Синергическое взаимодействие рецепторов NOD1 и TLR4 врожденного иммунитета: транскрипционные и метаболические аспекты

• Муругина Нина Евгеньевна
• Будихина Анна Сергеевна
• Максимчик Полина Валентиновна
• Дагиль Ю.А.
• Балясова Л.С.
• Муругин Владимир Владимирович
• Чкадуа Г.З.
• Пинегин Борис Владимирович
• Пащенков Михаил Владимирович

Резюме

Агонисты рецепторов NOD1 и TLR4 синергически активируют ряд функций макрофагов, в частности продукцию фактора некроза опухолей (TNF). В работе впервые изучены изменения метаболизма глюкозы в макрофагах при сочетанной стимуляции NOD1 и TLR4. Агонисты каждого названного рецептора (N-ацетил-D-мурамил-L-аланил-D-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота и липополисахарид, соответственно) увеличивали основные параметры гликолиза: скорость закисления внеклеточной среды, потребление глюкозы, высвобождение лактата. Изменения этих показателей при сочетанной стимуляции не превышали сумму изменений при раздельной стимуляции (аддитивные и инфрааддитивные взаимодействия). Наряду с этим при сочетанной стимуляции наблюдалось синергическое увеличение экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов в точках 4 и 9 ч после начала стимуляции. Таким образом, можно предположить, что метаболическая перестройка поддерживает синергическое увеличение синтеза цитокинов при одновременной стимуляции NOD1 и TLR4, однако первопричина этого синергизма заключается в увеличении длительности и/или амплитуды экспрессии генов цитокинов.

Ключевые слова:макрофаги; гликолиз; NOD1; TLR4; фактор некроза опухолей

Врожденная иммунная система определяет микробную инвазию с помощью паттерн-распознающих рецепторов (ПРР), агонистами которых являются консервативные структуры микробов - патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (ПАМП). Механизмы функционирования отдельно взятых ПРР за последние 20 лет изучены достаточно подробно, однако патогены, как правило, содержат несколько ПАМП, которые активируют несколько типов ПРР. Характер врожденного иммунного ответа при инфекциях определяется именно взаимодействиями ПРР [1].

Одним из распространенных вариантов взаимодействия между ПРР является синергизм, при котором ответ на сочетанную стимуляцию двух ПРР превышает сумму ответов на стимуляцию каждого ПРР по отдельности. В частности, хорошо описан синергизм между толл-подобными рецепторами (TLR), распознающими различные ПАМП бактериального и вирусного происхождения [2], и двумя представителями семейства NOD-подобных рецепторов - NOD1 и NOD2 (оба распознают фрагменты пептидогликана бактерий - мура-милпептиды) [3]. В совокупности эти рецепторы вносят основной вклад в распознавание бактериальных патогенов. Синергическая индукция цитокинов сочетаниями агонистов NOD1/NOD2 и TLR продемонстрирована как на моделях человеческих и мышиных клеток in vitro [4-11], так и на экспериментальных животных [12-14]. Введение мышам комбинации агониста NOD1 (лауроил-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновой кислоты) и TLR5 (фрагмента белка флагеллина) дает 80% защиту от летальной дозы высоковирулентной бактерии S. typhimurium, в то время как каждый компонент в отдельности защитным эффектом не обладает [14]. Кроме того, синергизм может играть роль и в патогенезе сепсиса, когда в тканевые жидкости и в кровоток высвобождаются чрезмерные количества агонистов TLR и NOD1/NOD2 [15]; синергическое взаимодействие этих агонистов может быть одной из причин гиперпродукции цитокинов, ведущей к развитию системного воспалительного синдрома в первой (гипервоспалительной) фазе сепсиса. Эти данные подчеркивают практическую значимость синергизма NOD-TLR. Однако необходимо отметить, что механизмы синергического взаимодействия NOD-TLR во многом остаются неясными.

При активации клеток врожденной иммунной системы происходит перестройка их метаболизма, или метаболическое репрограммирование, которое является базисом для других процессов, протекающих в активированных клетках [16, 17]. В частности, при активации макрофагов и дендритных клеток липополисахаридом (ЛПС), который является агонистом TLR4, наблюдается интенсификация гликолиза с переходом клеток на так называемый аэробный гликолиз [16, 18]. При аэробном гликолизе, несмотря на достаточное поступление кислорода в клетку, основным источником энергии является гликолиз (который не требует присутствия кислорода). Несмотря на более низкую энергоэффективность, реакции гликолиза генерируют АТФ быстрее, чем реакции окислительного фосфорилирования, а также являются поставщиками метаболитов в биосинтетические процессы, необходимые для синтеза регуляторных и эффекторных молекул [19, 20]. Аэробный гликолиз считается метаболической основой воспаления [16]. Однако вклад метаболического репрограммирования в синергические взаимодействия ПРР, в частности взаимодействия NOD-TLR, пока не известен.

