Анализ содержания плазмабластов в крови людей в разные сроки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой

• Силкина Марина Владимировна
• Карцева Алена Сергеевна
• Зенинская Наталья Алексеевна
• Марьин Максим Александрович
• Рябко Алена Константиновна
• Мунтян Я.О.
• Фирстова Виктория Валерьевна
• Шемякин Игорь Георгиевич
• Дятлов Иван Алексеевич

Резюме

Лечение сибирской язвы успешно проводят с использованием антибиотиков. Однако при легочной/кишечной форме или поздней стадии сибиреязвенной инфекции эффективность антибиотикотерапии резко падает. Это связано с накоплением в организме большого количества летального токсина, который и обусловливает летальный исход при сибирской язве. Летальный токсин состоит из протективного антигена (ПА) и летального фактора (ЛФ). При активной системной форме инфекции летальный токсин может быть нейтрализован только специфическими антителами к ПА и/или ЛФ. Один из подходов получения человеческих терапетических моноклональных антител подразумевает выделение специфических плазмабластов из крови иммунных доноров. В норме содержание плазмабластов в кровотоке крайне низкое - от 0,2 до 5%. Увеличение плазмабластов в крови кратковременно, в зависимости от типа вакцины и пути ее введения оно наблюдается на 5-13-е сутки после вакцинации.

Цель работы - выявление времени транзиторного увеличения плазмабластов в крови доноров после вакцинации. В работе показано, что у 5 из 12 доноров, многократно иммунизированных вакциной сибиреязвенной живой сухой, на 5-8-е сутки детектировались антитела против протективного антигена и у 2 - антитела против летального фактора. Из 5 серопозитивных сывороток только 2 характеризовались способностью нейтрализовать летальный токсин в экспериментах in vitro. Максимальный транзиторный выброс плазмабластов с фенотипом CD19⁺CD20^-/loCD27^hiCD38^hi в кровь регистрировался на 7-е сутки после иммунизации доноров вакциной живой сибиреязвенной сухой. Количество плазмабластов в этот срок увеличивалось до 6,9-14,6%. Предварительный анализ наличия антител в крови к ПА и ЛФ, а также оценка их нейтрализующей активности в отношении сибиреязвенного токсина позволит выбрать наиболее перспективного донора специфических плазмабластов для получения человеческих моноклональных антител к ПА или ЛФ.

Ключевые слова:Bacillus anthracis; плазмабласты; антитела; летальный токсин; токсин-нейтрализующая активность

Антибиотикотерапия сибирской язвы эффективна на ранних стадиях инфекции. На поздней стадии инфекции, а также при легочной и кишечной формах эффективность применения антибиотиков резко снижается [1]. Это связано с накоплением в крови 3-компонентного токсина сибирской язвы, состоящего из А- (летальный и отечный факторы) и В- (протективный антиген) субъединиц. Летальное действие сибиреязвенного токсина обусловлено прежде всего летальным токсином (ЛТ), состоящим из протективного антигена (ПА) и летального фактора (ЛФ) [2]. В связи с этим токсин-нейтрализующее действие при лечении сибирской язвы направлено прежде всего на нейтрализацию ЛТ. Так, ПА участвует в связывании токсина с рецептором, соответственно, при ингибировании ПА будет наблюдаться антитоксический эффект в отношении ЛФ и отечного фактора (ОФ). С использованием гибридомной технологии получены моноклональные антитела мыши (МкАТ) к ПА и ЛФ. В экспериментах in vitro на мышиных макрофагоподобных клеточных линиях J774 и RAW 264.7 была показана токсин-нейтрализующая активность МкАТ против ЛТ [3]. Эффективность ингибирования токсина сибирской язвы подтверждена в опытах на мышиных моделях [4]. Это позволило предположить эффективность использования токсин-нейтрализующих антител в терапевтических целях.

