Введение
Рекомбинантные аденовирусные векторы являются успешной платформой для создания различных вакцинных препаратов. Принцип создания таких вакцин заключается в том, что определенный ген или участок генома патогена встраивается в геном рекомбинантного аденовируса (rAd) человека или животного. При введении в организм rAd обеспечивает попадание генетического материала в клетки хозяина и экспрессию в них генов, кодирующих целевые антигены. В результате целевые антигены распознаются иммунной системой и индуцируют иммунный ответ против целевого патогена [1, 2].
В 2015 г. в России были зарегистрированы 2 первых вакцинных препарата на основе rAd человека - вакцины против вируса лихорадки Эбола "Гам-Эвак" и "Гам-Эвак Комби" [3]. В 2020 г. в России впервые в мире были зарегистрированы вакцинные препараты против новой коронавирусной инфекции SARS-CoV-2 [4] на основе rAd человека 5-го и 26-го серотипов (rAd5 и rAd26), несущих ген S-белка SARS-CoV-2: "Гам-Ковид-Вак" (Sputnik V), "Гам-Ковид-Вак Лио" и "Спутник Лайт" [5, 6]. В дальнейшем в мире были зарегистрированы еще 3 вакцины на основе rAd человека и шимпанзе против COVID-19 - заболевания, вызываемого SARS-CoV-2, - Ad5-nCov (CanSino Biologicals, Китай) [7], COVID-19 Ad26CovS1 (Johnson&Johnson/Janssen-Cilag, Нидерланды/США) [8] и ChAdOx1 nCoV-19 или Covishield (AstraZeneca plc/University of Oxford, Великобритания) [9].
Как известно, аденовирусы (Ad) способны эффективно активировать врожденный иммунный ответ, в том числе связываясь с Толл-подобным рецептором (TLR, Toll-like receptor) 9 [10]. Поэтому большинство исследователей полагают, что вакцины на основе rAd не нуждаются в адъювантах. Однако в некоторых случаях кандидатные вакцины на основе rAd-векторов все же не показали достаточную иммуногенность и/или протективность, они явно требуют различных способов ее повышения. Как правило, такая ситуация характерна для векторов, несущих секретируемые антигены различных патогенов (в частности, антигены малярийного плазмодия [11], Micobacterium tuberculosis [12] и др.). Кроме того, при создании Ad-вакцин широкого спектра действия против высокоизменчивых вирусов в качестве антигенов часто используют высококонсервативные внутренние вирусные белки, активирующие Т-клеточное звено иммунитета. В таких случаях также могут потребоваться адъюванты, способные усиливать активацию именно Т-клеточного звена.
Исследования последних 10-15 лет показали, что большинство адъювантов активируют антиген-презентирующие клетки (АПК) через рецепторы, распознающие патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (patogene-associated molecular patterns - PAMP) или молекулярные паттерны, ассоциированные с повреждением клеток (damage-associated molecular patterns - DAMP). Чаще всего активация АПК адъювантами происходит через TLRs. По этой причине большинство используемых и изучаемых на сегодняшний момент молекулярных адъювантов представляют собой очищенные или синтетические агонисты TLR. Теоретически одновременная активация нескольких видов TLRs при введении в организм rAd в сочетании с молекулярными адъювантами должна существенно усиливать иммуногенность векторной вакцины. Однако работы на эту тему показали противоречивые результаты. Так, введение животным лиганда для TLR-3 Poly[I:C] синтетического двухцепочечного сополимера полиинозиновой и полицитидиловой кислот или их комплекса с полилизином и карбоксиметилцеллюлозой (Poly[IC:LC]) в некоторых случаях усиливало иммуногенность вакцин на основе rAd и повышало активацию цитотоксических Т-лимфоцитов [13-15], в некоторых случаях способствовало снижению ответов антиген-специфических Т-клеток [16], а также приводило к усилению или ингибированию Т-клеточных ответов в зависимости от дозы rAd [17]. Введение лабораторным животным вакцин на основе rAd совместно с лигандами TLR4 в одних работах существенно увеличивало специфический клеточный иммунный ответ [16-19], тогда как в других работах приводило к очевидному снижению защиты [20]. Таким образом, стратегия введения в состав rAd-вакцин агонистов TLRs в качестве вспомогательного вещества пока не показала значительных успехов.
