Результаты
Молекулы миРНК сиквенс-специфично подавляют экспрессию гена Stat3 in vitro
С помощью программного обеспечения OligoWalk было спроектировано более 200 вариантов миРНК.
Данное программное обеспечение рассчитывает термодинамические параметры гибридизации РНК-олигонуклеотидов, а также предсказывает их свободную энергию связывания с мРНК-мишенью. Для синтеза было выбрано 5 вариантов миРНК. Выбор этих вариантов обусловлен следующими критериями: 1) предсказанная теоретическая эффективность ≥ 90 %; 2) сходство с другими генами в геноме мыши ≤ 84 %, что необходимо для нивелирования off-target-эффектов.
Представленные варианты были синтезированы и очищены, проведен скрининг биологической активности в экспериментах in vitro на культуре клеток L929, так как эти клетки конститутивно экспрессируют Stat3. Для этого 100 тыс. клеток трансфецировали 1 мкг миРНК в смеси с коммерческим реагентом Lipofectamine 2000, после чего оценивали активность целевого гена методом количественной ПЦР. Было показано, что один вариант миРНК (siSTAT3-1426) статистически значимо на 75 % снижал экспрессию Stat3 в клетках по сравнению с неспецифическими миРНК (siGFP) (рис. 2А). При этом отмечен дозозависимый эффект от применения siSTAT3-1426 (рис. 2Б). Эти данные свидетельствуют о сиквенс-специфическом подавлении экспрессии Stat3.
Рис. 2. Подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК в экспериментах in vitro
А - скрининг активности молекул миРНК на культуре клеток L929; Б - супрессия экспрессии гена Stat3 с помощью различных концентраций миРНК siSTAT3-1426 в культуре клеток L929. Клетки в количестве 100 тыс. трансфецировали смесью 1 мкг миРНК и коммерческого реагента Lipofectamine 2000, после чего определяли активность Stat3 методом количественной ПЦР. В качестве контроля клетки трансфецировали неспецифическими миРНК против гена Gfp (siGFP). Результаты выражали в % относительно активности Stat3 в необработанных клетках. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; n = 5; × - статистически значимо отличается от siGFP по U-критерию Манна-Уитни.
Комплекс миРНК и пептида-носителя подавляет активность гена Stat3 in vitro
В качестве носителя для созданной молекулы миРНК против гена Stat3 (siSTAT3-1426) мы использовали созданный ранее катионный дендримерный пептид LTP. Этот пептид способен доставлять нуклеиновые кислоты (включая миРНК) в различные типы клеток млекопитающих. Для эффективной доставки необходим 12,5-кратный избыток LTP в комплексе миРНК/пептид [16]. В отдельных экспериментах in vitro была изучена способность комплекса siSTAT3/LTP подавлять экспрессию Stat3 в клетках L929. Для этого в культуру клеток вносили siSTAT3/LTP в различных концентрациях, инкубировали 1 сут и измеряли экспрессию Stat3 методом количественной ПЦР. Как оказалось комплекс siSTAT3/ LTP в количестве 4 мкг (по миРНК) на 100 тыс. клеток статистически значимо супрессирует экспрессию Stat3 в 3,7 раза в сравнении с комплексом siGFP/LTP, в состав которого включены неспецифические молекулы миРНК (рис. 3А).
Рис. 3. Подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК в комплексе с пептидом LTP в экспериментах in vitro
А - подавление экспрессии гена Stat3 комплексом siSTAT3/LTP на культуре клетокL929. Клетки в количестве 100 тыс. трансфецировалиразличными количествами комплекса siSTAT3/LTP или siGFP/LTP (в качестве отрицательного контроля). Через 1 сут определяли активность Stat3 методом количественной ПЦР. Результаты нормализовали относительно экспрессии гена Hprt и выражали в виде RQ. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; n = 4; х - статистически значимо отличается от siGFP по U-критерию Манна-Уитни; Б - подавление экспрессии гена Stat3 комплексом siSTAT3/ LTP в Th17-клетках. Th0-клетки выделены из селезенок мышей, дифференцированы в Th17-клетки в течение 3 сут. В ходе дифференцировки клетки были обработаны молекулами миРНК siSTAT3-1426 в комплексе с различными трансфекционными агентами (Lipofectamine 2000 и LTP). Анализировали лизаты клеток методом количественной ПЦР. Результаты нормализовали относительно экспрессии гена "домашнего хозяйства" Actb и выражали в виде RQ. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; n = 3; х - статистически значимо отличается от "Без вектора" по U-критерию Манна-Уитни.
