Стимуляция В-клеток в системе ИЛ-21/CD40L в норме и у пациентов с общей вариабельной иммунной недостаточностью

Резюме

Введение. Общая вариабельная иммунная недостаточность (ОВИН) относится к первичным иммунодефицитам. К настоящему времени идентифицирован ряд генов, мутации в которых приводят к развитию ОВИН. Однако моногенные дефекты лежат в основе не более чем 10 % случаев ОВИН, а основная часть ОВИН связана с участием множества генов. В этих условиях для поиска и расшифровки возможных патогенетических факторов эффективно использовать анализ функциональных дефектов в активации В-лимфоцитов.

Цель исследования - поиск функциональных дефектов активации В-лимфоцитов у больных с ОВИН при стимуляции in vitro в системе ИЛ-21/CD40L.

Материал и методы. В исследовании приняли участие 14 пациентов с ОВИН. Группа сравнения состояла из 10 здоровых добровольцев. Из периферической крови были получены образцы мононуклеарных клеток крови, которые использовали для активации Т-клеток. В качестве активаторов использовали фитогемагглютинин (ФГА) или комбинацию форболмиристат-ацетата (PMA) и иономицина (Io). Индукцию экспрессии CD40L на CD4+-клетках оценивали с помощью проточной цитометрии. Активацию в системе ИЛ-21/CD40L проводили на В-клетках, которые предварительно выделяли из популяции мононуклеарных клеток методом иммуномагнитной сепарации. В качестве активирующих стимулов использовали рекомбинантный ИЛ-21 и фидерные клетки A549, стабильно трансфецированные геном CD40L. Дифференцировку В-клеток в плазмабласты определяли по доле клеток с фенотипом CD19+CD27+CD38+CD20low. Субпопуляции наивных (IgM+IgD+), непереключенных (IgM+CD27+) и переключенных (IgG+CD27+) В-клеток выделяли с помощью проточного сортировщика. Секрецию IgG и IgM определяли с помощью иммуноферментного анализа, а количество IgG-секретирующих клеток оценивали с помощью метода ELISpot (Enzyme-Linked Immuno-Spot Analysis).

Результаты. При активации Т-клеток с помощью поликлональных стимуляторов часть CD4+-клеток начинала экспрессировать CD40L. Стимуляция Т-клеток здоровых добровольцев с помощью ФГА или комбинации PMA и Io приводила к экспрессии CD40L на 10 и 80 % CD4+-клеток, соответственно. Наблюдалась сравнимая активация Т-клеток, полученных от пациентов с ОВИН, и доля CD4+CD40L+-клеток была близка к норме. В-клетки пациентов с ОВИН при стимуляции в системе ИЛ-21/CD40L сохраняли способность дифференцироваться в плазмабласты с фенотипом CD19+CD27+CD38+CD20low, но секретировали IgG в 10 раз меньше, чем В-клетки здоровых добровольцев.

Заключение. У пациентов с ОВИН пути активации В-клеток, связанные с ИЛ-21 и CD40L, остаются интактными, и функциональные дефекты, наблюдаемые при ОВИН, очевидно, связаны с другими молекулами.

Ключевые слова:общая вариабельная иммунная недостаточность; B-лимфоциты; плазмабласты; ИЛ-21; CD40L

Для цитирования: Астахова Е.А., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Бязрова М.Г, Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Стимуляции В-клеток в системе ИЛ-21/CD40L в норме и у пациентов с общей вариабельной иммунной недостаточностью. Иммунология. 2021; 41 (6): 631-640. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640

Финансирование. Работа поддержана грантом РФФИ № 20-015-00318. Работа Бязровой М.Г выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства ФГАОУ ВО РУДН Минобрнауки России.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Введение

Общая вариабельная иммунная недостаточность (ОВИН) относится к первичным иммунодефицитам. Клинические проявления ОВИН очень вариативны [1]. Одним из ключевых признаков ОВИН является нарушение в переключении В-лимфоцитов, что приводит к снижению синтеза Ig изотипов G, A и/или М [2]. По этой причине пациенты с ОВИН часто страдают от повторяющихся инфекций. Однако в клинической картине наблюдаются не только инфекционные проявления, но и такие симптомы, как патологическая лимфопролиферация, аутоиммунные осложнения, энтеропатия и развитие опухолей (в первую очередь лимфом).