Исходя из вышесказанного, более перспективным нам видится введение различных молекулярных адъювантов в состав векторов на основе rAd в качестве генетических конструкций. Они могут представлять собой как отдельный ген, кодирующий целевую иммуностимулирующую молекулу, так и генетическую конструкцию, кодирующую слитый белок, состоящий из целевого антигена и молекулярного адъюванта. Такой способ стимуляции иммунитета позволяет перенаправить иммунный ответ именно на целевой трансген, оказывая минимальное влияние на формирование иммунитета против самого rAd. Кроме того, некоторые исследования показывают, что стимуляция врожденного иммунитета векторным капсидом снижает экспрессию трансгена АПК в лимфатических узлах и, как следствие, приводит к ослаблению целевого иммунного ответа [21]. Таким образом, введение адъювантов в виде генетической конструкции в составе rAd позволит избежать нежелательного усиления иммунного ответа на rAd и неблагоприятного влияния на иммуногенность трансгена. Кроме того, в качестве адъювантов в составе вакцин на основе генетических конструкций можно использовать не только агонисты паттерн-распознающих рецепторов, но и последовательности, улучшающие презентацию антигена в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (Major Histocompatibility Complex - MHC), позволяющие мультимеризовать секретируемые антигены и др.
1. Адъюванты, улучшающие презентацию антигена в комплексе с молекулами MHC
В этом разделе будут рассмотрены адъюванты, входящие в состав rAd-вакцин в виде генетических конструкций, улучшающих презентацию антигена иммунной системе. Примерами таких адъювантов являются кальретикулин [22-25], домен олигомеризации C4bp [26, 27] и инвариантная цепь, ассоциированная с MHC класса II [21, 27-34].
1.1. Кальретикулин в качестве адъюванта в составе rAd-вакцин
Кальретикулин - это высококонсервативный Ca2+-связывающий белок массой 60 кДа, который повсеместно встречается в клетках млекопитающих и преимущественно располагается в просвете эндоплазматического ретикулума [35]. Кальретикулин выполняет различные биологические функции: шаперонная активность, регуляция гомеостаза Ca2+ и передача сигналов клеточной адгезии. Перенос кальретикулина из эндоплазматического ретикулума на поверхность клетки является ключевым этапом в распознавании и удалении апоптотических клеток путем фагоцитоза [36]. На поверхности апоптотических клеток кальретикулин может распознаваться дендритными клетками (ДК) или другими АПК, что приводит к фагоцитозу апоптотических клеток. Показано, что кальретикулин на поверхности раковых клеток представлен в комплексе с антигеном рака молочной железы муцином 1 (MUC1), а ДК, трансдуцированные rAd, экспрессирующим генетическую конструкцию MUC1-кальретикулин, активировали пролиферацию Т-клеток и продукцию цитокинов [22]. Адъювантные свойства кальретикулина также определяются его способностью связываться с молекулами MHC класса I. Кальретикулин взаимодействует с β2-микроглобулином в молекулах MHC и является частью комплекса, включающего также транспортер, связанный с процессингом антигена (TAP). Кальретикулин напрямую связывает антигенные пептиды при их транспорте в просвет эндоплазматического ретикулума. Кроме того, внеклеточный кальретикулин, связанный с пептидными антигенами, может захватываться АПК, что также приводит к презентации антигенов в комплексе с MHC класса I и стимуляции CD8+-Т-клеток (рис. 1) [37].
&hide_Cookie=yes)
Рис. 1. Механизм действия кальретикулина в качестве адъюванта
1 - взаимодействие антигена, слитого с кальретикулином, с В-клеточным рецептором; 2 - слитый белок кальретикулин-антиген транспортируется в антиген-презентирующую клетку (АПК) посредством связывания с поверхностным рецептором (например CD91) и способствует высвобождению антигена из эндосом в цитозоль, после чего антигены разрушаются и транспортируются в просвет эндоплазматического ретикулума (ЭПР) в комплексе с молекулами MHC класса I (МНС-I).
Кальретикулин был использован в качестве адъюванта при разработке противоопухолевой вакцины на основе rAd5. Такой Ad экспрессировал ген слитого с кальретикулином онкобелка папилломавируса человека HPV-17 E7 и использовался в качестве буста при праймировании вектором на основе Lactococcus lactis, также экспрессирующим ген E7. В результате такая стратегия вакцинации была признана эффективной и способной индуцировать клеточно-опосредованную цитотоксичность [23].