Также изучена способность комплекса siSTAT3/LTP супрессировать экспрессию Stat3 в Th17-клетках. Для этого Th0-клетки были выделены из селезенок мышей, дифференцированы в Th17-клетки в присутствии анти-CD28-антител, ИЛ-6, ТФРβ в течение 3 сут. В ходе дифференцировки клетки были обработаны молекулами миРНК siSTAT3-1426 в комплексе с различными трансфекционными агентами (Lipofectamine 2000 и LTP). В клетках, обработанных комплексом siSTAT3-1426 с LTP, мы выявили 2-кратное снижение уровня экспрессии мРНК Stat3 и 5-7-кратное снижение уровня экспрессии мРНК Il17а. При этом внесение в культуру клеток комплекса siSTAT3-1426 и Lipofectamine 2000 не приводило к изменению экспрессии этих генов (рис. 3Б). Учитывая, что комплекс молекул siSTAT3-1426 и пептида LTP в массовом соотношении 1/12,5 способен подавлять экспрессию генов Stat3 и Il17а в лимфоцитах, его использовали в последующих исследованиях in vivo на модели нейтрофильной БА у мышей.
Комплекс миРНК и пептида-носителя подавляет активность гена Stat3 in vivo и снижает нейтрофильное воспаление в легких
В экспериментах in vivo мы использовали ранее созданную модель нейтрофильной БА, которая характеризовалась повышенным уровнем аллерген-специ-фических IgE-антител, развитием гиперреактивности бронхов и нейтрофильным воспалением легких. В ходе исследования животным с индуцированной нейтрофильной БА проводили ингаляции комплексом молекул siSTAT3-1426 и пептида LTP (siSTAT3/LTP). В качестве контроля осуществляли ингаляции аналогичной дозой комплекса, содержащего неспецифические молекулы миРНК siGFP. После курса ингаляций у мышей оценивали степень выраженности основных проявление БА: уровень аллерген-специфических антител, изменение гиперреактивности бронхов, определяли клеточный состав БАЛ и выраженность гистопатологических изменений в легких.
Ингаляции комплексом, содержащим siSTAT3 и LTP, приводили к подавлению экспрессии гена Stat3 на 50 % в клетках БАЛ (р < 0,05) по сравнению с мышами, получавшими неспецифические молекулы siGFP (рис. 1Б). Изучение ГРБ показало, что у животных, получавших комплекс, состоящий из siSTAT3 и пептида-носителя LTP, не происходило изменения удельной сопротивляемости бронхов в сравнении с мышами, которым ингалировали комплекс, содержащий неспецифические миРНК; при этом ГРБ была значительно выше, чем в группе интактных животных (рис. 1В).
Аллерген-специфические антитела классов IgE, IgG2a и IgG1 детектировались в обеих экспериментальных группах животных, что свидетельствует о развитии гуморального иммунного ответа на аллерген у животных. При этом ингаляционное введение комплекса, содержащего siSTAT3, не влияло на уровень IgE- и IgG1-антител в сравнении с использованием siGFP. Это свидетельствует об отсутствии влияния супрессии гена Stat3 на формирование Th2-иммунного ответа. Мы также изучили изменение уровня IgG2a-антител в сыворотке крови, который является маркером Th1-иммунного ответа. Обнаружено увеличение уровня IgG2-антител у животных, получавших ингаляции siSTAT3, в сравнении с мышами, получившими siGFP (рис. 1Г).
