Токсин-нейтрализующая активность моноклональных антител против летального токсина Bacillus anthracis

Резюме

Введение. Сибирская язва - антропозоонозная инфекция, возбудителем которой является грам-положительная спорообразующая бактерия Bacillus anthracis. При желудочно-кишечной и легочной форме заболевания сложно поставить диагноз на ранних этапах заболевания, а на поздних - антибиотикотерапия становится неэффективной, так как патогенез и исход заболевания определяют сибиреязвенные токсины. Ведущую роль в гибели больного играет летальный токсин. Одним из способов нейтрализации токсина сибирской язвы является применение моноклональных антител (МкАт), специфичных к субъединицам летального токсина (ЛТ): протективному антигену (ПА) или летальному фактору (ЛФ).

Цель исследования - охарактеризовать и оценить токсин-нейтрализующую активность МкАт в отношении летального токсина B. anthracis в экспериментах in vitro и in vivo.

Материал и методы. Для осуществления данной работы в прокариотической системе экспрессии были получены субъединицы ЛТ - полноразмерные протективный антиген (рПА) и летальный фактор (рЛФ). Были получены мышиные МкАт 1D6F10, 4F6F8, 9D5C9 и 1Е10, специфичные к ПА, которые были наработаны in vivo в асцитической жидкости. Выделение иммуноглобулиновой фракции из асцитической жидкости проводили посредством аффинной хроматографии на колонке с сорбентом Protein G Sepharose. Были определены доменная принадлежность и подкласс МкАт. Для выявления наиболее перспективного токсин-нейтрализующего МкАт нами были проведены эксперименты in vivo и in vitro: на лабораторных мышах линии BALb/c и на клеточной линии макрофагов мыши J774А.1 соответственно. Жизнеспособность клеток in vitro оценивали при помощи МТТ-теста.

Результаты. В результате проведенных экспериментов было выбрано наиболее перспективное МкАт против IV домена ПА - 1Е10. В эксперименте in vitro с применением клеточной мышиной макрофагоподобной линии J774А.1 было показано, что МкАт 1Е10 в концентрации 1,25 мкг/мл и выше способно нейтрализовать ЛТ в дозе IC50. В экспериментах in vivo на мышах линии BALB/c было установлено, что МкАт 1Е10 в дозе 100 мкг/мышь защищает 100 % животных от гибели при последующем введении 4LD50 ЛТ.

Заключение. Таким образом, МкАт 1Е10 является перспективным для получения на его основе химерного МкАт, нейтрализующего ЛТ B. anthracis, со сниженной иммуно-генностью для людей. Можно предположить, что МкАт 1Е10 ингибирует 1-й этап сборки ЛТ - взаимодействие ПА с поверхностными рецепторами эукариотических клеток и, таким образом, может оказывать токсин-нейтрализующее действие.

Ключевые слова:Bacillus anthracis; моноклональные антитела; летальный токсин; протективный антиген; летальный фактор; токсин-нейтрализующая активность

Для цитирования: Романенко Я.О., Марьин М.А., Рябко А.К., Карцева А.С., Силкина М.В., Зенинская Н.А., Шемякин И.Г, Дятлов И.А., Фирстова В.В. Токсин-нейтрализующая активность моноклональных антител против летального токсина Bacillus anthracis. Иммунология. 2021; 42 (3): 232-242. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-232-242

Финансирование. Работа выполнена в рамках отраслевой программы Роспотребнадзора (Регистрационный номер 116030310014).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Введение

По данным Роспотребнадзора, ежегодно регистрируются единичные случаи заболеваний сибирской язвой. Однако на территории Российской Федерации насчитывается свыше 35 тыс. стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов, из них около 8 тыс. сибиреязвенных скотомогильников. Максимальное количество сибиреязвенных скотомогильников приходится на Приволжский, Центральный и Южный федеральные округа Российской Федерации [1]. В связи с этим в стране сохраняется неблагоприятная эпидемиологическая обстановка по сибиреязвенной инфекции. Подтверждением является вспышка сибирской язвы в июле-августе 2016 г. на территории Ямальского района Ямало-Ненецкого автономного округа, приведшая к заболеванию 36 человек, в том числе 18 детей, с 1 летальным исходом [2]. Также не стоит забывать о странах, граничащих с РФ. Например, по данным Роспотребнадзора, с начала 2018 г. на территории Китайской Народной Республики зарегистрировано 106 случаев сибирской язвы среди населения. В связи с подобными вспышками в близлежащих государствах возникает угроза завоза инфекции на территорию РФ [3].

Кроме того, споры сибирской язвы могут быть использованы в качестве биологического оружия. Экспертами Всемирной организации здравоохранения вычислено, что через 3 дня после применения 50 кг спор возбудителя сибирской язвы на протяжении 2-километровой зоны по направлению ветра в сторону города с населением 500 тыс. человек поражение инфекцией возникнет у 125 тыс. жителей, из них впоследствии погибнет 95 тыс. человек [4, 5].

Самой распространенной формой заболевания является кожная. Входные ворота инфекции - микротравмы и повреждения кожных покровов. Кожная форма эффективно лечится антибиотиками, однако лечению плохо поддаются легочная или кишечная формы заболевания, которые усугубляются сложностью постановки диагноза. На поздних стадиях сибиреязвенной инфекции терапия антибиотиками становится неэффективной и больной погибает в течение 24 ч из-за накопления в крови большого количества летального токсина (ЛТ), что приводит к развитию шокового состояния с последующим летальным исходом [6]. При генерализованной форме сибиреязвенной инфекции эффективной может быть только специфическая терапия, направленная против токсинов. Одним из возможных препаратов могут быть моноклональные антитела (МкАт) против ЛТ сибирской язвы. Нами был получен ряд МкАТ мыши против ПА Bacillus anthracis, которые в перспективе могут быть использованы для антитоксической терапии при лечении сибиреязвенной инфекции после их доработки (химеризации, гуманизации).

