Анализ количества и функциональной активности Т-клеток в аневризме брюшной аорты у мышей с отсутствием рецептора ИЛ-27

• Пешкова Юлия Олеговна
• Хорева Марина Викторовна
• Ганковская Людмила Викторовна
• Кольцова Екатерина Константиновна

Резюме

Введение. Аневризма брюшной аорты (АБА) - сосудистое заболевание стенки брюшной аорты, вызванное накоплением большого количества иммунных клеток, воспалением и разрушением стенки сосуда. Прогрессивный рост аневризмы часто приводит к ее разрыву, который может быть фатальным. На настоящий момент потенциальные иммунные механизмы, способствующие развитию АБА, мало изучены, что ограничивает возможности лечения данного заболевания.

Цель исследования - определить роль рецептора интерлейкина(ИЛ)-27 в регуляции количества и функциональной активности Т-клеток в АБА у мышей.

Материал и методы. Мышам с генотипами Apoe^-/-Il27ra^+/- и Apoe^-/-Il27ra^-/-, содержавшимся на диете с высоким уровнем углеводов и жиров (Western Diet, WD), были имплантированы осмотические помпы, наполненные ангиотензином II (Анг II) для развития АБА. Количество Т-клеток и их субпопуляций в ткани супраренального отдела брюшной аорты/АБА исследовали с помощью проточной цитофлуориметрии и иммунофлуоресцентного анализа. Продукцию секретируемых цитокинов измеряли методом иммуноферментного анализа в супернатанте клеток, выделенных из супраренального отдела брюшной аорты/АБА. Для сравнения 2 групп мышей (Apoe^-/-Il27ra^+/- и Apoe^-/-Il27ra^-/-) использовали двусторонний непарный t-критерий Стьюдента.

Результаты. Обнаружено пониженное количество Т-клеток, в частности CD4⁺- и CD8⁺-субпопуляций, в ткани супраренального отдела брюшной аорты/АБА у мышей в отсутствии рецептора ИЛ-27, которое сопровождалось ослабленной продукцией Т-хелперами (Th) цитокинов, таких как фактор некроза опухоли α (ФНОα) и интерферон-γ (ИФН-γ) (Th1), ИЛ-4 и ИЛ-13 (Th2), ИЛ-17A (Th17).

Заключение. Наши данные показывают, что сигнальный путь, опосредованный рецептором ИЛ-27, влияет на количество и функциональную активность Т-клеток, позволяя предположить, что ингибирование данного сигнала может быть использовано для разработки иммунотерапии для лечения AБA.

Ключевые слова:аневризма брюшной аорты; рецептор ИЛ-27; Т-клетки; цитокины; воспаление

Введение

Аневризма брюшной аорты (АБА) - сосудистое заболевание стенки брюшной аорты, характеризующееся расширением и истончением стенки сосуда. Оно вызвано накоплением инфильтрирующих иммунных клеток, воспалением и разрушением внеклеточного матрикса, которое приводит к разрыву стенки сосуда, кровотечению и нередко к смерти [1]. Основными факторами риска, способствующими развитию АБА, являются возраст (старше 65 лет), принадлежность к мужскому полу, курение, артериальная гипертензия и гиперхолестеринемия [2]. Патологические механизмы, запускающие процесс формирования АБА, в частности деградацию эластиновых волокон, до сих пор до конца не ясны, что затрудняет разработку фармакологического лечения. Лечение АБА в настоящее время ограничивается только хирургическим вмешательством и заместительной терапией [3, 4].

Инфильтрация стенки брюшной аорты иммунными клетками, такими как моноциты, нейтрофилы и лимфoциты, с последующим развитием хронического воспаления в стенке сосуда, является отличительной особенностью АБА [5]. В течение последнего десятилетия было создано несколько моделей развития АБА на мышах, которые проявляют признаки, характерные для АБА у людей [6]. Самой распространенной является модель с применением индукции ангиотензином(Анг) II, в основе которой лежит инфузия Анг II мышам, предрасположенным к развитию атеросклероза (Apoe^-/-) [7]. Развитие АБА в данной модели усугубляется при содержании мышей на диете с высоким уровнем углеводов и жиров (Western diet, WD), которая приводит к развитию гиперхолестеринемии [8, 9]. Помимо повышения артериального давления, Анг II регулирует активность различных иммунных и неиммунных клеток через ангиотензиновый рецептор 1 типа (AT1a-рецептор) [7, 10, 11]. Нами было показано, что Анг II действует на гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), усиливая миелопоэз [12].