При индукции у мышей нейтрофильной БА происходило 5-кратное увеличение общего количества клеток в образцах БАЛ по сравнению с интактными животными. Такое увеличение происходило за счет инфильтрации легких макрофагами, лимфоцитами и нейтрофилами. При этом увеличения числа эозинофилов не происходило. Это свидетельствует о развитии нейтрофильного воспаления в легких. Ингаляции комплексом siSTAT3/LTP приводило к значительному, 3-кратному уменьшению количества нейтрофилов в сравнении с мышами, получавшими ингаляции неспецифическими молекулами миРНК (siGFP) (рис. 4).
Рис. 4. Клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ)
Представлены средние значения количества клеток в 1 мл БАЛ ± стандартная ошибка; n = 7; х - статистически значимо отличается от siGFP по U-критерию Манна-Уитни.
Гистологический анализ легких не выявил статистически значимого уменьшения выраженности инфильтрации после курса ингаляций комплексом siSTAT3/LTP в сравнении с комплексом siGFP/LTP. Отмечена лишь тенденция к уменьшению числа клеток в перибронхиальных инфильтратах на 20 % (р = 0,18) (рис. 5А, 5Б). Также не выявлено уменьшения выраженности гиперплазии и метаплазии бронхиального эпителия у животных, получавших siSTAT3/LTP (рис. 5В). Однако у животных, ингалированных комплексом siSTAT3/LTP, снижалась толщина стенок бронхов (рис. 5Г).
Рис. 5. Гистологические изменения в ткани легких
А - микрофотографии ткани легких после окраски гематоксилином и эозином при увеличении в 400 раз, демонстрирующие выраженность перибронхиальной инфильтрации и утолщение бронхиального эпителия; Б - количество клеток в перибронхиальном инфильтрате; определяли количество клеток в 5 полях зрения; В - для оценки выраженности патологических процессов в дыхательных путях использовался полуколичественный метод оценки после дифференцированной окраски срезов органа гематоксилином и эозином. Выраженность признаков воспаления оценивали в баллах по следующей шкале: 0 - отсутствует; 1 - легкая; 2 - умеренная; 3 - тяжелая. Представлена медиана ± интерквартильный размах; n = 7; для статистического анализа применялся непараметрический критерий Краскела-Уоллиса; Г - толщина эпителия бронхов; измеряли толщину бронхиального эпителия в пикселях с использованием микрофотографий ткани легкого при увеличении в 200 раз и программного обеспечения Altami Studio. Анализировали 5 субсегментарных бронхов у каждого экспериментального животного. Представлены средние значения ± стандартная ошибка средней; n = 7; х - статистически значимо отличается от siGFP по U-критерию Манна-Уитни.
Изучена экспрессия провоспалительных цитокинов в клетках БАЛ. Было показано, что подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК приводит к снижению экспрессии генов Th17-цитокинов (в 2,1 раза для Il17a, в 4,8 раза для Il17f). В то же время не наблюдалось выраженного изменения в экспрессии генов Th2-цитокина - Il4 и Th1-цитокина - Ifng (рис. 6).
Обсуждение
В данной работе мы показали, что локальное подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК уменьшает воспаление в легких и ремоделирование респираторного тракта у мышей с индуцированной БА. Путем аэрозольной провокации смесью аллергена и ЛПС у животных воссоздавались следующие патологические изменения: воспаление легких, характеризующееся увеличением числа нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов в дыхательных путях, гиперреактивность и ремоделирование бронхов. Указанные патологические изменения формировались по Thl7-зависимому механизму [18], о чем свидетельствует увеличение экспрессии генов Stat3 (рис. 1Б), Il17a и Il17f (рис. 6) в клетках БАЛ. Соответственно, супрессия экспрессии Stat3 молекулами миРНК приводила к подавлению Th17-иммунного ответа, о чем свидетельствует значительное уменьшение экспрессии Il17a и Il17f в клетках БАЛ. При этом экспрессия гена Ifng, являющегося маркером TM-иммунного ответа, и гена Il4, который является маркером Th2-иммунного ответа, не изменялись после ингаляционного введения миРНК (рис. 6).
