Введение
Трудно переоценить роль, которую культуры клеток и клеточных линий сыграли в изучении физиологии человека и млекопитающих. Это утверждение в полной мере относится к вкладу, который клеточные линий внесли в исследования В-лимфоцитов. Наиболее очевидным примером из этой области является использование так называемых плазмацитом MOPC (mineral oil-induced plasmacytomas) [1]. С их помощью были получены первые препараты моноклональных иммуноглобулинов, изучена структура и некоторые функции этих молекул. С помощью MOPC расшифрованы механизмы перестройки генов Ig. Наконец, гибридомная технология стала возможна благодаря использованию одного из вариантов MOPC [2]. К сожалению, эффективного партнера для слияния с В-клетками человека так и не найдено, несмотря на значительные усилия, затраченные в этом направлении. Полезными моделями В-клеток человека являются также многочисленные линии клеток, полученные из лимфом Беркитта и ходжкинских лимфом. Однако подобные линии клеток образуются спонтанно и их нельзя получать контролируемым образом из заранее определенных популяций клеток. В этом отношении выгодно отличаются линии клеток, получаемые путем иммортализа-ции с помощью вируса Эпштейна-Барр [3, 4]. Однако В-клетки, трансформированные этим вирусом, характеризуются ограниченным потенциалом роста, низкой эффективностью клонирования и невысоким уровнем продукции Ig, который быстро падает при культивировании [5-8].
Идеальным решением могла бы стать разработка метода получения клонов В-клеток, подобного тому, который существует для Т-лимфоцитов [9]. Периодическая рестимуляция Т-клеток дает возможность клонировать Т-лимфоциты и наращивать Т-клетки практически в неограниченных количествах. Полученные таким образом клоны Т-лимфоцитов с успехом используются не только в научных исследованиях, но также для иммунотерапии опухолей [10]. Однако этот подход сталкивается с многочисленными трудностями. Это связано с тем, что для стимуляции и пролиферации В-лимфоцитов требуется более широкий спектр стимулов. С переменным успехом для стимуляции роста В-лимфоцитов использовали самые разнообразные активаторы, начиная от различных интерлейкинов (ИЛ) (ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10) и заканчивая лигандами Toll-подобных рецепторов - TLR7/8 (R848) или TLR9 (CpG), а также золотистым стафилококком или антителами против Ig [11-13].
Наиболее привлекательной системой для активации В-лимфоцитов представляется комбинация ИЛ-21 и лиганда рецептора CD40, поскольку именно эти стимулы принимают участие в активации В-клеток при иммунном ответе, который развивается в зародышевых центрах лимфоузлов [12]. В качестве агонистов молекулы CD40 использовались антитела против этого рецептора, а также растворимые формы его натурального лиганда CD40L [14]. Основной проблемой при таком подходе являлась необходимость гексамеризации растворимых форм агонистов CD40. Это условие в наиболее полной мере достигается, когда CD40L находится на поверхности фидерной клетки, с которой взаимодействует В-лимфоцит.
Целями данного исследования являлись получение фидерных клеток, несущих поверхностный CD40L, отработка протокола стимуляции В-лимфоцитов человека in vitro с помощью nn-21/CD40L, а также характеристика стимулированных В-лимфоцитов.
Материал и методы
Выделение лимфоцитов. В исследовании приняли участие 10 здоровых добровольцев в возрасте от 25 до 42 лет. Все добровольцы дали информированное согласие на проведение исследования. Периферическую венозную кровь собирали в гепаринизированные вакуумные пробирки. Мононуклеарные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколл-верографина (ρ = 1,077 г/см3). Эритроциты лизировали с помощью раствора FACS Lysis buffer (BD, США). В-лимфоциты выделяли из фракции мононукле-арных клеток путем отрицательной селекции с использованием набора для магнитной сортировки Dynabeads Untouched human B-cell kit (Thermo Fisher Scientific, США). Чистота выделенных В-лимфоцитов составляла не менее 98 %.