Получение МкАТ мыши является рутинным методом и не вызывает трудностей. Однако использование мышиных МкАТ для терапии людей связано с рядом ограничений: высокая иммуногенность, низкая эффективность, быстрое выведение из организма. Одним из подходов к решению данной проблемы является получение гибридомных клеток, синтезирующих МкАТ человека, что предполагает получение плазмабластов и слияние их с перевиваемой миеломной или гетеромиеломной клеткой. Большая сложность заключается в получении специфических плазмабластов человека в связи с их низким содержанием (~ 0,2% от всех мононуклеаров) в крови здоровых людей. Известно, что после вакцинации количество плазмабластов в кровотоке увеличивается до 5-6% и выше. Время транзиторного выброса плазмабластов в кровоток определяется особенностями вакцинного препарата и наблюдается между 5-13-ми сутками после вакцинациии.

Цель исследования - определить время, оптимальное для получения плазмабластов, у людей после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой.

Экспериментальная часть

Доноры. У людей, ежегодно иммунизированных вакциной сибиреязвенной живой сухой для подкожного и скарификационного применения (серия 265, Киров), на 0-е и 5, 6, 7, 8-е сутки после вакцинации брали цельную кровь в вакуумные пробирки Vacuette (Greiner-Bio-One, Австрия) с лития гепарином и активатором свертывания крови для получения сыворотки. Контролем при анализе содержания плазмабластов служили данные, полученные у этого же донора до вакцинации. Доноры, включенные в исследование, были иммунизированы не менее 2 раз. Интервал между крайней вакцинацией, предшествующей исследованию, и включением донора в данное исследование составлял 1 год. Группа сравнения при анализе титров антител к ПА и ЛФ состояла из 15 доноров, не иммунизированных и ранее не болевших сибирской язвой.

Выделение В-лимфоцитов. Гепаринизированную кровь инкубировали в пробирках в течение 20 мин с RosseteSepTM Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell technologies, Канада) из расчета 50 мкл реактива на 1 мл цельной крови. Затем кровь разводили в 2 раза средой RPMI 1640 ("Пан Эко", Россия), наслаивали на градиент плотности RosseteSepTM DM-L Density (Stemcell technologies, Канада) в соотношении 1 : 1 и центрифугировали в течение 20 мин при 1200 g с выключенным тормозом при комнатной температуре.

Полученное опалесцирующее кольцо на границе раздела двух сред собирали и дважды отмывали в среде RPMI 1640 при 300g в течение 10 мин, а затем ресуспендировали в полной питательной среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ глутамина ("ПанЭко", Россия), 10 мМ HEPES (Sigma, США), 25 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma, США) и 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS, Termo Fisher Scientific, США). Жизнеспособные клетки подсчитывали на автоматическом счетчике "ТС-20" (Bio-Rad, США) после окрашивания клеток трипановым синим (Invitrogen, США).

Фенотипирование лимфоцитов. Выделенные В-лимфоциты (6 - 10⁶ кл/мл) метили МкАТ CD19 BB515, CD20 APC-H7, CD27 APC, CD38-SF 594 (eBioscience, США) в соответствии с инструкцией производителя. Вкратце, образец клеток окрашивали в течение 20 мин в темноте при температуре 20 °С. Затем клетки отмывали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и фиксировали 1% раствором формалина. Цитометрический анализ проводили на проточном цитофлюориметре "FACS Aria III" (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения BD FACS Diva (версия 8.0). В каждом образце анализировали 10 000 клеток.

Получение рекомбинантных антигенов. Рекомбинантные белки, ПА и ЛФ Bacillus anthracis получили в системе экспрессии E. coli. Клетки E. coli штамма BL21(DE3), трансформированные экспрессионной плазмидой рЕТ22Ь(+)-ПА и рЕТ22Ь(+)-ЛФ, наращивали в среде 2xYT, содержащей 0,1% глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Экспрессию белка проводили при 25 °С в течение 6 ч под воздействием индуктора IPTG. Для очистки бактериальную биомассу собирали центрифугированием. Осветленный лизат очищали на колонке с Ni-сефарозой с последующей доочисткой на гель-фильтрационной хроматографии. Чистоту полученных рекомбинантных белков проверяли в электрофорезе в ПААГ в денатурирующих условиях по методу Лэммли. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим (R-250), молекулярную массу полученных полос сравнивали с коммерческим маркером молекулярных масс. Концентрацию определяли на спектрофотометре Smart Spec Plus (BIO-RAD, США) при длине волны 280 нм.