При ОВИН наблюдаются нарушения в дифференцировке наивных В-клеток в В-клетки памяти и антителосекретирующие клетки. Учитывая гетерогенность клинических симптомов у пациентов с ОВИН, были предприняты попытки стратификации пациентов по нарушениям дифференцировки В-лимфоцитов с целью поиска иммунологических маркеров формирования клинического фенотипа. Так, были созданы Фрайбургская (2002 г.) и Парижская (2003 г.) классификации, подразделяющие пациентов по количеству наивных В-клеток, В-клеток памяти с переключенным и непереключенным синтезом Ig [3-6]. Патогенез ОВИН в значительной степени остается невыясненным. К настоящему времени выявлено более 20 различных генов, регулирующих иммунный ответ, функциональность которых нарушена при этом заболевании [7]. Однако генетические дефекты регистрируются не более чем в 10 % случаев ОВИН. Вполне вероятно, что основная часть случаев ОВИН имеет комплексный генетический характер, и для их характеристики необходимо применять более общие физиологические параметры. К таким параметрам можно отнести эффективность стимуляции и дифференцировки В-лимфоцитов в системе in vitro.

Можно выделить 3 пути активации В-лимфоцитов. К 1-му пути относят активацию через антиген-специфический рецептор BCR, ко 2-му - стимуляцию под действием сигналов, получаемых в результате межклеточных взаимодействий CD40/CD40L с участием интерлейкина (ИЛ)-21 или ИЛ-4, и, наконец, 3-й путь включает активацию под действием ФНО-подобных цитокинов BAFF и APRIL. Основной путь активации В-лимфоцитов проходит через антиген-специфический рецептор BCR с участием костимуляторных молекул CD19, CD21, CD81 и Leu13. Этот сигнальный путь запускается при связывании BCR с антигеном или его поперечном связывании анти- Ig-антителами и комплементом. При стимуляции В-клеток через BCR и толл-подобный рецептор TLR9 развивается иммунный ответ на тимус-независимые антигены.

Ответ на тимус-зависимые антигены требует также участия дополнительных факторов и определенных клеточных взаимодействий, которые происходят в герминативных центрах лимфоузлов. В этих структурах В-клетки вступают в контакт с фолликулярными Т-хелперами, которые несут на своей поверхности CD40L и продуцируют значительное количество ИЛ-21. Совместное действие ИЛ-21 и CD40L обеспечивает активную пролиферацию В-клеток, их дифференцировку в плазмабласты, а затем в плазматические клетки, а также переключение синтеза Ig [8]. Дополнительным стимулом при активации В-клеток являются факторы BAFF (B cell Activating Factor of the TNF family) и APRIL (A Proliferation Induced Ligand) [9]. В отличие от ИЛ-21/CD40L, эти факторы обеспечивают долговременное выживание В-клеток и их превращение в долгоживущие плазматические клетки [10, 11].

Таким образом, анализируя функциональные дефекты в активации В-лимфоцитов, можно охватить широкий круг возможных нарушений и при этом установить молекулярные механизмы, приводящие к проявлению ОВИН. Такой функциональный подход позволяет сузить круг предполагаемых дефектов, которые в дальнейшем могут быть идентифицированы прямыми генетическими методами. Ранее нами был отработан эффективный метод для стимуляции В-клеток, который обеспечивает активацию В-клеток, дифференцировку их в плазмабласты и Ig-секретирующие клетки [12].

Цель настоящего исследования - поиск функциональных дефектов в активации В-лимфоцитов у пациентов с ОВИН при стимуляции В-клеток in vitro в системе HH-21/CD40L.

Материал и методы

Характеристика пациентов. В исследуемую группу были включены 10 пациентов с диагнозом ОВИН (4 женщины и 6 мужчин, средний возраст - 42 года, в диапазоне от 27 до 80 лет). Все пациенты характеризовались сниженным уровнем сывороточных IgG, IgA и/ или IgM, при нормальном количестве CD19+-клеток. Пациенты ежемесячно проходили заместительную терапию в виде введения внутривенного иммуноглобулина.

Исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого". Письменное информированное согласие было получено от каждого участника исследования перед выполнением каких-либо процедур исследования. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Этическим комитетом Института иммунологии (№ 3-1, 11 марта 2020 г.).

