Введение
Бруцеллез относится к бактериальным зоонозам; особенность его патогенеза заключается во внутриклеточном паразитировании возбудителя с незавершенным фагоцитозом, определяющим высокий риск трансформации в хроническое течение заболевания [1-6]. Известно, что при бруцеллезе ключевая роль принадлежит клеточному иммунитету и дисбалансу Th1-, про- и противовоспалительных цитокинов, а также интерферонов (ИФН), прежде всего ИФН-γ, необходимых для противодействия возбудителю [7, 8].
Цитокины выполняют регуляторную функцию, контролируют процессы воспаления, иммунного ответа на чужеродные антигены (отражают первичную реакцию на этиотропный агент). Исследование цитокинового статуса позволяет оценить характер течения процесса и прогнозировать исход заболевания при многих инфекциях, объективно оценить эффективность терапии. Определение динамики уровня про- и противовоспалительных цитокинов дает возможность характеризовать реакцию иммунной системы при конкретной инфекции [9].
Исследование белковых фракций сыворотки крови - один из наиболее распространенных биохимических анализов, позволяющих получить более полную картину клинико-физиологического состояния организма. При многих заболеваниях наблюдается изменение соотношения белковых фракций (диспротеинемия) при нормальном содержании общего белка.
Важными компонентами врожденных механизмов резистентности к инфекции являются острофазовые белки - неоднородная группа белковых субстанций, которые интенсивно синтезируются при развитии острой фазы воспаления под влиянием цитокинов: интерлейкина(ИЛ)-6, ИЛ-1β и фактора некроза опухоли а (ФНОα). Так, липополисахарид-связывающий белок (ЛПС-белок) синтезируется в клетках печени, легких и в энтероцитах под действием ИЛ-1, ИЛ-6 [7]. Этот белок обладает участком высокоаффинного связывания липополисахарида (ЛПС) грам-отрицательных бактерий. Образующийся комплекс ЛПС-белок/ЛПС взаимодействует с CD14 на поверхности макрофагов. В результате запускается каскад реакций, в конечном итоге приводящих к активации основных клеточных функций, связанных с развитием фагоцитоза и синтезом провоспалительных цитокинов ИЛ-12 и ИЛ-18 [6].
Одним их серологических маркеров активации Th1-типа иммунного ответа является неоптерин, представляющий собой метаболит нуклеиновых оснований, по структуре схожий с молекулой фолиевой кислоты [10, 11]. Основным индуктором его синтеза является ИФН-γ, при этом другие провоспалительные Th1-цитокины (ФНОα и ИЛ-2) резко усиливают выработку неоптерина, стимулированную ИФН-γ [12]. Это дает основание рассматривать неоптерин в качестве интегрального показателя цитокин-зависимой активации моноци-тов/макрофагов [4]. Неоптерин участвует в патогенезе многих заболеваний, связанных с активацией клеточного звена иммунитета. Увеличение его концентрации коррелирует с изменениями уровней ИНФ-γ и ФНОα и приводит к системному воспалительному ответу. Установлено, что гиперпродукция неоптерина напрямую сопряжена с активаторным влиянием этих цитокинов на метаболизм иммунных клеток [10, 13]. Данный показатель играет роль в реализации механизма цитотоксического действия активированных макрофагов.
Патогены, персистирующие внутри клеток (риккетсии, хламидии, шигеллы, бруцеллы, микобактерии), в острую фазу индуцируют клеточно-опосредованный иммунный ответ, в последующем, на более поздних сроках инфекционного процесса, развиваются гуморальные иммунные реакции [14].
Изучение особенностей фракционного состава белков сыворотки крови, уровня неспецифических острофазовых показателей неоптерина и ЛПС-белка в корреляции с комплексом провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-18) и ИНФ-γ при остром бруцеллезе позволит расширить представления об иммунопатогенезе этой инфекции.
Цель исследования - проведение комплексной оценки цитокинового профиля (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-18 и ИФН-γ), белкового спектра и белков острой фазы воспаления (неоптерина и ЛПС-белка) у пациентов с острым бруцеллезом.