Получение фидерных клеток, стабильно экспрессирующих CD40L. Фидерные клетки получали путем лентивирусной трансдукции [15]. Для получения лентивируса клетки HEK293T сеяли по 0,7 млн в лунку 6-луночного планшета за день до проведения трансфекции. На следующий день упаковочные плазмиды pCMV-VSV-G (0,45 мкг), pCMV-A8.2R (1,45 мкг), а также трансферную плазмиду EX-G0117-Lv105 (2,2 мкг), кодирующую CD40L, разводили стерильной водой до 112,5 мкл. К полученному раствору плазмид добавляли 12,5 мкл 2,5 мМ CaCl2 и 125 мкл раствора, содержавшего 50 мМ HEPES, 1,5 мМ Na2HPO4, 280 мМ NaCl, 10 мM KCl и 12 мM сахарозы. Полученную смесь общим объемом 250 мкл распределяли по поверхности лунки, перемешивая содержимое несколькими орбитальными движениями. Через 5-8 ч среду меняли на свежую.
Через 2 дня после трансфекции супернатант культуры клеток HEK293T собирали, фильтровали через 0,45 мкм фильтр и центрифугировали при 30 000 g 2 ч 30 мин при температуре 4 °C. Осадок суспендировали в 200 мкл среды, делали несколько последовательных разведений с 2-кратным шагом и добавляли к клеткам HEK293T, K562 или A549 для трансдукции. За 1 день до трансдукции клетки-мишени высевали в объеме 250 мкл в лунки 24-луночного планшета по 0,1 млн/лунку. Трансдуценты отбирали культивированием в селективной среде, содержавшей 10 мкг пуромицина.
Стимуляция лимфоцитов in vitro. Фидерные клетки в течении 2,5 часов обрабатывали 10 мкг/мл митомицина-С ("Kyowa Hakko Kogyo Co.", Япония), после чего клетки 4 раза отмывали в среде DMEM и сеяли по 10 000 клеток на лунку в 96-луночный планшет. Выделенные В-лимфоциты добавляли в лунки с фидерными клетками по 10 000 клеток на лунку. В-лимфоциты культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (все "ПанЭко", Россия) и 25 нг/мл ИЛ-21 (Peprotech, США) при 37 °C в 5 % CO2. При рестимуляции лимфоциты собирали, подсчитывали концентрацию и высевали на новые лунки со свежими фидерными клетками и свежей порцией ИЛ-21.
Проточная цитометрия. Эксперименты по проточной цитометрии проводили на свежевыделенных В-лимфоцитах или B-клетках после стимуляции in vitro в системе ИЛ-21/CD40L с использованием проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного двумя диодными лазерами - 488 нм и 561 нм. Для окрашивания лимфоцитов использовали следующие антитела: CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), против человеческого IgG-FITC (клон CH1) и IgM-FITC (клон MA2). Указанные антитела были получены в нашей лаборатории [16, 17] и коньюгированы с соответствующими красителями по ранее описанному методу [18,19]. Для определения экспрессии маркера CD40L использовали антитело CD154 (клон 24-31, Exbio, Чехия). Окрашивание производили в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки 2 раза отмывали в физиологическом растворе забуференном фосфатами. Перед измерением клеточную суспензию пропускали через ситечко с диаметром пор 40 мкм. Цитофлуориметрические данные обрабатывали при помощи программы FlowJo (США).
Определение Ig методом иммуноферментного анализа (ИФА). Антитела против человеческого IgG (клон 2A11) и IgM (клон CH2) в концентрации 10 мкг/мл сорбировали в лунках 96-луночных планшетов (Greiner, ФРГ), внося в лунку по 100 мкл раствора антител в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ). Планшеты инкубировали ночь при 4 °С, после чего трижды отмывали буфером PBS/Tween20. Лунки блокировали добавлением ФСБ, содержавшего 1 % бычьего сывороточного Ig, инкубировали в течение часа и 3 раза отмывали c помощью ФСБ с добавлением 0,1 % Твин 20 (ФСБ-Т). Тестируемые препараты разводили буфером для разведения антител, вносили в лунки планшета по 100 мкл и инкубировали в течение 1 ч. После инкубации лунки планшета отмывали три раза буфером ФСБ-Т. Для детекции IgM и IgG использовали вторичные антитела анти-IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (клоны MA2 и СH1 соответственно). После инкубации в течении 1 ч лунки промывали 3 раза с помощью ФСБ-Т, добавляли в лунки по 100 мкл раствора тетраметилбензидина ("Хема Медика", Россия), и инкубировали при комнатной температуре до появления окраски. Реакцию останавливали добавлением 50 мкл серной кислоты. Реакцию учитывали с помощью фотометра BioRad iMark Microplate Absorbance Reader (США), данные анализировали с помощью программы Zemfira 4.0 (США).