Образцы цельной крови собирали в гепаринизированные вакутейнерные пробирки (Sarstedt, Cat. No. 04.1927, Германия). Мононуклеарные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколлаверографина (р = 1,077 г/см3). B-клетки выделяли методом отрицательной иммуномагнитной сепарации с использованием набора Dynabeads Untouched human B cell kit (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 11351D, США). Субпопуляции переключенных В-клеток памяти (IgG+CD27+), непереключенных В-клеток памяти (IgM+CD27+) и наивных B-лимфоцитов (IgM+IgD+CD38+) выделяли с помощью проточного сортировщика клеток.

Активация лимфоцитов. Для активации Т-хелперов в качестве стимулирующих агентов использовали фито-гемагглютинин (ФГА; 10 мкг/мл), а также комбинацию форболмиристата (PMA; 17 нМ) и иономицина (Io; 220 нМ). Выделенные лимфоциты крови инкубировали in vitro в присутствии стимулирующих агентов в течение 18 ч (ФГА) или 4 ч (PMA + Io). В-лимфоциты выделяли из мононуклеарной фракции методом негативной иммуномагнитной сепарации или с помощью сортировки клеток на проточном сортировщике клеток. Выделенные В-клетки культивировали in vitro в течении нескольких дней в присутствии 25 нг/мл рекомбинантного ИЛ-21 (Peprotech, США) и фидерных клеток, несущих поверхностный CD40L [12]. На 4-й и 7-й день проводили рестимуляцию, добавляя свежую порцию ИЛ-21 и фидерных клеток.

Проточная цитометрия. Для окрашивания лимфоцитов использовали следующие антитела: CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), против человеческого IgG-FITC (клон CH1) и IgM-FITC (клон MA2). Указанные антитела ранее были получены в нашей лаборатории [13, 14] и были конъюгированы с соответствующими красителями по ранее описанному методу [15, 16]. Для определения экспрессии CD40L и IgD использовали клоны 24-31 и IA6-2 (Biolegend, США). Окрашивание производили в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки 2 раза отмывали в физиологическом растворе, забуференном фосфатами. Перед измерением клеточную суспензию пропускали через ситечко с диаметром пор 40 мкм. Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного 2 диодными лазерами 488 и 561 нм. Клетки сортировали на проточном сортировщике SH800S (Sony Biotechnology, США). Обработку цитофлуориметрических данных проводили при помощи программы FlowJo (BD Biosciences, США).

Определение Ig методом иммуноферментного анализа (ИФА). Антитела против человеческого IgG (клон 2A11) и IgM (клон CH2) в концентрации 10 мкг/мл сорбировали в лунках 96-луночных планшетов (Greiner, Германия), внося в лунку по 100 мкл раствора антител в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ). Планшеты инкубировали ночь при 4 °С, после чего трижды отмывали буфером ФСБ/Tween 20. Лунки блокировали добавлением ФСБ, содержавшего 1 % бычьего сывороточного Ig, инкубировали в течение часа и 3 раза отмывали c с помощью ФСБ с добавлением 0,1 % Tween 20 (ФСБ-Т). Образцы культуральных супернатантов серийно разводили от 1 : 2 до 1 : 200 раз в буфере для образцов. Планшеты инкубировали с образцами в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки планшеты дополнительно инкубировали в течение 1 ч со вторичными антителами против IgG или IgM человека, конъюгированными с пероксидазой хрена. Далее планшеты промывали 7 раз и проявляли в течение 10 мин с помощью 100 мкл раствора хромогена TMB. Реакцию остановили добавлением 50 мкл 1 M H2SO4 и оптическую плотность при 450 нм измеряли с помощью фотометра BioRad iMark Microplate Absorbance Reader (BioRad, США), данные анализировали с помощью программы Zemfira 4.0 (BioRad, США).