Интерлейкин(ИЛ)-27 - представитель ИЛ-6/ИЛ-12 семейства цитокинов, который вырабатывается миелоидными клетками в ответ на воспалительные стимулы, контролирует активацию и функцию различных популяций гемопоэтических клеток, а также некоторых негемопоэтических клеток, экспрессирующих рецептор ИЛ-27 (IL-27R) [13]. Большинство исследований по изучению функций ИЛ-27 были сфокусированы на Т-клетках, по большей части на CD4⁺-субпопуляции. Так, например, было показано, что сигнал, передаваемый через IL-27R, способствует развитию Т-хелперов (Th) 1 типа и выработке интерферона-γ (ИФН-γ), при этом блокирует дифференцировку в сторону Th2- и Th17-типов [14-16]. В то же время ИЛ-27 способствует продукции ИЛ-10 CD4⁺-Т-регуляторными клетками (Treg) [17]. Недавние исследования in vitro продемонстрировали, что ИЛ-27 вызывает повышение экспрессии провоспалительных молекул в моноцитах [18]. Однако данные, полученные на моделях in vivo, напротив, позволяют предположить противовоспалительную роль ИЛ-27, так как дендритные клетки мышей с нокаутом по гену Il27r (Il27ra^-/-) показали высокий уровень экспрессии костимулирующих молекул, что приводило к усиленному развитию иммунного ответа Th1-типа [19]. К тому же была установлена вовлеченность ИЛ-27 в усиление миелопоэза [20, 21].

Роль сигнала, передаваемого через IL-27R, в механизме развития АБА была показана нами ранее [12], однако его влияние на количество Т-клеток и уровень продукции Т-клеточных цитокинов в стенке АБА у мышей не изучено.

Материал и методы

Лабораторные животные. В данной работе были использованы мыши, нокаутные по гену аполипопротеина Е (Apoe^-/-) и рецептора ИЛ-27 (Il27ra^-/-), полученные из питомника Джексона (Jackson lab?оratory, США). У Apoe^-/--мышей развивается атеросклероз при содержании их на специальной диете, включающей холестерин (0,2 %), жиры (21,2 %), белки (17,3 %) и углеводы (48,5 %) (Western Diet, WD) (Teklad, 88137, США). Apoe^-/--мышей скрещивали с Il27ra^-/--мышами для получения мышей с генотипами Apoe^-/-Il27ra^+/- и Apoe^-/-Il27ra^-/-. Начиная с 8-й недели рождения все мыши были переведены на WD и содержались на ней в течение 12 нед. На 8-й неделе содержания всем мышам проводили имплантацию помп, содержащих Анг II (Alzet, модель 2004, США). Спустя 4 нед мышей забивали и проводили анализ количества Т-клеток, их субпопуляций и продуцируемых ими цитокинов в супраренальном отделе брюшной аорты/АБА. Анализ генотипа экспериментальных животных проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием геномной ДНК, выделенной из фрагмента ткани хвоста индивидуальной мыши. Всех мышей содержали в виварии для лабораторных животных в онкологическом центре Фокс Чейз, Филадельфия, США (Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA, USA). Все эксперименты на мышах были предварительно одобрены комитетом по охране и использованию животных Онкологического центра Фокс Чейз (IACUC).

