Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L и их характеристика

Резюме

Введение. Клеточные линии и культуры являются незаменимым инструментом в исследованиях физиологии клеток. Культуры В-лимфоцитов имеют важное значение для изучения В-клеточного ответа, генерации антител, а также для создания терапевтических моноклональных антител. Вместе с тем активация В-лимфоцитов и их продолжительное культивирование in vitro продолжают оставаться нерешенной проблемой.

Цель исследования - разработка протокола стимуляции В-лимфоцитов человека in vitro, характеристика фенотипических и функциональных особенностей стимулированных В-клеток для последующего использования протокола для определения количества В-клеток памяти, секвенирования генов Ig, а также получения иммортализованных клонов В-лимфоцитов.

Материал и методы. Клетки, стабильно трансфецированные геном CD40L, получали путем лентивирусной трансдукции. В-лимфоциты выделяли из периферической крови человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина с дальнейшим обогащением методом отрицательной селекции с использованием магнитных микросфер. В-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью фидерных клеток, несущих поверхностный CD40L, в присутствии экзогенного рекомбинантного интерлейкина(ИЛ)-21. Количество и фенотип стимулированных В-лимфоцитов определяли, используя многоцветную проточную цитометрию. Секрецию IgM и IgG в культурах В-лимфоцитов оценивали с помощью иммуноферментного анализа.

Результаты. С помощью лентивирусной трансдукции были получены клетки HEK293, K562 и A549, стабильно трансфецированные геном CD40L. Исходя из экспрессии молекулы CD40L, а также ростовых свойств для дальнейшего исследования в качестве фидера была выбрана линия трансфецированных клеток A549. При совместном культивировании фидерных клеток и В-лимфоцитов в присутствии экзогенного ИЛ-21 наблюдалась стимуляция В-лимфоцитов. В-лимфоциты начинали пролиферировать и через 7 дней их количество увеличивалось в среднем в 8 раз. Стимулированные В-лимфоциты изменяли свою морфологию. Они приобретали неправильную форму с псевдоподиями, группировались вокруг фидерных клеток и начинали активно передвигаться. При ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоциты изменяли свой поверхностный фенотип и к 10-му дню около 40 % В-клеток дифференцировались в плазмабласты (CD19+CD27+CD38+). При этом доля CD20+-клеток снижалась до 20 %. Процент клеток с поверхностной экспрессией Ig также снижался. Секреция IgM и IgG в процессе стимуляции, напротив, возрастала. К 12-му дню пролиферативный потенциал В-клеток исчерпывался и они погибали.

Заключение. Культивирование В-лимфоцитов in vitro в присутствии экзогенного ИЛ-21, а также фидерных клеток, экспрессирующих молекулу CD40L, является удобной системой для получения активированных В-лимфоцитов, которые могут использоваться для решения различных задач.

Ключевые слова:культура клеток; B-лимфоциты; плазмабласты; ИЛ-21; CD40L

Для цитирования: Бязрова М.Г, Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Васильева Ю.В., Прилипов А.Г, Филатов А.В. Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (6): 501-510. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-501-510.

Финансирование. Работа поддержана грантом Российского научного фонда № 19-15-00331.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Введение

Трудно переоценить роль, которую культуры клеток и клеточных линий сыграли в изучении физиологии человека и млекопитающих. Это утверждение в полной мере относится к вкладу, который клеточные линий внесли в исследования В-лимфоцитов. Наиболее очевидным примером из этой области является использование так называемых плазмацитом MOPC (mineral oil-induced plasmacytomas) [1]. С их помощью были получены первые препараты моноклональных иммуноглобулинов, изучена структура и некоторые функции этих молекул. С помощью MOPC расшифрованы механизмы перестройки генов Ig. Наконец, гибридомная технология стала возможна благодаря использованию одного из вариантов MOPC [2]. К сожалению, эффективного партнера для слияния с В-клетками человека так и не найдено, несмотря на значительные усилия, затраченные в этом направлении. Полезными моделями В-клеток человека являются также многочисленные линии клеток, полученные из лимфом Беркитта и ходжкинских лимфом. Однако подобные линии клеток образуются спонтанно и их нельзя получать контролируемым образом из заранее определенных популяций клеток. В этом отношении выгодно отличаются линии клеток, получаемые путем иммортализа-ции с помощью вируса Эпштейна-Барр [3, 4]. Однако В-клетки, трансформированные этим вирусом, характеризуются ограниченным потенциалом роста, низкой эффективностью клонирования и невысоким уровнем продукции Ig, который быстро падает при культивировании [5-8].