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (версия 8.4.3 GraphPad Software, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью одномерного критерия Краскела-Уоллиса. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p ≤ 0,05. Данные на гистограммах показывают среднее значение и стандартную ошибку среднего.
Результаты
Получение фидерной линии, экспрессирующей поверхностный CD40L
В клетки HEK293, K562 и A549 с помощью ленти-вирусного вектора вводили ген CD40L. После селекции в среде с пуромицином трансдуцированные клетки демонстрировали высокий уровень экспрессии поверхностного CD40L. По данным проточной цитометрии его экспрессировали более 80 % клеток A549 (рис. 1). Исходя из ростовых свойств, а также способности ад-гезироваться на пластик мы выбрали линию A549, стабильно трансфецированную CD40L, которая получила название A549.40L и была использована во всех дальнейших экспериментах.
Рис. 1. Экспрессия CD40L на трансдуцированных клетках
Клетки K562 (А), A549 (Б) и HEK293T (В) окрашивали антителом против CD40L, а затем вторичными антителами против Ig мыши мечеными FITC. В негативном контроле клетки окрашивали только вторичными антителами.
Пролиферация В-лимфоцитов при ИЛ-21/CD40L-стимуляции in vitro
Используя иммуномагнитную сепарацию из популяции мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров выделяли В-лимфоциты и рассе-вали их в лунки 96-луночного планшета по 10 000 клеток на лунку. В опытные лунки предварительно сеяли фидерные клетки A549.40L по 10 000 клеток на лунку, которые для предотвращения собственной пролиферации были предварительно обработаны митомицином. В опытные лунки добавляли ИЛ-21 до концентрации 25 нг/мл. В контрольных лунках, которые не содержали ни фидерных клеток, ни ИЛ-21, лимфоциты не росли и погибали к 3-му дню культивирования. Обработанные митомицином фидерные клетки также погибали в течение 3-4 дней. В опытных лунках отчетливо наблюдался активный рост В-лимфоцитов. Для того чтобы оценить пролиферативный потенциал В-лимфоцитов, на 4, 8 и 12-й день делали рестимуляцию. Для этого 10 000 стимулированных лимфоцитов вносили в новые лунки 96-луночного планшета. Лунки для рестимуляции содержали свежепосеянные фидерные клетки (10 000 клеток на лунку) и ИЛ-21 (25 нг/мл). Динамика роста В-лимфоцитов для одного из доноров приведена на рис. 2А. К 4-му дню стимуляции количество В-лимфоцитов увеличивалось примерно в 2 раза. Максимальный рост В-лимфоцитов отмечался на 8-й день стимуляции, когда после пересева к 8-му дню количество В-лимфоцитов увеличивалось примерно в 4-5 раз. При рестимуляции на 12-й день В-клетки практически переставали делиться и примерно к 15-му дню В-лимфоциты погибали (см. рис. 2А). Используя эту схему, было проведено 9 независимых экспериментов по стимуляции В-лимфоцитов от разных доноров, которые подтвердили обнаруженные закономерности роста при ИЛ-21/СD40L-стимуляции (рис. 2Б).
Рис. 2. Увеличение количества лимфоцитов при стимуляции с помощью ИЛ-21/CD40L
А - динамика роста В-лимфоцитов в одном эксперименте при рестимуляции на 4, 8 и 12-й дни; Б - результаты 9 независимых экспериментов при рестимуляции на 4-й и 7-й дни. Здесь и на рис. 4-7 приведены средние значения ± стандарные отклонения. Звездочки показывают значимую разницу между группами, которую определяли с помощью одномерного критерия Краскела- Уоллиса; *- p < 0,03; **** - p < 0,0001; ns - недостоверное отличие.
