Гибридные белки CFP10 и ESAT6. Путь от разработки молекулы до скрининга населения на туберкулезную инфекцию

Резюме

В обзоре рассмотрена история создания и широкомасштабного производства препарата Диаскинтест® для массового обследования населения с целью выявления туберкулезной инфекции. Молекула содержит два белка - ESAT6 и CFP10, которые имеются только у вирулентных микобактерий туберкулеза и отсутствуют в вакцинном штамме M. bovis BCG. Прогностическая ценность препарата определяется тем, что эти белки секретируются только делящимися микобактериями туберкулеза, а не находящимися в спящем состоянии. Для массового выпуска генно-инженерного диагностического препарата в масштабах всей страны потребовалось создание высокотехнологичного производства, что и было сделано в кратчайшие сроки. Диагностикум предназначен для внутрикожного введения. Техника введения аналогична пробе Манту, что позволило сделать тест доступным для массового применения. В доклинических исследованиях доказана безопасность, высокая специфичность, чувствительность кожного теста с препаратом Диаскинтест®. Клинические исследования, результаты которых подтвердились в широкой клинической практике, и пострегистрационные наблюдения позволили доказать, что проба обладает высокой специфичностью, чувствительностью и прогностической значимостью. Проведение массового скрининга всего детского и подросткового населения способствовало резкому снижению заболеваемости и улучшению структуры клинических форм у заболевших. Применение пробы в группах риска у взрослых позволяет выявлять как лиц с туберкулезом, так и нуждающихся в превентивном лечении. Доказана эффективность пробы с препаратом Диаскинтест® в реальной клинической практике при использовании в первичном звене здравоохранения.

Ключевые слова:аллерген туберкулезный рекомбинантный; Диаскинтест®; туберкулезная инфекция

Для цитирования: Кудлай Д.А. Гибридные белки CFP10 и ESAT6. Путь от разработки молекулы до скрининга населения на туберкулезную инфекцию. Иммунология. 2021; 42 (2): 166-174. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-2-166-174

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки

Конфликт интересов. Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.

Введение

Туберкулез (ТБ) остается одной из главных проблем здравоохранения во всем мире, и если в ближайшие годы не будут определены новые профилактические меры, Mycobacterium tuberculosis (МБТ) будет инфицировано 2 млрд человек [1]. Цели стратегии Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) по борьбе с туберкулезом не могут быть реализованы без решения вопроса о диагностике и лечении латентной туберкулезной инфекции (ЛТИ). Важное значение имеет разработка новых диагностических тестов, результаты которых имели бы высокое прогностическое значение для оценки вероятности развития болезни среди инфицированных [2-5]. Среди основных задач - разработка биомаркера для выявления и диагностики туберкулезной инфекции у детей, который мог бы использоваться при систематическом скрининге. Для применения на уровне первичной медицинской помощи биомаркер должен иметь низкую стоимость и отличаться простотой исполнения тестирования [6].

В 1998 г. была завершена расшифровка генома МБТ [7]. Секвенирование цельного генома МБТ оказало непосредственное влияние на понимание биологии данного возбудителя. Геном M. tuberculosis радикально отличается от других видов бактерий. Большая часть генов обеспечивает синтез ферментов, вовлеченных в процессы липогенезиса и липолизиса. Отмечается большая консервативность геномов микобактерий комплекса M. tuberculosis. Сравнительные исследования геномов M. bovis и M. bovis BCG [8] и сравнительный анализ M. tuberculosis H37Rv и M. bovis BCG [9, 10] привели к идентификации зоны RD1, присутствующей во всех штаммах M. tuberculosis и патогенных штаммах M. bovis, но отсутствующих во всех штаммах вакцины M. bovis BCG и большинстве микобактерий внешней среды. Два из наиболее полно описанных антигенов, используемых в диагностических целях (ESAT-6 и CFP-10), кодируются в зоне RD1 (рис. 1) [11-13].