Хирургическая имплантация помп, содержащих Анг II. Для развития АБА у мышей использовалась модель имплантации осмотических помп с Анг II [7]. Осмотические помпы (Alzet, модель 2004, США) заполняли раствором Анг II, учитывая массу животного и продолжительность эксперимента (4 нед) (800 нг/кг в минуту; Calbiochem, 2787322, США). Готовые помпы инкубировали при 37 °С в течение ночи в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (Gibco, США). Имплантацию помпы проводили под наркозом, делали небольшой надрез в области лопатки, раздвигали подкожную жировую клетчатку для образования кармана для помпы, вставляли помпу и закрывали рану хирургическими клипсами.

Проточная цитофлуориметрия. Apoe^-/-Il27ra^+/-- и Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей, имплантированных помпой с Анг II, подвергали эвтаназии асфиксией в CO₂-камере. Выделяли участок супраренального отдела брюшной аорты/АБА, разрезали на мелкие кусочки и инкубировали в 2 мл смеси ферментов для разрушения ткани, содержащей гиалуронидазу (120 ед/мл) (Sigma, H3506, США), коллагеназу I (450 ед/мл) (Sigma, C0130, США), коллагеназу XI (250 ед/мл) (Sigma, C7657, США) и ДНКазу I (120 ед/мл) (Sigma, D4263, США) в солевом растворе Хэнкса (HBSS) (Gibco, США) на шейкере в течение 55 мин при 37 °C. После окончания инкубации полученную суспензию клеток фильтровали через 70 мкм фильтр и окрашивали следующими антителами: CD45-PerCP (30-F11; Biolegend, 103130, США), CD11b-Cy7PE (M1/70; BioLegend, 101216, США), TCRβ-Cy55APC (H57-597; BioLegend, 109224, США), TCRβ-PE (H57-597, Biolegend, 109208, США) CD4-PE (GK1.5; BioLegend, 100408, США) и краситель Live/Dead Yellow (Life Technologies, 1862666, США) (для отделения живых клеток от мертвых) с последующим анализом на проточном цитофлуориметре LSR II (BD Bioscience, США) с применением программного обеспечения FACSDiva 6.0 (BD Bioscience, США). Все антитела были использованы в разведении 1:50, а Live/Dead Yellow - в разведении 1:200 в FACS-буфере [ФСБ, содержавшем 3 % бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma, США) и 0,1 % азида натрия (Sigma, США)]. Для анализа результатов использовали программное обеспечение FlowJo (версия 9.7.6) (BD Bioscience, США). Анализ проводили следующим образом. Вначале по данным прямого (FSC) и бокового светорассеивания (SSC) проводили отбор популяции гемопоэтических клеток. Далее отбирали живые (негативные по окрашиванию красителем Live/Dead Yellow) гемопоэтические CD45⁺-клетки. Из популяции живых гемопоэтических клеток выделяли популяцию Т-клеток (СD45⁺TCRβ⁺). Из популяции СD45⁺TCRβ⁺-Т-клеток дополнительно выделяли субпопуляции Т-хелперов (Th) (СD45⁺TCRβ⁺СD4⁺) и цитотоксических Т-клеток (СD45⁺TCRβ⁺CD8⁺).

Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов тканей супраренальных отделов брюшных аорт/АБА. Для иммунофлуоресцентного анализа срезов ткани супраренальные отделы брюшных аорт/АБА изолировали и заключали в реагент для криоблоков (Tissue-Tek O.C.T. Compound, Sakura Finetek, США) с последующим приготовлением криосрезов на криотоме. Срезы толщиной 5 мкм фиксировали в ледяном ацетоне в течение 10 мин с последующей фиксацией в 100 мМ растворе Na₂HPO₄, содержащего 60 мМ лизина, 7 мМ периодата натрия (Sigma-Aldrich, США) и 1 % параформальдегида (Electron Microscopy Sciences, США) (рН 7,4), на льду в течение 8 мин. Далее срезы последовательно инкубировали с авидином и биотином (Vector Laboratories, США) при комнатной температуре в течение 10 мин и с блокирующим буфером [1 % раствор БСА в ФСБ, содержащего 5 % козьей сыворотки (Sigma, США)] в течение 15 мин при комнатной температуре для блокирования неспецифического связывания. После этого срезы окрашивали в течение ночи при 4 °С крысиными антителами против CD3 мыши (17А2, Biolegend, США) в разведении 1:100 с последующим окрашиванием вторичными козьими антикрысиными IgG-антителами Alexa Fluor 568 (Molecular Probes, США) в разведении 1:500 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем образцы окрашивали диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) в разведении 1:1000 (Sigma, 32670, США) в течение 7 мин при комнатной температуре. Покровные стекла монтировали на предметные стекла с помощью фотозащитного реактива Prolong Gold (Invitrogen, P36930, США).