Примечательно, что подавление экспрессии Stat3 приводило к уменьшению содержания нейтрофилов в БАЛ в 3 раза, в то время как содержание макрофагов и лимфоцитов не изменялось (см. рис. 4). Это объясняется тем, что Th17-клетки и секретируемые ими цитокины (ИЛ-17А и nn-17F) участвуют в привлечении нейтрофилов в участок воспаления, в данном случае в легкие [21, 22]. В то же время уменьшение нейтрофильного воспаления легких не приводило к снижению сопротивляемости бронхов; этот показатель оставался на относительно высоком уровне (см. рис. 1В). По всей видимости, нейтрофилы не вносят значимого вклада в развитие гиперактивности бронхов.
Дополнительно мы оценили гистологические изменения в ткани легких, которые показали, что супрессия экспрессии Stat3 и уменьшение нейтрофильного воспаления частично нивелируют признаки ремоделирования бронхов. В частности, происходило восстановление толщины стенок бронхов, но при этом такие признаки ремоделирования, как метаплазия и гиперплазия бронхиального эпителия, не уменьшались после блокирования гена Stat3. Высокий уровень метаплазии и гиперплазии эпителия объясняет повышенную гиперреактивность бронхов у мышей, получавших миРНК.
Были изучены изменения уровней аллерген-специфических IgE-, IgG1- и IgG2a-антител после подавления экспрессии Stat3 молекулами миРНК. Супрессия этого гена не приводила к изменению уровней IgE-и IgG1-антител, являющихся маркерами Th2-иммунного ответа [23]. В то же время происходило увеличение уровня IgG2a-антител, что свидетельствует о переключении иммунного ответа в сторону TM-типа [23] (см. рис. 1Г). Антитела классов IgE и IgG1 у мышей важны для развития ГРБ [24, 25]. Учитывая, что уровни этих антител не уменьшаются после супрессии Stat3, это может объяснять отсутствие благоприятного эффекта молекул миРНК на сопротивляемость бронхов.
Известно, что молекулы миРНК самопроизвольно не проникают к месту действия - в цитоплазму клеток-мишеней [15, 26]. Для этого молекулы миРНК водили аэрозольно в комплексе с катионным пептидом-носителем LTP [16]. Ранее нами было показано, что данный пептид способен доставлять нуклеиновые кислоты в широкий спектр клеток млекопитающих, включая лимфоциты [16]. В данном исследовании мы получили популяцию Тй17-клеток мышей и в эксперименте in vitro обработали ее комплексом молекул миРНК и LTP, что привело к подавлению экспрессии генов Stat3 и Il17a (рис. 3). Это доказывает способность пептида LTP доставлять молекулы миРНК в Тh17-клетки и негативно регулировать экспрессию провоспалительных цитокинов.
Полученные нами результаты сходны с ранее проведенными исследованиями других авторов. В работе H. Lim и соавт. [27] осуществлен нокаут гена Stat3 в Т-клетках мышей с последующей индукцией у них экспериментальной БА. Методом проточной цитометрии показано уменьшение количества Тh17-клеток в ткани легких и в лимфатических узлах после нокаута гена Stat3, при этом количество Th1- и Тh2-клеток увеличивалось [27]. Мы также наблюдали супрессию Тh17-иммунного ответа в легких после подавления активности гена Stat3 молекулами миРНК (рис. 6). Важно отметить, что инактивация гена Stat3 в Т-клетках не приводила к уменьшению уровня инфильтрации легких провоспалительными клетками [27]. Это согласуется с полученными нами данными. Анализ клеточного состава БАЛ (см. рис. 4) и гистологический анализ ткани легких (см. рис. 5Б) показали отсутствие уменьшения количества инфильтрирующих легкие клеток после подавления активности Stat3 молекулами миРНК. При этом мы обнаружили 3-кратное уменьшение числа нейтрофилов в образцах БАЛ (см. рис. 4), в то же время в работе H. Lim и соавт. [27] не проведена дифференцировка клеток, инфильтрирующих ткань легких, что не позволяет судить об изменении уровня нейтрофилии после нокаута гена Stat3. Также авторы показали что инактивация гена Stat3 в Т-клетках приводила к незначительному уменьшению гиперсекреции слизи эпителием бронхов [27]. Это согласуется с полученными нами результатами, подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК не влияло на выраженность метаплазии и гиперплазии эпителия бронхов (см. рис. 5В).