Идеальным решением могла бы стать разработка метода получения клонов В-клеток, подобного тому, который существует для Т-лимфоцитов [9]. Периодическая рестимуляция Т-клеток дает возможность клонировать Т-лимфоциты и наращивать Т-клетки практически в неограниченных количествах. Полученные таким образом клоны Т-лимфоцитов с успехом используются не только в научных исследованиях, но также для иммунотерапии опухолей [10]. Однако этот подход сталкивается с многочисленными трудностями. Это связано с тем, что для стимуляции и пролиферации В-лимфоцитов требуется более широкий спектр стимулов. С переменным успехом для стимуляции роста В-лимфоцитов использовали самые разнообразные активаторы, начиная от различных интерлейкинов (ИЛ) (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10) и заканчивая лигандами Toll-подобных рецепторов - TLR7/8 (R848) или TLR9 (CpG), а также золотистым стафилококком или антителами против Ig [11-13].

Наиболее привлекательной системой для активации В-лимфоцитов представляется комбинация ИЛ-21 и лиганда рецептора CD40, поскольку именно эти стимулы принимают участие в активации В-клеток при иммунном ответе, который развивается в зародышевых центрах лимфоузлов [12]. В качестве агонистов молекулы CD40 использовались антитела против этого рецептора, а также растворимые формы его натурального лиганда CD40L [14]. Основной проблемой при таком подходе являлась необходимость гексамеризации растворимых форм агонистов CD40. Это условие в наиболее полной мере достигается, когда CD40L находится на поверхности фидерной клетки, с которой взаимодействует В-лимфоцит.

Целями данного исследования являлись получение фидерных клеток, несущих поверхностный CD40L, отработка протокола стимуляции В-лимфоцитов человека in vitro с помощью nn-21/CD40L, а также характеристика стимулированных В-лимфоцитов.

Материал и методы

Выделение лимфоцитов. В исследовании приняли участие 10 здоровых добровольцев в возрасте от 25 до 42 лет. Все добровольцы дали информированное согласие на проведение исследования. Периферическую венозную кровь собирали в гепаринизированные вакуумные пробирки. Мононуклеарные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (ρ = 1,077 г/см3). Эритроциты лизировали с помощью раствора FACS Lysis buffer (BD, США). В-лимфоциты выделяли из фракции мононукле-арных клеток путем отрицательной селекции с использованием набора для магнитной сортировки Dynabeads Untouched human B-cell kit (Thermo Fisher Scientific, США). Чистота выделенных В-лимфоцитов составляла не менее 98 %.

Получение фидерных клеток, стабильно экспрессирующих CD40L. Фидерные клетки получали путем лентивирусной трансдукции [15]. Для получения лентивируса клетки HEK293T сеяли по 0,7 млн в лунку 6-луночного планшета за день до проведения трансфекции. На следующий день упаковочные плазмиды pCMV-VSV-G (0,45 мкг), pCMV-A8.2R (1,45 мкг), а также трансферную плазмиду EX-G0117-Lv105 (2,2 мкг), кодирующую CD40L, разводили стерильной водой до 112,5 мкл. К полученному раствору плазмид добавляли 12,5 мкл 2,5 мМ CaCl2 и 125 мкл раствора, содержавшего 50 мМ HEPES, 1,5 мМ Na2HPO4, 280 мМ NaCl, 10 мM KCl и 12 мM сахарозы. Полученную смесь общим объемом 250 мкл распределяли по поверхности лунки, перемешивая содержимое несколькими орбитальными движениями. Через 5-8 ч среду меняли на свежую.