Изображения были получены с помощью конфокального микроскопа Leica SP8 DM6000 с использованием иммерсионных объективов ×20 и ×40 HCXPLADO при длине волны возбуждения 563 нм и проанализированы с помощью программы Imaris (Bitplane, Великобритания).

Измерение концентрации секретируемых цитокинов в супернатанте методом ИФА. Клеточную суспензию, полученную путем ферментативного расщепления супраренальных отделов брюшных аорт/АБА, выделенных из Apoe^-/-Il27ra^+/-- и Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей, имплантированных помпой с Анг II, переносили в лунки 96-луночного круглодонного планшета. Далее клетки осаждали, к суспензии клеток добавляли среду RPMI (Gibco, США), содержавшую анти-CD3- и анти-CD28-антитела (8 мкг/мл) (eBioscience, США) для активации Т-клеток. Клетки культивировали при 37 °С и 5 % СО₂ в течение 48 ч.

Измерение концентрации цитокинов в супернатанте проводили с помощью набора Mouse Cytokine 23-plex assay (eBioscience, США), согласно протоколу производителя, следующим образом. В 96-луночный круглодонный планшет добавляли антитела, связанные с магнитными частицами, и образец (супернатант). Проводили инкубацию на шейкере (500 об/мин) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем последовательно добавляли детектирующие биотинилированные антитела и стрептавидин, меченный флуоресцентным красителем PE, с последующими инкубациями в течение 30 мин при тех же условиях. После окончания инкубации ресуспендировали магнитные частицы в буфере для анализа. Результаты оценивали на приборе MagePix (Luminex Instrument, eBiosсince, США).

Статистическая обработка результатов. Двусторонний непарный t-критерий Стьюдента использовали для сравнения 2 групп мышей (Apoe^-/-Il27ra^+/- и Apoe^-/-Il27ra^-/-). Данные были проанализированы с использованием программного обеспечения GraphPad (версия 6.0) (GraphPad Prism, США). Данные представлены как среднее значение и стандартная ошибка среднего (± SEM). Значение р < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Пониженное количество Т-клеток в ткани супраренального отдела брюшной аорты/АБА у Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей

В норме аорта содержит небольшое количество макрофагов, Т-клеток и других иммунных клеток, тогда как во время развития воспаления и атеросклероза у людей и у мышей происходит инфильтрация иммунными клетками наружной стенки аорты (адвентиция) [22, 23]. Значительное накопление гемопоэтических клеток в стенке сосуда, включая Т- и миелоидные клетки, также является одним из главных признаков АБА. В данном исследовании мы решили проверить, может ли сигнал, передаваемый через IL-27R, влиять на количество Т-клеток в ткани АБА. Мы скрестили Apoe^-/--мышей с Il27ra^-/--мышами для получения мышей с генотипами Apoe^-/-Il27ra^+/- и Apoe^-/-Il27ra^-/-. В работе использовались мыши из одного помета, содержащиеся в одних и тех же клетках с одинаковыми условиями, для того чтобы исключить различия в микробиоте и генетике. Начиная с 8-й недели после рождения мыши были переведены на диету WD и содержались на ней в течение 12 нед. На 8-й неделе содержания на диете всем мышам проводили имплантацию осмотических помп, наполненных Анг II. Спустя 4 нед мышей забивали и проводили анализ АБА (рис. 1). Полученные данные подтверждают опубликованные нами ранее данные о том, что инфузия Анг II приводит к развитию АБА у мышей с наличием IL-27R (Apoe^-/-Il27ra^+/-), в то время как частота развития АБА значительно снижена у мышей с дефицитом IL-27R (Apoe^-/-Il27ra^-/-) [12].