В еще одном исследовании [28] авторами был осуществлен нокаут гена Stat3 в эпителиальных клетках, после чего у мышей моделировалось экспериментальная БА. У животных с инактивированным геном наблюдались снижение ГРБ, уменьшение инфильтрации легких эозинофилами и Th2-клетками, а также снижался уровень продуцируемых ими цитокинов (ИЛ-4, -5, -13). При этом уровень Th1-цитокина интерферона-у оставался неизменным. Уменьшение количества Th2-клеток в легких авторы связывают со снижением уровня хемокина TARC, являющегося аттрактантом этих клеток. Сходные результаты были получены при использовании ингибиторов киназ, вовлеченных в STAT3-сигнальный путь [28]. В отличие от исследования [28], мы не выявили влияния супрессии гена Stat3 на уровень Th2-цитокинов в легких (рис. 6), что, скорее всего, связано с различиями в используемых моделях воспаления легких. Авторы исследования [28] индуцировали экспериментальную БА путем активации Th2-иммунного ответа, сопряженного с инфильтрацией легких эозинофилами, в то же время в нашем исследовании мы индуцируем нейтрофильное воспаление легких, которое развивается по Тh17-зависимому механизму.
Рис. 6. Изменение экспрессии цитокинов в клетках бронхоальвеолярного лаважа
Представлены средние значения относительной экспрессии генов цитокинов Ifng, Il4, Il17a и Il17f ± стандартная ошибка. Уровень экспрессии гена в группе "Норма" был принят за 1; n = 7; х - статистически значимо отличается от siGFP по U-критерию Манна-Уитни.
Заключение
Таким образом, был создан комплекс, состоящий из молекул миРНК против гена Stat3 и пептида-носителя LTP, ингаляции которым приводят к уменьшению Тh17-зависимого нейтрофильного воспаления легких. Применение созданного комплекса может быть многообещающим подходом к терапии нейтрофильной кортикостероид-резистентной БА.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Шиловский И.П., Хаитов М.Р.; сбор и обработка материала - Юмашев К.В., Никольский А. А., Вишнякова Л.И., Барвинская Е.Д., Ковчина В.И., Туренко В.Н., Корнеев А.В., Каганова М.М.; статистическая обработка данных - Никольский А.А., Вишнякова Л.И., Барвинская Е.Д., Ковчина В.И.; написание текста - Шиловский И.П., Никольский А.А.; редактирование - Брылина В.Е., Никонова А.А.; утверждение окончательного варианта статьи - Козлов И.Б., Кофиади И.А., Петухова О.А.; ответственность за целостность всех частей статьи - Сергеев И.В., Маерле А.В., Кудлай Д.А.