Мы впервые изучили изменения метаболизма глюкозы в макрофагах при раздельной и сочетанной стимуляции агонистом рецептора NOD1 (N-ацетилмурамил-L-аланил-Э-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновой кислотой, или М-триДАП [3]) и агонистом TLR4 (ЛПС). Для более полного описания эффектов сочетанной стимуляции измеряли также секрецию TNF и экспрессию мРНК основных провоспалительных цитокинов.

Материал и методы

Реактивы. Рекомбинантный человеческий грануло-цитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) был закуплен у фирмы Miltenyi Biotec (ФРГ), М-триДАП - у Invivogen (США), ЛПС E. coli O111:B4, 2-дезоксиглюкоза (2-ДГ) и олигомицин - у Sigma (США). Полная культуральная среда (ПКС) представляла собой RPMI-1640 (Life Technologies, Великобритания) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Life Technologies) и 10% фетальной телячьей сыворотки (PAA, Австрия).

Получение и стимуляция макрофагов. Культуры макрофагов были получены путем 6-суточного культивирования моноцитов крови доноров с ГМ-КСФ, как описано ранее [21]. По истечении 6 сут клетки трипсинизировали, отмывали и подсчитывали. Для оценки продукции TNF клетки помещали в 96-луночные плоскодонные планшеты (SPL Life Sciences, Республика Корея) по 20 тыс. клеток на лунку, давали клеткам прикрепиться, после чего добавляли М-триДАП и/или ЛПС в различных концентрациях в дублях. Через 3 и 24 ч собирали супернатанты, в которых определяли уровни TNF, используя наборы реактивов для иммуноферментного анализа фирмы "Цитокин" (Санкт-Петербург, Россия).

Исследование потребления глюкозы и высвобождения лактата. Трипсинизированные макрофаги помещали в 24-луночные планшеты в количестве 250 тыс. клеток в 500 мкл ПКС на лунку, после чего добавляли растворы М-триДАП и ЛПС, приготовленные на ПКС. В лунки отрицательного контроля добавляли чистую ПКС. Планшеты инкубировали 24 ч при 37 °С в атмосфере 5% CO₂, после чего собирали супернатанты. Концентрацию глюкозы в супернатантах и в ПКС определяли на биохимическом анализаторе Synchron CX5 Pro (Beckman Coulter, США). Потребление глюкозы одной клеткой за 24 ч рассчитывали по формуле ПГ = (C_ПКС −C_{супернатант}) · 5·10⁻⁴ / 250 000, где 5·10⁻⁴ - объем культуры (в литрах), 250 000 - количество клеток в культуре. Результаты нормализовали по количеству клеточного белка, принимая количество белка в нестимулированной лунке в данном опыте за 100%. Концентрации лактата измеряли колориметрическим методом с помощью набора реактивов фирмы Biovision (США). Высвобождение лактата в расчете на клетку вычисляли аналогично потреблению глюкозы.

Анализ клеточного метаболизма в реальном времени. Скорость закисления внеклеточной среды (extracellular acidification rate - ECAR) и скорость потребления кислорода (oxygen consumption rate - OCR) измеряли на приборе Seahorse XFe96 Analyzer (Agilent Technologies, США). ECAR и OCR отражают интенсивность, соответственно, гликолиза и митохондриального дыхания. Изменения pH и содержания кислорода фиксируются чувствительными датчиками в тонком слое среды, прилегающем к клеточному монослою. Макрофаги высевали в планшеты Seahorse XF96 (Agilent) в количестве 16 000 клеток на лунку в 80 мкл ПКС. Наутро производили замену ПКС на специальную среду, представляющую собой XF base medium (Agilent) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 11 мМ D-глюкозы (Sigma) и 10% фетальной телячьей сыворотки. После уравновешивания pH в инкубаторе с атмосферным воздухом планшеты переносили в прибор. ECAR и OCR измеряли каждые 9 мин (продолжительность измерений - 3 мин). После 3 базальных измерений впрыскивали стимуляторы (растворы М-триДАП, ЛПС или среду) и делали еще 22 измерения. Результаты нормализовали по клеточному белку. Вычисляли площади под кривыми "время-ответ" (AUC) после добавления стимуляторов.