Рис. 1. Схема эксперимента

Мышей с генотипами Apoe^-/-Il27ra^+/- и Apoe^-/-Il27ra^-/- содержали на диете Western Diet (WD) в течение 12 нед. На 8-й неделе содержания мышам имплантировали осмотические помпы, содержащие Анг II.

АБА - аневризма брюшной аорты.

Мы провели цитофлуориметрический анализ и оценили количество Т-клеток и их субпопуляций (CD4 и CD8) в стенке супраренального отдела брюшной аорты/АБА у Apoe^-/-Il27ra^+/-- и Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей. Обнаружили значительное снижение абсолютного количества СD45⁺TCRβ⁺-клеток у мышей с отсутствием IL-27R (Apoe^-/-Il27ra^-/-) по сравнению с контрольной группой мышей (Apoe^-/-Il27ra^+/-) (рис. 2А). Более того, количество СD45⁺TCRβ⁺СD4⁺- и СD45⁺TCRβ⁺CD8⁺-клеток также было снижено у Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей (рис. 2Б).

Рис. 2. Пониженное количество Т-клеток в ткани супраренального отдела брюшной аорты/АБА у Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей

Супраренальные отделы брюшных аорт/АБА, выделенные из мышей с генотипами Apoe^-/-Il27ra^+/- (n = 6) и Apoe^-/-Il27ra^-/- (n = 8), имплантированных помпой с Анг II, обрабатывали смесью ферментов для получения суспензии одиночных клеток с последующим окрашиванием Live/Dead Yellow, антителами против CD45, CD11b, TCRβ, CD4 и анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии. А. Слева - репрезентативные результаты проточной цитометрии CD45⁺TCRβ⁺-клеток. Цифры указывают содержание клеточной популяции в процентах в каждом гейте; справа - абсолютное количество живых CD45⁺TCRβ⁺-клеток. Б. Слева - репрезентативные результаты проточной цитометрии CD45⁺TCRβ⁺CD4⁺- и CD45⁺TCRβ⁺CD8⁺-Т-клеток; справа - абсолютное количество живых CD45⁺TCRβ⁺CD4⁺- и CD45⁺TCRβ⁺CD8⁺-Т-клеток. * - р < 0,05; ** - p < 0,01, двусторонний непарный t-критерий Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ± SEM из 3 независимых экспериментов.

Чтобы определить локализацию Т-клеток в стенке супраренального отдела брюшной аорты/АБА, мы провели иммунофлуоресцентное окрашивание замороженных срезов тканей супраренальных отделов брюшных аорт/АБА, выделенных от Apoe^-/-Il27ra^+/-- и Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей, имплантированных помпой с Анг II, антимышиными CD3-антителами (маркер Т-клеток). Мы наблюдали уменьшенное количество CD3⁺-клеток в адвентиции супраренального отдела брюшной аорты/АБА у Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей (рис. 3). Таким образом, наши данные показывают, что сигнал, передаваемый через IL-27R, вовлечен в регуляцию количества Т-клеток в АБА.

Рис. 3. Локализация и количество CD3⁺-клеток (Т-клетки) в ткани супраренального отдела брюшной аорты/АБА у Apoe^-/-Il27ra^+/-- и Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей, получавших Анг II.

Данные получены с помощью иммунофлуоресцентного анализа. П - просвет аорты; M - медиа; A - адвентиция; AБA - аневризма брюшной аорты. Красный цвет - CD3⁺-клетки. Репрезентативные изображения из 3 независимых экспериментов.