Через 2 дня после трансфекции супернатант культуры клеток HEK293T собирали, фильтровали через 0,45 мкм фильтр и центрифугировали при 30 000 g 2 ч 30 мин при температуре 4 °C. Осадок суспендировали в 200 мкл среды, делали несколько последовательных разведений с 2-кратным шагом и добавляли к клеткам HEK293T, K562 или A549 для трансдукции. За 1 день до трансдукции клетки-мишени высевали в объеме 250 мкл в лунки 24-луночного планшета по 0,1 млн/лунку. Трансдуценты отбирали культивированием в селективной среде, содержавшей 10 мкг пуромицина.

Стимуляция лимфоцитов in vitro. Фидерные клетки в течении 2,5 часов обрабатывали 10 мкг/мл митомицина-С ("Kyowa Hakko Kogyo Co.", Япония), после чего клетки 4 раза отмывали в среде DMEM и сеяли по 10 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет. Выделенные В-лимфоциты добавляли в лунки с фидерными клетками по 10 000 клеток на лунку. В-лимфоциты культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (все "ПанЭко", Россия) и 25 нг/мл ИЛ-21 (Peprotech, США) при 37 °C в 5 % CO2. При рестимуляции лимфоциты собирали, подсчитывали концентрацию и высевали на новые лунки со свежими фидерными клетками и свежей порцией ИЛ-21.

Проточная цитометрия. Эксперименты по проточной цитометрии проводили на свежевыделенных В-лимфоцитах или B-клетках после стимуляции in vitro в системе ИЛ-21/CD40L с использованием проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного двумя диодными лазерами - 488 нм и 561 нм. Для окрашивания лимфоцитов использовали следующие антитела: CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), против человеческого IgG-FITC (клон CH1) и IgM-FITC (клон MA2). Указанные антитела были получены в нашей лаборатории [16, 17] и коньюгированы с соответствующими красителями по ранее описанному методу [18,19]. Для определения экспрессии маркера CD40L использовали антитело CD154 (клон 24-31, Exbio, Чехия). Окрашивание производили в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки 2 раза отмывали в физиологическом растворе забуференном фосфатами. Перед измерением клеточную суспензию пропускали через ситечко с диаметром пор 40 мкм. Цитофлуориметрические данные обрабатывали при помощи программы FlowJo (США).

Определение Ig методом иммуноферментного анализа (ИФА). Антитела против человеческого IgG (клон 2A11) и IgM (клон CH2) в концентрации 10 мкг/мл сорбировали в лунках 96-луночных планшетов (Greiner, ФРГ), внося в лунку по 100 мкл раствора антител в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ). Планшеты инкубировали ночь при 4 °С, после чего трижды отмывали буфером PBS/Tween20. Лунки блокировали добавлением ФСБ, содержавшего 1 % бычьего сывороточного Ig, инкубировали в течение часа и 3 раза отмывали c помощью ФСБ с добавлением 0,1 % Твин 20 (ФСБ-Т). Тестируемые препараты разводили буфером для разведения антител, вносили в лунки планшета по 100 мкл и инкубировали в течение 1 ч. После инкубации лунки планшета отмывали три раза буфером ФСБ-Т. Для детекции IgM и IgG использовали вторичные антитела анти-IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (клоны MA2 и СH1 соответственно). После инкубации в течении 1 ч лунки промывали 3 раза с помощью ФСБ-Т, добавляли в лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина ("Хема Медика", Россия), и инкубировали при комнатной температуре до появления окраски. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл серной кислоты. Реакцию учитывали с помощью фотометра BioRad iMark Microplate Absorbance Reader (США), данные анализировали с помощью программы Zemfira 4.0 (США).