Исследование экспрессии генов с помощью полимеразной цепной реакции обратного транскрипта в реальном времени (ПЦР-РВ). Экспрессию генов TNF, ИЛ-6 и ИЛ-1 в, в соответствии с международной номенклатурой генов в макрофагах анализировали с помощью ПЦР-РВ, как описано ранее [21]. Относительную экспрессию (ОЭ) генов рассчитывали по методу 2 ^-ΔΔCt. Референс-образцами, в которых ОЭ всех генов равнялась 1, служили нестимулированные клетки данного донора. В качестве нормировочного гена использовали GAPDH.

Вестерн-блоттинг. Методика подробно описана ранее [21]. Для определения фосфорилированных форм протеинкиназ Akt (pT308 и pS473), p70-S6K (pT389), p38 (pT180/pY182), MNK (pT197/pT202) и фосфорилированной формы фактора инициации трансляции eIF4E (pS209) использовали поликлональные кроличьи антитела производства Cell Signaling Technologies (США), для определения фосфорилированной ERK1/2 (pT202/ pY204) - мышиные моноклональные антитела той же фирмы. А-тубулин определяли с помощью мышиных моноклональных антител (клон DM1A) производства Novus Biologicals (США). Денситометрический анализ выполняли с помощью программы ImageJ (США). Интенсивности специфических полос нормализовали по α-тубулину. Относительные уровни белков рассчитывали как отношение нормализованных интенсивностей полос в стимулированных и в нестимулированных клетках.

Обработка данных и статистический анализ. Для оценки взаимодействия двух агонистов вычисляли индексы синергизма (ИС) по формуле:

ИС = Ответ (C1, C2) / [Ответ (C1) + Ответ (C2)],

где Ответ (C1, С2) - ответ клеток на стимуляцию сочетанием агонистов 1 и 2 в концентрациях C1 и C2 соответственно, Ответ (C1) и Ответ (C2) - ответы на стимуляцию агонистом 1 в концентрации C1 и агонистом 2 в концентрации C2. Взаимодействие считали синергическим при ИС > 1 с достоверностью p < 0,05 в t-тесте Стьюдента. Взаимодействие считали аддитивным при отсутствии достоверного отличия ИС от 1 (простая суммация эффектов агонистов). Взаимодействие считали инфрааддитивным, если эффект сочетания агонистов был меньше, чем сумма эффектов одиночных агонистов (ИС < 1 при p < 0,05), но не меньше, чем эффект любого одиночного агониста. Для статистического анализа использовали программу GraphPad Instat 3.06 (GraphPad Software, США).

Результаты

Продукция TNF при сочетанной стимуляции макрофагов агонистами NOD1 и TLR4. Уровни TNF в супернатантах макрофагов определяли через 3 и 24 ч после добавления М-триДАП и ЛПС в различных концентрациях раздельно и в сочетаниях. Как видно из рис. 1, А и табл. 1, через 3 ч после начала стимуляции имеет место простая суммация эффектов двух агонистов (аддитивное взаимодействие, ИС достоверно не отличаются от 1). Однако через 24 ч синергический эффект очевиден (ИС в большинстве случаев > 2; см. табл. 1). Таким образом, судя по продукции TNF, агонисты NOD1 и TLR4 взаимодействуют синергически, однако синергизм проявляется на относительно поздних сроках активации клетки.

Экспрессия TNF, ИЛ-6, ИЛ-1β - при сочетанной стимуляции агонистами NOD1 и TLR4. Далее изучали экспрессию мРНК TNF, ИЛ-6 и ИЛ-1β - в макрофагах при стимуляции М-триДАП, ЛПС и их сочетании. М-триДАП и ЛПС использовали в концентрациях, соответственно, 10 мкг/мл и 10 нг/мл (концентрации, дающие выраженный синергический эффект по продукции TNF, - см. рис. 1, А и табл. 1). Как видно из рис. 1, Б и табл. 2, через 1 ч после добавления стимуляторов синергическая индукция мРНК еще отсутствует, наблюдается простая суммация эффектов двух агонистов. Однако в более поздних точках (4 и 9 ч) наблюдается синергическое взаимодействие агонистов (см. табл. 2).

Таким образом, данные по экспрессии мРНК согласуются с данными по продукции TNF, учитывая, что наработка и секреция белкового продукта гена запаздывает по сравнению с экспрессией мРНК.

Изменения метаболизма глюкозы при стимуляции М-триДАП и ЛПС. В процессе гликолиза 1 молекула глюкозы расщепляется до 2 молекул пирувата. Последний частично или полностью превращается в лактат, который высвобождается из клетки, вызывая закисление внеклеточной среды. Динамику скорости закисления среды (ECAR) измеряли в течение ~ 3 ч с момента добавления М-триДАП и ЛПС. Оба агониста вызывали дозозависимое повышение (ECAR) (рис. 2, А, Б).