Определение антител к протективному антигену и летальному фактору в сыворотке крови. На поверхности лунок поликарбонатного планшета иммобилизировали рекомбинантный белок ЛФ или ПА B. anthracis. Для этого в лунки планшета вносили по 100 мкл раствора рекомбинантных белков в концентрации 0,01 мг/мл, инкубировали в течение 2 ч при температуре 37 °С и перемешивании на орбитальном шейкере при скорости 300 об/мин. По окончании инкубации проводили 3-кратную отмывку лунок планшета PBS с добавлением 0,05% Tween-20 (PBS-Tween). Свободные валентности пластика блокировали обезжиренным молоком, внося его в объеме 200 мкл на лунку. Блокировку проводили в течение 1 ч при температуре 37 °С и перемешивании, после чего 3-кратно отмывали с использованием PBS-Tween. Сыворотки доноров разводили в PBS в соотношениях от 1 : 25 до 1 : 3200 с 2-кратным шагом разведения и инкубировали в течение 1 ч на шейкере при температуре 37 °C, затем 3-кратно промывали PBS-Tween. В лунки планшета добавляли по 100 мкл конъюгата кроличьих антител против IgG человека с пероксидазой хрена (Sigma, США) в разведении 1 : 5000 в PBS. После часовой инкубации и 6-кратной отмывки планшета во все лунки вносили по 100 мкл субстратиндикаторной смеси. Реакцию останавливали 2 М серной кислотой (50 мкл/лунку). Результаты учитывали на спектрофотометре "Smart Spec Plus" (BIO-RAD, США) при длине волны 492 нм.

Оценка токсин-нейтрализующей активности антител. Токсическая доза (ED100) ПА и ЛФ для клеточной линии J774A.1 была определена в предыдущих экспериментах и составила 100 нг/мл ЛФ и 500 нг/мл ПА.

В лунки 96-луночного планшета, содержащие адгезированные клетки макрофагоподобной линии J774A.1 в 85 мкл полной питательной среды DMEM (Termo Fisher Scientific, США), вносили рекомбинантные ПА и ЛФ, предварительно инкубировавшиеся в течение 1 ч при 37 °С разными разведениями сывороток доноров. Сыворотки доноров титровали двойным шагом, начиная с разведения 1 : 25 до 1 : 200. В качестве положительного контроля использовали лунки без добавления токсина и антител, в качестве отрицательного - с добавлением 0,024% мертиолята натрия (Oskar Tropitzsch, Германия). Все исследуемые точки дублировали в 4 повторах. После внесения всех ингредиентов планшеты инкубировали 4 ч при 37 °С в ^^инкубаторе, а затем добавляли по 10 мкл 3-[4,5-диметилтиазолил-2-ел]-2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) и инкубировали еще 4 ч. Клеточный слой лизировали добавлением 175 мкл диметилсульфоксида (DMSO, Sigma-Aldrich, США). Оптическую плотность клеточного лизата измеряли на планшетном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) при длине волны 540 нм.

Токсин-нейтрализующую активность сывороток определяли по жизнеспособности клеток, выражали в процентах и рассчитывали по формуле:

Жизнеспособность клеток = OD(пробы)^-OD(K^-) / OD(K⁺)^-OD (K^-),

где K^- - лунки с добавлением 0,024% мертиолята натрия, а K⁺- лунки без добавления токсина и антител; OD - оптическая плотность.

Показатель жизнеспособности клеток, составляющий 50%, считался пороговым для разграничения положительных и отрицательных результатов.

Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета программ Exel. Достоверность различия сравниваемых величин оценивали по критерию Стьюдента (t) и уровню вероятности безошибочного прогноза (p). Статистический анализ цитометрических данных проводили в программе BD FACS Diva (версия 8.0).