Также были описаны rAd, экспрессирующие генетическую конструкцию, кодирующую антиген M. tuberculosis, слитый с кальретикулином [24], и генетическую конструкцию, кодирующую слитый с кальретикулином поверхностный антиген вируса гепатита B (HBV) [25].
1.2. C4-связывающий белок в качестве адъюванта в составе rAd-вакцин
C4-связывающий белок (C4bp - С4 binding protein) - это белок плазмы крови, действующий как ингибитор комплемента и представляющий собой олигомер с центральной ножкой и семью разветвленными α-цепями. При слиянии с целевыми антигенами C4bp может обеспечивать их олигомеризацию (рис. 2), увеличивая время циркуляции антигена и повышая его иммуногенность [37].
&hide_Cookie=yes)
Рис. 2. Механизм действия C4-связывающего белка в качестве адъюванта
Домен олигомеризации C4bp при слиянии с антигеном образует антиген-гептамеры. 1 - представление гептамерного белка-мишени В-клеткам; 2 - гептамеры, попавшие в АПК, разлагаются в кислых эндосомах и презентируются в комплексе с молекулами MHC класса II (MHC-II) на поверхности АПК CD4+-Т-клеткам; 3 - антигенный комплекс покидает эндосомы и перекрестно презентируется в комплексе с молекулами MHC класса I (MHC-I) CD8+-Т-клеткам.
Так, иммунизация мышей высококонсервативным поверхностным белком Neisseria gonorrhoeae MtrE, слитым с олигомеризующим доменом C4bp, приводила к индукции высоких титров антител, способных распознавать MtrE, экспрессируемый на поверхности N. gonorrhoeae, и проявляющих высокую MtrE-зависимую бактерицидную активность [38]. Кандидатная ДНК-вакцина, несущая гены секретируемых E1 и E2 (sE1 и sE2) белков оболочки вируса гепатита С (HCV), собирающихся в олигомеры путем слияния с доменом олигомеризации C4b, эффективно индуцировала гуморальный и клеточный иммунный ответ против белков оболочки вируса, а также способствовала выработке вирус-нейтрализующих антител [39].
RAd, несущие гены антигенов малярийного плазмодия, слитых с олигомеризующим доменом C4bp, были способны эффективно индуцировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ, превышающий иммунный ответ на антигены малярийного плазмодия, не связанные с олигомеризующим доменом C4bp [26, 27]. Однако, согласно этим публикациям, олигомеризующий домен C4bp повышает иммуногенность не всех антигенов, поэтому объяснить адъювантные свойства C4bp только способностью к олигомеризации нельзя [26, 27].
1.3. MHC-II-ассоциированная инвариантная цепь в качестве адъюванта в составе rAd-вакцин
Инвариантная цепь (Ii) представляет собой интегральный мембранный белок типа II, который временно ассоциируется с MHC класса II во время синтеза в эндоплазматическом ретикулуме. Там происходит обмен части Ii, известной как CLIP-пептид, на фрагмент антигена. Образовавшийся комплекс пептид-MHC-II транспортируется в клеточную мембрану, где фрагмент антигена презентируется иммунной системе в комплексе с MHC класса II [37] (рис. 3).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 3. Механизм действия инвариантной цепи Ii в качестве адъюванта
Антиген, слитый с Ii, образует тримерный комплекс, связывающийся с молекулами MHC класса II (MHC-II). К презентации антигенов в комплексе с MHC-II приводят 2 пути: 1 - прямой транспорт в эндосомы, где антиген переносится к MHC-II; 2 - непрямой транспорт через транс-отдел комплекса Гольджи к внешней мембране АПК. Отсюда комплекс интернализуется и повторно попадает на путь презентации антигена. 3 - целевой антиген дополнительно способен презентироваться в комплексе с молекулами MHC класса I (MHC-I) в результате убиквитинилирования и разрезания иммунопротеасомами.
