В связи с появлением новых методов исследования в морфологии и усовершенствованием уже известных методик неуклонно растет интерес иммунологов к строению селезенки как важного и самого большого периферического органа иммунной системы [1]. Селезенка является органом иммуногенеза и лимфопоэза, в котором происходят антигензависимая дифференцировка иммунокомпетентных клеток, образование эффекторных клеток и клеток памяти, а также элиминация отживших и поврежденных кроветворных клеток [2]. Она имеет сложное анатомическое строение иммунокомпетентной белой пульпы, включая периартериальные лимфоидные муфты, лимфоидные узелки с герминативными центрами, периартериальной, мантийной и маргинальной зонами. Такое строение создает благоприятные условия для эффективного кооперированного взаимодействия клеток, участвующих в иммунном ответе [3]. Кроме Т- и В-лимфоцитов, формирующих соответствующие Т- и В-зависимые зоны, в белой пульпе селезенки присутствуют макрофаги, ретикулярные и дендритные клетки (ДК). В селезенке имеются ДК двух типов: интердигитирующие (в периартериальных зонах лимфоидных узелков) - клетки миелоидного происхождения, взаимодействующие с наивными Т-лимфоцитами и активизирующие Т-хелперы, а также супрессоры Т- и В-лимфоцитов; фолликулярные - клетки некостномозгового происхождения, находятся в герминативных центрах лимфоидных узелков, не способны к передвижению, обеспечивают рост и дифференцировку В-лимфоцитам, принимают участие в образовании первичных лимфоидных узелков, образуя густую прочную сеть для них[4]. Некоторые авторы особо выделяют ДК центров размножения, которые также являются клетками не костномозгового происхождения, в отличие от фолликулярных, они способны к миграции [5].
В литературе имеются данные о том, что ДК селезенки активно принимают участие в противоопухолевом иммунном надзоре. Однако существуют противоречивые данные о функциональной направленности этих клеток в противоопухолевом иммунном ответе. Некоторые авторы считают, что селезеночные ДК обладают высоким противоопухолевым потенциалом и способны подавлять рост опухолевых клеток, тогда как дендритные клетки тимуса не обладают такой активностью [6]. Другие считают, что ДК селезенки, напротив, могут способствовать ускользанию опухоли от иммунного надзора [7].
Известно, что введение канцерогена запускает ряд процессов в организме, приводящих к определенным нарушениям в органах иммуногенеза [8]. Однако экспериментальные работы по изучению влияния канцерогена (1,2-диметилгидразина) на морфологию и ДК селезенки в частности проводятся сравнительно недавно, поэтому актуально углубленное изучение морфологической и иммуногистохимической картины тканей селезенки при экспериментальном канцерогенезе, индуцированном 1,2-диметилгидразином.
Цель исследования - изучить ДК и основные морфологические изменения тканей селезенки при введении 1,2-диметилгидразина через 1 и 4 мес после воздействия.
Материал и методы
Исследования выполнены на 70 белых нелинейных крысах-самцах. Животные содержались в виварии по нормам и правилам проведения работ с лабораторными животными согласно принципам Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. Работа выполнена с сентября 2013 г. по февраль 2017 г. на базе ФГБОУ ВО "Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова".
Животных разделили на 2 группы: 1-я - интактные (n = 30); 2-я - крысы с внутрибрюшинным введением 1,2-диметиггидразина 1 раз в неделю, 20 мг/кг, в течение 1 мес согласно модели R.F. Jacoby и соавт. (1991) (п = 40). Интактным животным для контроля вводили также внутрибрюшинно 1 раз в неделю в течение 1 мес изотонический раствор хлорида натрия. Животных выводили из эксперимента через 1 и 4 мес после окончания курса инъекций путем декапитации. В работе использовали селезенку только тех крыс, у которых аденокарцинома толстой кишки была подтверждена патоморфологически.
В работе использовали следующие методы:
1. Иммуногистохимический метод с использованием коммерческого поликлонального антитела к белку S100 (DAKO, Дания). Исследование выполняли в соответствии со стандартными протоколами. Тканевые срезы толщиной 3 мкм наносили на высокоадгезивные стекла с полилизиновым покрытием и высушивали при комнатной температуре в течение 24 ч. Окрашивали ручным способом с использованием систем визуализации LeicaChromoPlex™ 1 DualDetectionfor BOND. Для контроля чувствительности и специфичности реакции использовали неиммунизированные сыворотки.