Результаты

Определение антител к протективному антигену и летальному фактору. Антитела к ПА и ЛФ и токсиннейтрализующую активность сывороток у доноров до иммунизации не выявляли. Анализ сывороток вакцинированных доноров показал, что у 5 из 12 вакцинированных доноров на 5-8-е сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой появлялись антитела к ПА (табл. 1). Уровень антител к ПА варьировал от 1 : 50 до 1 : 1600. Наличие антител к ПА не зависело от сроков забора крови после вакцинации и ее кратности. Антитела к ЛФ выявлены только у 2 многократно вакцинированных доноров, кровь которых взяли на исследование на 7-е сутки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой.

Определение токсин-нейтрализующей активности сывороток крови. Из 5 сывороток, в которых обнаружены специфические антитела к ПА, только 2 сыворотки характеризовались способностью нейтрализовать ЛТ B. anthracis в тесте in vitro, что проявлялось в защите от гибели 50% и более клеток линии J774 А.1 в присутствии ЛТ. Токсин-нейтрализующая активность сывороток проявлялась в разведениях от 1 : 25 до 1 : 100. Сыворотки контрольных доноров не обладали способностью нейтрализовать ЛТ, как и сыворотки, полученные от доноров, вакцинированных против сибирской язвы, у которых не выявлены антитела к ПА и ЛФ.

Анализ содержания плазмабластов в разные сроки после вакцинации. В процессе дифференцировки В-лимфоцитов происходит изменение их фенотипа, по которому можно определить стадию созревания клеток, выделить субпопуляции плазмабластов и В-клеток памяти. Плазмабласты экспрессируют CD 19-молекулу и незначительное количество CD20, а также усиленно экспрессируют CD27- и CD38-молекулы. В процессе дальнейшей дифференцировки плазмабласты могут полностью терять экспрессию CD19- и CD20-молекул. Таким образом, плазмабласты могут иметь фенотипы: CD19⁺CD20^loCD27^hiCD38^hi, CD19⁺CD20^-CD27^hiCD38^hi, CD19^-CD20^-CD27^hiCD38^hi.

Для определения содержания субпопуляции плазмабластов мы гейтировали субпопуляции В-лимфоцитов по наличию/отсутствию CD19- и ОЛ20-молекул и анализировали экспрессию на их поверхности CD27^hiCD38^hi (см. рисунок). Обнаружено, что только в субпопуляциях CD19⁺CD20^- и CD19⁺CD20¹⁰ выявлены клетки с высокой экспрессией CD27^hiCD38^hi. Данные подтверждены методом обратного гейтирования. Таким образом, основной фенотип плазмабластов, циркулирующих в крови людей в ранние сроки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой, имели субпопуляции CD19⁺CD20^loCD27^hiCD38^hi и CD19⁺CD20^-CD27^hiCD38^hi.

Анализ процентного содержания плазмабластов с фенотипом CD19⁺CD20^-/loCD27^hiCD38^hi проводили в крови у людей на 5, 6, 7, 8-е сутки после вакцинации. Результаты исследований показали, что содержание плазмабластов увеличивалось на 6, 7, 8-е сутки после вакцинации по сравнению с их содержанием до вакцинации (табл. 2).

Сравнительный анализ изменения количества плаз-мабластов в крови доноров показал плавное нарастание количества плазмабластов к 7-м суткам вакцинального процесса с последующим снижением их содержания на 8-е сутки после вакцинации (см. табл. 2). Таким образом, транзиторное увеличение содержания субпопуляции CD19⁺CD20^-/loCD27^hiCD38^hi в крови доноров выявлено на 7-е сутки после их иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой.