Определение Ig-секретирующих клеток методом ELISpot (Enzyme-Linked ImmunoSpot Analysis). Лунки 96-луночного планшета Multiscreen HTS Filter Plates (Merck, США) с размером пор 0,45 мкм покрывали кроличьими антитела против IgG или IgM человека (R&D Systems, США) в концентрации 10 мкг/лунку. Стимулированные В-клетки высевали в лунки (от 100 до 3000 клеток на лунку) и инкубировали в течение 16 ч при 37 ° C, 5 % CO2. После 3-кратной отмывки в PBS, содержавшем 0,05 % Tween 20, в лунки добавляли биотинилированные антитела против IgG или IgM человека (R&D Systems, США) и инкубировали 16 ч. После 3-кратной отмывки в PBS/Tween20, в разведении 1 : 60 добавляли конъюгат стрептавидина с щелочной фосфатазой (R&D Systems, США) и планшеты дополнительно инкубировали в течение 2 ч. После несколько отмывок добавляли хромоген из набора B Cell ELISpot Development (R&D Systems, США) и инкубировали до появления четких пятен. Реакцию останавливали промыванием водой. Изображения лунок получали с помощью ридера CTL ImmunoSpot Analyzer (CTL, США). Лунки, покрытые нерелевантным белком, служили в качестве отрицательного контроля.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism версия 8.4.3 (GraphPad, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью критерия Манна-Уитни, а также с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p < 0,05. Данные на гистограммах показывают медиану и межквартильный размах.

Результаты

Наблюдаемые при ОВИН дефекты стимуляции В-лимфоцитов потенциально могут быть связаны с нарушениями активации T-хелперов. Для того чтобы оценить эту возможность, мы изучили индукцию стимуляторной молекулы CD40L на Т-клетках пациентов с ОВИН. Т-клетки активировали обработкой фитогемагглютинином (ФГА) или комбинацией форболмиристат-ацетата (PMA) и иономицина (Io) в течение 18 ч (ФГА) или 4 ч (PMA + Io). Стимулированные клетки окрашивали комбинацией антител CD4-FITC и CD40L-PE. При стимуляции Т-клеток здоровых добровольцев с помощью ФГА (n = 10) около 10 % CD4+-клеток начинали экспрессировать CD40L. Примерно такую же активацию Т-лимфоцитов мы наблюдали при стимуляции Т-клеток пациентов с ОВИН (n = 14, p = 0,12) (рис. 1).

Рис. 1. Индукция экспрессии молекулы CD40L на СD4+-клетках пациентов с ОВИН и здоровых добровольцев

Лимфоциты крови культивировали in vitro в присутствии фитогемагглютинина (ФГА) (А) или комбинации форболмиристат-ацетата (PMA) и иономицина (Io) (Б).

Здесь и на рис. 3-5: ОВИН - общая вариабельная иммунная недостаточность.

Активация с помощью PMA + Io была более эффективной и вызывала значительную экспрессию CD40L на поверхности T-хелперов. Стимуляция клеток здоровых добровольцев (n = 6) в течение 4 ч обеспечивала экспрессию CD40L на 85 % CD4+-клеток (рис. 1). У пациентов с ОВИН (n = 5) доля CD4+-клеток, экспрессирующих CD40L, была незначительно ниже = 0,25). Таким образом, по крайней мере у исследованных пациентов с ОВИН нарушения в функционирования В-лимфоцитов не были связаны с недостатком экспрессии молекулы CD40 при активации T-хелперов.

Далее мы перешли к функциональной оценке непосредственно В-клеточного звена иммунитета. С этой целью мы сравнили пациентов с ОВИН со здоровыми добровольцами по эффективности В-клеточной стимуляции in vitro в системе Hn-21/CD40L. Использованная нами схема стимуляции была достаточно эффективной и обеспечивала пролиферацию В-клеток и их дифференцировку в плазмабласты лимфоцитов, полученных как от здоровых добровольцев, так и от пациентов с ОВИН. В контрольные точки на 4, 7 и 10-й день стимуляции с помощью проточной цитометрии мы определяли общее количество и фенотип активированных клеток.

Эксперименты с В-клетками здоровых добровольцев показали, что наивные В-лимфоциты пролиферировали более активно, чем В-клетки памяти (рис. 2). На 7-й день стимуляции индекс пролиферации наивных В-лимфоцитов более чем в 2 раза превышал индекс пролиферации переключенных и непереключенных В-клеток памяти.

Рис. 2. Пролиферация отдельных субпопуляций В-клеток здоровых добровольцев при стимуляции in vitro в системе ИЛ-21/CD40L

С помощью клеточного сортировщика были выделены наивные В-клетки (IgM+IgD+) и В-клетки памяти с непереключенным (IgM+IgD-CD27+) и переключенным (IgG+CD27+IgD-IgM-) фенотипом, которые стимулировали in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L.