Материал и методы
Участники исследования. Исследовали образцы крови от 65 пациентов с лабораторно подтвержденным диагнозом "острый бруцеллез", поступивших в бруцеллезное отделение ГБУЗ СК "Городская клиническая больница № 2" г. Ставрополя. Все клинические исследования проводили после получения информированного добровольного согласия от обследуемых. Клинические исследования выполняли с соблюдением принципов Хельсинкской декларации; исследование одобрено экспертной комиссией ФКУЗ "Ставропольский противочумный институт" Роспотребнадзора (экспертное заключение № 48 от 08.04.2021) и ФГБОУ ВО "Ставропольский государственный медицинский университет" Минздрава России (экспертное заключение № 14 от 22.10.2020). Диагноз "бруцеллез" устанавливали на основании данных эпидемиологических, клинических и лабораторных исследований.
Согласно данным из выписок историй болезни, у всех пациентов бруцеллез характеризовался среднетяжелым течением. В большинстве случаев (75,4 %) диагностированы очаговые проявления бруцеллезной инфекции в виде костно-суставных проявлений: реактивные артриты (56,9 %), сакроилеит (16,9 %). У 16 (24,62 %) пациентов определены только признаки генерализации инфекции без формирования очаговых поражений. Основные клинические проявления - лихорадка различной степени выраженности, артралгии, гепатоспленомегалия (89,2 %). У большинства пациентов (81,5 %) температурная реакция достигала фебрильных значений (38-39 °С), субфебрильная температура наблюдалась у 7 (10,8 %) пациентов и только у 5 (7,7 %) пациентов установлена пиретическая лихорадка (> 39 °С).
Группу сравнения составили здоровые добровольцы (n = 32), не переболевшие бруцеллезом и не вакцинированные против этой инфекции. Группы были сопоставимы по полу и возрасту.
Лабораторные исследования. Обеззараживание исследуемого материала осуществляли в соответствии СП 1.3.3118-13 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)". Концентрацию общего белка определяли на биохимическом анализаторе Cobas c 311 (Roche diagnostics, Швейцария), фракционный состав белков сыворотки крови - с использованием системы для электрофореза (SAS-1 + SAS-2), HELENA (Великобритания), с применением тест-системы "Белки-сыворотки-24" (Helena BioSciences Europe, Великобритания). Методом твердофазного иммуноферментного анализа проведено определение уровней ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-12, ИЛ-18, ИФН-γ в сыворотке крови с использованием тест-систем "ИФА-ВЕКТОР-БЕСТ" (Вектор-Бест, Россия). Уровень ИЛ-6 определяли иммунохемилюминесцентным методом на анализаторе Cobas e 411 (Roche diagnostics, Швейцария). Определение уровня неоптерина выполняли с использованием тест-систем Neopterin ELISA ("IBL, Hamburg", Германия). ЛПС-белок определяли с помощью тест-системы Hbt Human LBP ELISA (Hycult biotechnology, Голландия).
Исследование показателей проводили до и после курса антибиотикотерапии (доксициклин и рифампицин в течение 6 нед). Затем всем пациентам с острым бруцеллезом была назначена иммуномодулирующая терапия: Ликопид® в дозировке 10 мг курсом 21 день. Отсутствие высокоэффективных схем антибактериальной терапии, высокий риск формирования хронического течения бруцеллеза и особенности иммунопатогенеза заболевания (незавершенный фагоцитоз, внутриклеточное паразитирование) стали основанием для назначения курса иммунокорригирующей терапии в комплексном лечении бруцеллеза. Средства иммунотерапии и иммунокоррекции применяются при лечении бруцеллеза (Клинические рекомендации Министерства здравоохранения РФ "Бруцеллез у взрослых", утверждены 30.10.2014; п. 4.11).
Статистическая обработка. Для статистического анализа использовали T-критерий Вилкоксона и t-критерий Стьюдента для несвязанных совокупностей. Уровень достоверности принимали равным р < 0,05.