В 2008 г. P.J. Holst и соавт. впервые использовали Ii в качестве генетического адъюванта в составе rAd-вакцины [28], причем они обнаружили улучшение презентации антигена как в комплексе с MHC класса II, так и в комплексе с MHC класса I, что приводило к повышению клеточного иммунитета [28]. С тех пор Ii использовалась в целом ряде кандидатных вакцин против различных патогенов [29-34]. Кандидатная вакцина на основе rAd, экспрессирующего ген гликопротеина вируса лимфоцитарного хориоменингита (Lymphocytic Choriomeningitis Virus - LCMV), слитого с Ii, стимулировала образование CD4+- и CD8+-Т-клеток in vitro и in vivo. Кроме того, иммунизированные кандидатной вакциной мыши были защищены от летального вирус-индуцированного хориоменингита и системной инфекции высокоинвазивным штаммом. При терапевтической противоопухолевой вакцинации кандидатная rAd-вакцина показала ту же эффективность, что и вакцина на основе аттенуированного LCMV. При этом животные, вакцинированные rAd, экспрессирующим немодифицированный гликопротеин LCMV, хоть и были защищены от системной инфекции, но защита от летального хориоменингита была временной, а эффективность при терапии опухолей существенно снижена [29].
RAd шимпанзе в сочетании с рекомбинантным вирусом осповакцины, несущие ген малярийного антигена ME-TRAP, слитый с Ii, показали способность индуцировать высокие уровни как CD4+-, так и CD8+-Т-клеточного иммунного ответа у лабораторных мышей. Исследования на приматах подтвердили способность Ii увеличивать уровни ME-TRAP-специфических CD8+- и CD4+-Т-клеток примерно в 6 и в 2 раза, соответственно, по сравнению с рекомбинантными векторами, не содержащими Ii [30].
Иммунизация обезьян rAd, несущим гены вируса иммунодефицита обезьян (SIV) tat, vif, rev и vpr, слитые с геном Ii, вызывала индукцию Т-клеточного иммунитета и приводила к частичной защите от заражения [31].
Кандидатная вакцина широкого спектра действия против HPV разработана на основе консервативных последовательностей белков E1 и E2 из существующих онкогенных штаммов HPV. Вакцина представляет собой rAd шимпанзе, несущий генетическую последовательность, кодирующую белок слияния, состоящий из E1 и E2, а также человеческой инвариантной цепи изоформы 2 (HIi2). Кандидатная вакцина показала свою эффективность на мышах и макаках [21].
Ad шимпанзе 3-го серотипа (ChAd3) и модифицированный вектор MVA, несущие генетическую последовательность, кодирующую Ii человека, слитую с неструктурными антигенами (NS) HCV, применялись у людей в режиме гетерологичной прайм-буст-иммунизации. Кандидатная вакцина хорошо переносилась и увеличивала пролиферативную активность Т-лимфоцитов, пиковую величину и широту и Т-клеточного иммунного ответа против HCV по сравнению с вакциной, в состав которой Ii не входила. В модели на мышах и в экспериментах in vitro было показано, что Ii, слитая с NS, увеличивает иммунный ответ на HCV за счет усиленного убиквитинирования и протеасомной деградации [32].
Однако следует отметить, что, согласно литературным данным, применение полноразмерной Ii человека в качестве адъюванта может привести к образованию аутоиммунных антител. Было показано, что антитела к CLIP-домену инвариантной цепи человека ассоциированы с осевым спондилитом [40], поэтому безопасность применения Ii человека в качестве молекулярного адъюванта находится под вопросом. Для решения этой проблемы были разработаны 2 стратегии: применение усеченного варианта Ii, а также использование инвариантной цепи, происходящей из других организмов. Оказалось, что для сохранения адъювантных свойств и эффективной активации Т-клеточного иммунитета было достаточно трансмембранного домена Ii, состоящего всего из 26 аминокислотных остатков. Было показано, что активация у мышей CD8+-Т-клеточного ответа на малярийный антиген с помощью rAd, несущего ген малярийного антигена, слитого с трансмембранным доменом Ii, была в 2-3 раза выше, чем индуцированная с помощью полноразмерной Ii. Также было показано, что включение в состав rAd участков Ii форели, акулы и курицы приводило к индукции высоких уровней CD8+-Т-клеточного ответа [33].
К настоящему времени на стадии клинических испытаний безопасности находится кандидатная вакцина от малярии на основе rAd шимпанзе и рекомбинантного MVA, несущие генетическую конструкцию, кодирующую антиген малярийного плазмодия LS2, слитый с трансмембранным доменом Ii акулы (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03203421). На II фазе клинических испытаний находится вакцина против HCV на основе rAd шимпанзе и рекомбинантного MVA, несущих гены антигенов HCV и Ii человека (ClinicalTrials.gov Identifier: NCT03688061).