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (версия 8.4.3 GraphPad Software, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью одномерного критерия Краскела-Уоллиса. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p ≤ 0,05. Данные на гистограммах показывают среднее значение и стандартную ошибку среднего.

Результаты

Получение фидерной линии, экспрессирующей поверхностный CD40L

В клетки HEK293, K562 и A549 с помощью ленти-вирусного вектора вводили ген CD40L. После селекции в среде с пуромицином трансдуцированные клетки демонстрировали высокий уровень экспрессии поверхностного CD40L. По данным проточной цитометрии его экспрессировали более 80 % клеток A549 (рис. 1). Исходя из ростовых свойств, а также способности ад-гезироваться на пластик мы выбрали линию A549, стабильно трансфецированную CD40L, которая получила название A549.40L и была использована во всех дальнейших экспериментах.

Рис. 1. Экспрессия CD40L на трансдуцированных клетках

Клетки K562 (А), A549 (Б) и HEK293T (В) окрашивали антителом против CD40L, а затем вторичными антителами против Ig мыши мечеными FITC. В негативном контроле клетки окрашивали только вторичными антителами.

Пролиферация В-лимфоцитов при ИЛ-21/CD40L-стимуляции in vitro

Используя иммуномагнитную сепарацию из популяции мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров выделяли В-лимфоциты и рассе-вали их в лунки 96-луночного планшета по 10 000 клеток на лунку. В опытные лунки предварительно сеяли фидерные клетки A549.40L по 10 000 клеток на лунку, которые для предотвращения собственной пролиферации были предварительно обработаны митомицином. В опытные лунки добавляли ИЛ-21 до концентрации 25 нг/мл. В контрольных лунках, которые не содержали ни фидерных клеток, ни ИЛ-21, лимфоциты не росли и погибали к 3-му дню культивирования. Обработанные митомицином фидерные клетки также погибали в течение 3-4 дней. В опытных лунках отчетливо наблюдался активный рост В-лимфоцитов. Для того чтобы оценить пролиферативный потенциал В-лимфоцитов, на 4, 8 и 12-й день делали рестимуляцию. Для этого 10 000 стимулированных лимфоцитов вносили в новые лунки 96-луночного планшета. Лунки для рестимуляции содержали свежепосеянные фидерные клетки (10 000 клеток на лунку) и ИЛ-21 (25 нг/мл). Динамика роста В-лимфоцитов для одного из доноров приведена на рис. 2А. К 4-му дню стимуляции количество В-лимфоцитов увеличивалось примерно в 2 раза. Максимальный рост В-лимфоцитов отмечался на 8-й день стимуляции, когда после пересева к 8-му дню количество В-лимфоцитов увеличивалось примерно в 4-5 раз. При рестимуляции на 12-й день В-клетки практически переставали делиться и примерно к 15-му дню В-лимфоциты погибали (см. рис. 2А). Используя эту схему, было проведено 9 независимых экспериментов по стимуляции В-лимфоцитов от разных доноров, которые подтвердили обнаруженные закономерности роста при ИЛ-21/СD40L-стимуляции (рис. 2Б).

Рис. 2. Увеличение количества лимфоцитов при стимуляции с помощью ИЛ-21/CD40L

А - динамика роста В-лимфоцитов в одном эксперименте при рестимуляции на 4, 8 и 12-й дни; Б - результаты 9 независимых экспериментов при рестимуляции на 4-й и 7-й дни. Здесь и на рис. 4-7 приведены средние значения ± стандарные отклонения. Звездочки показывают значимую разницу между группами, которую определяли с помощью одномерного критерия Краскела- Уоллиса; *- p < 0,03; **** - p < 0,0001; ns - недостоверное отличие.