Материал и методы

Получение и очистка рекомбинантного летального токсина. Рекомбинантные белки - субъединицы ЛТ B. anthracis - полноразмерный протективный антиген (рПА) [7] и летальный фактор (рЛФ) [8], а также GST-содержащий III домен и 6His-несущий IV домен ПА (рПА III и рПА IV), получили в прокариотической системе экспрессии. Продуценты рекомбинантных белков получали, трансформируя штамм E. coli BL21(DE3) экспрессионными плазмидами pET22b-PA, pET22b-LF, pET22b-PAIII и pET22b-PAIV. Трансформанты высевали на твердую агаризованную среду на основе 2xYT, содержащую 1 % глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина. Полученные трансформанты наращивали в жидкой среде 2xYT, содержащей 0,1 % глюкозы и 100 мкг/мл ампициллина, при 37 °С до достижения оптимальной оптической плотности культуры. Экспрессию белка индуцировали добавлением 0,4 мМ изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) и проводили накопление продукта при 30 °С в течение 6 ч. Бактериальную биомассу собирали центрифугированием. Очистку осветленного центрифугированием лизата проводили на колонке, набитой сорбентом cOmplete™ His-Tag Purification Resin (Roche, Германия), с последующей доочисткой на гель-фильтрационной колонке Superdex 200 (GE Healthcare, Великобритания). Эффективность очистки проверяли с помощью электрофореза в 10 % полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях.

Получение и очистка МкАт к протективному антигену Bacillus anthracis. Для получения МкАТ, специфичных к ПА, мышей линии BALB/c иммунизировали по следующей схеме: вводили подкожно рПА в дозе 100 мкг/мышь с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), через 2 нед повторно иммунизировали в дозе 100 мкг/мышь с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ), спустя 2 нед мышей реиммунизировали в дозе 100 мкг/мышь рПА без адъюванта. На 3-и сутки после последней иммунизации проводили гибридизацию спленоцитов гипериммунных мышей (1 - 108 клеток) по методу Келера и Мильштейна с партнером для слияния - клетками мышиной миеломы линии Sp2/0-Ag14 (1 - 107 клеток). В качестве агента для слияния применяли раствор полиэтиленгликоля в диметилсульфоксиде. Слившиеся клетки рассевали в лунки культуральных планшетов с заранее подготовленным фидерным слоем. После гибридизации проводили селекцию с применением HAT, скрининг, клонирование и криоконсервацию гибридных клеток. Было проведено 2 гибридизации. В результате 1- й получили МкАт 1Е10 и 1D6F10 [7]. В результате 2- й гибридизации были получены МкАт 4F6F8 и 9D5C9. Все МкАт наращивали in vivo в асцитической жидкости в мышах. Выделение фракции иммуноглобулинов из асцитической жидкости проводили c помощью аффинной хроматографии на колонке с сорбентом Protein G Sepharose (GE Healthcare, Великобритания) с последующей доочисткой на колонке Superdex 200. Эффективность очистки проверяли с помощью электрофореза в 10 % ПААГ в денатурирующих условиях.

Определение доменной и классовой принадлежности МкАт. Оценку иммунологической специфичности МкАТ проводили методом иммуноблота (вестерн-блоттинга) с рекомбинантным белком ПА В. anthracis, а также III и IV доменами ПА для определения доменной специфичности МкАт, проявляющих активность в отношении рПА. Рекомбинантные белки подвергали электрофорезу в 10 % ПААГ, после чего осуществляли горизонтальный перенос белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (GE Healthcare, Великобритания) в системе быстрого полусухого переноса Trans-Blot® Turbo™ Transfer System (Bio-Rad, США). После завершения переноса мембрану блокировали, погружая в обезжиренное молоко с массовой долей жира не более 0,5 % и инкубируя в течение 1 ч на орбитальном термостатируемом шейкере при 300 об/мин и температуре 37 °С. Для промывки мембран использовали фосфатно-солевой буфер (ФСБ) с добавлением 0,05 % Твин-20 (ФСБ-Т) (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,76 мМ KH2PO4, рН 7,4). Блокированные и промытые мембраны разрезали на полоски так, чтобы на каждой присутствовали маркеры молекулярных масс и все исследуемые мишени. Инкубировали каждую полоску отдельно с исследуемыми МкАт в концентрации 1 мкг/мл в ФСБ. Все мембраны инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 °С. Далее, после 3-кратной промывки буфером ФСБ-Т, полоски инкубировали с пероксидазным конъюгатом к суммарной фракции IgG мыши (Anti-Mouse IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in rabbit, Sigma, США) в разведении 1 : 10 000, затем 4 раза промывали ФСБ-Т. Визуализацию продуктов реакции проводили 0,05 % раствором диаминобензидина (Sigma, США) в ФСБ с добавлением 0,015 % Н2О2. Реакцию останавливали промывкой дистиллированной водой, мембраны высушивали (рис. 1). Подкласс МкАт определяли в иммунохроматографическом тесте с использованием набора для определения изотипов МкАт мыши (Roche Diagnostic Corporation, США) (рис. 2).