Рис. 1. Сравнение генетических карт M. tuberculosis и M. Bovis BCG [по 14]

В уникальной области RD1 генома M. tuberculosis кодируются, в частности, 2 секреторных белка - ESAT6 (early secreted antigenic target) и CFP10 (culture filtrate protein). Белки ESAT6 с молекулярной массой около 6 кДа и CFP10 с молекулярной массой 10 кДа относятся к ключевым молекулам, определяющим вирулентные свойства M. tuberculosis. Также было установлено, что против этих белков формируется длительный иммунный ответ, а это важно для диагностики туберкулеза.

Для разработки отечественного реагента для диагностики туберкулеза были проведены эксперименты по выбору антигенных детерминант, локализованных в области RD1 M. Tuberculosis, для использования их в качестве диагностического реагента [15, 16]. Выбор полипептидов для создания туберкулезного диагностикума был обусловлен тем, что ранние секреторные белки CFP10 и ESAT6 играют ключевую роль в развитии туберкулезной инфекции. Для подтверждения этого были проведены эксперименты на мышах, аэрозольно инфицированных M. bovis BCG, M. bovis BCG/RD1 (культурой M. bovis BCG, трансформированной RD1 M. tuberculosis), M. tuberculosis H37Rv. Вакцинированные M. bovis BCG животные служили отрицательным контролем, поскольку экспрессия генов RD1 у культуры M. bovis BCG нарушена. Было установлено, что M. bovis BCG/RD1 значительно менее вирулентна, нежели M. tuberculosis H37Rv, но заражение этими культурами приводило к одинаковым последствиям в организмах опытных животных. У инфицированных M. bovis BCG/RD1 и M. tuberculosis H37Rv животных обнаруживали хроническую инфекцию легких. На ранней стадии заражения в легочной ткани был выявлен высокий уровень активированных CD4+- и CD8+-Т-клеток (по другим данным, наблюдали выработку антител именно к CFP10 и ESAT6). Также наблюдали накопление в бронхолегочных секретах и легочной ткани CD11с+- и CD11bhigh-клеток (другими словами, имела место локализация очагов возбудителя инфекции). Проанализировав составы РНК (транскриптомы) M. bovis BCG и M. bovis BCG/ RD1, обнаружили активацию только RD1-генов, что дало основания связать инфекционные события с экспрессией CFP10 и ESAT6.

Параллельно были проведены эксперименты по идентификации антигенных детерминант, локализованных в области RD1 МБТ, для разработки диагностического реагента на основе синтетических пептидов. Схема постановки таких экспериментов основана на постулате, что искомые антигены должны индуцировать синтез интерферона(ИФН)-γ при инкубации с лимфоцитами, выделенными из селезенки лабораторных мышей, инфицированных МБТ, и не вызывать такой реакции при инкубации с лимфоцитами мышей, инфицированных M. bovis BCG или нетуберкулезными микобактериями. Исследование различных синтетических пептидов в описанной экспериментальной модели позволили сделать несколько важных выводов: уровень индукции ИФН-γ коррелировал с размерами исследуемых пептидов и был максимальным в случае использования пептидов размером 20 и более аминокислот; использование нескольких полипептидов в одной реакции усиливало уровень синтеза ИФН-γ.

Этот этап исследований был чрезвычайно важен для определения технологической стратегии производства нового препарата для кожного теста. В лабораторных тест-системах, использующих принцип антиген-стимулированной индукции ИФН-γ, требуется очень небольшое количество синтетического пептида для постановки реакции, в то время как для постановки кожного теста нужны в тысячу раз большие количества антигена. Короткий пептид можно синтезировать искусственно, искусственный синтез длинного многочленного пептида достаточно дорог.

Исходя из этого при разработке нового реагента для кожного теста было запланировано - используя методы генной инженерии, сконструировать неприродный гибридный белок, содержащий полный набор антигенных детерминант ESAT6 и CFP10 M. tuberculosis (при этом белок CFP10 проявляет функции шаперона в комплексе ESAT6-CFP10) и предусмотреть возможность его промышленного производства [17].

Физико-химические и молекулярно-биологические свойства белков CFP10 и ESAT6 M. tuberculosis

Белки CFP10 и ESAT6 M. tuberculosis H37Rv обладают молекулярной массой в 10,8 и 9,9 кДа и pI 4,39 и 4,27 соответственно. В изотермическом калориметрическом титровании для CFP10 и ESAT6 была измерена константа образования гетеродимера - 2 - 10-7 М (по другим данным ≤ 1,1 - 10-8 М) и определена температура "расплавленной глобулы" гетеродимера - Тм 53,4 °С. Такие значения константы димеризации и Тм свидетельствовали о его высокой термодинамической и биологической стабильности.