При сочетанной стимуляции синергический эффект наблюдался только при самых низких концентрациях (табл. 3). Во всех остальных случаях имели место аддитивные эффекты (ИС достоверно не отличался от 1) либо инфрааддитивные эффекты (ИС < 1 при p < 0,05). Достоверных изменений скорости потребления кислорода клетками за период наблюдения не происходило (данные не показаны).

Также изучали потребление глюкозы и высвобождение лактата - два основных биохимических показателя гликолиза - за 24-часовой период после добавления агонистов. Прирост этих показателей происходил как при раздельной, так и при сочетанной стимуляции, причем при сочетанной он более выражен, чем при раздельной (рис. 2, В, Г), однако синергического эффекта тоже не наблюдалось. Так, ИС для потребления глюкозы составил 0,76 ± 0,3, для высвобождения лактата - 1,26 ± 0,56; оба индекса достоверно не отличались от 1, что говорит о простой суммации эффектов. Следует отметить, что при том же сочетании концентраций М-триДАП и ЛПС (10 мкг/мл и 10 нг/мл) наблюдалось мощное синергическое усиление продукции TNF и экспрессии основных провоспалительных цитокинов (см. выше).

Активация киназ, регулирующих метаболизм. Также оценивали активацию некоторых сигнальных путей, регулирующих клеточный метаболизм. Так, сигнальный путь Akt-mTOR-p70 отвечает за усиление синтеза белка и интенсификацию гликолиза (переход на аэробный гликолиз) в активированных клетках [18, 22]. Сигнальные пути p38-MNK-eIF4E и ERK-MNK-eIF4E участвуют в активации синтеза белка [21, 23]. Уровни фосфорилированных форм Akt, p70, p38, ERK, MNK и eIF4E оценивали с помощью вестерн-блоттинга через 1 и 4 ч после добавления М-триДАП, ЛПС и их сочетания (рис. 3). Во всех случаях наблюдали либо аддитивные и инфрааддитивные взаимодействия (ИС < 1), либо отсутствие повышения фосфорилирования исследуемых белков при стимуляции; синергических эффектов не наблюдали.

Обсуждение

В настоящей работе взаимодействия между NOD1 и TLR4 изучены на нескольких уровнях, включая продукцию цитокинов, экспрессию генов цитокинов и регуляцию клеточного метаболизма. Судя по продукции TNF (см. рис. 1, А, табл. 1), агонисты NOD1 и TLR4 взаимодействуют синергически, однако синергический эффект развивается на относительно поздних сроках активации клетки, тогда как на более ранних сроках наблюдается суммация эффектов двух агонистов. Исходя из данных по экспрессии мРНК (см. рис. 1, Б, табл. 2) можно предполагать, что события, приводящие к синергической индукции выработки цитокинов при сочетанной стимуляции NOD1 и TLR4, происходят на уровне транскрипции мРНК цитокинов между 1 и 4 ч после начала стимуляции.

Врожденный иммунный ответ в первую очередь реализуется через синтез белковых молекул (цитокинов, антимикробных белков и т. д.), что требует усиления анаболических процессов. Агонисты NOD1 и TLR4 стимулируют аэробный гликолиз (см. рис. 2), который является поставщиком энергии, а также метаболитов для синтеза белка и фосфолипидных мембран [19]. Однако при сочетанной стимуляции агонистами NOD1 и TLR4 синергического усиления гликолиза в макрофагах не происходит, имеют место аддитивные или инфрааддитивные взаимодействия (т. е. ответ на сочетание агонистов равен или ниже суммы ответов на каждый агонист по отдельности). Эти результаты можно объяснить исходя из предположения, что у клеток имеется определенный метаболический потолок, который не может быть превышен, причем этот потолок достигается уже при раздельной стимуляции. Синергические эффекты отсутствуют и на уровне сигнальных путей, регулирующих гликолиз и обмен белка. Из совокупности полученных данных можно сделать вывод о том, что метаболическая перестройка поддерживает синергическое усиление синтеза цитокинов при сочетанной стимуляции NOD1 и TLR4, однако первопричина синергических эффектов заключается в синергическом увеличении экспрессии генов цитокинов при сочетанной стимуляции. Изучение механизмов, регулирующих транскрипционный ответ клетки при сочетанной стимуляции, является актуальной задачей.