Изменение фенотипа В-лимфоцитов при ИЛ-21/СD40L-стимуляции in vitro
При ИЛ-21/СD40L-стимуляции изменялась морфология В-лимфоцитов. Если до стимуляции они имели шарообразную форму, то после стимуляции они приобретали неправильную форму с псевдоподиями, группировались вокруг фидерных клеток A549.40L и начинали активно передвигаться (рис. 3).
Рис. 3. Микроскопия В-лимфоцитов А549.40L, стимулированных in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L
Представлены два репрезентативных поля. Изображения получены с помощью инвертированного микроскопа Olympus IX71, объектив 60×.
В процессе стимуляции HH-21/CD40L В-лимфоциты изменяли свой поверхностный фенотип. Свежевыделенные или стимулированные В-лимфоциты окрашивали следующими комбинациями антител: IgG-FITC/CD27-PC5.5/CD38-PC7, CD19-PE/anti-IgM-FITC/CD27-PC5.5/CD38-PC7, CD19-PE/CD20-FITC/CD27-PC5.5/CD38-PC7. На 4-й день стимуляции появлялась субпопуляция CD27+CD38+-В-лимфоцитов и процент этих клеток продолжал расти в ходе стимуляции, достигая максимума на 10-й день (рис. 4). По своему фенотипу эти клетки соответствовали плазмабластам и плазматическим клеткам [20].
Рис. 4. Увеличение процента плазмабластов и плазматических клеток при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов
Свежевыделенные или симулированные В-лимфоциты окрашивали антителами CD19-PE, CD27-PC5.5 и CD38-PC7 и анализировали на проточном цитометре. Указан процент CD27+CD38+-клеток относительно всех В-лимфоцитов. ** - p < 0,002.
Кроме того, CD27+CD38+-В-лимфоциты либо утрачивали экспрессию CD20, либо экспрессировали его на низком уровне по сравнению с нестимулированными В-лимфоцитами (рис. 5).
Рис. 5. Снижение процента В-клеток, экспрессирующих поверхностный CD20, при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов
Свежевыделенные или симулированные В-лимфоциты окрашивали антителами CD20-FITC, CD19-PE, CD27-PC5.5 и CD38-PC7 и процент CD20+CD27+CD38+-В-лимфоцитов определяли с помощью проточной цитометрии.
В ходе эксперимента наблюдалось снижение доли клеток, несущих поверхностный IgG или IgM, но в то же время увеличивался процент лимфоцитов с внутриклеточным окрашиванием IgG, что косвенно может свидетельствовать о секреции IgG (рис. 6).
Рис. 6. Снижение процента В-клеток, экспрессирующих поверхностный IgM и IgG, при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов
Свежевыделенные или стимулированные В-лимфоциты окрашbвали антителами CD19-PE, анти-IgM-FITC (А) или CD19-PE, анти-IgG-FITC (Б) и процент позитивных клеток определяли с помощью проточной цитометрии.
Секреция IgM и IgG в культурах В-лимфоцитов при ИЛ-21/СD40L-стимуляции in vitro
Чтобы подтвердить предположение о том, что ИЛ-21/CD40L-стимуляция индуцирует секрецию Ig, супернатанты В-клеточных культур на 4, 7 и 10-й дни были тестированы методом иммуноферментного анализа на наличие IgM и IgG. При стимуляции уровень иммуноглобулинов IgM и IgG возрастал по сравнению с культурой В-лимфоцитов без ИЛ-21/CD40L-стимуляции (рис. 7). Секреция IgM находилась на более высоком уровне, чем секреция IgG.
Рис. 7. Секреция IgM и IgG при ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-лимфоцитов in vitro
Секрецию IgM (А) и IgG (Б) определяли на 4, 7 и 10-й дни культивирования В-лимфоцитов. В качестве отрицательного контроля использовали супернатанты, полученные на 4-й день культивирования от лимфоцитов без ИЛ-21/CD40L-стимуляции.