Методом сайт-направленного мутагенеза были выявлены ключевые аминокислотные остатки обсуждаемых молекул, ответственные за развитие инфекционных событий, гетеродимеризацию и связывание с клеточной поверхностью (последнее только для CFP10). Структура гетеродимера, где показаны аминокислотные остатки ESAT, замена которых вела к исчезновению (или значительному снижению) вирулентности соответствующих мутантных линий M. tuberculosis, представлена в статье P. Brodin и соавт. [18].

Вывод о высокой стабильности гетеродимера нашел подтверждение в опытах по ограниченному протеолизу, КД- и ЯМР-исследованиях комплекса CFP10-ESAT6. Было показано, что участки CFP10-ESAT6, вовлеченные в димеризацию, протеолитически недоступны, а образование комплекса ведет к увеличению α-спирализации ESAT6. Аналогичное изменение "жесткости" структуры ESAT6 наблюдали и в комплексе этого белка с димиристоилфосфатидилхолиновой мембраной in vitro.

В экспериментах по тушению флуоресценции ALEXA-меченых клеток U-937 обнаружено связывание CFP10 в составе гетеродимера с клеточной мембраной. Установлено, что в связывание вовлечен лишь С-концевой участок CFP10, не принимающий участие в образовании (и/или стабилизации) гетеродимера. Партнер такого связывания на мембране клеток U-937 идентифицирован не был.

На модельных липосомах подтверждена способность ESAT6 разрушать клеточную мембрану, причем такую активность ESAT6 проявлял только вне гетеродимера. Были выявлены условия освобождения ESAT6 из комплекса с CFP10. Оказалось, что при рН 5,5-4,0 (приближение к изоэлектрическим точкам CFP и ESAT) гетеродимер неустойчив и способен высвобождать ESAT6. Проведенные исследования позволили сделать лишь предварительные выводы о биологической роли CFP10, ESAT6 и их димера. По-видимому, CFP10 и гетеродимер стабилизируют ESAT6, сохраняя его функциональные возможности на ранней стадии инфекции, и своеобразно "презентируют" ESAT для связывания с мембраной клеток хозяина. Роль ESAT, по-видимому, сводится к переключению иммунного ответа организма-хозяина на себя и, тем самым, к сохранению жизнеспособности популяции возбудителя, что и происходит на ранних этапах инфекции (высокий уровень CD4+- и CD8+-Т-клеток в легких, иммунный ответ на CFP10 и ESAT6).

Эти данные стали основой для разработки препарата Диаскинтест®, который содержит гибридный белок, состоящий из двух ранних белков M. tuberculosis - CFP10 и ESAT6 [15, 16].

Лабораторные этапы получения гибридного белка CFP10-ESAT6 для создания препарата Диаскинтест® подробно изложены в патенте и статьях В.И. Киселева и соавт. (2005, 2008, 2009 гг.) [15-17].

Разработка биотехнологического инновационного продукта для идентификации туберкулезной инфекции у взрослых и детей - препарата Диаскинтест®

Генетическая конструкция pET_CFP_ESAT, регламент ферментации и выделения рекомбинантного белка ESAT6-CFP10 были переданы профильной фармацевтической компании для промышленного производства, где препарат получил название Диаскинтест®.

Метод выделения рекомбинантного белка - основы препарата Диаскинтест® - из клеток штамма-продуцента состоял из следующих стадий: разрушение клеток-продуцентов; извлечение целевого белка из клеточного лизата в раствор и проведение рефолдинга рекомбинантного белка; его хроматографическая очистка и перевод в буфер готовой лекарственной формы (ГЛФ). Выделение рекомбинантного белка ESAT6-CFP10 подробно описано в статьях [15, 16].

После выделения белок лиофилизировали и хранили при 4 оС. Разработанный лабораторный регламент позволил получать препаративные количества рекомбинантного белка со степенью очистки 95-98 % (рис. 2).