Изменение фенотипа В-лимфоцитов при ИЛ-21/СD40L-стимуляции in vitro

При ИЛ-21/СD40L-стимуляции изменялась морфология В-лимфоцитов. Если до стимуляции они имели шарообразную форму, то после стимуляции они приобретали неправильную форму с псевдоподиями, группировались вокруг фидерных клеток A549.40L и начинали активно передвигаться (рис. 3).

Рис. 3. Микроскопия В-лимфоцитов А549.40L, стимулированных in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L

Представлены два репрезентативных поля. Изображения получены с помощью инвертированного микроскопа Olympus IX71, объектив 60×.

В процессе стимуляции HH-21/CD40L В-лимфоциты изменяли свой поверхностный фенотип. Свежевыделенные или стимулированные В-лимфоциты окрашивали следующими комбинациями антител: IgG-FITC/CD27-PC5.5/CD38-PC7, CD19-PE/anti-IgM-FITC/CD27-PC5.5/CD38-PC7, CD19-PE/CD20-FITC/CD27-PC5.5/CD38-PC7. На 4-й день стимуляции появлялась субпопуляция CD27+CD38+-В-лимфоцитов и процент этих клеток продолжал расти в ходе стимуляции, достигая максимума на 10-й день (рис. 4). По своему фенотипу эти клетки соответствовали плазмабластам и плазматическим клеткам [20].

Рис. 4. Увеличение процента плазмабластов и плазматических клеток при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов

Свежевыделенные или симулированные В-лимфоциты окрашивали антителами CD19-PE, CD27-PC5.5 и CD38-PC7 и анализировали на проточном цитометре. Указан процент CD27+CD38+-клеток относительно всех В-лимфоцитов. ** - p < 0,002.

Кроме того, CD27+CD38+-В-лимфоциты либо утрачивали экспрессию CD20, либо экспрессировали его на низком уровне по сравнению с нестимулированными В-лимфоцитами (рис. 5).

Рис. 5. Снижение процента В-клеток, экспрессирующих поверхностный CD20, при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов

Свежевыделенные или симулированные В-лимфоциты окрашивали антителами CD20-FITC, CD19-PE, CD27-PC5.5 и CD38-PC7 и процент CD20+CD27+CD38+-В-лимфоцитов определяли с помощью проточной цитометрии.

В ходе эксперимента наблюдалось снижение доли клеток, несущих поверхностный IgG или IgM, но в то же время увеличивался процент лимфоцитов с внутриклеточным окрашиванием IgG, что косвенно может свидетельствовать о секреции IgG (рис. 6).

Рис. 6. Снижение процента В-клеток, экспрессирующих поверхностный IgM и IgG, при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов

Свежевыделенные или стимулированные В-лимфоциты окрашbвали антителами CD19-PE, анти-IgM-FITC (А) или CD19-PE, анти-IgG-FITC (Б) и процент позитивных клеток определяли с помощью проточной цитометрии.

Секреция IgM и IgG в культурах В-лимфоцитов при ИЛ-21/СD40L-стимуляции in vitro

Чтобы подтвердить предположение о том, что ИЛ-21/CD40L-стимуляция индуцирует секрецию Ig, супернатанты В-клеточных культур на 4, 7 и 10-й дни были тестированы методом иммуноферментного анализа на наличие IgM и IgG. При стимуляции уровень иммуноглобулинов IgM и IgG возрастал по сравнению с культурой В-лимфоцитов без ИЛ-21/CD40L-стимуляции (рис. 7). Секреция IgM находилась на более высоком уровне, чем секреция IgG.

Рис. 7. Секреция IgM и IgG при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов in vitro

Секрецию IgM (А) и IgG (Б) определяли на 4, 7 и 10-й дни культивирования В-лимфоцитов. В качестве отрицательного контроля использовали супернатанты, полученные на 4-й день культивирования от лимфоцитов без ИЛ-21/CD40L-стимуляции.