Литература
1. GINA Committee. Global Initiative for Asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention. 2020. URL: https://ginasthma.org/wp-content/uploads/2020/04/GINA-2020-Appendix_final-wms.pdf (date of access October 14, 2021)
2. 2. Soriano J.B., Abajobir A.A., Abate K.H., Abera S.F. et al. Global, regional, and national deaths, prevalence, disability-adjusted life years, and years lived with disability for chronic obstructive pulmonary disease and asthma, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet Respir. Med. 2017; 5: 691-706. DOI: http://doi.org/10.1016/S2213-2600(17)30293-X
3. Авдеев С.Н., Ненашева Н.М., Жуденков К.В., Петраковская В.А., Изюмова Г.В. Распространенность, заболеваемость, фенотипы и другие характеристики тяжелой бронхиальной астмы в Российской Федерации. Пульмонология. 2018; 28: 341-58. DOI: http://doi.org/10.18093/0869-0189-2018-28-3-341-358
4. Moote W., Kim H., Ellis A.K. Allergen-specific immunotherapy. Allergy Asthma Clin. Immunol. 2018; 14: 1-10. DOI: http://doi.org/10.1186/s13223-018-0282-5
5. Павлова К.С., Курбачева О.М., Галицкая М.А., Смирнов Д.С. Актуальные представления о механизмах аллерген-специфической иммунотерапии, потенциальных маркерах эффективности и путях совершенствования. Российский аллергологический журнал. 2017; 14: 5-17. DOI: http://doi.org/10.36691/RJA290
6. Corren J., Lemanske R.F., Hanania N.A., Korenblat P.E., Parsey M.V., Arron J.R., Harris J.M., Scheerens H., Wu L.C., Su Z., Mosesova S., Eisner M.D., Bohen S.P., Matthews J.G. Lebrikizumab treatment in adults with asthma. N. Engl. J. Med. 2011; 365: 1088-98. DOI: http://doi.org/10.1056/NEJMoa1106469
7. Wenzel S.E. Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches. Nat. Med. 2012; 18: 716-25. DOI: http://doi.org/10.1038/nm.2678
8. Seys S.F., Lokwani R., Simpson J.L., Bullens D.M.A. New insights in neutrophilic asthma. Curr. Opin. Pulm. Med. 2019; 25: 113-20. DOI: http://doi.org/10.1097/MCP.0000000000000543
9. Liu W., Liu S., Verma M., Zafar I., Good J.T., Rollins D., Groshong S., Gorska M.M., Martin R.J., Alam R. Mechanism of TH2/TH17-predominant and neutrophilic TH2/TH17-low subtypes of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2017; 139: 1548-58. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jaci.2016.08.032
10. Chaudhry A., Rudra D., Treuting P., Samstein R.M., Liang Y., Kas A., Rudensky A.Y. CD4+ regulatory T cells control Th17 responses in a STAT3-dependent manner. Science. 2009; 326: 986-91. DOI: http://doi.org/10.1126/science.1172702
11. Halwani R., Sultana A., Vazquez-Tello A., Jamhawi A., Al-Masri A.A., Al-Muhsen S. Th-17 regulatory cytokines IL-21, IL-23, and IL-6 enhance neutrophil production of IL-17 cytokines during asthma. J. Asthma. 2017; 54: 893-904. DOI: http://doi.org/10.1080/02770903.2017.1283696
12. Shilovskiy I.P., Nikolskii A.A., Kurbacheva O.M., Khaitov M.R. Modern view of neutrophilic asthma molecular mechanisms and therapy. Biochemistry (Mosc). 2020; 85: 854-68. DOI: http://doi.org/10.1134/S0006297920080027
13. Saw P.E., Song E.W. siRNA therapeutics: a clinical reality. Sci. China Life Sci. 2020; 63: 485-500. DOI: http://doi.org/10.1007/s11427-018-9438-y
14. Nikam R.R., Gore, K.R. Journey of siRNA: clinical developments and targeted delivery. Nucleic Acid Ther. 2018; 28: 209-24. DOI: http://doi.org/10.1089/nat.2017.0715
15. Koloskova O.O., Nosova A.S., Sebyakin Y.L., Ilyukhina A.A., Shilovskiy I.P., Khaitov M.R. Liposomal siRNA delivery systems (review). Russ. J. Biopharm. 2017; 9: 3-10.
