительных цитокинов. Эффект 2-ДГ на продукцию TNF оказался двунаправленным, что было для нас несколько неожиданным. На раннем этапе активации (3 ч) 2-ДГ в концентрации 50 мМ ингибировала секрецию TNF, индуцированную М-триДАП и ЛПС, тогда как на позднем этапе (24 ч) - напротив, вызывала повышение уровней TNF в супернатантах (рис. 4, А). Оба эффекта 2-ДГ были дозозависимыми и проявлялись также в концентрациях 10 и 2 мМ (данные не показаны). Иная картина наблюдалась при использовании Akt-I-1/2: этот ингибитор подавлял М-триДАП-индуцированную продукцию TNF как на ранних, так и на поздних сроках, но не влиял на ЛПС-индуцированную продукцию TNF (рис. 4, Б).

Влияние 2-ДГ на экспрессию мРНК цитокинов тоже было двунаправленным (рис. 4, В). 2-ДГ ингибировала раннюю экспрессию TNF, ИЛ-6 и ИЛ-1Р (через 1 ч после добавления М-триДАП и ЛПС). Однако в более поздние сроки (4 и 9 ч) 2-ДГ усиливала М-триДАП- и ЛПС-индуцированную экспрессию TNF, а также М-триДАП-индуцированную экспрессию ИЛ-6, тогда как ингибирующий эффект 2-ДГ на ЛПС-индуцированную экспрессию ИЛ-6 и на экспрессию ИЛ-1Р, наблюдавшийся на ранних сроках, на более поздних сроках исчезал. Фактически в присутствии 2-ДГ экспрессия провоспалительных цитокинов, в частности TNF, не подавлялась, а смещалась на более поздние сроки после активации клетки.

Ингибитор Akt-I-1/2 подавлял экспрессию мРНК ИЛ-6 и в меньшей степени TNF и ИЛ-1Р, в М-триДАП-стимулированных клетках на раннем сроке активации (1 ч), не влияя на эти показатели на более поздних сроках (рис. 4, Г). Akt-I-1/2 не влиял на ЛПС-индуцированную экспрессию мРНК цитокинов (см. рис. 4, Г), что согласуется с данными по секреции TNF (см. рис. 4, Б).

Индукция экспрессии аконитатдекарбоксилазы-1 (ACOD1). Характерной чертой метаболического репрограммирования макрофагов при стимуляции ЛПС является индукция гена ACOD1 (другое название -IRG1) [31]. Фермент ACOD1 декарбоксилирует цис-аконитат - один из метаболитов цикла Кребса - с образованием итаконата [31]. Поскольку нормальный ход цикла Кребса предполагает превращение цис-аконитата в изоцитрат и далее в a-кетоглутарат, то вследствие активности ACOD1 цикл Кребса прерывается (за счет изъятия цис-аконитата), возобновляясь со стадии a-кетоглутарата, запасы которого пополняются благодаря глутаминолизу [3]. Итаконат обладает выраженной антимикробной активностью [31], ингибирует сукцинатдегидрогеназу, вызывая второй разрыв цикла Кребса [16, 32], а также ингибирует экспрессию ИЛ-1Р [16, 33].

В нестимулированных макрофагах экспрессия белка ACOD1 не определялась (рис. 5, А). При стимуляции макрофагов ЛПС наблюдалась мощная индукция мРНК и белка ACOD1 (рис. 5, А, Б), что согласуется с литературными данными. В макрофагах, стимулированных М-триДАП, уровни мРНК ACOD1 были на порядок ниже, а белок ACOD1 присутствовал лишь в следовых количествах (см. рис. 5, А, Б).

По данным литературы, для индукции экспрессии ACOD1 необходимо аутокринное действие интерферо-нов I типа [33]. Поэтому мы изучили экспрессию MX1 -интерферон-индуцибельного гена, являющегося маркером эндогенной продукции интерферонов. При стимуляции ЛПС наблюдалось повышение экспрессии MX1 через 4 ч и позже (рис. 5, В), что, вероятно, объясняется индукцией выработки интерферона-Р через TRIF-зависимый сигнальный путь. В макрофагах, стимулированных М-триДАП, экспрессия MX1 не менялась (рис. 5, В). Таким образом, экспрессия ACOD1 действительно коррелирует с отсут-ствием/наличием индукции эндогенных интерферонов. Однако из рис. 5 видно, что повышение мРНК ACOD1 до максимального уровня происходило уже через 1 ч после добавления стимуляторов (т. е. раньше повышения мРНК MX1), что не может быть объяснено аутокринным действием интерферонов, для выработки которых требуется не менее 2-3 ч.