Благодарность. Авторы выражают благодарность И. А. Суриной и Е.Н. Дроздовой (клинико-диагностическая лаборатория ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России) за помощь в определении глюкозы.

Литература

1. Trinchieri G., Sher A. Cooperation of Toll-like receptor signals in innate immune defence. Nat. Rev. Immunol. 2007; 7 (3): 179-90.

2. Beutler B. Inferences, questions and possibilities in Toll-like receptor signalling. Nature. 2004; 430 (6996): 257-63.

3. Girardin S.E., Travassos L.H., Herve M., Blanot D. et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41 702-8.

4. Netea M.G., Ferwerda G., de Jong D.J., Jansen T. et al. Nucleotidebinding oligomerization domain-2 modulates specific TLR pathways for the induction of cytokine release. J. Immunol. 2005; 174 (10): 6518-23.

5. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C. et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2-activating agonists. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70.

6. Kim Y.G., Park J.H., Shaw M.H., Franchi L. et al. The cytosolic sensors Nod1 and Nod2 are critical for bacterial recognition and host defense after exposure to Toll-like receptor ligands. Immunity. 2008; 28 (2): 246-57.

7. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K. et al. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2471-6.

8. van Heel D.A., Ghosh S., Hunt K.A., Mathew C.G. et al. Synergy between TLR9 and NOD2 innate immune responses is lost in genetic Crohn’s disease. Gut. 2005; 54 (11): 1553-7.

9. van Beelen A.J., Zelinkova Z., Taanman-Kueter E.W., Muller F.J. et al. Stimulation of the intracellular bacterial sensor NOD2 programs dendritic cells to promote interleukin-17 production in human memory T cells. Immunity. 2007; 27 (4): 660-9.

10. Tada H., Aiba S., Shibata K., Ohteki T. et al. Synergistic effect of Nod1 and Nod2 agonists with toll-like receptor agonists on human dendritic cells to generate interleukin-12 and T helper type 1 cells. Infect. Immun. 2005; 73 (12): 7967-76.

11. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., ЧулкинаМ. и др. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов различных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38 (2): 118-23.

12. Meshcheryakova E., Guryanova S., Makarov E., Alekseeva L. et al. Prevention of experimental septic shock by pretreatment of mice with muramyl peptides. Int. Immunopharmacol. 2001; 1 (910): 1857-65.

13. Murch O., Abdelrahman M., Kapoor A., Thiemermann C. Muramyl dipeptide enhances the response to endotoxin to cause multiple organ injury in the anesthetized rat. Shock. 2008; 29 (3): 388-94.

14. Tukhvatulin A.I., Gitlin 1.1., Shcheblyakov D.V., Artemicheva N.M. et al. Combined stimulation of Toll-like receptor 5 and NOD1 strongly potentiates activity of NF-kappaB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar Typhimurium infection. Infect. Immun. 2013; 81 (10): 3855-64.

15. Kobayashi T., Tani T., Yokota T., Kodama M. Detection of peptidoglycan in human plasma using the silkworm larvae plasma test. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000; 28 (1): 49-53.

16. O’Neill L.A., Pearce E.J. Immunometabolism governs dendritic cell and macrophage function. J. Exp. Med. 2015; 213 (1): 15-23.

17. Buck M.D., O’Sullivan D., Pearce E.L. T cell metabolism drives immunity. J. Exp. Med. 2015; 212 (9): 1345-60.

18. Everts B., Amiel E., Huang S.C., Smith A.M. et al. TLR-driven early glycolytic reprogramming via the kinases TBK1-IKKvarepsilon supports the anabolic demands of dendritic cell activation. Nat. Immunol. 2014; 15 (4): 323-32.

19. Vander Heiden M.G., Cantley L.C., Thompson C.B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 2009; 324 (5930): 1029-33.

20. Diskin C., Palsson-McDermott E.M. Metabolic modulation in macrophage effector function. Front. Immunol. 2018; 9: 270.

21. Pashenkov M.V., Balyasova L.S., Dagil Y.A., Pinegin B.V. The role of the p38-MNK-eIF4E signaling axis in TNF production downstream of the NOD1 receptor. J. Immunol. 2017; 198 (4): 1638-48.

22. Cheng S.C., Quintin J., Cramer R.A., Shepardson K.M. et al. mTOR- and HIF-1alpha-mediated aerobic glycolysis as metabolic basis for trained immunity. Science. 2014; 345 (6204): 1250684.

23. Waskiewicz A.J., Flynn A., Proud C.G., Cooper J.A. Mitogen-activated protein kinases activate the serine/threonine kinases Mnk1 and Mnk2. Embo J. 1997; 16 (8): 1909-20.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)