Рис. 2. Препарат гибридного белка до и после очистки [17, 21]

Производство нового иммунобиологического препарата подробно описано в книге "Кожная проба с препаратом "Диаскинтест" - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции" под ред. М.А. Пальцева (2011) и условно разделено на 3 производственные зоны:

- зона микробиологического синтеза целевого белка;

- зона хроматографической очистки целевого белка;

- зона приготовления ГЛФ.

Для выделения рекомбинантного белка диаскинтест культуру клеток продуцента отделяли от культуральной среды центрифугированием, полученную биомассу разрушали в буфере, содержащим 6М гуанидин-хлорида.

Лизат клеток-продуцентов передавали на стадию хроматографического выделения и очистки целевого белка, где он проходил следующую обработку:

1. Хроматографию на металл-хелатном носителе.

2. Хроматографию на анионообменном носителе.

3. Обращенно-фазовую хроматографию.

Окончательную очистку проводили гель-фильтрацией на колонке, заполненной гелем Superdex 75Рв. Колонку предварительно уравновешивали буферным раствором, содержащим Na2HPO4, NaH2PO4, KCl, NaCl и полисорбат 80. Элюирование проводили этим же буферным раствором.

Полученный таким образом концентрат белка подвергали дополнительному контролю по показателям и специфической активности с привлечением специализированной лаборатории ГУ "Центральный научно-исследовательский института туберкулеза" РАМН (в настоящее время - ФГБНУ "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" Минобрнауки России). Все стадии технологического процесса вали-дированы и должным образом задокументированы.

Для получения ГЛФ препарата непосредственно перед фасовкой концентрат разводили стерильным буферным раствором, в состав которого входили полисорбат 80, NaCl, Na2HPO4 - 2H2O, KH2PO4, в качестве консерванта - фенол. После тщательного перемешивания препарат фасовали во флаконы марки 2R по 3,0 мл, укупоривали резиновыми пробками и обкатывали колпачками с контролем первичного вскрытия.

Доклинические исследования препарата Диаскинтест®

Доклинические исследования проводили на мышах и морских свинках. Исследования проведены в НИИ молекулярной медицины [входит в состав ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет)] и НИИ фтизиопульмонологии ММА им. И.М. Сеченова (в настоящее время ФГБУ "Национальный медицинский исследовательский центр фтизиопульмонологии и инфекционных заболеваний" Минздрава России), в вивариях ФГБУ "Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича" Минздравсоцразвития России (в настоящее время ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России), ГУ "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" РАМН (сейчас ФГБНУ "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" Минобрнауки России). Исследование проводилось в сравнении с национальным стандартом очищенного туберкулина (ОСО ППД-Л2). Основное разведение ОСО ППД-Л2 содержит 50000 ТЕ в 1 мл. Штаммы микобактерий: Mycobacterium tuberculosis: H37Rv#102, R1Rv, "Academia", 5549, 2165; Mycobacterium bovis Bovinus 8; Mycobacterium kansasii; Mycobacterium marinum; Mycobacterium bovis BCG-1 -вакцина туберкулезная (BCG) сухая для внутрикожного введения, производство Филиала "Медгамал" НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (В настоящее время ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России), г. Москва.

Результаты исследований позволили утверждать, что препарат Диаскинтест® как в высоких, так и в низких дозах не вызывает реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) у интактных, у вакцинированных BCG или у сенсибилизированных нетуберкулезными микобактериями морских свинок. В то же время реакции на внутрикожное введение различных доз этого препарата животным, зараженным микобактериями туберкулеза, инфицирующих человека, сопоставима с реакциями на туберкулин. Представленные данные указывали на возможность использования препарата Диаскинтест® для диагностики инфицирования микобактериями туберкулеза и для дифференциальной диагностики поствакцинальной и постинфекционной реакции ГЗТ к туберкулину [19, 20].