Наряду с пролиферацией наблюдалась также дифференцировка В-клеток в плазмабласты. Как правило, пациенты с ОВИН характеризуются сниженным количеством переключенных В-клеток памяти. Тем не менее именно эти клетки наиболее активно дифференцировались в плазмабласты. На 7-й день стимуляции процент плазмабластов в популяции переключенных В-клеток памяти достигал 80 % (рис. 3), в то время в отсортированных субпопуляциях наивных и непереключенных В-клеток памяти доля плазмабластов составляла всего 7 и 61 % соответственно. Увеличение доли плазмабластов сопровождалось уменьшением доли исходных недифференцировавшихся IgG+CD27+-клеток. В отличие от этого, у пациентов с ОВИН только малая доля переключенных В-клеток памяти дифференцировалась в плазмабласты. Соответственно доля IgG+CD27+-клеток при этом уменьшалась незначительно.

Рис. 3. Стимуляция in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L отдельных субпопуляций В-лимфоцитов здоровых добровольцев

С помощью клеточного сортировщика были выделены наивные В-клетки (IgM+IgD+) и В-клетки памяти с непереключенным (IgM+IgD-CD27+) и переключенным (IgG+CD27+IgD-IgM-) фенотипом, которые стимулировали in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L.

Слева показана пролиферация клеток; справа - дифференцировка в плазмабласты В-клеток из различных субпопуляций.

К 7-му дню стимуляции В-клетки начинали секретировать в среду Ig. По секреции IgM наивные и непереключенные В-клетки памяти пациентов с ОВИН не отличались от таковых показателей В-клеток здоровых добровольцев (рис. 4). Можно отметить, что В-клетки памяти с поверхностным IgG вовсе не секретировали IgM, что свидетельствовало о хорошем качестве сортировки. Вполне естественно, что секреция IgG в наибольшей степени отмечалась в субпопуляции В-клеток с переключенным фенотипом. У В-клеток пациентов с ОВИН уровень IgG секреции был примерно на порядок меньше, чем у В-клеток здоровых добровольцев (p = 0,0006). Наивные В-клетки, несмотря на высокий уровень пролиферации, не демонстрировали заметной секреции IgG, следовательно, стимуляция ИЛ-21/CD40L не обеспечивала переключение синтеза с IgM на IgG. В популяции непереключенных клеток памяти здоровых добровольцев в некоторых случаях наблюдался небольшой, но вполне заметный уровень секреции IgG. Это свидетельствовало о возможности переключения с синтеза IgM на синтез IgG при стимуляции ИЛ-21/CD40L in vitro. В отличие от этого, у пациентов с ОВИН в субпопуляции В-клеток с непереключенным фенотипом никакой секреции IgG не наблюдалось.

Рис. 4. Секреция IgM и IgG в культурах ИЛ-21/CD40L-стимулированных субпопуляций В-лимфоцитов здоровых добровольцев и пациентов с ОВИН на 7-й день после стимуляции

Для того чтобы подтвердить или опровергнуть возможность переключения синтеза Ig при стимуляции in vitro В-клеток пациентов с ОВИН, мы провели дополнительное исследование с помощью более чувствительного метода ELISpot (рис. 5). В среднем около 50 % переключенных В-клеток здоровых добровольцев (n = 5), а также пациентов с ОВИН (п = 5) в процессе стимуляции KT-21/CD40L превращались в IgG-секретирующие клетки (рис. 5). В популяции непереключенных и наивных В-клеток наблюдался небольшой, но достоверный уровень IgG-секретирующих клеток. Таким образом, В-клетки пациентов с ОВИН по сравнению с В-клетками здоровых добровольцев характеризовались существенно сниженным уровнем секреции IgG, однако сохраняли способность к переключению синтеза с IgM на IgG.

Рис. 5. Образование IgG-секретирующих клеток в культурах ИЛ-21/CD40L-стимулированных субпопуляций В-лимфоцитов здоровых добровольцев и пациентов с ОВИН на 7-й день стимуляции

Перед стимуляцией В-клетки были поделены на субпопуляции наивных (IgM+IgD+), непереключенных (IgM+CD27+) и переключенных (IgG+) клеток.

