Введение
Анкилозирующий спондилит (АС) - хроническое воспалительное заболевание из группы спондилоартритов, характеризующееся обязательным поражением крестцово-подвздошных суставов и/или позвоночника с потенциальным исходом их в анкилоз, частым вовлечением в патологический процесс энтезисов и периферических суставов [1]. Хотя этиопатогенез заболевания изучен не полностью, роль генетических факторов в восприимчивости к АС неоспорима [2].
Человеческие лейкоцитарные антигены (Human leucocyte antigens - HLA) являются наиболее полиморфными локусами в геноме человека. По данным Комитета по номенклатуре факторов HLA-системы ВОЗ (The WHO Nomenclature Committee for Factors of the HLA System), на декабрь 2018 г. HLA-локусы представлены 21 499 аллелем [3], многие из них ассоциированы со специфическими иммуноопосредованными заболеваниями.
Ассоциативная связь антигена HLA-B*27 с АС обнаружена более 40 лет назад. Однако из более чем 188 аллелей HLA-B*27, зарегистрированных на сегодняшний день, основные подтипы HLA-B*27, связанные с АС, различаются по частоте встречаемости в разных этнических группах [4, 5]. Так, HLA-B*27:02 зарегистрирован у европейских пациентов с АС, особенно часто в южно-европейских странах [6], HLA-B*27:03 - у африканцев [7], HLA-B*27 антиген - присутствует у больных АС большинства этнических групп [4, 5], тогда как HLA-B*27:07 и HLA-B*27:08 выявляются значительно реже у больных АС, в основном у европейцев [9, 10]. При этом есть исследования, показывающие, что некоторые редко встречающиеся HLA-В *27-аллели -27:06 и 27:09 - не выявляются у больных АС, и даже, предположительно, играют протективную роль [9, 11].
В Российской Федерации практически отсутствуют данные по распределению аллелей HLA-B*27 у больных АС [12].
Цель данной работы - изучение профиля аллелей локуса HLA-B у больных с АС.
Материал и методы
В исследование был включен 121 больной: 100 -пациенты ФГБНУ "Научно-исследовательский институт ревматологии им. В. А. Насоновой", 21 - пациенты КОГБУЗ "Кировская областная клиническая больница". Все пациенты соответствовали модифицированным Нью-Йоркским критериям (1984) АС. Статистический анализ проводили с использованием программы Epi Info (версия 7). Различия в распределении клинических проявлений как номинальных показателей между группами HLA-аллелей оценивали в четырехпольной таблице по величине критерия независимости χ2. При значении одного из показателей <5 использовали точный метод Фишера. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.
Препараты ДНК для HLA-типирования получены из замороженных образцов цельной крови (антикоагулянт - ЭДТА) методом колоночной фильтрации с использованием наборов реагентов QIAamp DNA Blood Mini Kit (QIAGEN, Германия). Концентрация препаратов ДНК, которую определили на спектрофотометре TECAN Infinite 200 (TECAN, Швейцария), составляла в среднем 25-40 нг/мкл при соотношении А260/А280 = 1,75 ÷ 1,95.
HLA-типирование образцов больных с диагнозом АС по локусу HLA-B проводили по технологии SBT (Sequencing Based Typing) с применением базовых наборов реагентов AlleleSEQR HLA Sequencing (Abbott, США). Чтобы избежать неоднозначности типирования, использовали реагенты для уточнения гетерозиготных неоднозначностей, в реакцию брали амплификаты на стадии амплификации при постановке HLA-типирования с базовыми наборами реагентов.
Капиллярный электрофорез осуществляли на 48-капиллярном генетическом анализаторе 3730 (Applied Biosystems, США), полученные сиквенсы просматривали в программе Sequencing Analysis (v.5.2), анализировали в программе SBTEngine с использованием библиотеки HLA-аллелей - IMGT/HLA 3.25.0.
В качестве группы сравнения использовали когорту потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток, включенных в регистр неродственных доноров ФГБУН "Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови ФМБА России" (n = 29 253).
Исследование одобрено этическим комитетом ФГБНУ "Научно-исследовательский институт ревматологии им. В.А. Насоновой", письменное информированное согласие получено от всех пациентов.
Результаты
При HLA-типировании образцов ДНК, выделенных от лиц с установленным диагнозом АС, результат типирования в высоком разрешении по локусу HLA-B получен для всех образцов. Аллельный вариант HLA-B*27 выявлен у каждого пациента с диагнозом АС, а в 5 случаях данный аллельный вариант встретился в гомозиготном состоянии. Не обнаружено различий в отношении активности АС и данных инструментальных обследований между пациентами с HLA-B*27 в гомозиготном состоянии и с HLA-B*27 в гетерозиготном состоянии.
Частота встречаемости аллелей локуса HLA-B у больных с АС представлена в табл. 1.
Из табл. 1 следует, что у исследуемого контингента лиц в ходе эксперимента обнаружены всего 3 аллеля HLA-B*27 - 27:05, 27:02 и 27:04. Из аллельного профиля локуса HLA-B следует, что ни одна другая аллельная группа не выявлена у большинства исследуемой выборки, а многие аллели получены лишь единожды.
Сравнительный анализ клинических проявлений АС (вариант дебюта, длительность заболевания, активность, функциональные нарушения, аксиальные, внеаксиальные и внескелетные проявления) и данных обследований у пациентов с АС с различными аллелями HLA-B*27 показал отсутствие статистически значимых различий (р < 0,05) между этими группами.