Обсуждение

Проведенная работа показала, что характеристики метаболического репрограммирования макрофагов, активированных агонистом NOD1 (М-триДАП) и стандартным стимулом (ЛПС), во многом схожи. По данным анализа метаболизма в реальном времени, оба агониста вызывают быстрый прирост гликолиза наряду с незначительным снижением потребления кислорода, что может расцениваться как активация аэробного гликолиза. Влияние обоих агонистов на гликолиз зависит от активности киназы Akt, но не зависит от активности комплекса mTORC1 и повышения экспрессии ферментов гликолиза. Указанные процессы, вероятно, являются стереотипным ответом клеток врожденного иммунитета на стимуляцию ПРР [12], хотя выраженность ответа может зависеть от вида и дозы стимула. В то же время выявлены особенности метаболического репрограммирования, индуцированного агонистом NOD1 по сравнению с ЛПС: 1) более устойчивое повышение ECAR, сохраняющееся спустя 20 ч после добавления агониста; 2) тенденция к утилизации высвобождаемого клетками лактата; 3) практическое отсутствие индукции ACOD1 и, следовательно, сохранение непрерывности цикла Кребса. Возможно, эти особенности связаны между собой: поскольку поглощаемый клеткой лактат метаболи-зируется в цикле Кребса, непрерывность цикла может способствовать переработке больших количеств лактата М-триДАП-стимулированными клетками по сравнению с ЛПС-стимулированными.

Особый интерес представляет связь между параметрами гликолиза и экспрессией провоспалительных цитокинов. В нашей работе гликолиз в макрофагах ингибировали два соединения: 2-ДГ и ингибитор Akt. Однако их эффект на экспрессию TNF, ИЛ-6 и ИЛ-1Р оказался неодинаков и неоднозначен. Это заставляет предполагать, что влияние 2-ДГ и ингибитора Akt на экспрессию цитокинов обусловлено не только и не столько ингибированием гликолиза, сколько воздействием на другие процессы и сигнальные пути. Так, ингибитор Akt снижал М-триДАП-индуцированную экспрессию TNF, ИЛ-6 и ИЛ-1Р, но практически не влиял на ЛПС-индуцированную экспрессию этих же цитокинов. Известно, что киназа Akt участвует в различных сигнальных путях, связанных с активацией и диффе-ренцировкой макрофагов [34], хотя о вовлеченности Akt в сигнальные пути от рецепторов NOD1 и NOD2 до сих пор не сообщалось.

2-ДГ подавляла раннюю стадию экспрессии цитокинов при активации клеток М-триДАП и ЛПС, но усиливала позднюю стадию, фактически сдвигая экспрессию цитокинов на более поздний срок после начала активации. Литературные данные о влиянии 2-ДГ на продукцию цитокинов противоречивы. Сообщалось как об ингибирующем [12, 35-37], так и об усиливающем [38] действии 2-ДГ на ЛПС-индуцированную продукцию TNF и ряда других цитокинов, а также об отсутствии эффекта [39]. Описания ингибирующего действия 2-ДГ также противоречивы. По данным B. Everts и соавт., 2-ДГ не влияет на экспрессию мРНК TNF, ИЛ-6 и ряда других цитокинов при 3-часовой активации мышиных дендритных клеток ЛПС, но ингибирует секрецию этих цитокинов, что указывает на избирательное действие 2-ДГ на посттранскрипционные этапы продукции цитокинов [12]. Однако по данным Na и соавт., в мышиных макрофагах ингибируется также ЛПС-индуцированная экспрессия мРНК TNF, ИЛ-6 и ИЛ-ip, на ранних этапах активации (1-4 ч) [37]. Возможно, наблюдаемые различия в эффектах 2-ДГ зависят от вида животных, типа клеток, а также от времени, прошедшего после добавления агонистов ПРР, о чем говорят и данные настоящей работы. Механизмы действия 2-ДГ как ингибитора гликолиза на экспрессию цитокинов могут быть разнообразны. В частности, ферменты гликолиза GAPDH и PKM2 могут транслоцироваться в ядро и выступать в качестве непосредственных транскрипционных и посттранскрипционных регуляторов экспрессии цитокинов, причем данная функция GAPDH и PKM2 зависит от интенсивности гликолиза [36, 40]. Позднее усиливающее влияние 2-ДГ на экспрессию цитокинов может реализовываться через создание оксидативного стресса в клетке [41], однако этот вопрос нуждается в дальнейшем изучении.

Таким образом, в работе впервые охарактеризованы изменения углеводного и энергетического метаболизма макрофагов при их активации веществом мурамилпеп-тидной природы. Показана неоднозначность влияния ингибиторов гликолиза на продукцию и экспрессию провоспалительных цитокинов.

Литература/References

1. O’Neill L.A., Pearce E.J. Immunometabolism governs dendritic cell and macrophage function. J. Exp. Med. 2015; 213 (1): 15-23.