Обсуждение

Нами были получены 3 линии фидерных клеток, которые стабильно трансфецированы геном CD40L. Все полученные клетки обладали высокой экспрессией поверхностного CD40L. Клетки К562 являются суспензионными, а клетки HEK293T слабо адгезируются к культуральному пластику. Это создает некоторые неудобства при пересеве и рестимуляции В-лимфоцитов. В отличие от этого клетки А549 хорошо адгезируются, поэтому при пересеве В-лимфоцитов они оставались в исходной лунке. С использованием фидерных клеток A549.40L в сочетании с экзогенным рекомбинантным ИЛ-21 нами был отработан протокол стимуляции В-лимфоцитов, выделенных из периферической крови человека. Использованная система стимуляции обеспечивала устойчивый рост В-лимфоцитов в течение первых 8 дней культивирования in vitro. За это время количество В-лимфоцитов в среднем увеличивалось в 8 раз. Это соответствует одному клеточному делению примерно 1 раз в каждые 2,3 дня. ИЛ-21/CD40L-стимуляция вызывала изменение морфологии В-лимфоцитов и их поверхностного фенотипа. Заметное количество клеток приобретало фенотип плазмабластов, который характеризовался совместной экспрессией маркеров CD27 и CD38 при снижении экспрессии маркера CD20. Стимулированные В-лимфоциты начинали секретировать заметные количества IgG и IgM.

Таким образом, в результате HH-21/CD40L-стимуляции образуются активированные В-лимфоциты, которые можно использовать для решения различных задач. Стимулированные В-лимфоциты в отличие от наивных В-клеток, а также от покоящихся В-клеток памяти, начинают секретировать антитела, что делает возможным определение антиген-специфического ответа. Количество антиген-специфических лимфоцитов можно определять методом ELISpot, а уровень секреции Ig - с помощью иммуноферментного анализа.

При ИЛ-21/CD40L-стимуляции в активированных В-клетках запускается активный синтез антител, который сопровождается повышением уровня мРНК, кодирующей Ig. Это в значительной мере упрощает амплификацию и последующее секвенирование генов Ig из единичных В-клеток. Таким образом, ИЛ-21/CD40L-стимулированные лимфоциты являются удобным объектом для определения полных последовательностей ДНК сопряженных легких и тяжелых цепей Ig и для создания на их основе новых человеческих моноклональных антител.

При ИЛ-21/CD40L-стимуляции пролиферативный потенциал В-клеток к 12-му дню исчерпывался и клетки погибали в результате апоптоза. Этот предел можно преодолеть путем репрограммирования В-клеток при введении генов транскрипционных факторов BCL6 и BCL-XL [21, 22]. Фактор BCL6 удерживает В-клетки на стадии плазмабластов, а фактор BCL-XL препятствует вхождению их в апоптоз. С помощью репрограммирования В-клеток были получены иммортализованные клоны В-лимфоцитов, которые секретировали человеческие моноклональные антитела против возбудителя столбняка и вируса гриппа, а также респираторно-синцитиального вируса и парэховируса [23]. Отработанную нами процедуру ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-клеток можно рассматривать как необходимый этап в создании иммортализованных клонов В-лимфоцитов.

Отработанный протокол стимуляции В-лимфоцитов был использован нами для определения коронавирус-специфических В-клеток памяти, образующихся во время острой фазы SARS-CoV-2-инфекции [24], а также для оценки уровня вирус-нейтрализующих антител, которые секретировали активированные В-клетки памяти.

Заключение

Таким образом, нами были получены фидерные клетки, экспрессирующие молекулу CD40L, и отработан протокол стимуляции В-лимфоцитов in vitro в присутствии экзогенного ИЛ-21 и фидерных клеток. Протокол обеспечивал получение активированных В-лимфоцитов, которые могут использоваться в других приложениях.

Вклад авторов

Сбор и обработка материала - Бязрова М.Г., Спиридонова А.Б., Астахова Е.А., Васильева Ю.В.; написание текста, редактирование - Бязрова М.Г., Прилипов А.Г., Филатов А.В.; окончательный вариант и целостность текста - Филатов А. В.