2. Окраска гематоксилином и эозином для исследования морфологии селезенки и проведения морфометрических измерений. Ткань селезенки фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 24 ч, промывали проточной водой, затем выполняли стандартную проводку на тканевом гистопроцессоре Leica ASP 200. После проводки кусочки ткани селезенки заливали в парафин и готовили парафиновые блоки. Парафиновые срезы селезенки толщиной 4 мкм наносили на отрицательно заряженные стекла Mentzel Glasses super frost и окрашивали гематоксилином и эозином по стандартной методике.
3. Компьютерная морфометрия. Цифровые снимки микропрепаратов получены с применением системы архивирования на базе микроскопа "МИКРОМЕД 3 ЛЮМ" с использованием цифровой фотокамеры и персонального компьютера с набором прикладных программ. Микрофотографии для проведения морфометрических измерений получены при увеличениях в 100 и 400 раз. Количественные морфометрические измерения выполнены с применением лицензионной программы "Микро-Анализ". Площадь мембранной и цитоплазматической иммуногистохимической реакции оценивали методом автоматического выделения и подсчета площади интересующего цветового спектра (окрашенного DAB) по отношению к площади снимка.
Затем числовые значения площади позитивной иммуногистохимической реакции переводили в процентное отношение к общей площади снимка. Для каждого среза выполнены измерения не менее чем в 10 интересующих полях зрения.
4. Определение индексов, характеризующих морфо-функциональное состояние изучаемых структур белой пульпы селезенки [9]:
а) герминативно-фолликулярный индекс (ГФИ) - для определения степени развития герминативных центров:
ГФИ= Dгц/Dлф,
где Dгц - диаметр герминативных центров, Dлф - диаметр лимфоидных узелков;
б) индекс Керногана (ИК) - для определения пропускной способности микрососудов селезенки:
ИК= (2·L)/D,
где L - толщина стенки центральной артериолы, D - внутренний диаметр центральной артериолы;
в) лимфоидный коэффициент (ЛК) - для определения соотношения Т- и В-зависимых зон:
ЛК= Dлф/Lпм,
где Dлф - диаметр лимфоидных узелков, Lпм - ширина периартериальных лимфоидных муфт.
5. Статистическую обработку цифровых данных проводили с помощью лицензионного пакета Microsoft Office 2003 (Word и Excel) и программы G-Stat, достоверность определяли по t-критерию Стьюдента. В работе приводятся следующие показатели: М - средняя арифметическая величина; m - средняя ошибка средней арифметической величины. Достоверными считали отличия при p < 0,05 [10].
Результаты и обсуждение
В результате исследования выявлено, что канцерогенез, индуцированный введением 1,2-диметигидразина, приводит к уменьшению массы крыс: через 1 мес после введения канцерогена на 20%, а через 4 мес - 24% (табл. 1). Изменение других антропометрических данных (длина тела, хвоста, ушей) носит недостоверный характер на обоих сроках воздействия канцерогена. Введение 1,2-диметилгидразина сопровождается уменьшением массы селезенки: через 1 мес после инъекций на 22%, а через 4 мес - на 27% (табл. 1).
&hide_Cookie=yes)
При окраске срезов селезенки крыс гемотоксилином и эозином визуализируется красная и белая пульпа. При этом доля красной пульпы от общей массы органа в среднем составляет 75-85%. В лимфоидных узелках белой пульпы интактных животных определяются центральная артерия, чаще расположенная эксцентрично и окруженная периартериально Т-зависимой зоной, герминативный центр, мантийная и маргинальная зоны. Среди лимфоидных узелков встречаются первичные узелки без герминативных центров и вторичные с центрами размножения, появляющиеся только после антигенной стимуляции (рис. 1, А). Соотношение между вторичными и первичными лимфоидными узелками составляет 2,6 : 1 в одном поле зрения. При иммуногистологическом исследовании в герминативных центрах вторичных лимфоидных узелков определяются S100+-дендритные клетки, которые образуют стромальный каркас центров размножения (рис. 2).