Обсуждение

Как известно, ОВИН характеризуется дефектами в функционировании В-клеточного звена иммунитета. Эта недостаточность может быть следствием нарушений как в самих В-лимфоцитах, так и в Т-хелперах, которые обеспечивают нормальное функционирование В-клеток. Важной молекулой, участвующей в поддержании и регуляции В-клеточного ответа, является CD40L [17, 18]. Эта костимуляторная молекула экспрессируется на активированных T-хелперах, которые участвуют в стимуляции В-лимфоцитов и в развитии иммунного ответа. Взаимодействие молекул CD40L и CD40 запускает сигналинг, который приводит к В-клеточной пролиферации, препятствует апоптозу, вызывает переключение изотипа синтезируемого Ig, соматического гипермутагенеза, а также созреванию аффинности антител [19]. При дисрегуля-ции или отсутствии экспрессии CD40L на T-хелперах значительно снижается активация В-лимфоцитов. Мы предположили, что дефекты активации и стимуляции В-лимфоцитов при ОВИН могут быть связаны с недостаточной экспрессией CD40L на T- хелперах.

Экспрессию CD40L на Т-хелперах мы индуцировали путем совместной активации протеинкиназы С и кальциевых каналов под действием PMA и Io. Альтернативный путь стимуляции Т-клеток - воздействие на митоген-активируемую протеинкину MAPK с помощью обработки ФГА. И в одном, и в другом случае наблюдалась индуцированная экспрессия CD40L на CD4+-клетках. Однако различий между Т-клетками пациентов с ОВИН и здоровых добровольцев по индукции CD40L не наблюдалось. Мы пришли к выводу, что для исследованных нами вариантов ОВИН экспрессия CD40L не является причиной дефектного функционирования В-клеток. В литературе имеются довольно противоречивые сведения об изменениях экспрессии CD40L при ОВИН. Полученные нами результаты находятся в соответствии с данными, полученными в работе [20], однако противоречат выводам другой публикации [21]. В последней работе авторы отмечают, что наиболее заметные нарушения экспрессии CD40L наблюдались в клетках детей от 7 до 14 лет. Средний возраст обследованных нами пациентов был значительно выше (42 года), возможно, этим объясняются различия в полученных результатах.

Изучение ОВИН до сих пор в основном концентрировалось на определении отдельных субпопуляций В-лимфоцитов [5, 10, 22]. В отношении функциональных тестов при ОВИН имеются только единичные сообщения. В качестве примера можно привести публикацию S. Borte и соавт. [23], в которой было показано, что ИЛ-21/анти-CD40-стимуляция В-лимфоцитов, полученных от пациентов с ОВИН, способна вызывать переключение синтеза IgM на синтез IgG и IgA и обеспечивать дифференцировку в плазматические клетки, секретирующие IgG и IgA. Возможность переключения синтеза Ig у пациентов с ОВИН была нами продемонстрирована с помощью чувствительного теста ELISpot. Наше исследование показало, что В-клетки пациентов с ОВИН способны должным образом реагировать на активирующие стимулы и они сохраняют способность к передаче сигнала по оси ИЛ-21/CD40. Совокупность полученных нами и литературных данных говорит о том, что при распространенных формах ОВИН ни ИЛ-21, ни CD40L не являются лимитирующими факторами созревания В-клеток и что функциональные дефекты, очевидно, связаны с другими молекулами. Это открывает новые возможности для разработки новых способов лечения пациентов с ОВИН.

Заключение

Таким образом, при стимуляции Т-клеток пациентов с ОВИН с помощью как комбинации PMA и Io, так и ФГА наблюдается выраженная индукция CD40L на CD4+-клетках. По способности к индукции CD40L Т-хелперы пациентов с ОВИН не отличаются от соответствующих Т-клеток нормальных добровольцев и патогенез ОВИН не связан с нарушением экспрессии молекулы CD40L. В-клетки пациентов с ОВИН при стимуляции в системе Hn-21/CD40L секретировали в 10 раз меньше IgG, чем В-клетки здоровых добровольцев. В то же время В-клетки пациентов с ОВИН при стимуляции сохраняли способность к переключению синтеза IgM на синтез IgG. Это свидетельствует о том, что при ОВИН ни ИЛ-21, ни CD40L не являются лимитирующими факторами созревания В-клеток и что функциональные дефекты, наблюдаемые при ОВИН, очевидно, связаны с другими молекулами.