1.4. MHC-II-ассоциированная инвариантная цепь с сайтом разрезания для фуриновой протеазы в качестве адъюванта в составе rAd-вакцин
Во всех исследованиях, описанных ранее, научные коллективы стремились с помощью слияния целевого антигена с Ii увеличить Т-клеточный ответ на кандидатную вакцину. Однако было показано, что Ii может существенно улучшать и антительный иммунный ответ при отсутствии ее влияния на правильную укладку антигена.
Антиген, связанный с Ii, может как презентироваться в комплексе с молекулами MHC класса II, так и транспортироваться через комплекс Гольджи в виде тримера на поверхность клетки. Если в состав белка слияния включить сайт разрезания фуриновой протеазой, то в комплексе Гольджи происходит разрезание пептида слияния и отделение тримеризующего домена, связанного с антигеном, от инвариантной цепи. Далее тример целевого антигена будет секретироваться во внеклеточный компартмент. Это повысит доступность антигена для В-клеток, при этом сохранится увеличение уровня презентации антигена в комплексе с молекулами MHC класса II и MHC класса I [37] (рис. 4).
&hide_Cookie=yes)
Рис. 4. Механизм действия инвариантной цепи с сайтом расщепления для фуриновой протеазы Ii-furin в качестве адъюванта
1 - интеграция сайта расщепления в инвариантной цепи (Ii) не влияет на прямой путь презентации антигена в комплексе с молекулой MHC класса II (MHC-II); 2 - при непрямом пути презентации молекула Ii расщепляется в транс-отделе комплекса Гольджи резидентной фуриновой эндопротеазой. Антиген, связанный с последовательностью тримеризации Ii, высвобождается в виде тримера во внеклеточное пространство, где встречается с В-клетками и индуцирует образование антител. 3 - целевой антиген дополнительно способен презентироваться в комплексе с молекулой MHC класса I (MHC-I) в результате убиквитинилирования и разрезания иммунопротеасомами.
Действительно, при включении в состав белка слияния, несущего антигены Plasmodium falciparum и Ii, сайта разрезания для фуриновой протеазы, rAd, экспрессирующий генетическую конструкцию, кодирующую такой белок слияния, значительно увеличивал способность индуцировать образование антител к целевым антигенам с сохранением всех адъювантных свойств Ii [34].
1.5. Лиганд CD40L в качестве адъюванта в составе rAd-вакцин
Лиганд CD40 (CD40L), мембранный белок типа II, является ключевой костимулирующей молекулой и важным регулятором иммунной системы. Эта молекула быстро экспрессируется на активированных CD4+-Т-клетках. Рецептор CD40L - молекула CD40 - представлена на всех АПК. Взаимодействие рецептора CD40 с его лигандом индуцирует активацию АПК [37].
Таким образом, молекула CD40L обладает потенциальными адъювантными свойствами. Показана ее эффективность в составе векторных вакцин, экспрессирующих секретируемые антигены, слитые с CD40L, что позволяет направить секретируемый антиген в АПК и эффективно их активировать. Потенциал CD40L как молекулярного адъюванта был исследован различными научными группами, в том числе в составе генетических конструкций, кодирующих целевые антигены, слитые с CD40L и экспрессируемые rAd.
Так, показал свою эффективность и способность индуцировать иммунный ответ широкого спектра действия rAd, экспрессирующий секретируемую НА2-субъединицу гемагглютинина вируса гриппа, слитую с лигандом CD40L мыши [41]. RAd, экспрессирующий генетическую конструкцию, кодирующую слитый белок, состоящий из глобулярного эктодомена S-белка коронавируса ближневосточного респираторного синдрома (MERS-CoV) и CD40L мыши, продемонстрировал существенное повышение иммуногенности по сравнению с rAd, лишенным CD40L, и показал свою эффективность даже при однократной иммунизации. При этом кандидатная вакцина обеспечивала полную защиту животных от гибели после заражения MERS-CoV, предотвращала репликацию вируса, а также моноцитарную и лимфоцитарную инфильтрацию легких по сравнению с контрольной группой [42].