Рис. 1. Специфическая активность моноклональных антител по отношению к полноразмерному протективному антигену (ПА), III и IV доменам ПА B. Anthracis

А - результаты электрофоретического разделения белков в 10 % ПААГ, окраска Кумасси R-250: 1 - маркеры молекулярных масс SM0671 (Fermentas, США); 2 - рекомбинантный полноразмерный ПА; 3 - рекомбинантный III домен ПА; 4 - рекомбинантный IVдомен ПА; Б-Д- результаты вестерн-блот-анализа рекомбинантных белков с детекцией антителами: 1D6F10 (Б); 1Е10 (В); 4F6F8 (Г); 9D5C9 (Д): 1 - маркеры молекулярных масс SM0671 (Fermentas, США); 2 - рекомбинантный полноразмерный ПА; 3 - рекомбинантный IV домен ПА; 4 - рекомбинантный III домен ПА.

Рис. 2. Классовая принадлежность моноклональных антител (МкАт)

1 - МкАт 1D6F10; 2 - МкАт 4F6F8; 3 - МкАт 9D5C9; 4 - МкАт 1Е10.

Токсин-нейтрализующая активность МкАт in vitro. Тест был проведен на клеточной линии J774А.1 макрофагов мыши. Жизнеспособность клеток оценивали при помощи МТТ-теста (Mosmann, 1983) [МТТ - тетразолиевый краситель 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолиум бромид]. В лунки 96-луночного планшета вносили макрофаги J774А.1 в концентрации 2 - 104 клеток на лунку, инкубировали 12 ч при 37 °С и 5 % CO2. В тесте использовали рекомбинантный ЛТ. Для этого смешивали субъединицы ЛТ в концентрации, составляющей IC50: рПА 0,5 мкг/мл и рЛФ 0,1 мкг/мл (концентрация IC50 определена в предварительных экспериментах). Для оценки токсин-нейтрализующей активности МкАт использовали в концентрациях 2,5; 1,25; 0,625 и 0,3125 мкг/мл, что соответствует молярным соотношениям МкАт : рПА - 2,5 : 1; 1,25 : 1; 0,625 : 1 и 0,3125 : 1. ЛТ и МкАт смешивали в концентрациях, 10-кратно превышающих требуемые, выдерживали 30 мин для связывания МкАт с ПА83, а затем добавляли по 10 мкл смеси в лунки с клетками, содержащие по 90 мкл культуральной среды. Для определения токсин-нейтрализующей активности МкАт дополнительно анализировали жизнеспособность клеточной культуры при добавлении 10 мкл чистого ФСБ и принимали жизнеспособность клеток в данных лунках за 100 % после инкубации (по показателю OD540). Также в другую группу лунок добавляли по 10 мкл 0,25 % мертиолята натрия и приравнивали их жизнеспособность к 0 %. Кроме того, в качестве контроля в лунки со средой добавляли МкАт 1D6F10, 4F6F8, 9D5C9 против III домена ПА и 1E10 против IV домена ПА без ЛТ. Время инкубации всех образцов с клетками 1774А.1 составило 4 ч. По окончании инкубации во все лунки вносили по 10 мкл раствора МТТ (до конечной концентрации 5 мкг/мл) в ФСБ и инкубировали при тех же условиях в течение ночи. Затем в лунки планшета вносили по 150 мкл диметилсульфоксида для растворения кристаллов формазана и измеряли оптическую плотность при длине волны 540 нм на планшетном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) (рис. 3).

Рис. 3. Токсин-нейтрализующая активность моноклональных антител (МкАт) 1D6F10, 4F6F8, 9D5C9, 1E10 на клеточной линии мышиных макрофагов 1774А.1 (по результатам МТТ-теста)

Определение LD50 летального токсина на модели in vivo. Для определения LD50 готовили разведения ЛТ (рПА/рЛФ = 1/1), начиная с 24 мкг/мышь (по общему белку) до 4 мкг/мышь с 2-кратным шагом разведения. Полученные растворы вводили мышам линии BALb/с (по 9 мышей в группе) в ретроорбитальную вену глаза. Контрольная группа получала инъекции чистого ФСБ. Учет гибели животных проводили 1 раз в сутки в течение 14 дней. Значение LD50 рассчитывали по формуле Кербера:

LD50 = LD100 - (Z × D) / M,

где D - интервал между каждыми двумя смежными дозами; Z - среднее арифметическое числа животных, у которых наблюдалась учитываемая реакция; M - число животных в каждой группе.

Определение токсин-нейтрализующей активности МкАт in vivo. Для определения защитной дозы МкАт, позволяющий нейтрализовать ЛТ, мышам линии BALb/с (по 9 голов в группе) вводили МкАт 1D6F10, 4F6F8, 9D5C9 против III домена ПА и 1E10 против IV домена ПА в дозах 25, 50 и 100 мкг/мышь. Через 24 ч после введения МкАт мышам внутрибрюшинно вводили ЛТ в дозе 4LD50 (50 мкг/мышь ЛТ, рПА/рЛФ=1/1). Учет гибели животных проводили 1 раз в сутки в течение 14 дней. Для достоверности результатов брали 5 контрольных групп животных. 1-й контрольной группе животных (по 9 голов в группе) вводили инъекцию чистого ЛТ (50 мкг/мл рПА / 50 мкг/мл рЛФ = 1/1). Другим контрольным группам животных (по 9 голов в группе) вводили одно из исследуемых МкАт в максимальной концентрации 100 мкг/мышь (рис. 4-7).