Частота встречаемости аллельного варианта HLA-B*27 у потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток в зависимости от региона их проживания представлена в табл. 2. В связи с тем, что все потенциальные доноры гемопоэтических стволовых клеток для включения в регистр типируются в разрешении от среднего к высокому, невозможно рассчитать указанную частоту встречаемости для конкретных аллелей HLA-B*27, это можно сделать только для всей аллельной группы. У лиц контрольной группы выявлены аллели HLA-B*27:05, 27:02, 27:04, 27:14, 27:07, 27:09, а также аллели 27:133 [13], 27:05:31 [14] и 27:07:05 [15], впервые обнаруженные и описанные у жителей Российской Федерации.
Из табл. 2 следует, что наибольшей частотой встречаемости HLA-B*27 характеризуются жители Республик Чувашия (9,87%) и Марий Эл (7,96%), которые, вероятно, будут характеризоваться наибольшей распространенностью АС [16, 17]. Наименьшими частотами встречаемости HLA-B*27 характеризуются жители Приморского края и регионов Северного Кавказа.
Обсуждение
Генетическая ассоциация HLA-B*27 с АС впервые обнаружена в начале 1970-х гг. и с тех пор не раз подтверждалась в дальнейших исследованиях.
Молекула HLA-B*27 является уникальной молекулой человеческих лейкоцитарных антигенов I класса не только в силу ее высокой ассоциативности с АС, но и из-за особенного аминокислотного состава. Наличие В-кармана и свободной тиольной группы Cys67 - две важнейшие структурные особенности, отличающие HLA-B*27 от других HLA-антигенов [18]. Свободный тиоловый остаток Cys67 способствует формированию гомодимера молекулы HLA-B*27 во внеклеточном домене, что оказывает большое влияние на его физиологическую роль [19].
Установлено неравномерное распределение гена HLA-B*27 в мире. Наибольшей распространенностью HLA-B*27 и самым высоким показателем выявления спондилоартропатий характеризуются эскимосы и коренные американцы, проживающие в приполярной области и на севере Канады [4, 20]. Известно, что распределение HLA-B*27 имеет тенденцию к градиентному снижению распространенности с севера на юг, что, предположительно, отражает генетический отбор лучшей сопротивляемости инфекциям. В нашем исследовании это подтверждается распределением HLA-B*27 в группе сравнения - минимальными значениями частоты встречаемости характеризуются наиболее южные из изучаемых регионов страны: Приморский край (2,5%), Чеченская Республика (3,14%) и Республика Дагестан (3,27%).
На сегодняшний день описано 188 подтипов HLA-B*27, большинство из них отличаются нуклеотидными заменами в экзонах 2 и 3, отвечающих за формирование пептид связывающего сайта [5]. HLA-B*27:05 является наиболее распространенным подтипом и присутствует практически в каждой мировой популяции. Считается, что HLA-B*27:05 был "родительским" подтипом, из которого могли образоваться все остальные подтипы путем точечных мутаций (HLA-B*27:03), рекомбинации (HLA-B*27:06, 27:09) и генетической конверсии (HLA-B*27:01, HLA-B*27:02, HLA-B*27:04).
Следует отметить, что аллели HLA-B*27, а также их ассоциативность с АС существенно различаются у представителей различных этнических групп. Помимо HLA-B*27:05, доказана ассоциированность с АС следующих аллелей HLA-B *27:01, HLA-B *27:02, HLA-B*27:03, HLA-B*27:04, HLA-B*27:10, HLA-B*27:13, HLA-B*27:14, HLA-B*27:15 [21, 22]. Остальные аллели обнаруживаются с очень низкой частотой встречаемости, и их связь с АС, как правило, неизвестна.
Среди европеоидов преобладающим является аллель HLA-B*27:05, частота встречаемости которого обычно составляет >70% от всех HLA-B*27-позитивных лиц [4, 21]. Также его считают наиболее распространенным аллелем, ассоциированным с АС, на втором месте находится аллель HLA-B*27:02 [4, 21] Полученное в нашем исследовании распределение аллелей HLA-B*27 у пациентов с АС совпадает с их распределением среди лиц европейского происхождения. Аллель HLA-B*27:04, выявленный только у одного пациента изученной выборки, является основным аллелем, ассоциированным с АС в китайской популяции [23].
Аллель HLA-B*27:14, ассоциированность которого с АС подтверждена несколькими исследованиями, нами выявлен только в группе сравнения. Обнаружение аллеля HLA-B *27:09 только в группе сравнения свидетельствует в пользу гипотезы о его защитной роли [11].
С момента открытия высокой ассоциации HLA-B*27 с АС предложено несколько гипотез, объясняющих роль HLA-B*27 в патогенезе заболевания. Первоначально акцент был сделан на уровень экспрессии гена HLA-B*27 при проявлении заболевания, предполагалось, что уровень мРНК коррелирует с активностью клинического течения АС. Однако влияние гомозиготности HLA-B*27 так и осталось спорным [4, 21, 22]. В нашем исследовании не обнаружено различий в отношении активности АС между пациентами с HLA-B*27 в гомозиготном и гетерозиготном состояниях.
Выводы
1. Впервые определен аллельный профиль локуса HLA-B у лиц с диагнозом АС, проживающих на территории Российской Федерации. Аллели HLA-B*27:05 и HLA-B*27:02 определены как два основных аллеля, ассоциированных с АС.
2. Установлено, что особенности клинического течения АС среди пациентов российской популяции не ассоциируются с аллелями HLA-B*27.
3. Гомозиготный HLA-B*27 выявлен не только при АС, но и среди лиц группы сравнения, что свидетельствует о полигенном контроле заболевания.