16. Kozhikhova K.V, Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofeeva A.V, Gaisina A.R., Shatilov A.A., Turetskiy E.A., Andreev I.M., Smirnov V.V, Dvornikov A.S., Khaitov M.R. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org. Biomol. Chem. 2018; 16: 8181-90. DOI: http://doi.org/10.1039/c8ob02039f
17. Kanasty R., Dorkin J.R., Vegas A., Anderson D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nat. Mater. 2013; 12: 967-77. DOI: http://doi.org/10.1038/nmat3765
18. Шиловский И.П., Никольский А.А., Ковчина В.И., Болотова С.И., Вишнякова Л.И., Соколова А.Р., Барвинская Е.Д., Хаитов М.Р. Активация Th17-иммунного ответа при экспериментальной нейтрофильной бронхиальной астме у мышей. Иммунология. 2019; 40: 5-15. DOI: http://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16001
19. Lu Z.J., Mathews D.H. OligoWalk: an online siRNA design tool utilizing hybridization thermodynamics. Nucleic Acids Res. 2008; 36: 104-8. DOI: http://doi.org/10.1093/nar/gkn250
20. Shilovskiy I.P., Sundukova M.S., Babakhin А.А., Gaisina A.R., Maerle A.V., Sergeev I.V., Nikolskiy A.A., Barvinckaya E.D., Kovchina V.I., Kudlay D.A., Nikonova A.A., Khaitov M.R. Experimental protocol for development of adjuvant-free murine chronic model of allergic asthma. J. Immunol. Methods. 2019; 468: 10-9. DOI: http://doi.org/10.1016/j.jim.2019.03.002
21. Chang H.S., Lee T.H., Jun J.A., Baek A.R., Park J.S., Koo S.M., Kim Y.K., Lee H.S., Park C.S. Neutrophilic inflammation in asthma: mechanisms and therapeutic considerations. Expert Rev. Respir. Med. 2017; 11: 29-40. DOI: http://doi.org/10.1080/17476348.2017.1268919
22. Newcomb D.C., Peebles R.S. Th17-mediated inflammation in asthma. Curr. Opin. Immunol. 2013; 25: 755-760. DOI: http://doi.org/10.1016/j.coi.2013.08.002
23. Steinke J.W., Borish L. Th2 cytokines and asthma. Interleukin-4: its role in the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin-4 receptor antagonists. Respir. Res. 2001; 2: 66-70. DOI: http://doi.org/10.1186/rr40
24. Miyajima I., Dombrowicz D., Martin T.R., Ravetch J.V, Kinet J.P., Galli S.J. Systemic anaphylaxis in the mouse can be mediated largely through IgG1 and Fc gammaRIII. Assessment of the cardiopulmonary changes, mast cell degranulation, and death associated with active or IgE- or IgG1-dependent passive anaphylaxis. J. Clin. Invest. 1997; 99: 901-14. DOI: http://doi.org/10.1172/JCI119255
25. Oettgen H.C., Martin T.R., Wynshaw-Boris A., Deng C., Drazen J.M., Leder P. Active anaphylaxis in IgE-deficient mice. Nature. 1994; 370: 367-70. DOI: http://doi.org/10.1038/370367a0
26. Juliano R.L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2016; 44: 6518-48. DOI: http://doi.org/10.1093/nar/gkw236
27. Lim H., Cho M., Choi G., Na H., Chung Y. Dynamic control of Th2 cell responses by STAT3 during allergic lung inflammation in mice. Int. Immunopharmacol. 2015; 28: 846-53. DOI: http://doi.org/10.1016/j.intimp.2015.03.051
28. Simeone-Penney M.C., Severgnini M., Tu P., Homer R.J., Mariani T.J., Cohn L., Simon A.R. Airway epithelial STAT3 is required for allergic inflammation in a murine model of asthma. J. Immunol. 2007; 178: 6191-9. DOI: http://doi.org/10.4049/jimmunol.178.10.6191