Литература

1. Gearhart P.J., Mock B.A., Casellas R., Cancro M.P. The reign of antibodies: A celebration of and tribute to Michael Potter and his homogeneous immunoglobulin workshops. J. Immunol. 2018; 200: 23-6. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.1701516.

2. Köhler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 1975; 256: 495-7. DOI: https://www.doi.org/10.1038/256495a0.

3. Küppers R. B cells under influence: transformation of B cells by Epstein-Barr virus. Nat. Rev. Immunol. 2003; 3: 801-2. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nri1201.

4. Nilsson K. Human B-lymphoid cell lines. Hum. Cell. 1992; 5: 25-41. PMID: 1329931.

5. Crain M.J., Sanders S.K., Butler J.L., Cooper M.D. Epstein-Barr virus preferentially induces proliferation of primed B cells. J. Immunol. 1989; 143: 1543-8. PMID: 2547870.

6. Laffly E., Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after. Hum. Antibodies. 2005; 14: 33-55. PMID: 16424599.

7. O’Nions J., Allday M.J. Proliferation and differentiation in isogenic populations of peripheral B cells activated by Epstein-Barr virus or T cell-derived mitogens. J. Gen. Virol. 2004; 85: 881-95. DOI: https://www.doi.org/10.1099/vir.0.19704-0.

8. Steinitz M. Production of human monoclonal antibodies by the Epstein-Barr virus method. In: Steinitz M (ed). Methods Mol. Biol. Humana Press: Totowa, N.J. 2014; 1060: 111-22. DOI: https://www.doi.org/10.1007/978-1-62703-586-6_6.

9. Mossalayi M.D., Lecron J.C., Tanzer J., Goube de Laforest P. Relationship between IL-2 and human T cell colony formation. Clin. Exp. Immunol. 1986; 66: 532-8. PMID: 3494553.

10. Rohaan M.W., van den Berg J.H., Kvistborg P., Haanen J.B.A.G. Adoptive transfer of tumor-infiltrating lymphocytes in melanoma: a viable treatment option. J. Immunother. Cancer. 2018; 6: 102. DOI: https://www.doi.org/10.1186/s40425-018-0391-1.

11. Auladell M., Nguyen T.H., Garcillán B., Mackay F., Kedzierska K., Fox A. Distinguishing naïve-from memory-derived human B cells during acute responses. Clin. Transl. Immunol. 2019; 8. DOI: https://www.doi.org/10.1002/cti2.1090.

12. Banchereau J., Bazan F., Blanchard D., Briè F., Galizzi J.P., van Kooten C., Liu Y.J., Rousset F., Saeland S. The CD40 antigen and its ligand. Annu. Rev. Immunol. 1994; 12: 881-926. DOI: https://www.doi.org/10.1146/annurev.iy.12.040194.004313.

13. Huggins J., Pellegrin T., Felgar R.E., Wei C., Brown M., Zheng B., Milner E.C.B., Bernstein S.H., Sanz I., Zand M.S. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27− naive human B cells. Blood. 2007; 109: 1611-9. DOI: https://www.doi.org/10.1182/blood-2006-03-008441.

14. Wiesner M., Zentz C., Mayr C., Wimmer R., Hammerschmidt W., Zeidler R., Moosmann A. Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation. PLoS ONE. 2008; 3: e1464. DOI: https://www.doi.org/10.1371/journal.pone.0001464.

15. Филатов А.В., Лаврова О.И., Мазуров Д.В., Шевалье А.Ф. Экспрессия лимфоцитарного фосфатазо-ассоциированного белка на лимфоидных линиях человека. Иммунология. 2011; 32 (1): 30-4.

16. Filatov A.V., Krotov G.I., Zgoda V.G., Volkov Y. Fluorescent immunoprecipitation analysis of cell surface proteins: A methodology compatible with mass-spectrometry. J. Immunol. Meth. 2007; 319: 21-33. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.jim.2006.09.014.