Рис. 4. Токсин-нейтрализующая активность моноклональных антител (МкАт) 1D6F10 на модели in vivo

Рис. 5. Токсин-нейтрализующая активность моноклональных антител (МкАт) 4F6F8 на модели in vivo

ЛТ - летальный токсин.

Рис. 6. Токсин-нейтрализующая активность моноклональных антител (МкАт) 9D5C9 на модели in vivo

Рис. 7. Токсин-нейтрализующая активность моноклональных антител (МкАт) 1Е10 на модели in vivo

Оценка длительности циркуляции МкАт in vivo. Мышей линии BALB/c разделили на 2 группы по 9 животных. 1-й группе животных вводили перитонеально МкАт в разных концентрациях (100, 500, 1000 мкг/мышь в ФСБ, по 3 мыши в подгруппе), 2-й контрольной группе вводили чистый ФСБ. Чтобы оценить длительность циркуляции введенного антитела в кровяном русле, у животных из ретроорбитальной вены глаза отбирали кровь на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 14 и 21-е сутки. Для определения титров антител в крови у животных проводили непрямой твердофазный иммуноферментный анализ. В лунки 96-луночного полистиролового планшета вносили по 100 мкл раствора с рПА в концентрации 1 мкг/мл на лунку в ФСБ и инкубировали при температуре 37 °С в течение 2 ч на планшетном орбитальном шейкере (Elmi, Латвия) при скорости вращения платформы 370 об/мин. Трижды отмывали ФСБ-Т, каждый раз внося в лунки планшета по 200 мкл отмывающего раствора. Затем свободные валентности пластика блокировали молоком с массовой долей жира не более 0,5 %, внося по 200 мкл на лунку, и инкубировали при температуре 37 °С в течение 1 ч при тех же условиях. Трижды отмывали ФСБ-Т. Далее во все 1-е лунки ряда вносили кровь в разведении 1 : 100 в 2-кратном повторе, титровали в вертикальных рядах с 2-кратным шагом и инкубировали при тех же условиях, после чего отмывали 3 раза. Добавляли в лунки конъюгат кроличьих антител против IgG мыши с пероксидазой хрена в разведении 1 : 10 000. Планшет инкубировали при температуре 37 °C в течение 40 мин на шейкере, затем 6 раз отмывали ФСБ-Т. После этого в лунки вносили по 100 мкл субстрат-индикаторного раствора (10 мкл 30 % Н202 и 8 мг ортофенилендиамина на 10 мл фосфатно-цитратного буфера рН 5,0). Положительную реакцию оценивали по появлению желто-коричневого окрашивания раствора. Реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 4N серной кислоты. Детекцию проводили на планшетном спектрофотометре xMark (Bio-Rad, США) при длине волны 492 нм (рис. 8). Предельным титром считали такое разведение сыворотки крови животных, значение оптической плотности для которого превышало таковое в лунках c отрицательным контролем как минимум в 2 раза.

Рис. 8. Длительность циркуляции моноклональных антител (МкАт) 1E10 против IV домена протективного антигена (ПА) в крови животных

Время полувыведения антител рассчитывали по формуле:

T1/2=(t2- t1) × ln × (2)/ln × ([C1 - C2]),

где T1/2 - время полувыведения МкАт из организма животных; t2 и t1 - время в точках 2 и 1, соответственно; С1 и С2 - титры специфических МкАт в сыворотке крови животных в точках 1 и 2, соответственно.

Рассчитывали значение T1/2 для каждой вводимой животным концентрации, после чего находили среднее арифметическое.

Результаты

Определение доменной и классовой принадлежности МкАт

На основании данных иммуноблоттинга с использованием МкАт со специфической активностью против полноразмерного ПА было выявлено, что гибридомы 1D6F10, 4F6F8 и 9D5C9 синтезировали антитела против III домена ПА, гибридома 1Е10 синтезировала антитела против IV домена ПА (см. рис. 1).

Результаты иммунохроматографического теста показали, что МкАт 1D6F10, 4F6F8, 9D5C9 против III домена ПА и МкАт 1Е10 против IV домена ПА относятся к иммуноглобулинам G, изотипу G1 (см. рис. 2).

Токсин-нейтрализующая активность МкАт 1D6F10, 4F6F8, 9D5C9 против III домена ПА и 1E10 против IV домена ПА на модели in vitro

Сравнительный анализ токсин-нейтрализующей активности на клеточной линии 1774А.1 позволил выявить наиболее перспективное МкАт: МкАт 1Е10 в концентрациях от 1,25 мкг/мл нейтрализовало ЛТ. При этой концентрации жизнеспособность клеток J774A.1 составила 73 %, а при концентрации МкАт 1Е10 2,5 мкг/мл - 99 %. Токсин-нейтрализующее действие МкАт 4F6F8 начиналось от концентрации 1,25 мкг/мл, при которой жизнеспособность клеток J774A.1 составила 60 %, а при концентрации 2,5 мкг/мл - 82 %. МкАт 1D6F10 в концентрации 1,25 мкг/мл не блокировало действие ЛТ. Жизнеспособность клеток J774A.1 составила 47 %, при увеличении концентрации МкАт 1D6F10 до 2,5 мкг/мл - 57 %. МкАт 9D5C9 не обладает токсин-нейтрализующей активностью даже при максимальной концентрации 2,5 мкг/мл, жизнеспособность клеток J774A.1 составила 19,5 %. При этом МкАт не является токсичным для линии J774A.1, о чем свидетельствует 100 % выживаемость клеток без ЛТ в среде с добавлением максимальной исследуемой концентрации МкАт 9D5C9. Это свидетельствует о потенцирующем эффекте МкАт 9D5C9, которое усиливает действие ЛТ (см. рис. 3).