Клинические исследования

Работы по изучению препарата проводили в 2007-2008 гг. в ГУ "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" РАМН (сейчас ФГБНУ "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" Минобрнауки России), Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения Москвы (сейчас ГБУЗ города Москвы "Московский научно-практический центр борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы"), ФГУ Санкт-Петербурский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии Федерального агентства по высокотехнологической медицинской помощи (сейчас ФГБУ "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопульмонологии" Минздрава России) [21]. Доказано, что внутрикожная проба с препаратом Диаскинтест® безопасна: не наблюдалось необычных общих реакций и неспецифических местных проявлений. Повторные пробы не вызывают сенсибилизации организма.

Проба с препаратом Диаскинтест® обладает высокой специфичностью: частота отрицательных реакций у детей после вакцинации BCG составила 100 %; при нетуберкулезных заболеваниях легких у взрослых - 94,6 %, у детей - 100 %; при внелегочных процессах нетуберкулезной природы у взрослых - 98,5 %; у лиц, излеченных от внелегочных форм туберкулеза, - 100,0 %.

Проба с препаратом Диаскинтест® обладает высокой чувствительностью: частота положительных реакций у детей и подростков с нелеченным туберкулезом органов дыхания составила 97,3 %; у взрослых, больных туберкулезом органов дыхания, - 84,2 %; у взрослых, больных туберкулезом внелегочных локализаций, - 89,7 %.

Уменьшение интенсивности реакции вплоть до отрицательной отмечено у 52,0 % детей и подростков, получивших полный курс контролируемой химиотерапии, и у 44,4 % взрослых, больных туберкулезом органов дыхания, после 3 мес лечения.

У детей, контактировавших с бактериовыделителями, частота положительных реакций на пробу с Диаскинтест® достоверно ниже у лиц, получивших контролируемую превентивную химиотерапию, чем у лиц, не получивших таковую: 60,0 и 94,5 % соответственно.

Аллерген туберкулезный рекомбинантный (препарат Диаскинтест®) зарегистрирован в 2008 г. и с 2009 г. внедрен в широкую практику здравоохранения приказом Минздравсоцразвития РФ № 855 [22].

Результаты проведенных клинических исследований полностью подтвердились в реальной клинической практике в течение 10 лет при сплошных обследованиях детей и подростков и в группах высокого риска развития туберкулеза взрослых [23-28], что стало основанием для применения теста в качестве скринингового метода обследования населения на туберкулез [29, 30].

Выявляемость туберкулеза среди лиц с положительными реакциями на препарат Диаскинтест® в 2013 г. в Москве составила 5 %, столько же лиц (5 %) выявлено с процессами в фазе кальцинации (группа III А). В то же время выявляемость туберкулеза и посттуберкулезных изменений среди туберкулин-положительных детей была в 40 раз меньше - 0,13 % [31]. В последующие годы при сплошных скрининговых обследованиях эта тенденция сохранилась, при том, что заболеваемость у детей значительно снизилась [23, 24].

Высокая выявляемость туберкулеза и латентной туберкулезной инфекции первичного туберкулезного инфицирования по пробе с препаратом Диаскинтест® отмечена во многих регионах России [25-27, 32, 33].

Результат пробы с препаратом Диаскинтест® является критерием отбора на компьютерную томографию (КТ), в результате которой стали выявляться столь малые формы туберкулеза внутригрудных лимфоузлов, которые на обычных рентгенограммах не выявлялись [31-34].

Проведение в Москве скрининга взрослых лиц из групп риска (социальных, медицинских и эпидемиологических) на наличие туберкулезной инфекции показало, что положительный результат пробы с препаратом Диаскинтест® прямо коррелировал с риском развития туберкулеза и высокой заболеваемостью в этих группах [28, 35, 36].

О важном прогностическом значении кожных тестов с препаратом Диаскинтест® свидетельствует высокая эффективность превентивной химиотерапии у лиц с положительными реакциями. Известно, что противотуберкулезные препараты, используемые для этой цели, в частности изониазид, действуют только на микобактерии, активно делящиеся, и не действуют на находящиеся в дормантном ("спящем") состоянии [37-39]. Иначе говоря, лица с положительной реакцией имеют высокий риск развития заболевания. Назначение им противотуберкулезной терапии значительно снизило заболеваемость в этих группах как у детей [31], так и взрослых: лиц, принимающих блокаторы ФНОα [35, 36], а также у больных ВИЧ-инфекцией [40]. У лиц с отрицательным значением тестов отмечена высокая отрицательная прогностическая значимость - они не заболевают туберкулезом при отсутствии химиопрофилактики.