2. Buck M.D., O’Sullivan D., Pearce E.L. T cell metabolism drives immunity. J. Exp. Med. 2015; 212 (9): 1345-60.

3. Jha A.K., Huang S.C., Sergushichev A., Lampropoulou V. et al. Network integration of parallel metabolic and transcriptional data reveals metabolic modules that regulate macrophage polarization. Immunity. 2015; 42 (3): 419-30.

4. Mills E.L., Kelly B., Logan A., Costa A.S.H. et al. Succinate dehydrogenase supports metabolic repurposing of mitochondria to drive inflammatory macrophages. Cell. 2016; 167 (2): 457-70.e13.

5. Huang S.C., Everts B., Ivanova Y., O’Sullivan D. et al. Cell-intrinsic lysosomal lipolysis is essential for alternative activation of macrophages. Nat. Immunol. 2014; 15 (9): 846-55.

6. Van den Bossche J., O’Neill L.A., Menon D. Macrophage immunometabolism: where are we (going)? Trends Immunol. 2017; 38 (6): 395-406.

7. Stienstra R., Netea-Maier R.T., Riksen N.P., Joosten L.A.B. et al. Specific and complex reprogramming of cellular metabolism in myeloid cells during innate immune responses. Cell Metab. 2017; 26 (1): 142-56.

8. Ip W.K.E., Hoshi N., Shouval D.S., Snapper S. et al. Antiinflammatory effect of IL-10 mediated by metabolic reprogramming of macrophages. Science. 2017; 356 (6337): 513-9.

9. Vander Heiden M.G., Cantley L.C., Thompson C.B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 2009; 324 (5930): 1029-33.

10. Diskin C., Palsson-McDermott E.M. Metabolic modulation in macrophage effector function. Front Immunol. 2018; 9: 270.

11. Tannahill G.M., Curtis A.M., Adamik J., Palsson-McDermott E.M. et al. Succinate is an inflammatory signal that induces IL-1beta through HIF-1alpha. Nature. 2013; 496 (7444): 238-42.

12. Everts B., Amiel E., Huang S.C., Smith A.M. et al. TLR-driven early glycolytic reprogramming via the kinases TBK1-IKKvarepsilon supports the anabolic demands of dendritic cell activation. Nat. Immunol. 2014; 15 (4): 323-32.

13. Cheng S.C., Quintin J., Cramer R.A., Shepardson K.M. et al. mTOR- and HIF-1 alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 2014; 345 (6204): 1250684.

14. Krawczyk C.M., Holowka T., Sun J., Blagih J. et al. Toll-like receptor-induced changes in glycolytic metabolism regulate dendritic cell activation. Blood. 2010; 115 (23): 4742-9.

15. Meiser J., Kramer L., Sapcariu S.C., Battello N. et al. Proinflammatory macrophages sustain pyruvate oxidation through pyruvate dehydrogenase for the synthesis of itaconate and to enable cytokine expression. J Biol Chem. 2016; 291 (8): 3932-46.

16. Lampropoulou V., Sergushichev A., Bambouskova M., Nair S. et al. Itaconate links inhibition of succinate dehydrogenase with macrophage metabolic remodeling and regulation of inflammation. Cell Metab. 2016; 24 (1): 158-66.

17. Girardin S.E., Boneca I.G., Carneiro L.A., Antignac A. et al. Nod1 detects a unique muropeptide from gram-negative bacterial peptidoglycan. Science. 2003; 300 (5625): 1584-7.

18. Chamaillard M., Hashimoto M., Horie Y., Masumoto J. et al. An essential role for NOD1 in host recognition of bacterial peptidoglycan containing diaminopimelic acid. Nat Immunol. 2003; 4 (7): 702-7.

19. Dagil Y.A., Arbatsky N.P., Alkhazova B.I., L’Vov V L. et al. The dual NOD1/NOD2 agonism of muropeptides containing a meso-diaminopimelic acid residue. PLoS One. 2016; 11 (8): e0160784.

20. Дагиль Ю.А., Арбатский Н.П., Алхазова Б.И., Львов В. Л. и др. Структурные особенности селективных и неселективных агонистов NOD-рецепторов. Мед. иммунология. 2017; (19): 705-14. [Dagil Yu.A., Arbatsky, N.P., Alkhazova, B.I., L’vov, V.L. et al. Structural features of selective and non-selective NOD receptor agonists. Meditsinskaya immunologiya [Medical Immunology]. 2017; (19): 705-14. (in Russian)]

21. Pashenkov M.V., Popilyuk S.F., Alkhazova B.I., L’Vov V.L. et al. Muropeptides trigger distinct activation profiles in macrophages and dendritic cells. Int Immunopharmacol. 2010; 10 (8): 875-82.