Обсуждение

В-лимфоциты играют важную роль в формировании адаптивного иммунного ответа против патогенов, главным образом за счет способности синтезировать специфические антитела. Иммунизация вакциной живой сибиреязвенной сухой индуцирует синтез антител, специфических к антигенам B. anthracis [5]. Результаты наших исследований показали, что на 5-8-е сутки после иммунизации вакциной живой сибиреязвенной сухой у 5 из 12 доноров были выявлены антитела к ПА и у 2 из всех вакцинированных - к ЛФ. Все серопозитивные доноры были иммунизированы против сибирской язвы свыше 10 раз, что позволяет выдвинуть гипотезу о сохранении у них клеток памяти, способствующих быстрому синтезу специфических антител.

Основная роль антител к ПА и ЛФ заключается в нейтрализации ЛТ. Однако, как показали предыдущие исследования, не все антитела к ПА и ЛФ характеризуются токсин-нейтрализующей активностью [6]. В связи с этим сыворотку доноров проанализировали на способность нейтрализовать цитотоксическое действие ЛТ in vitro на клеточной линии J774.1. Сыворотка только 2 из 5 доноров ингибировала цитотоксическое действие ЛТ.

Появление антител в крови свидетельствует о том, что после первичного контакта с антигенами ПА и ЛФ в лимфатических узлах произошла диффренцировка лимфоцитов сначала в плазмабласты, а затем в плазматические клетки, синтезирующие специфические антитела. Короткоживущие плазматические клетки мигрируют из вторичных лимфоидных органов в костный мозг, где превращаются в долгоживущие плазматические клетки. В момент миграции плазмабластов в ниши иммунной системы, располагающихся в лимфатических узлах, костном мозге, селезенке или слизистых, ассоциированных с лимфатической тканью, их количество в кровяном русле увеличивается на короткий промежуток времени [7], что делает возможным выделение специфических плазмабластов из крови.

Фенотип плазмабластов определяется как CD19⁺CD20^loCD27^hiCD38^hi, CD19⁺CD20^-CD27^hiCD38^hi или CD19^-CD20^-CD27^hiCD38^hi. Так, CD38 и CD27 экспрессируются на большинстве плазмабластов в ярко выраженном количестве [8]. Молекула CD38 катализирует образование циклической АДФ-рибозы и НАДФ и регулирует Ca²⁺ в лимфоидной клетке [9]. Молекула CD27^- - член семейства рецепторов факторов некроза опухоли, она индуцирует дифференцировку и способствует выживанию клетки [10] и экспрессируется на большинстве B-клеток памяти [11]. В процессе дифференцировки B-лимфоцитов в плазмабласты снижается экспрессия СБ20-молекулы на поверхности клетки [12]. В исследованиях мы выявили, что плазмабласты, циркулирующие в крови людей в ранние сроки после иммунизации вакциной сибиреязвенной живой сухой, характеризовались фенотипами CD19⁺CD20^loCD27^hiCD38^hi и CD19⁺CD20^-CD27^hiCD38^hi.

Время максимального выброса плазмабластов в кровоток после иммунизации или инфекции колеблется в зависимости от пути проникновения антигенов и кратности вакцинации/инфекции и характера инфекционного агента. При острых инфекционных заболеваниях, например, после заражения вирусами гриппа, количество плазмабластов после выхода их в кровь снижается до базового уровня медленно в течение 2-3 нед [13]. После вакцинации волонтеров против вируса Денге максимальный выброс плазмабластов в кровь наблюдали на 13-е сутки [14]. После вакцинации аттенуированным штаммом YF-17D, вызывающим желтую лихорадку [15], инактивированной противогрип позной вакциной [16, 17], столбнячной вакциной [8] наибольшее количество плазмабластов у людей регистрировали на 6-е или 7-е сутки. Результаты наших исследований показали, что максимальное количество CD19⁺CD20^-/loCD27^hiCD38^hi-субпопуляции в крови после иммунизации людей вакциной живой сибиреязвенной сухой выявляли на 7-е сутки. На 8-е сутки исследований у вакцинированных доноров количество плазмабластов падало и достигало значений контроля.

Заключение

Таким образом, время максимального выброса плазмабластов в кровоток доноров соответствовало 7-му дню после иммунизации вакциной живой сибиреязвенной сухой.