Токсин-нейтрализующая активность МкАт 1D6F10 против III домена ПА на модели in vivo

О токсин-нейтрализующей активности МкАт 1D6F10 судили по выживаемости мышей после введения им ЛТ в дозе 4LD50. За сутки до введения токсина мышам внутрибрюшинно вводили МкАт в дозах от 25 до 100 мкг/мышь. Высокая эффективность нейтрализации ЛТ была выявлена только при концентрации МкАт 1D6F10 100 мкг/мышь - выживаемость животных составила 70 %. При введении МкАт 1D6F10 в концентрации 50 мкг/мышь наблюдалась незначительная токсин-нейтрализующая активность - выживаемость животных составила лишь 30 %. При введении МкАт в концентрации 25 мкг/мышь все животные пали на 3-и сутки (см. рис. 4).

Токсин-нейтрализующей активность МкАт 4F6F8 против III домена ПА на модели in vivo

На основании данных о выживаемости мышей после введения им ЛТ в дозе 4LD50 было выявлено, что МкАт 4F6F8 обладает низкой токсин-нейтрализующей активностью, при повышении концентрации наблюдается увеличение продолжительности жизни животных. При введении МкАт в концентрации 25 мкг/мышь все мыши пали на 1-е сутки. При введении МкАт в концентрации 50 мкг/мышь животные пали на 4-е сутки. Введение МкАт в концентрации 100 мкг/мышь увеличивало продолжительности жизни животных до 10 суток (см. рис. 5).

Токсин-нейтрализующая активность МкАт 9D5C9 против III домена ПА на модели in vivo

На основании данных о выживаемости мышей после введения им ЛТ в дозе 4LD50 было выявлено, что МкАт 9D5C9 ни в одной из концентраций не защищало мышей от гибели. При введении МкАт 9D5C9 все животные гибли в 1-е сутки эксперимента, как и мыши контрольной группы, которым вводили только ЛТ в концентрации 4LD50 (см. рис. 6).

Токсин-нейтрализующая активность МкАт 1E10 против IV домена ПА на модели in vivo

Было выявлено, что введение МкАт 1Е10 обладает нейтрализующей активностью в отношении ЛТ B. anthracis. При введении МкАт в дозе 100 мкг/мышь выживаемость животных составила 100 %, при введении МкАт в дозе 50 мкг/мышь - 70 %, при введении МкАт в дозе 25 мкг/мышь все животные пали на 1-е сутки (см. рис. 7).

Оценка длительности циркуляции МкАт 1E10 против IV домена ПА на модели in vivo

МкАт 1Е10 показало наиболее эффективную токсин-нейтрализующую активность и была проанализирована длительность его циркуляции в кровяном русле мышей. Как и ожидалось, максимальное количество МкАт 1Е10 обнаруживалось на 1-е сутки. В последующие сроки проведения анализа концентрация антител снижается и на 21-й день после введения МкАт 1Е10 в дозе 100 мкг/мышь титр этих антител в сыворотке крови составил 1 : 200. При введении МкАт в более высоких дозах (500 и 1000 мкг/мышь) титры антител к 21-му дню после их введения составили 1 : 400 и 1 : 800 соответственно (см. рис. 8). Титры специфических антител у мышей контрольной группы не регистрировались. Рассчитанное время полувыведения для МкАт 1Е10 составило 4,33 суток.

Обсуждение

Бактерии Bacillus anthracis продуцируют термолабильные белки: ПА (82,7 кДа), ЛФ (90,2 кДа) и отечный фактор (ОФ) (89 кДа) [9, 10]. ПА в комбинации с ЛФ образуют ЛТ - основной фактор патогенности возбудителя сибирской язвы, обеспечивающий летальность при сибиреязвенной инфекции [11]. ПА является центральным компонентом белкового токсина, каждый состоит из 4 структурных независимых доменов. Основная функция домена I заключается в связывании ПА с ЛФ. Домен II участвует в формировании петли, которая в дальнейшем встраивается в мембрану и образует катион-селективный канал. Домен III участвует в олигомеризации ПА и связывании олигомерной структуры с ЛФ и/или ОФ. Функция домена IV заключается в связывании ПА с рецепторами на поверхности эукариотических клеток [12, 13]. На 1-м этапе ПА с участием домена IV связывается с рецепторами на поверхности эукариотических клеток, и сразу после этого полноразмерный ПА с молекулярной массой 83 кДа расщепляется фурин-подобными протеазами клетки хозяина с образованием ПА63 (63 кДа) и ПА20 (20 кДа) [13]. ПА63 начинают олигомеризоваться с участием домена III ПА, образуя гептамерные или октамерные структуры, называемые препорами. С одним гептамером связываются 3 молекулы ЛФ и/или ОФ, а с одним октамером - 4 молекулы ЛФ и/или ОФ. С помощью домена I ПА связывается с ЛФ и/или ОФ, образуя ЛТ или отечный токсин (ОТ), который в дальнейшем проникает в клетку с помощью клатрин-зависимого эндоцитоза. Таким образом происходит формирование эндосомы. Содержимое эндосомы постепенно закисляется, вследствие чего ПА изменяет свою конформацию и встраивается в мембрану эндосомы. Это приводит к формированию истиной поры. С участием доменов I и II происходит транслокация ЛФ или ОФ через истинную пору в цитозоль эукариотической клетки. Проявление токсического действия ЛТ осуществляется за счет расщепления летальным фактором МАРК-киназ, что в дальнейшем приводит к апоптозу [14-16]. Учитывая, что ЛТ проявляет свои токсические свойства только в собранном виде, можно предположить, что антитела, ингибирующие любой из этап сборки токсина, будут характеризоваться токсин-нейтрализующими свойствами.