22. Pashenkov M.V., Balyasova L.S., Dagil Y.A., Pinegin B.V. The role of the p38-MNK-eIF4E signaling axis in TNF production downstream of the NOD1 receptor. J. Immunol. 2017; 198 (4): 1638-48.

23. Rogatzki M.J., Ferguson B.S., Goodwin M.L., Gladden L.B. Lactate is always the end product of glycolysis. Front Neurosci. 2014; 9: 22.

24. Hahn E.L., Halestrap A.P., Gamelli R.L. Expression of the lactate transporter MCT1 in macrophages. Shock. 2000; 13 (4): 253-60.

25. John S., Weiss J.N., Ribalet B. Subcellular localization of hexokinases I and II directs the metabolic fate of glucose. PLoS One. 2011; 6 (3): e17674.

26. Miyamoto S., Murphy A.N., Brown J.H. Akt mediates mitochondrial protection in cardiomyocytes through phosphorylation of mitochondrial hexokinase-II. Cell Death Differ. 2008; 15 (3): 521-9.

27. Bain J., Plater L., Elliott M., Shpiro N. et al. The selectivity of protein kinase inhibitors: a further update. Biochem. J. 2007; 408 (3): 297-315.

28. Jiang H., Shi H., Sun M., Wang Y. et al. PFKFB3-driven macrophage glycolytic metabolism is a crucial component of innate antiviral defense. J. Immunol. 2016; 197 (7): 2880-90.

29. Boyd S., Brookfield J.L., Critchlow S.E., Cumming I.A. et al. Structure-based design of potent and selective inhibitors of the metabolic kinase PFKFB3. J. Med. Chem. 2015; 58 (8): 3611-25.

30. Clem B.F., O’Neal J., Tapolsky G., Clem A.L. et al. Targeting 6-phosphofructo-2-kinase (PFKFB3) as a therapeutic strategy against cancer. Mol. Cancer Ther. 2013; 12 (8): 1461-70.

31. Michelucci A., Cordes T., Ghelfi J., Pailot A. et al. Immune-responsive gene 1 protein links metabolism to immunity by catalyzing itaconic acid production. Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 2013; 110 (19): 7820-5.

32. Cordes T., Wallace M., Michelucci A., Divakaruni A.S. et al. Immunoresponsive gene 1 and itaconate inhibit succinate dehydrogenase to modulate intracellular succinate levels. J. Biol. Chem. 2016; 291 (27): 14 274-84.

33. Mills E.L., Ryan D.G., Prag H.A., Dikovskaya D. et al. Itaconate is an anti-inflammatory metabolite that activates Nrf2 via alkylation of KEAP1. Nature. 2018; 556 (7699): 113-7.

34. Vergadi E., Ieronymaki E., Lyroni K., Vaporidi K. et al. Akt Signaling pathway in macrophage activation and M1/M2 polarization. J. Immunol. 2017; 198 (3): 1006-14.

35. Dietl K., Renner K., Dettmer K., Timischl B. et al. Lactic acid and acidification inhibit TNF secretion and glycolysis of human monocytes. J Immunol. 2010; 184 (3): 1200-9.

36. Hu K., Yang Y., Lin L., Ai Q. et al. Caloric restriction mimetic 2-Deoxyglucose alleviated inflammatory lung injury via suppressing nuclear pyruvate kinase M2-signal transducer and activator of transcription 3 pathway. Front Immunol. 2018; 9: 426.

37. Na Y.R., Gu G.J., Jung D., Kim Y.W. et al. GM-CSF induces inflammatory macrophages by regulating glycolysis and lipid metabolism. J. Immunol. 2016; 197 (10): 4101-9.

38. Miller E.S., Koebel D.A., Sonnenfeld G. The metabolic stressor 2-deoxy-D-glucose (2-DG) enhances LPS-stimulated cytokine production in mice. Brain Behav Immun. 1993; 7 (4): 317-25.

39. Wang A., Huen S.C., Luan H.H., Yu S. et al. Opposing effects of fasting metabolism on tissue tolerance in bacterial and viral inflammation. Cell. 2016; 166 (6): 1512-25.e12.

40. Millet P., Vachharajani V, McPhail L., Yoza B. et al. GAPDH binding to TNF-alpha mRNA contributes to posttranscriptional repression in monocytes: a novel mechanism of communication between inflammation and metabolism. J. Immunol. 2016; 196 (6): 2541-51.

41. Shutt D.C., O’Dorisio M.S., Aykin-Burns N., Spitz D.R. 2-deoxy-D-glucose induces oxidative stress and cell killing in human neuroblastoma cells. Cancer Biol. Ther. 2010; 9 (11): 853-61.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)