Результаты
В ходе проведенного исследования установлено, что у пациентов с острым бруцеллезом до начала антибиотикотерапии уровень ИЛ-12 составил 25,66 ± 0,72 пг/мл, что ниже (р < 0,05) показателя в группе сравнения (31,75 ± 0,72 пг/мл). После антибиотикотерапии уровень ИЛ-12 не изменился (25,87 ± 0,89 пг/мл; р > 0,05). Применение иммунотропного средства сопровождалось увеличением уровня ИЛ-12 в среднем до 38,13 ± 2,34 пг/мл (р < 0,001). Ликопид® способствовал активации синтеза ИЛ-12, что положительно повлияло на формирование адаптивного иммунного ответа. В сыворотке крови пациентов с острым бруцеллезом уровень ИЛ-12, ключевого цитокина в инициации лимфоцит-зависимого иммунного ответа, был ниже, чем в контрольной группе (р < 0,05). Селективное ингибирование синтеза ИЛ-12 при сохранении продукции других провоспалительных цитокинов (ИЛ-8, ИФН-γ), вероятно, является одним из факторов длительной персистенции Brucella spp. в организме хозяина.
Уровень ИЛ-18 у пациентов с острым бруцеллезом до антибиотикотерапии значительно превысил (р < 0,05) показатель в группе сравнения (32,37 ± 0,63 пг/мл) - 68,5 ± 12,5 пг/мл, после завершения антибактериальной терапии уровень ИЛ-18 составил 66,4 ± 10,9 пг/мл. При иммуномодуляторной терапии уровень ИЛ-18 практически не изменился - 67,73 ± 11,48 пг/мл. Несмотря на проведенный курс приема Ликопида® в сыворотке крови пациентов сохраняется высокий уровень ИЛ-18. Это может свидетельствовать об активном воспалении при отсутствии клинических проявлений болезни.
Уровень ИЛ-8 у пациентов с острым бруцеллезом до лечения составил 8,66 ± 0,59 пг/мл и значительно (р < 0,05) превысил соответствующий показатель в группе сравнения (4,33 ± 0,8 пг/мл). После антибиотикотерапии уровень ИЛ-8 оставался высоким (8,76 ± 0,96 пг/мл), не отличаясь от исходного (р > 0,05). Прием Ликопида® способствовал снижению (6,44 ± 0,14 пг/мл) уровня ИЛ-8 - это связано с уменьшением воспалительного процесса на фоне терапии.
Уровень ИЛ-6 до лечения - 17,39 ± 1,3 пг/мл (р < 0,05) превысил соответствующие значения в группе сравнения (6,67 ± 0,60 пг/мл). Анализ данных показал, что у пациентов с острым бруцеллезом после лечения антибиотиками уровень ИЛ-6 составил 14,4 ± 2,36 пг/мл, после приема иммуномодулятора данные были сопоставимы 14,1 ± 1,42 пг/мл. Высокий уровень провоспалительного цитокина ИЛ-6 свидетельствует о стимуляции иммунного ответа и опосредует острую фазу воспаления. ИЛ-6 стимулирует пролиферацию и дифференцировку В- и Т-клеток.
В ходе проведенного исследования установлено, что до начала специфического лечения у пациентов с острым бруцеллезом уровень ИЛ-1Р (8,35 ± 0,47 пг/мл) был значительно выше по сравнению со значением в группе сравнения (1,6 ± 0,39 пг/мл; р < 0,05). Это связано с тем, что ИЛ-1β участвует в первичной стадии иммунного ответа: активирует лимфоциты (Т-хелперы) и способствует трансформации В-лимфоцитов в плазматические клетки, которые, в свою очередь, участвуют в образовании антител. После курса антибиотикотерапии уровень ИЛ-1Р снизился до 5,98 ± 0,62 пг/мл, прием Ликопида® способствовал снижению уровня ИЛ-1β - 2,67 ± 0,62 пг/мл (р < 0,001).
Уровень ИФН-γ в сыворотке крови пациентов с острым бруцеллезом до проведения антибиотикотерапии составил 18,22 ± 5,03 пг/мл (р < 0,05), что значительно превышало соответствующий показатель в группе сравнения (3,35 ± 0,6 пг/мл). После завершения курса антибактериальной терапии уровень ИНФ-γ снизился до 7,19 ± 3,03 пг/мл (р > 0,05). Прием Ликопида® способствовал повышению уровня ИФН-γ до 20,93 ± 5,03 пг/мл (р < 0,05). Иммуномодулирующий эффект ИФН-γ заключается в способности к регуляции взаимодействия клеток, участвующих в иммунном ответе, приводя к эффективной элиминации инфекционного агента.