&hide_Cookie=yes)
При определении морфометрических показателей выявлено, что через 1 мес после курсового введения 1,2-диметилгидразина белая пульпа селезенки сохраняет зональное строение. Границы лимфоидных узелков и периартериальных лимфоидных муфт сохраняются, однако становятся менее отчетливыми. Количество вторичных лимфоидных узелков изменяется недостоверно, а соотношение между первичными и вторичными составляет 1,7 : 1 (рис. 1, Б). ГФИ увеличивается, а ЛК, напротив, уменьшается, отражая напряженность гуморального иммунитета и отчасти Т-клеточного звена иммунного ответа, что может быть обусловлено преждевременной инволюцией тимуса при химическом канцерогенезе [11]. Однако на этом фоне происходит незначительное (на 14%) сокращение площади лимфоидных узелков, а их диаметр уменьшается на 19%. Площадь герминативных центров вторичных узелков уменьшается на 21%, а диаметр - на 12%. Замечено, что ширина маргинальной зоны и периартериальных лимфоидных муфт изменяется недостоверно (см. табл. 1). Диаметр центральной артерии уменьшается, а толщина стенок, напротив, увеличивается на 12%, что приводит к увеличению ИК (табл. 2), свидетельствующего о снижении пропускной способности центральной артерии.
&hide_Cookie=yes)
При иммуногистохимическом исследовании были выявлены S100+-клетки как в герминативных центрах лимфоидных узелков, так и в небольшом количестве в мантийной зоне. Отмечено, что через 1 мес после введения канцерогена на фоне уменьшения площади и диаметра лимфоидных узелков происходит значительное увеличение ДК в них (рис. 3), вероятно, это может привести к уменьшению числа плазмацитов и В-лимфоцитов (см. табл. 1). В литературе до сих пор встречаются противоречивые данные о распределении белка S100 в органах иммуногенеза. Одни авторы выделяют S100-отрицательные фолликулярные ДК и S100+-клетки периартериальных лимфоидных муфт [12]. В других исследованиях показано, что белок S100 обнаруживается как в фолликулярных ДК, так и в интердигитирующих клетках, однако S100+-клетки все же доминируют в герминативных центрах [13].
&hide_Cookie=yes)
Более значимые изменения наблюдаются через 4 мес после окончания курса инъекций канцерогена: лимфоидные узелки теряют правильную форму, контуры между зонами становятся более размытыми, стертыми. Количество вторичных лимфоидных узелков достоверно увеличивается в 2 раза, однако соотношение между ними и первичными узелками сокращается и составляет 1,5 : 1, что, возможно, свидетельствует об уменьшении антигенной стимуляции (рис. 1, В). ГФИ увеличивается более значимо по сравнению с предыдущим сроком, а ЛК изменяется незначительно (см. табл. 1). Площадь лимфоидных фолликулов сокращается, составляя 25%, что более значимо по сравнению с изменениями у предыдущего срока. Площадь герминативных центров вторичных фолликулов сокращается на 18%, а их диаметр - на 15%, однако количество S100+-клеток в них достоверно не изменяется. Ширина маргинальной зоны у животных через 4 мес после воздействия канцерогена достоверно сокращается на 11%, а ширина периартериальных лимфоидных муфт изменяется недостоверно (см. табл. 1). Диаметр центральной артерии уменьшается на 21%, а толщина стенок - на 28%, что, приводит к увеличению ИК, как и в предыдущем случае, (см. табл. 2). Такое нарушение микроциркуляции может свидетельствовать о снижении поступления клеток в селезенку в результате акцидентальной инволюции тимуса на введение 1,2-диметилгидразина [14].
Таким образом, курсовое введение 1,2-диметил-гидразина в дозе, эквивалентной развитию аденокарциномы толстой кишки, оказывает на селезенку значимое воздействие с разной степенью выраженности у исследуемых групп крыс. Через 1 мес после курса инъекций канцерогена происходит сокращение площади и диаметра лимфоидных узелков селезенки, уменьшение диаметрагерминативных центров с увеличением количества 8100+-клеток в них, ширина периатериальных лимфоидных муфт и маргинальной зоны сокращается при уменьшении пропускной способности центральной артерии. Такие изменения сопровождаются напряжением гуморального и клеточного звеньев иммунного надзора, которое в свою очередь приводит к недостаточности противоопухолевого иммунного ответа. Более выраженные изменения через 4 мес после курса введения канцерогена могут свидетельствовать не только о более грубом нарушении противоопухолевого иммунного надзора, но и о возможном прогрессировании неопластических процессов.