Пониженная продукция провоспалительных цитокинов в ткани супраренального отдела брюшной аорты/АБА у Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей

Цитокины, продуцируемые активированными миелоидными клетками и Т-клетками, являются главными медиаторами воспаления, они вовлечены в развитие различных воспалительных заболеваний, включая АБА. К настоящему времени точно неизвестно, Тh1- или Тh2-цитокины наиболее важны для развития АБА [24, 25]. Мы определили концентрацию секретируемых цитокинов в супернатанте, собранном после стимуляции клеточной суспензии, выделенной из ткани супраренальных отделов брюшных аорт/АБА у Apoe^-/-Il27ra^+/-- и Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей, получивших Анг II, в среде RPMI, содержащей анти-CD3/анти-CD28-антитела для активации Т-клеток, в течение 48 ч. Мы обнаружили пониженную продукцию нескольких провоспалительных цитокинов, включая ФНОα, ИФН-γ и ИЛ-17A в супраренальном отделе брюшной аорты/АБА у Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей по сравнению с контрольными Apoe^-/-Il27ra^+/--мышами. Интересно, что продукция Тh2-цитокинов была также существенно снижена у Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей (рис. 4).

Рис. 4. Пониженная продукция цитокинов, продуцируемых Т-клетками, в ткани супраренального отдела брюшной аорты/АБА у Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей

Клеточную суспензию, выделенную из супраренальных отделов брюшных аорт/АБА Apoe^-/-Il27ra^+/--мышей (n = 5) и Apoe^-/-I/l27ra^-/--мышей (n = 5), имплантированных помпой с Анг II, стимулировали в среде, содержащей анти-CD3/анти-CD28-антитела, в течение 48 ч для активации Т-лимфоцитов, с последующим определением уровня цитокинов в полученном супернатанте. * - р < 0,05, двусторонний непарный t-критерий Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ± SEM из 3 независимых экспериментов.

Обсуждение

Роль сигнала, передаваемого через IL-27R, была широко исследована в последнее десятилетие в различных моделях инфекционных заболеваний [13-16]. Однако его роль при хронических воспалительных заболеваниях недостаточно изучена. Так, было показано, что ИЛ-27 подавляет развитие воспаления в стенке аорты во время развития атеросклероза, другой сердечно-сосудистой патологии. В генетической модели атеросклероза на мышах с использованием индукции заболевания высокоуглеводной диетой (Ldlr^-/-), полное отсутствие рецептора ИЛ-27 приводило к усиленному поглощению окисленных липопротеинов низкой плотности (oxLDL) макрофагами с последующим образованием пенистых клеток, которые способствуют формированию атеросклеротической бляшки [26]. В то же время дефицит рецептора ИЛ-27 только в гемопоэтических клетках приводил к ускоренному прогрессированию заболевания у мышей за счет увеличения числа Th17-CD4⁺-T-клеток и повышенной продукции ИЛ-17А, ИЛ-6 и ФНОα [27]. Более того, полное отсутствие IL-27R в другой генетической модели спонтанного атеросклероза (Apoe^-/-) также усиливало его развитие из-за усиления процесса презентации антигена в стенке аорты, происходящего вследствие накопления и гиперактивации иммунных клеток [28].

Ранее нами было показано, что сигнал, опосредуемый IL-27R, играет провоспалительную роль при развитии АБА. Введение Анг II вызывало ослабление развития АБА у Apoe^-/--мышей с нокаутом гена Il27r. Наличие рецептора ИЛ-27 способствовало усиленному ответу ГСК на Анг II, который выражался увеличением продукции миелоидных клеток, в частности моноцитов и нейтрофилов, в костном мозге с их последующим выходом и миграцией в стенку брюшной аорты, что способствовало формированию АБА, в то время как отсутствие рецептора ИЛ-27 препятствовало вхождению ГСК в клеточный цикл в ответ на инфузию Анг II и, как следствие, выходу в стенку брюшной аорты меньшего количества миелоидных клеток, которых было недостаточно для формирования АБА [12].

В стенке АБА у человека, как и у мышей, обнаружено большое количество миелоидных клеток и лимфоцитов [5]. Однако было показано, что после инфузии Анг II у Apoe^-/--мышей в течение первых 3 дней происходит мобилизация миелоидных клеток, в частности моноцитов, из селезенки в стенку брюшной аорты [29].