17. Khvastunova A.N., Kuznetsova S.A., Al-Radi L.S., Vylegzhanina A.V., Zakirova A.O., Fedyanina O.S., Filatov A.V., Vorobjev I.A., Ataullakhanov F. Anti-CD antibody microarray for human leukocyte morphology examination allows analyzing rare cell populations and suggesting preliminary diagnosis in leukemia. Sci. Rep. 2015; 5: 12573. DOI: https://www.doi.org/10.1038/srep12573.

18. Berg E.A., Fishman J.B. Labeling antibodies with Cy5-phycoerythrin. Cold Spring Harb. Protoc. 2019; pdb.prot099317. DOI: https://www.doi.org/10.1101/pdb.prot099317.

19. Vira S., Mekhedov E., Humphrey G., Blank P.S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal. Biochem. 2010; 402: 146-50. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.ab.2010.03.036.

20. Лушова А.А., Жеремян Э.А., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Бязрова М.Г., Филатов А.В. Субпопуляции В-лимфоцитов: функции и молекулярные маркеры Иммунология. 2019; 40 (6): 63-76. DOI: https://www.doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16009.

21. Kwakkenbos M.J., Bakker A.Q., van Helden P.M., Wagner K., Yasuda E., Spits H., Beaumont T. Genetic manipulation of B cells for the isolation of rare therapeutic antibodies from the human repertoire. Methods. 2014; 65: 38-43. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.ymeth.2013.07.002.

22. Kwakkenbos M.J., Diehl S.A., Yasuda E., Bakker A.Q., van Geelen C.M.M., Lukens M.V. van Bleek G.M., Widjojoatmodjo M.N., Bogers W.M.J.M., Mei H., Radbruch A., Scheeren F.A., Spits H., Beaumont T. Generation of stable monoclonal antibody-producing B cell receptor-positive human memory B cells by genetic programming. Nat. Med. 2010; 16: 123-8. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nm.2071.

23. Kwakkenbos M.J., Helden P.M., Beaumont T., Spits H. Stable longterm cultures of selfrenewing B cells and their applications. Immunol. Rev. 2016; 270: 65-77. DOI: https://www.doi.org/10.1111/imr.12395.

24. Болдырева М.Н. Вирус SARS-CoV-2 и другие эпидемические коронавирусы: патогенетические и генетические факторы развития инфекций. Иммунология. 2020; 41 (3): 197-205. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-3-197-205.

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Рахим Мусаевич
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, научный руководитель ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, главный аллерголог-иммунолог Минздрава России
Медицина сегодня
"ХИРУРГИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА И БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ЛЕЧЕНИЯ РАН И ГНОЙНО-НЕКРОТИЧЕСКИХ ОЧАГОВ У ДЕТЕЙ И ВЗРОСЛЫХ"

Глубокоуважаемые коллеги! 17 - 18 мая 2021 года РОО "Хирургическое общество - Раны и раневые инфекции" Société Française et Francophone des Plaies et Cicatrisations Sociedad Iberolatinoamericana Úlceras y Heridas ГБУЗ "НИИ неотложной детской хирургии и...

XI Съезд онкологов России.

13-15 мая 2021 года в Ярославле состоится XI Съезд онкологов России 13-15 мая в Ярославле состоится XI съезд онкологов России. Несмотря на неблагоприятную эпидемиологическую обстановку, организаторы посчитали возможным провести реальную встречу с соблюдением всех мер...

Международная промышленная академия, 26-27 мая 2021 г.

"50 процентов нашего здоровья зависит от питания" В.А. Тутельян, академик РАН, научный руководитель ФИЦ питания и биотехнологии III БИЗНЕС-ФОРУМ "РАЗВИТИЕ ПРОИЗВОДСТВА ОБОГАЩЕННОЙ И СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОЙ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ. НОВЫЙ ФОРМАТ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИНДУСТРИИ И МЕДИЦИНЫ"...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»