Обсуждение
Нами были получены 3 линии фидерных клеток, которые стабильно трансфецированы геном CD40L. Все полученные клетки обладали высокой экспрессией поверхностного CD40L. Клетки К562 являются суспензионными, а клетки HEK293T слабо адгезируются к культуральному пластику. Это создает некоторые неудобства при пересеве и рестимуляции В-лимфоцитов. В отличие от этого клетки А549 хорошо адгезируются, поэтому при пересеве В-лимфоцитов они оставались в исходной лунке. С использованием фидерных клеток A549.40L в сочетании с экзогенным рекомбинантным ИЛ-21 нами был отработан протокол стимуляции В-лимфоцитов, выделенных из периферической крови человека. Использованная система стимуляции обеспечивала устойчивый рост В-лимфоцитов в течение первых 8 дней культивирования in vitro. За это время количество В-лимфоцитов в среднем увеличивалось в 8 раз. Это соответствует одному клеточному делению примерно 1 раз в каждые 2,3 дня. ИЛ-21/CD40L-стимуляция вызывала изменение морфологии В-лимфоцитов и их поверхностного фенотипа. Заметное количество клеток приобретало фенотип плазмабластов, который характеризовался совместной экспрессией маркеров CD27 и CD38 при снижении экспрессии маркера CD20. Стимулированные В-лимфоциты начинали секретировать заметные количества IgG и IgM.
Таким образом, в результате HH-21/CD40L-стимуляции образуются активированные В-лимфоциты, которые можно использовать для решения различных задач. Стимулированные В-лимфоциты в отличие от наивных В-клеток, а также от покоящихся В-клеток памяти, начинают секретировать антитела, что делает возможным определение антиген-специфического ответа. Количество антиген-специфических лимфоцитов можно определять методом ELISpot, а уровень секреции Ig - с помощью иммуноферментного анализа.
При ИЛ-21/CD40L-стимуляции в активированных В-клетках запускается активный синтез антител, который сопровождается повышением уровня мРНК, кодирующей Ig. Это в значительной мере упрощает амплификацию и последующее секвенирование генов Ig из единичных В-клеток. Таким образом, ИЛ-21/CD40L-стимулированные лимфоциты являются удобным объектом для определения полных последовательностей ДНК сопряженных легких и тяжелых цепей Ig и для создания на их основе новых человеческих моноклональных антител.
При ИЛ-21/CD40L-стимуляции пролиферативный потенциал В-клеток к 12-му дню исчерпывался и клетки погибали в результате апоптоза. Этот предел можно преодолеть путем репрограммирования В-клеток при введении генов транскрипционных факторов BCL6 и BCL-XL [21, 22]. Фактор BCL6 удерживает В-клетки на стадии плазмабластов, а фактор BCL-XL препятствует вхождению их в апоптоз. С помощью репрограммирования В-клеток были получены иммортализованные клоны В-лимфоцитов, которые секретировали человеческие моноклональные антитела против возбудителя столбняка и вируса гриппа, а также респираторно-синцитиального вируса и парэховируса [23]. Отработанную нами процедуру ИЛ-21/CD40L-стимуляции В-клеток можно рассматривать как необходимый этап в создании иммортализованных клонов В-лимфоцитов.
Отработанный протокол стимуляции В-лимфоцитов был использован нами для определения коронавирус-специфических В-клеток памяти, образующихся во время острой фазы SARS-CoV-2-инфекции [24], а также для оценки уровня вирус-нейтрализующих антител, которые секретировали активированные В-клетки памяти.
Заключение
Таким образом, нами были получены фидерные клетки, экспрессирующие молекулу CD40L, и отработан протокол стимуляции В-лимфоцитов in vitro в присутствии экзогенного ИЛ-21 и фидерных клеток. Протокол обеспечивал получение активированных В-лимфоцитов, которые могут использоваться в других приложениях.
Вклад авторов
Сбор и обработка материала - Бязрова М.Г., Спиридонова А.Б., Астахова Е.А., Васильева Ю.В.; написание текста, редактирование - Бязрова М.Г., Прилипов А.Г., Филатов А.В.; окончательный вариант и целостность текста - Филатов А. В.