Известно множество работ, в которых описано получение мышиных МкАт, нейтрализующих ЛТ B. anthracis. Так, в работе C.D. Kelly-Cirino и N.J. Mantis [17] описано получение пула МкАт против доменов III и IV ПА. Авторы подробно исследовали 3 клона МкАт: 2-А7 со специфичностью к III домену ПА, 1-F1 и 2-В12 к домену IV ПА. МкАт к домену III ПА не показало никакой нейтрализующей активности как в тесте in vitro, так и в тесте in vivo. МкАт 1-F1 в тесте in vitro показало токсин-нейтрализующую активность 50 % в концентрации 0,2 мкг/мл и 100 % - в концентрации более 0,7 мкг/мл в отношении 60 нг ЛТ. МкАт 2-В12 в том же тесте проявило меньшую активность: потребовалась концентрация МкАт 0,4 мкг/мл для 50 % защиты клеток, а максимальная токсин-нейтрализующая активность не превышала 90 % даже при использовании МкАт в концентрации 2,5 мкг/мл и выше. При проведении теста на нейтрализацию ЛТ in vivo МкАт в количестве 550 мкг/мышь вводили через 5 мин после инъекции ЛТ в дозе 100 мкг/мышь. По истечении срока наблюдения (80 ч) в группе, которой вводили МкАт 1-F1 совместно с ЛТ, выживаемость составила 40 %, при этом МкАт 2-В 12 защищало лабораторных животных лучше - выживаемость на конец эксперимента зафиксирована на уровне 60 %.

F. Brossier и соавт. [18] также получили мышиные МкАт, нейтрализующие действие ЛТ возбудителя сибирской язвы. Полученные in vitro результаты (МТТ-тест) свидетельствуют о 100 % токсин-нейтрализующем эффекте МкАт 7.5 (специфичны к домену IV ПА) в концентрации 10 мкг/мл и МкАт 48.3 (специфичны к домену III ПА) в концентрации 1 мкг/мл при преинкубировании указанных МкАт с ЛТ (500 нг/мл ПА + 1 мкг/мл ЛФ) в течение 1 ч. В данной работе тест in vivo был проведен на аутбредных мышах лини OF1 с заражением животных штаммом B. anthracis Sterne (10 LD50) через 16 ч после введения исследуемых МкАт. Максимальный протективный эффект достигался при введении МкАт 7.5 или 48.3 по отдельности в количестве 100 мкг/мышь или при сочетанном введении обоих МкАт в количестве по 10 мкг/мышь каждого - достигнута 75 % выживаемость животных. Полностью защитить животных от заражения штаммом Sterne удалось лишь при сочетании обоих указанных МкАт против ПА и одного нейтрализующего МкАт против рецептор-связывающего эпитопа ЛФ.

Одним из первых охарактеризованных МкАт, нейтрализующих ЛТ B. anthracis, было МкАт 14В7 [19, 20]. В МТТ-тесте данное МкАт показывало 50 % токсин-нейтрализующую активность в концентрации 0,32 мкг/мл при использовании ЛТ в концентрации 80 нг/мл ПА + 80 нг/мл ЛФ. В экспериментах на крысах МкАт 14В7 в количестве 40 мкг обеспечивает 100 % выживаемость животных при внутривенном введении им 40 мкг ПА и 8 мкг ЛФ. На основе данного МкАт разработаны химерные и гуманизированные токсин-нейтрализующие МкАт [20].

Установлено, что 3 из 4 полученных и исследованных нами гибридом синтезировали МкАт против домена III ПА (1D6F10, 4F6F8, 9D5C9), 1 гибридома синтезировала МкАт против домена IV ПА (1Е10). Все МкАт относятся к иммуноглобулинам G, изотипу G1. Токсин-нейтрализующая активность полученных МкАт сопоставима с описанными выше МкАт, направленными против ПА.

В модельных экспериментах in vitro нами было выявлено наиболее перспективное МкАт 1E10 против домена IV ПА, которое нейтрализовало ЛТ (500 нг/мл ПА + 100 нг/мл ЛФ) в наиболее низких по сравнению с другими МкАт концентрациях: МкАт 1Е10 в концентрации от 1,25 мкг/мл обеспечивало 100 % жизнеспособность клеток. Гибридома 4F6F8, которая синтезирует МкАт против домена III ПА, нейтрализовала ЛТ в концентрации 2,5 мкг/мл, при этом жизнеспособность клеток составила 82 %.

Токсин-нейтрализующая активность МкАт 1E10 как наиболее перспективного препарата для нейтрализации ЛТ была проанализирована в экспериментах in vivo на мышах линии BALB/c. Результаты исследований показали, что внутрибрюшинного введения МкАт 1E10 в дозе 100 мкг/мышь достаточно для предотвращения гибели животных от последующего внутривенного введения ЛТ B. anthracis в дозе 4LD50 (50 мкг ПА + 50 мкг ЛФ на мышь).