Заключение

Препарат Диаскинтест®, содержащий рекомбинантный белок ESAT6-CFP10, показал свою высокую специфичность, чувствительность, прогностическую значимость и выявляемость туберкулеза при скрининговых обследованиях. Проведенные клинические исследования, результаты которых подтвердились в широкой клинической практике, и продолжающиеся в течение более 10 лет пострегистрационные наблюдения доказали эффективность пробы с препаратом Диаскинтест®. Ее использование в первичном звене здравоохранения позволило добиться резкого снижения заболеваемости детей и подростков во всей стране. Применение пробы в группах риска у взрослых позволяет снизить заболеваемость этих пациентов и существенно сократить затраты на лечение туберкулеза.

Литература

1. Lönnroth K., Castro K., Chakaya J., Chauhan L., Floyd K., Glaziou P. et al. Tuberculosis control and elimination 2010-50: cure, care, and social development. Lancet. 2010; 375 (9728): 1814-29. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(10)60483-7

2. Consensus meeting report: development of a Target Product Profile (TPP) and a framework for evaluation for a test for predicting progression from tuberculosis infection to active disease. Geneva : World Health Organization, 2017. (WHO/HTM/TB/2017.18). URL: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/igo )

3. Кудлай Д.А. Биомаркеры и иммунологические тесты. Экспериментально-клинические параллели латентной туберкулезной инфекции. Туберкулез и болезни легких. 2020; 98 (8): 63-74. URL: http://doi.org/10.21292/2075-1230-2020-98-8-63-74

4. Implementing the end TB strategy: the essentials. World Health Organization. Geneva, 2015(WHO/HTM/TB/2015.31). URL: http://www.who.int/tb/publications/2015/end_tb_essential.pdf?ua=1 ) (date of access 18 July, 2017)

5. Latent tuberculosis infection: updated and consolidated guidelines for programmatic management. Geneva : World Health Organization, 2018.

6. Pai M. Innovations in tuberculosis diagnostics: progress and translational challenges. EBioMedicine. 2015; 2 (3): 182-3. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2015.01.018

7. Cole S., Brosch R., Parkhill J. et al. Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence. Nature. 1998; 393: 537-44.

8. Mahairas G., Sabo P., Hickey M. et al. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis. J. Bacteriol. 1996; 178: 1274-82.

9. Behr M., Wilson M., Gill W. et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science. 1999; 284: 1520-3.

10. Dillon D., Alderson М., Day Н. et al. Molecular and immunological character izationof Mycobacterium tuberculosis CFP-10, an immunodiagnostic antigen missing in Mycobacterium bovis BCG. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 3285-90.

11. Harboe M., Oettinger T., Wiker H. et al. Evidence for occurrence of the ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence in Mycobacterium bovis BCG. Infect. Immun. 1996; 64: 16-22.

12. Arend S., Andersen P., van Meijgaarden K. et al. Detection of active tuberculosis infection by T cell responses to early-secreted antigenic target 6-kDa protein and culture filtrate protein 10. J. Infect. Dis. 2000; 181: 1850-4.

13. Berthet F., Rasmussen P., Rosenkrands I. et al. Mycobacterium tuberculosis operon encoding ESAT-6 and a novel low-molecular-mass culture filtrate protein (CFP-10). Microbiology. 1998; 144 (11): 3195-203.

14. Киселев В.И., Пальцев М.А., Перельман М.И., Барановский П.М. Научное обоснование и создание аллергена туберкулезного рекомбинантного CFP10-ESAT6 (препарат "Диаскинтест"). В кн.: Кожная проба с препаратом "Диаскинтест" - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции. Под ред. М.А. Пальцева. 2-е изд., перераб. и доп. Москва : Шико, 2011: 73-87.

15. Киселев В.И., Северин Е.С., Перельман М.И., Пальцев М.А. Новые биотехнологические решения в диагностике и профилактике туберкулезной инфекции. Вестник НИИ молекулярной медицины. 2005; 5: 37-46.