В данном исследовании мы оценили влияние сигнала, опосредуемого рецептором ИЛ-27, на количество и функциональную активность Т-клеток в стенке сосуда у Apoe^-/--мышей, имплантированных помпой с Анг II и содержавшихся на WD. Нами обнаружено, что в ткани супраренального отдела брюшных аорт/АБА у мышей с генетическим нокаутом по гену рецептора ИЛ-27 наблюдалось пониженное количество Т-клеток, а именно CD4⁺- и CD8⁺-субпопуляций, что полностью коррелировало со снижением частоты развития АБА у таких мышей. С помощью иммунофлуоресцентного окрашивания мы показали, что в ткани супраренального отдела брюшной аорты/АБА у мышей Т-клетки преимущественно локализуются в адвентиции.

В предыдущих исследованиях было выявлено наибольшее накопление Th1- и Th2-Т-клеток в ткани АБА у пациентов [24, 25], однако совсем недавние исследования обнаружили накопление Th17- и Th22-Т-клеток [30, 31]. Каждая популяция Т-клеток характеризуется специфической продукцией цитокинов. Так, Th1-Т-клетки характеризуются продукцией ФНОα и ИФН-γ, Th2-клетки - ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13, Th17-клетки - ИЛ-17A. У пациентов с АБА в крови был обнаружен повышенный уровень некоторых провоспалительных цитокинов - ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-17А, ФНОα и ИФН-γ. Более того, повышенный уровень ИФН-γ был связан с ускоренным развитием и ростом АБА [32, 33]. Исследования, проведенные в моделях АБА на мышах, показывают неоднозначные результаты о роли ФНОα и ИФН-γ в развитии данного заболевания. В своей работе W. Xiong и соавт. показали что мыши с генетическим отсутствием ИФН-γ (Ifng^-/-) были защищены от развития АБА, вызванной хлоридом кальция (модель с индукцией CaCl₂), тогда как введение рекомбинантного ИФН-γ мышам, у которых отсутствуют CD4⁺-Т-клетки (CD4^-/-) и которые устойчивы к развитию АБА, восстанавливало способность развивать АБА [34]. Однако исследование, выполненное c использованием другой модели АБА, индуцированной введением Анг II, продемонстрировало защитную роль ИФН-γ [35]. Дефицит ФНОα (Tnfa^-/-) ослаблял развитие АБА, как и использование его антагониста [36], в то время как отсутствие рецептора 1 типа ФНОα (p55-Tnfr^-/-) существенно не влияло на формирование АБА [37]. Данные о Th2-цитокинах позволяют предположить их потенциальную патогенную роль в развитии АБА. Так, было показано, что ИЛ-4 и ИЛ-5 способствуют формированию заболевания путем увеличения продукции матриксных металлопротеиназ, ферментов, участвующих в деградации внеклеточного матрикса [38, 39]. Роль ИЛ-17А в развитии АБА остается спорной. Генетическое отсутствие ИЛ-17 (Il17^-/-) и введение его антагониста ослабляло развитие АБА [31]. Однако ослабленная продукция ИЛ-17, вызванная повышенной эндогенной экспрессией SOCS3 у мышей, приводила к развитию АБА [40]. В представленной работе мы показали, что Apoe^-/--мыши с дефицитом IL-27R характеризовались не только более низким числом Т-клеток, но и пониженной функциональной активностью Т-клеток, которая была определена путем измерения продукции цитокинов в супернатанте клеточной суспензии. Анализ спектра цитокинов, продуцируемых в АБА, выявил пониженные уровни ФНОα, ИФН-γ, ИЛ-4, ИЛ-13 и ИЛ-17A у Apoe^-/-Il27ra^-/--мышей по сравнению с контрольной группой Apoe^-/-Il27ra^+/--мышей.

Таким образом, полученные нами данные показывают важную роль ИЛ-27 и его рецептора в развитии АБА путем регуляции количества и активации Т-клеток. Однако дальнейшие исследования необходимы, для того чтобы оценить, какое действие: прямое или косвенное - оказывает данный сигнальный путь на функционирование Т-клеток в ткани АБА у мышей.