Вклад авторов. Сбор и обработка материала - Астахова Е.А., Шилкина А.Б., Бязрова М.Г., Фролов Е.А.; написание текста, редактирование - Филатов А. В., Бязрова М.Г., Латышева Т.В.; окончательный вариант и целостность текста - Филатов А.В., Латышева Е.А.

Литература

1. Jolles S. The variable in common variable immunodeficiency: a disease of complex phenotypes. J. Allergy Clin. Immunol. Pract 2013; 1: 545-56; quiz 557. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaip.2013.09.015

2. Maglione P.J., Ko H.M., Beasley M.B., Strauchen J.A., Cunningham-Rundles C. Tertiary lymphoid neogenesis is a component of pulmonary lymphoid hyperplasia in patients with common variable immunodeficiency. J. Allergy Clin. Immunol 2014; 133: 535-42. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2013.08.022

3. Лушова А.А., Жеремян Э.А., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Бязрова М.Г., Филатов А.В. Субпопуляции В-лимфоцитов: функции и молекулярные маркеры. Иммунология. 2019; 40 (6): 63-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16009

4. Piqueras B., Lavenu-Bombled C., Galicier L., Bergeson-van der Cruyssen F., Mouthon L., Chevret S. et al. Common variable immunodeficiency patient classification based on impaired B cell memory differentiation correlates with clinical aspects. J. Clin. Immunol. 2003; 23: 385-400. DOI: https://doi.org/10.1023/A:1025373601374

5. Warnatz K., Denz A., Dräger R., Braun M., Groth C., Wolff-Vorbeck G. et al. Severe deficiency of switched memory B cells (CD27+IgM−IgD−) in subgroups of patients with common variable immunodeficiency: a new approach to classify a heterogeneous disease. Blood. 2002; 99: 1544-51. DOI: https://doi.org/10.1182/blood.V99.5.1544

6. Wehr C., Kivioja T., Schmitt C., Ferry B., Witte T., Eren E. et al. The EUROclass trial: defining subgroups in common variable immunodeficiency. Blood 2008; 111: 77-85. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2007-06-091744

7. Bogaert D.J.A., Dullaers M., Lambrecht B.N., Vermaelen K.Y., De Baere E., Haerynck F. Genes associated with common variable immunodeficiency: one diagnosis to rule them all? J. Med. Genet 2016; 53: 575-90. DOI: https://doi.org/10.1136/jmedgenet-2015-103690

8. Ettinger R., Sims G.P., Fairhurst A.-M., Robbins R., da Silva Y.S., Spolski R. et al. IL-21 induces differentiation of human naive and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 2005; 175: 7867-79. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.175.12.7867

9. Avery D.T., Kalled S.L., Ellyard J.I., Ambrose C., Bixler S.A., Thien M. et al. BAFF selectively enhances the survival of plasmablasts generated from human memory B cells. J. Clin. Invest. 2003; 112: 286-97. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI18025

10. Barbosa R.R., Silva S.L., Silva S.P., Melo A.C., Pereira-Santos M.C., Barata J.T. et al. Reduced BAFF-R and increased TACI expression in common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 2014; 34: 573-83. DOI: https://doi.org/10.1007/s10875-014-0047-y

11. Matsuda Y., Haneda M., Kadomatsu K., Kobayashi T. A proliferation-inducing ligand sustains the proliferation of human naïve (CD27−) B cells and mediates their differentiation into long-lived plasma cells in vitro via transmembrane activator and calcium modulator and cyclophilin ligand interactor and B-cell mature antigen. Cell. Immunol. 2015; 295: 127-36. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2015.02.011

12. Бязрова М.Г., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Васильева Ю.В., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (6): 18-27. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-18-27

13. Filatov A.V., Krotov G.I., Zgoda V.G., Volkov Y. Fluorescent immunoprecipitation analysis of cell surface proteins: A methodology compatible with mass-spectrometry. J. Immunol. Methods. 2007; 319: 21-33. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jim.2006.09.014