Данные об уровне провоспалительных цитокинов и острофазовых белков представлены на рис. 1.
&hide_Cookie=yes)
Рис. 1. Сравнительный анализ уровня провоспалительных цитокинов и острофазовых белков при остром бруцеллезе
ИЛ - интерлейкин; ИФН-γ - интерферон-γ; ЛПС - липополисахарид.
Анализ уровня белков острой фазы воспаления показал, что у пациентов с острым бруцеллезом до лечения антибиотиками уровень ЛПС-белка составил 52,2 ± 0,77 пг/мл (р < 0,05), что значительно выше по сравнению с группой сравнения (6,98 ± 0,76 пг/мл; р < 0,05).
После курса антибиотикотерапии уровень ЛПС-белка составил 50,79 ± 0,78 пг/мл, после курсового приема иммуномодулятора - 34,17 ± 0,63 пг/мл (р < 0,001).
Уровень неоптерина в сыворотке крови пациентов с бруцеллезом до начала специфической терапии составил 21,01 ± 3,6 нмоль/л, что значительно выше по отношению к группе сравнения (5,7 ± 0,54 нмоль/л; p < 0,05). После окончания курса антибиотикотерапии уровень неоптерина снизился до 13,69 ± 3,39 нмоль/л (р < 0,05), но не достиг нормальных показателей. После курса приема Ликопида® уровень неоптерина снизился до 11,49 ± 2,86 нмоль/л, что меньше по сравнению с его уровнем до лечения (р < 0,05), но выше, чем в группе сравнения (р < 0,05).
У всех обследуемых также провели анализ концентрации общего белка, альбумина, α1- и α2-фракций глобулинов, β- и γ-глобулинов, а также рассчитали альбумин-глобулиновое соотношение (рис. 2).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 2. Сравнительный анализ фракционного состава белков сыворотки крови: А - белковый профиль группы сравнения; Б - белковый профиль пациента с диагнозом "острый бруцеллез"
Уровни α1- и α2-фракции глобулинов в сыворотке крови пациентов составили 7,04 ± 0,23 и 10,93 ± 0,38 % соответственно, что превышало показатели в группе сравнения (4,3 ± 0,24 % и 9,73 ± 0,49 %, р < 0,05). Увеличение уровня a-глобулинов при бруцеллезной инфекции можно связать с экссудативно-воспалительным процессом разной степени, вызывающим увеличение содержания в крови гаптоглобина, мигрирующего при электрофорезе вместе с a-глобулинами. Наблюдалось также снижение концентрации общего белка - до 51,7 г/л (63,7-75,8 г/л), альбумина - до 39,7 г/л (45,8-55,6 г/л) и повышение относительного количества глобулинов - в среднем до 20,8 % (11,7-28,6 %), в основном за счет α- и γ-глобулиновых фракций. Количество β-глобулинов было в пределах нормы (8-15 %). Повышение γ-глобулиновой фракции и появление М-пика в γ-зоне у пациентов с острым бруцеллезом связано с иммуновоспалительными реакциями, активацией антителогенеза и их концентрацией в сыворотке крови.
Обсуждение
В ходе проведенного исследования установлено, что в острую фазу бруцеллезной инфекции (до лечения) отмечается высокий уровень провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18 и ИФН-γ). Они действуют на иммунокомпетентные клетки, инициируя воспалительный ответ. Ключевая роль в развитии воспалительных реакций, обусловленных системой клеточного иммунитета, против многочисленных внутриклеточных патогенов, в том числе бруцеллы, принадлежит ИФН-γ [9], который продуцируется активированными Т-хелперами 1-го типа (Th1) и натуральными киллерами (НК-клетки). Высокий уровень ИФН-γ в крови пациентов с острым бруцеллезом закономерно отражает активацию клеточного иммунного ответа [6].