2. Цитокины в качестве адъювантов в составе rAd-вакцин
Цитокины - это небольшие белки, предназначенные для передачи сигналов иммунными клетками. Цитокины являются многообещающими кандидатами в качестве адъювантов в составе генетических вакцин. Умеренная и устойчивая экспрессия цитокинов, ограниченная местом инъекции генетической вакцины, помогает добиться длительной циркуляции цитокинов, обладающих коротким периодом полужизни, сводя к минимуму риск системного "цитокинового шторма". В качестве адъювантов для вакцин на основе генетических конструкций цитокины сначала начали использоваться в составе ДНК-вакцин. Например, интерлейкин(ИЛ)-2, индуцирующий пролиферацию Т- и НК-клеток, показал свои адъювантные свойства в составе ДНК-вакцины против Mycoplasma pneumoniae [43] и хронической миелоидной лейкемии [44]. ИЛ-12 - провоспалительный цитокин, секретируемый ДК и моноцитами, использовался в качестве адъюванта в составе кандидатных ДНК-вакцин против инфекции Yersinia pestis [45], HBV [46], HCV [47], Toxoplasma gondii [48] и ВИЧ [49]. ИЛ-15 индуцирует пролиферацию НК- и T-клеток. Синергический адъювантный эффект ИЛ-15 и ИЛ-21 был использован в ДНК-вакцине против инфекции T. gondii [50]. Последовательное введение в состав ДНК-вакцины против ящура генов, кодирующих ИЛ-6, ИЛ-7 и ИЛ-15, усиливало образование CD4+-Т-клеток [51]. Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) рекрутирует АПК в сайт иммунизации, способствует созреванию ДК и успешно использовался в составе кандидатных ДНК-вакцин, в том числе против вируса иммунодефицита обезьян [52, 53].
Введение в состав rAd-вакцин генов, кодирующих различные цитокины, тоже описано в литературе, хотя оно встречается реже, чем их введение в состав в ДНК-вакцин. Так, при иммунизации макак реплицирующимся одноцикловым rAd, экспрессирующим гены антигенов ВИЧ, дополнительное введение rAd, экспрессирующих гены, кодирующие белок 4-1BBL, являющийся рецептором АПК, ГМ-КСФ, ИЛ-21 или фрагменты токсина Clostridoides difficile, приводило к усилению гуморального иммунного ответа [54]. Интраназальная иммунизация мышей rAd, экспрессирующими гены антигенов вируса гриппа А гемагглютинина и нуклеопротеина, в комбинации с векторами на основе rAd, экспрессирующими гены, кодирующие ИЛ-1β и ИЛ-18, значительно увеличила иммуногенность rAd-вакцин, особенно мукозальный гуморальный иммунный ответ [55].
3. Белки теплового шока в качестве адъювантов в составе rAd-вакцин
Белки теплового шока (HSP - Heat Shock Protein) наиболее известны своей функцией шаперонов, помогающих в правильном сворачивании белков, особенно во время клеточного стресса. HSP играют роль в доставке антигенов к молекулам MHC класса I и их презентации Т-клеткам [56]. Механизм влияния HSP на презентацию антигена в комплексе с молекулами MHC аналогичен действию кальретикулина (см. рис. 1).
Также они способны активировать TLR4 [57], т. е. вполне подходят на роль молекулярных адъювантов. Показано, что интраназальная иммунизация мышей гибридным белком, представляющим собой слитый белок из четырех эктодоменов ионного канала вируса гриппа М2 и белка теплового шока Hsp70 M. tuberculosis 4M2e-mHsp70, вызывала значимые уровни гуморального и клеточного иммунного ответа, причем Т-клеточный ответ имел Th1-направленость с последующим усилением продукции интерферона(ИФН)-γ, IgG и IgA [58]. Таким образом, создание вирусных векторов, несущих генетические конструкции, кодирующие слитые белки, включающие антигены-мишени и молекулами HSP, перспективно с точки зрения разработки эффективных вакцинных препаратов. Введение различных антигенов, слитых с HSP, мышам, сначала в виде рекомбинантных белков [59, 60], а позже в составе ДНК-векторов [61], продемонстрировало увеличение уровней гуморального и клеточного иммунного ответа по сравнению с введением антигенов без слияния с HSP.