Для препаратов иммуноглобулинов с потенциальным терапевтическим действием также определяют фармакокинетические параметры, в частности время полувыведения вещества из кровяного русла. Первичные исследования проводят с помощью моделей на лабораторных животных (мышах, крысах, морских свинках, кроликах, обезьянах). В качестве терапевтических МкАт, нейтрализующих токсин возбудителя сибирской язвы, рассматривают, например, полностью человеческие полноразмерные МкАт [21-23], химерные МкАт мышь-человек [20, 24], scFv-фрагменты мышиных МкАт [25], фрагменты мышиных МкАт, конъюгированных с ПЭГ [26], но не полноразмерные мышиные МкАт. Время полувыведения антител (T1/2) зависит от дозы, размера молекулы вещества, места введения и выбранной модели на животных. Так, полноразмерные человеческие МкАт IQNPA и IQNLF при введении мышам в дозе 100 мкг на животное показали T1/2, равное 11,2 и 6,8 дней, соответственно [22]. При интраперитонеальном введении мышам человеческого антитела AVP-21D9 в дозе 1000 мкг/мышь (50 мг/кг) регистрировали время полувыведения 2,8 ± 1,4 дня. При введении этого же МкАт кроликам Т варьировало от 5,0 ± 2,7 до 8,9 ± 2,7 дней в зависимости от дозы (1 или 10 мг/кг соответственно), а в экспериментах на морских свинках - 4,5 ± 1,6 или 13,8 ± 8,1 дней (5 или 50 мг/кг соответственно) [23]. ScFv-фрагменты ожидаемо имеют время полувыведения, измеряемое минутами [25]. Химерное модифицированное МкАт ETI-204, сконст руированное на основе мышиного МкАт 14В7 и зарегистрированное как Anthim (Obiltoxaximab), при внутривенном введении кроликам в дозе 10 мг/животное показало T1/2 3,8 ± 0,5 дней или, по другим данным, 1-2 дня [20, 27].

В среднем время циркуляции IgG-антител в организме составляет 21 день. Однако на длительность циркуляции антител большое влияние оказывают посттрансляционные модификации белка. Существенным влиянием на фармакокинетику и фармакодинамику антител оказывают особенности их гликозилирования. В зависимости от особенностей гликозилирования может меняться как аффинность к рецепторам эукариотических клеток и соответственно рецептор-опосредованный клиренс, так и степень защищенности антитела от воздействия протеаз. В связи с этим мы проанализировали длительность циркуляции МкАт 1Е10. Введенные мышам МкАт 1Е10 выявлялись в организме животных на протяжении минимум 21 дня. Их титры снижались до значений 1 : 200, 1 : 400, 1 : 800 в соответствии с их начальной дозой (100, 500, 1000 мкг/мышь). Рассчитанное среднее Т1/2 мышиного МкАт 1Е10 составило 4,33 дня, что сравнимо с данными экспериментов на животных для большинства терапевтических человеческих и химерных антител против ПА.

Заключение

На основании результатов экспериментов, проведенных на клеточной линии 1774А.1 и на мышах линии BALb/c, выявлено наиболее эффективное токсин-нейтрализующее МкАт 1Е10, относящееся к IgG1, направленное против домена IV ПА. Учитывая механизмы сборки ЛТ, можно предположить, что МкАт 1Е10 ингибирует 1-й этап сборки ЛТ - взаимодействие ПА с поверхностными рецепторами клеток, и, таким образом, может ингибировать проникновение ЛТ в клетку. Как известно, МкАт мыши являются иммуногенными для человека. С целью получения терапевтического МкАт гибридома, синтезирующая МкАт 1Е10, может быть использована для конструирования химерного или гуманизированного МкАт.

Вклад авторов

Концепция и дизайн исследования - Дятлов И. А.; сбор и обработка материала - Романенко Я.О., Силкина М.В., Зенинская Н.А.; статистическая обработка - Карцева А.С.; написание и редактирование текста - Рябко А.К.; ответственность за целостность всех частей статьи - Шемякин И.Г.; утверждение окончательного варианта статьи - Фирстова В.В.

Литература

1. Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 7 июня 2010 г. № 01/8458-0-32 "О сибиреязвенных скотомогильниках".

2. О ситуации по сибирской язве и мерах профилактики. 10 июля 2020 г. URL: http://70.rospotrebnadzor.ru/epidemiologic_situation/144415/

3. О сибирской язве в Китае. 10 июля 2020 г. URL: https://www.rospotrebnadzor.ru/about/info/news/news_details.php?ELEMENT_ID=9991&sphrase_id=2572722

4. Cieslak T.J., Eitzen E.M. Jr. Clinical and epidemiologic principles of anthrax. Emerg. Infect. Dis. 1999; 5 (4): 552-5.

5. Рубинштейн Э. Биотерроризм: значение антимикробных препаратов. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001; 4 (3): 290-300.

6. Hughes J.M., Gerberding J.L. Anthrax bioterrorism: lessons learned and future directions. Emerg. Infect. Dis. 2002; 8 (10): 1013-4.

7. Белова Е.В., Колесников А.В., Захарова М.Ю., Дубилей С.А., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Особенности иммунного ответа на летальный токсин Bacillus anthracis. Биоорганическая химия. 2008; 34 (5): 639-44.

8. Zakharova M.Yu., Kuznetsov N.A., Dubiley S.A., Kozyr A.V., Fedorova O.S., Chudakov D.M., Knorre D.G., Shemyakin I.G., Gabibov A.G., Kolesnikov A.V. Substrate Recognition of Anthrax Lethal Factor Examined by Combinatorial and Pre-steady-state Kinetic Approaches. J Biol Chem. 2009; 284 (27): 17902-13.