После курса антибактериальной терапии в крови пациентов сохраняется высокий уровень ИФН-γ с тенденцией к снижению, но он превышал показатели в группе сравнения. Полученные результаты свидетельствуют о сохраняющейся активности клеточного иммунного ответа, вероятно, о продукции клетками Th1-и других провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18), стимулирующих цитотоксические клетки и T-эффекторы гиперчувствительности замедленного типа. Несмотря на проведенный курс антибиотикотерапии у пациентов с острым бруцеллезом средней степенью тяжести течения продукция ИЛ-8, ИЛ-18 характеризовалась более высокими уровнями, свидетельствующими о воспалении. Продолжительный повышенный синтез цитокинов может стать фактором прогрессирования патологического процесса, оказывая прямое повреждающее действие на клетки и ткани, индуцируя альтерацию, нарушение целостности сосудистой стенки, усиление и хронизацию воспалительного процесса [9, 13].
У пациентов с бруцеллезом средней степени тяжести течения на фоне общей интоксикации (у 81,5 % пациентов температура достигала фебрильных значений - 38-39 °С) усиливается также синтез белков острой фазы воспаления (ЛПС-белок, неоптерин), которые играют ключевую роль в патогенезе болезни.
Установленный нами высокий уровень ЛПС-белка подтверждает длительную персистенцию возбудителя несмотря на лечение антибиотиками и отсутствие полной эрадикации возбудителя. ЛПС бруцеллы выступает как иммуномодулирующий фактор, необходимый для выживания и репликации возбудителя в организме хозяина [6].
В крови пациентов с острым бруцеллезом установлен высокий уровень неоптерина, превышающий уровень в группе сравнения. Полученное значение уровня неоптерина в крови пациентов свидетельствуют об активных воспалительных реакциях на клеточном уровне [8, 11], индуктором которых является сохраняющаяся антигенная нагрузка. Повышенный уровень неоптерина имеет диагностическую значимость в оценке воспаления, степени тяжести течения заболевания и эффективности проводимой терапии [5, 8, 11].
Результаты проведенных исследований также свидетельствуют о том, что при остром бруцеллезе наблюдается диспротеинемия: отмечается повышение в крови уровня глобулинов, в основном за счет α- и γ-глобулиновых фракций, умеренное снижение концентрации общего белка в крови, гипоальбуминемия, снижение альбумино-глобулинового коэффициента.
Таким образом, в противодействии бруцеллезу ключевая роль принадлежит клеточному иммунитету и дисбалансу Th1-, про- и противовоспалительных цитокинов, а также интерферонов, прежде всего ИФН-γ, необходимых для элиминации возбудителя. ИФН-γ, неоптерин и ЛПС-белок относятся к иммуномодулирующим факторам реакции иммунитета на возбудителя.
Исход естественного течения бруцеллеза у человека определяется результатом иммунных реакций между бруцеллой и иммунной системой в виде полной эрадикации патогена или развитием внутриклеточного паразитизма с формированием хронического заболевания.
Заключение
Комплексная оценка цитокинового статуса (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-18, ИНФ-γ) и белков острой фазы воспаления (неоптерина и ЛПС-белка) отражает интенсивность локального и/или системного ответа на инфекцию. Патофизиологические изменения белкового состава сыворотки крови у пациентов с острым бруцеллезом характеризуются метаболической перестройкой, демонстрируя преимущественно воспалительный характер протеинограммы.
Выявление существующих взаимосвязей между многочисленными проявлениями заболевания и лежащими в их основе индивидуальными физиологическими и патологическими реакциями организма на данную инфекцию позволят определить объективные критерии активности бруцеллезного процесса. Выраженность и глубина патологических сдвигов в цитокиновом статусе, маркерах острой фазы воспаления при бруцеллезной инфекции отражают патогенетические механизмы формирования органных поражений при бруцеллезе и коррелируют с активностью инфекционного процесса.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Куличенко А.Н., Санникова И.В., Махиня О.В.; сбор и обработка материала - Саркисян Н. С., Ковалевич Н.И.; статистическая обработка - Саркисян Н.С., Махиня О.В.; написание текста - Саркисян Н.С., Ковалевич Н.И., Санникова И.В., Махиня О.В.; редактирование - Куличенко А.Н.