Предварительный анализ наличия антител в крови к ПА и ЛФ, а также оценка их нейтрализующей активности в отношении сибиреязвенного токсина позволит выбрать наиболее перспективного донора для получения специфических плазмабластов с целью получения человеческих МкАТ к ПА или ЛФ, способных нейтрализовать ЛТ.

Литература

1. Zasada A. А. Injectional anthrax in human: а new face of the old disease. Adv. Clin. Exp. Med. 2018; 27 (4): 553-8.

2. Krantz B.A. Anthrax lethal toxin co-complexes are stabilized by contacts between adjacent lethal factors. J. Gen. Physiol. 2016; 148 (4): 273-5.

3. Маринин Л.И., Дятлов И.А., Мокриевич А.Н., Бахтеева И.В. и др. Методы изучения биологическихсвойств возбудителя сибирской язвы. М. : ГИГИЕНА, 2009.

4. Smith K., Crowe S.R., Garman L., Guthridge C.J. et al. Human monoclonal antibodies generated following vaccination with AVA provide neutralization by blocking furin cleavage but not by preventing oligomerization. Vaccine. 2012; 30 (28): 4276-83.

5. Chi X., Li J., Liu W., Wang X. et al. Generation and characterization of human monoclonal antibodies targeting anthrax protective antigen following vaccination with a recombinant protective antigen vaccine. Clin. Vaccine Immunol. 2015; 22 (5): 553-60.

6. Kelly-Cirino C.D., Mantis N.J. Neutralizing monoclonal antibodies directed against defined linear epitopes on domain 4 of anthrax protective antigen. Infect. Immun. 2009; 77 (11): 4859-67.

7. Caraux A., Klein B., Paiva B., Bret C. et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 2010; 95 (6): 1016-20.

8. Qian Y., Wei C., Eun-Hyung Lee F., Campbell J. et al. Elucidation of seventeen human peripheral blood B-cell subsets and quantification of the tetanus response using a density-based method for the automated identification of cell populations in multidimensional flow cytometry data. Cytometry B Clin. Cytometry. 2010; 78 (Suppl 1): 69-82.

9. Partida-Sanchez S., Cockayne D.A., Monard S., Jacobson E.L. et al. Cyclic ADP-ribose production by CD38 regulates intracellular calcium release, extracellular calcium influx and chemotaxis in neutrophils and is required for bacterial clearance in vivo. Nat. Med. 2001; 7 (11): 1209-16.

10. Borst J., Hendriks J., Xiao Y. CD27 and CD70 in T cell and B cell activation. Curr. Opin. Immunol. 2005; 17 (3): 275-81.

11. Wu Y.C., Kipling D., Dunn-Walters D.K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2011; 2 (81): 1-12.

12. Jego G., Bataille R., Pellat-Deceunynck C. Interleukin-6 is a growth factor for nonmalignant human plasmablasts. Blood. 2001; 97 (6): 1817-22.

13. Wrammert J., Onlamoon N., Akondy R.S., Perng G.C. et al. Rapid and massive virus-specific plasmablast responses during acute dengue virus infection in humans. J. Virol. 2012; 86 (6): 2911-8.

14. Magnani D.M., Silveira C.G.T., Ricciardi M.J., Gonzalez-Nieto L. et al. Potent plasmablast-derived antibodies elicited by the National Institutes of Health Dengue Vaccine. J. Virol. 2017; 91 (22).

15. Querec T.D., Akondy R.S., Lee E.K., Cao W. et al. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 2009; 10 (1): 116-25.

16. Cox R.J., Brokstad K.A., Zuckerman M.A., Wood J.M. et al. An early humoral immune response in peripheral blood following parenteral inactivated influenza vaccination. Vaccine. 1994; 12 (11): 993-9.

17. Halliley J.L., Kyu S., Kobie J.J., Walsh E.E. et al. Peak frequencies of circulating human influenza-specific antibody secreting cells correlate with serum antibody response after immunization. Vaccine. 2010; 28 (20): 3582-7.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)