9. Smith H. Discovery of the anthrax toxin: the beginning of in vivo studies on pathogenic bacteria. Trends Microbiol. 2000; 8 (5): 199-200.

10. Aulinger B.A., Roehrl M.H., Mekalanos J.J., Collier R.J., Wang J.Y. Combining anthrax vaccine and therapy: a dominant-negative inhibitor of anthrax toxin is also a potent and safe immunogen for vaccines. Infect. Immun. 2005; 73 (6): 3408-14.

11. Petosa C., Collier R.J., Klimpel K.R., Leppla S.H., Liddington R.C. Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen. Nature. 1997; 385 (6619): 833-8.

12. Green B.D., Flatt P.R., Bailey C.J. Dipeptidyl peptidase IV (DPP IV) inhibitors: a newly emerging drug class for the treatment of type 2 diabetes. Diabetes Vasc. Dis. Res. 2006; 3 (3): 159-65.

13. Little S.F., Novak J.M., Lowe J.R., Leppla S.H., Singh Y., Klimpel K.R., Friedlander A.M. Characterization of lethal factor binding and cell receptor binding domains of protective antigen of Bacillus anthracis using monoclonal antibodies. Microbiology. 1996; 142 (3): 707-15.

14. Liu S., Zhang Y., Hoover B., Leppla S.H. The receptors that mediate the direct lethality of anthrax toxin. Toxins (Basel). 2012; 5 (1): 1-8.

15. Kirby J.E. Anthrax lethal toxin induces human endothelial cell apoptosis. Infect. Immun. 2004; 72 (1): 430-9.

16. Comer J.E., Chopra A.K., Peterson J.W., König R. Direct inhibition of T-lymphocyte activation by anthrax toxins in vivo. Infect. Immun. 2005; 73 (12): 8275-81.

17. Kelly-Cirino C.D., Mantis N.J. Neutralizing monoclonal antibodies directed against defined linear epitopes on domain 4 of anthrax protective antigen. Infect. Immun. 2009; 77 (11): 4859-67.

18. Brossier F., Lévy M., Landier A., Lafaye P., Mock M. Functional analysis of Bacillus anthracis protective antigen by using neutralizing monoclonal antibodies. Infect. Immun. 2004; 72 (11): 6313-7.

19. Little S.F., Leppla S.H., Cora E. Production and characterization of monoclonal antibodies to the protective antigen component of Bacillus anthracis toxin. Infect. Immun. 1988; 56 (7): 1807-13.

20. Mohamed N., Clagett M., Li J., Jones S., Pincus S., D’alia G., Nardone L., Babin M., Spitalny G., Casey L. A high-affinity monoclonal antibody to anthrax protective antigen passively protects rabbits before and after aerosolized Bacillus anthracis spore challenge. Infect. Immun. 2005; 73 (2): 795-802.

21. Mazumdar S. Raxibacumab. MAbs. 2009; 1 (6): 531-8.

22. Albrecht M.T., Li H., Williamson D., LeButt C.S., Flick-Smith H.C., Quinn C.P. et al. Human monoclonal antibodies against anthrax lethal factor and protective antigen act independently to protect against Bacillus anthracis infection and enhance endogenous immunity to anthrax. Infect. Immun. 2007; 75 (11): 5425-33.

23. Peterson J.W., Comer J.E., Noffsinger D.M., Wenglikowski A., Walberg K.G., Chatuev B.M. Human monoclonal anti-protective antigen antibody completely protects rabbits and is synergistic with ciprofloxacin in protecting mice and guinea pigs against inhalation anthrax. Infect. Immun. 2006; 74 (2): 1016-24.

24. Hou A.W., Morrill A.M. Obiltoxaximab: adding to the treatment arsenal for Bacillus anthracis infection. Ann. Pharmacother. 2017; 51 (10): 908-13.

25. Maynard J.A., Maassen C.B.M., Leppla S.H., Brasky K., Patterson J.L., Iverson B.L. Protection against anthrax toxin by recombinant antibody fragments correlates with antigen affinity. Nat. Biotechnol. 2002; 20 (6): 597-601.

26. Mabry R., Rani M., Geiger R., Hubbard G.B., Carrion R. Jr, Brasky K. Passive protection against anthrax by using a high-affinity antitoxin antibody fragment lacking an Fc region. Infect. Immun. 2005; 73 (12): 8362-8.

27. Greig S.L. Obiltoxaximab: first global approval. Drugs. 2016; 76 (7): 823-30.

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Рахим Мусаевич
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, научный руководитель ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, главный аллерголог-иммунолог Минздрава России
РОСМЕДОБР 2021
Вскрытие
Медицина сегодня
Пост-релиз "Молекулярная диагностика"

Молекулярная диагностика на страже "биопорядка": как современные технологии позволяют выжить в век эпидемий Новые технологии молекулярной диагностики в эпоху COVID-19/пандемий Обеспечение массового экспресс-тестирования населения - приоритетная задача, которая поможет...

"Муковисцидоз: из детства во взрослую жизнь"

Всероссийская школа по Муковисцидозу с международным участием "Муковисцидоз: из детства во взрослую жизнь" С 24 по 25 ноября 2021 года профессионалы в области педиатрии, терапии, пульмонологии, гастроэнтерологии, эндокринологии, генетики, диетологии, микробиологии,...

Амбулаторный прием 24 ноября.

Коморбидность - бич современного общества и головная боль для каждого терапевта. Как минимизировать комбинации препаратов и, как следствие, побочных эффектов у больных с сочетанной патологией? Именно этот злободневный вопрос мы задали ведущим экспертам российского...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»