14. Khvastunova A.N., Kuznetsova S.A., Al-Radi L.S., Vylegzhanina A.V., Zakirova A.O., Fedyanina O.S. et al. Anti-CD antibody microarray for human leukocyte morphology examination allows analyzing rare cell populations and suggesting preliminary diagnosis in leukemia. Sci. Rep. 2015; 5: 12573. DOI: https://doi.org/10.1038/srep12573

15. Berg E.A., Fishman J.B. Labeling antibodies with Cy5-Phycoerythrin. Cold Spring Harb. Protoc. 2019; 2019: pdb.prot099317. DOI: https://doi.org/10.1101/pdb.prot099317

16. Vira S., Mekhedov E., Humphrey G., Blank P.S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal. Biochem 2010; 402: 146-50. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ab.2010.03.036

17. Foy T.M., Aruffo A., Bajorath J., Buhlmann J.E., Noelle R.J. Immune regulation by CD40 and its ligand GP39. Annu. Rev. Immunol 1996; 14: 591-617. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.14.1.591

18. van Kooten C., Banchereau J. CD40-CD40 ligand. J. Leukoc. Biol. 2000; 67: 2-17. DOI: https://doi.org/10.1002/jlb.67.1.2

19. Revy P., Geissmann F., Debré M., Fischer A., Durandy A. Normal CD40-mediated activation of monocytes and dendritic cells from patients with hyper-IgM syndrome due to a CD40 pathway defect in B cells. Eur. J. Immunol 1998; 28: 3648-54. DOI: https://doi.org/10.1002/(SICI)1521-4141(199811)28:11<3648::AID-IMMU3648>3.0.CO;2-U

20. Kowalczyk D., Macura-Biegun A., Zembala M. The expression of CD40 on monocytes of children with primary humoral immunodeficiencies. Pediatr. Res. 2006; 59: 816-9. DOI: https://doi.org/10.1203/01.pdr.0000219298.96471.18

21. Brugnoni D., Airò P., Lebovitz M., Malacarne F., Ugazio A.G., Notarangelo L.D. et al. CD4+ cells from patients with Common Variable Immunodeficiency have a reduced ability of CD40 ligand membrane expression after in vitro stimulation. Pediatr. Allergy Immunol 1996; 7: 176-9. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1399-3038.1996.tb00129.x

22. ЛаберкоА.Л., Старичкова Ю.В., Хисматуллина Р.Д., Персианцева М.И., Масчан М.А., Балашов Д.Н., Румянцев А.Г. Оптимизация планирования трансплантаций гемопоэтических стволовых клеток с использованием информационной системы у детей с первичными иммунодефицитами. Иммунология. 2021; 42 (1): 49-59. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-1-49-59

23. Borte S., Pan-Hammarström Q., Liu C., Sack U., Borte M., Wagner U. et al. Interleukin-21 restores immunoglobulin production ex vivo in patients with common variable immunodeficiency and selective IgA deficiency. Blood. 2009; 114: 4089-98. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2009-02-207423

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Президент журнала
Президент журнала
Хаитов Рахим Мусаевич
Академик РАН, доктор медицинских наук, профессор, заслуженный деятель науки Российской Федерации, научный руководитель ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, главный аллерголог-иммунолог Минздрава России
Оргздрав-2022. Эффективное управление в здравоохранении
РОСМЕДОБР 2021
Вскрытие
Медицина сегодня
Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии.

28-29 апреля 2022 г. в Екатеринбурге состоится IX Евро-Азиатская конференция по офтальмохирургии (ЕАКО). Свое название конференция получила неслучайно, ведь именно в городе, расположенном на границе Европы и Азии, раз в два года встречаются офтальмологи из разных регионов...

Актуальные вопросы нейроофтальмологии,

Уважаемые коллеги! 28 января 2022 года состоится XXI научно-практическая нейроофтальмологическая конференция " Актуальные вопросы нейроофтальмологии. Поражение зрительного нерва: взгляд офтальмолога, невролога, вирусолога-ифекциониста, нейрохирурга " Конференция посвящается...

Конгресс, посвященный Всемирному дню борьбы с ожирением.

В Москве пройдет Конгресс, посвященный Всемирному дню борьбы с ожирением, с международным участием С 28 февраля по 2 марта 2022 года пройдет научно-образовательное мероприятие для врачей - Конгресс, посвященный Всемирному дню борьбы с ожирением. Ожирение представляет одну из...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»