L. Cheng и соавт. сконструировали rAd, экспрессирующий генетическую конструкцию, кодирующую C-концевой участок Hsp70 (Hsp70C), слитый с С-концом белка S0.7 вируса Хантаан. По сравнению с rAd, экспрессирующим только S0.7, без Hsp70C, добавление HSP увеличивало титр вирус-нейтрализующих антител и существенно улучшало протективные свойства rAd. При этом Т-клеточный ответ был сдвинут в сторону Th1-клеток, секретировавших ИФН-γ и ИЛ-2, но не ИЛ-4 и ИЛ-10 [62]. RAd, несущие гены антигенов возбудителя африканской чумы свиней, слитые с флагеллином FlaB из Vibrio vulnicus или белком теплового шока Hsp70 M. tuberculosis (mHsp70), при иммунизации свиней показали значительно более высокие уровни антиген-специфического IgA в носовых смывах, смывах из трахеи и легких, чем при иммунизации rAd, несущим только гены антигенов возбудителя африканской чумы свиней. По сравнению с иммунизацией rAd-Flab-F1, иммунизация rAd-F1-Hsp70 индуцировала значительно более высокие уровни IgA на слизистых оболочках. При этом уровни IgA коррелировали с присутствием в легочном лаваже животных ИЛ-4, ИЛ-10 и ИФН-α [63].
4. Агонист ТLR5 флагеллин в качестве адъюванта в составе rAd-вакцин
Флагеллин, компонент жгутиков бактерий, является лигандом для TLR5 и вызывает большой интерес в качестве адъюванта в составе генетических вакцин, так как его просто экспрессировать, в том числе с помощью rAd. К тому же он стабильно и эффективно активирует врожденный иммунный ответ. Высокий уровень экспрессии TLR5 на поверхности эпителиальных клеток легких, кишечника, моноцитов/макрофагов и ДК позволяет флагеллину быть эффективным адъювантом для активации иммунного ответа на слизистых оболочках. Кроме уже упомянутой работы H. Lu и соавт. [63], был проведен ряд других исследований о возможности использования флагеллина в качестве адъюванта в составе rAd-вакцин. Показано, что rAd, несущий генетическую конструкцию, кодирующую гликопротеин вируса бешенства, слитый с флагеллином Salmonella typhimurium (FliC), при внутримышечном, но не пероральном введении, вызывал более сильные иммунный ответ и обеспечивал более высокий уровень защиты от бешенства, чем rAd, экспрессирующий только ген гликопротеина вируса бешенства [64]. Однако H.F. Rady и соавт. продемонстрировали, что при прайм-буст-иммунизации мышей ДНК или аденовирусным вектором, несущим ген, кодирующий антиген M. tuberculosis Ag85А, введение в состав ДНК или rAd гена, кодирующего FliC, слитый с антигеном, приводит к появлению очагов воспаления в легких и временной потере массы тела иммунизированных животных, а также к заметному снижению уровней CD4+- и CD8+-Т-клеточного ответа на слизистой при применении схемы прайм-буст-иммунизации (внутримышечное введение ДНК-вектора/интраназальное введение rAd). Эти данные показывают, что адъювантная активность флагеллина сильно зависит от способа введения и состава генетической вакцины, а его включение в состав генетических вакцин может приводить к появлению нежелательных побочных эффектов [65].
Заключение
В данном обзоре описывается введение адъювантов в состав rAd-вакцин в качестве генетических конструкций. Здесь рассматриваются различные генетические конструкции, способствующие повышению иммуногенности и защитных свойств вакцин против инфекционных заболеваний. Основными типами таких "генетических" адъювантов являются молекулы, улучшающие презентацию антигена иммунным клетками в комплексе с молекулами MHC (кальретикулин, C4-связывающий белок, MHC-II-ассоциированная инвариантная цепь, лиганд CD40L), молекулы, стимулирующие иммунные клетки (цитокины), а также молекулы, активирующие паттерн-распознающие рецепторы врожденного иммунного ответа (белки теплового шока, лиганды TLRs). Все эти молекулы показали себя достаточно перспективными в качестве адъювантов в виде генетических конструкций, включенных в состав rAd. Однако очень часто их эффективность зависит от свойств самого антигена и патогена, вводимой при иммунизации дозы rAd и др. Таким образом, невозможно признать какой-либо из описываемых подходов универсальным, для каждой разрабатываемой вакцины на основе rAd необходимо проводить подбор генетической конструкции, способной повысить ее иммуногенность и вызвать активацию необходимого для данной вакцины звена иммунитета.