16. Киселев В.И., Барановский П.М., Пупышев С.А. и др. Новый кожный тест для диагностики туберкулеза на основе рекомбинантного белка ESAT-CFP. Молекулярная медицина. 2008; 4: 4-6.

17. Киселев В.И., Пальцев М.А. Гибридный белок CFP10-ESAT6, индуцирующий реакцию гиперчувствительности замедленного типа в отношении M. tuberculosis, кодирующая его химерная нуклеиновая кислота и рекомбинантный плазмидный экспрессирующий вектор, ее содержащий, способ получения гибридного белка и дозированная лекарственная форма для внутрикожной инъекции на его основе. Патент РФ на изобретение № 2360926, 2008.

18. Brodin P., de Jonge M.I., Majlessi L. et al. Functional analysis of early secreted antigenic target-6, the dominant T-cell antigen of Mycobacterium tuberculosis, reveals key residues involved in secretion, complex formation, virulence, and immunogenicity. J. Biol. Chem. 2005; 280 (40): 33 953-9. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.m503515200

19. Леви Д.Т., Рухамина М.Л. Доклинические исследования препарата "Диаскинтест". В кн.: Кожная проба с препаратом "Диаскинтест" - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции. Под ред. М.А. Пальцева. 2-е изд., перераб. и доп. Москва : Шико, 2011: 65-79.

20. Бочарова И.В., Демин А.В. Доклинические исследования специфической активности препарата "Диаскинтест". В кн.: Кожная проба с препаратом "Диаскинтест" - новые возможности идентификации туберкулезной инфекции. Под ред. М.А. Пальцева. 2-е изд., перераб. и доп. Москва : Шико, 2011: 114-25.

21. Киселев В.И., Барановский П.М., Рудых И.В. и др. Клинические исследования нового кожного теста Диаскинтест® для диагностики туберкулеза. Проблемы туберкулеза. 2009; (2): 1-8.

22. Приказ Минздравсоцразвития России от 29.10.2009 № 855. "О внесении изменения в приложение № 4 к Приказу Минздрава России от 21 марта 2003 г. № 109".

23. Слогоцкая Л.В., Богородская Е.М., Синицын М.В., Кудлай Д.А., Шамуратова Л.Ф., Севостьянова Т.А. Скрининг туберкулезной инфекции с различными вариантами применения аллергена туберкулезного рекомбинантного у детей и подростков в г. Москве. Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2020; 99 (2): 136-46.

24. Слогоцкая Л.В., Богородская Е.М., Шамуратова Л.Ф., Севостьянова Т.А. Эффективность скрининга туберкулезной инфекции у детей и подростков в г. Москве в 2019 г. на основе нового алгоритма применения внутрикожной пробы с аллергеном туберкулезным рекомбинантным (ESAT-6/CFP-10). Туберкулез и болезни легких. 2021; 99 (1): 15-25. DOI: https://doi.org/10.21292/2075-1230-2021-99-1-15-25

25. Aksenova V.A., Vasilyeva I.A., Kasaeva T.Ch., Samoilova A.G., Pshenichnaya N.Yu., Tyulkova T.E. Latent tuberculosis infection in children and adolescents in Russia. Int. J. Infect. Dis. 2020; 92S: S26-30. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.02.038

26. Аксенова В.А., Барышникова Л.А., Клевно Н.И., Кудлай Д.А. Скрининг детей и подростков на туберкулезную инфекцию в России - прошлое, настоящее, будущее. Туберкулез и болезни легких. 2019; 97 (9): 59-67. DOI: http://doi.org/10.21292/2075-1230-2019-97-9-59-66

27. Кудлай Д.А., Старшинова А.А., Довгалюк И.Ф. Аллерген туберкулезный рекомбинантный: 10-летний опыт применения теста у детей и подростков в Российской Федерации (данные метаанализа). Педиатрия. Журнал имени Г.Н. Сперанского. 2020; 99 (3): 121-9.

28. Богородская Е.М., Слогоцкая Л.В., Белиловский Е.М., Рощупкина О.М. Латентная туберкулезная инфекция в группах риска у взрослого населения города Москвы, 2012-2016 гг. Туберкулез и социально-значимые заболевания. 2017; 2: 10-15.

29. Приказ Минздрава России от 29.12.2014 № 951. "Об утверждении методических рекомендаций по совершенствованию диагностики и лечения туберкулеза органов дыхания". Москва : Министерство здравоохранения России, 2014.

30. Приказ Минздрава России от 21.03.2017 № 124н "Об утверждении порядка и сроков проведения профилактических медицинских осмотров граждан в целях выявления туберкулеза".

31. Слогоцкая Л.В., Сенчихина О.Ю., Никитина Г.В., Богородская Е.М. Эффективность кожного теста с аллергеном туберкулезным рекомбинантным при выявлении туберкулеза у детей и подростков Москвы в 2013 г. Педиатрическая фармакология. 2015; 1: 99-103.

32. Аксенова В.А., Барышникова Л.А., Клевно Н.И., Сокольская Е.А., Долженко Е.Н., Шустер A.M. и др. Новые возможности скрининга и диагностики различных проявлений туберкулезной инфекции у детей и подростков в России. Вопросы современной педиатрии. 2011; 4: 16-22.

33. Долженко Е.Н., Шейкис Е.Г., Серегина И.В. Диагностические возможности аллергена туберкулезного рекомбинантного в скрининг-диагностике туберкулезной инфекции у детей подросткового возраста в Рязанской области. Туберкулез и болезни легких. 2015; 6: 56-7.

34. Богородская Е.М., Белиловский Е.М., Пучков К.Г., Сенчихина О.Ю., Шамуратова Л.Ф. Заболеваемость туберкулезом детей раннего возраста в городе Москве и факторы, влияющие на нее. Туберкулез и социально-значимые заболевания. 2014; 5: 16-23.

35. Борисов С.Е., Лукина Г.В., Слогоцкая Л.В. и др. Скрининг и мониторинг туберкулезной инфекции у ревматологических больных, получающих генно-инженерные биологические препараты. Туберкулез и болезни легких. 2011; 6: 42-50.

36. Фролова К.С., Борисов С.Е., Слуцкая О. М. Туберкулез у больных с воспалительными заболеваниями на фоне лечения ингибиторами ФНО-альфа. Туберкулез и социально-значимые заболевания. 2018; 2: 31-41.

37. Cardona P. A dynamic reinfection hypothesis of latent tuberculosis infection. Infection. 2009; 37 (2): 80-6.

38. Fox W., Ellard G., Mitchison D. Studies on the treatment of tuberculosis under taken by the British Medical Research Council tuberculosis units, 1946-1986, with relevant subsequent publications. Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 1999; 3: 231-79.

39. Mitchison D. Basic mechanisms of chemotherapy. Chest. 1979; 76 (6): 771-81.

40. Синицын М.В., Богородская Е.М., Аюшеева Л.Б., Белиловский Е.М. Латентная туберкулезная инфекция среди ВИЧ-инфицированных лиц в городе Москве. Туберкулез и социально-значимые заболевания. 2017; 2: 42-9.

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Рахим Мусаевич
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, научный руководитель ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, главный аллерголог-иммунолог Минздрава России
Медицина сегодня
Конгресс по аллергологии и иммунологии

23 - 25 июня в Москве состоится 17-й Международный междисциплинарный конгресс по аллергологии и иммунологии Одной из ключевых тем станет обсуждение результатов испытания первого в мире ингаляционного препарата против коронавируса - МИР 19, разработанного ФМБА. Мероприятие...

III клинико-лабораторный Форум специалистов лабораторной медицины.

ФЛМ приглашает к информационному сотрудничеству в рамках Третьего клиниколабораторного Форума специалистов лабораторной медицины. 24-25 июня 2021 года в г. Санкт-Петербург состоится Третий клинико-лабораторный Форум специалистов лабораторной медицины. Место проведения: ФГБУ...

IX Международный междисциплинарный конгресс по заболеваниям органов головы и шеи

Уважаемые коллеги! Рады сообщить, что 24-26 мая 2021 года состоится IX Международный междисциплинарный конгресс по заболеваниям органов головы и шеи в очно-заочном формате! ➤ Адрес мероприятия: Москва, Трубецкая, д.8 ➤ Трансляция мероприятия: Образовательный...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»