Заключение

Полученные результаты показали, что сигнальный путь, опосредуемый рецептором ИЛ-27, влияет на количество Т-клеток и продукцию цитокинов в АБА, что может быть использовано для разработки иммунотерапии этого заболевания.

Литература

1. Nordon I.M., Hinchliffe R.J., Loftus I.M., Thompson M.M. Pathophysiology and epidemiology of abdominal aortic aneurysms. Nat. Rev. Cardiol. 2011; 8 (2): 92-102. DOI: https://doi.org/10.1038/nrcardio.2010.180

2. Altobelli E., Rapacchietta L., Profeta V.F., Fagnano R. Risk Factors for abdominal aortic aneurysm in population-based studies: a systematic review and meta-analysis. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2018; 15 (12). DOI: https://doi.org/10.3390/ijerph15122805

3. Kim H.O., Yim N.Y., Kim J.K., Kang Y.J., Lee B.C. Endovascular aneurysm repair for abdominal aortic aneurysm: a comprehensive review. Korean J. Radiol. 2019; 20 (8): 1247-65. DOI: https://doi.org/10.3348/kjr.2018.0927

4. Lindeman J.H., Matsumura J.S. Pharmacologic management of aneurysms. Circ. Res. 2019; 124 (4): 631-46. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.118.312439

5. Yuan Z., Lu Y., Wei J., Wu J., Yang J., Cai Z. Abdominal aortic aneurysm: roles of inflammatory cells. Front. Immunol. 2020; 11: 609161. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.609161

6. Golledge J., Krishna S.M., Wang Y. Mouse models for abdominal aortic aneurysm. Br. J. Pharmacol. 2020. DOI: https://doi.org/10.1111/bph.15260

7. Daugherty A., Manning M.W., Cassis L.A. Angiotensin II promotes atherosclerotic lesions and aneurysms in apolipoprotein E-deficient mice. J. Clin. Invest. 2000; 105 (11): 1605-12. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI7818

8. Liu J., Lu H., Howatt D.A., Balakrishnan A., Moorleghen J.J., Sorci-Thomas M. et al. Associations of ApoAI and ApoB-containing lipoproteins with AngII-induced abdominal aortic aneurysms in mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2015; 35 (8): 1826-34. DOI: https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.115.305482

9. Николаева Т.Н., Козлов В.В., Кожевникова Т.Н., Григорьева Е.А., Сосновская О.Ю., Чекнев С.Б., Санин А.В., Пронин А.В. Изучение иммунного ответа и состояния метаболизма на экспериментальных моделях развития гиперлипидемии и метаболического синдрома. Иммунология. 2021; 42 (4): 337-45. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-4-337-345

10. Pueyo M.E., Gonzalez W., Nicoletti A., Savoie F., Arnal J.F., Michel J.B. Angiotensin II stimulates endothelial vascular cell adhesion molecule-1 via nuclear factor-kappaB activation induced by intracellular oxidative stress. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2000; 20 (3): 645-51. DOI: https://doi.org/10.1161/01.atv.20.3.645

11. Sahar S., Dwarakanath R.S., Reddy M.A., Lanting L., Todorov I., Natarajan R. Angiotensin II enhances interleukin-18 mediated inflammatory gene expression in vascular smooth muscle cells: a novel cross-talk in the pathogenesis of atherosclerosis. Circ. Res. 2005; 96 (10): 1064-71. DOI: https://doi.org/10.1161/01.RES.0000168210.10358.f4

12. Peshkova I.O., Aghayev T., Fatkhullina A.R., Makhov P., Titerina E.K., Eguchi S. et al. IL-27 receptor-regulated stress myelopoiesis drives abdominal aortic aneurysm development. Nat. Commun. 2019; 10 (1): 5046. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019-13017-4

13. Yoshida H., Hunter C.A. The immunobiology of interleukin-27. Annu. Rev. Immunol. 2015; 33: 417-43. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-032414-112134

14. Yoshida H., Hamano S., Senaldi G., Covey T., Faggioni R., Mu S. et al. WSX-1 is required for the initiation of Th1 responses and resistance to L. major infection. Immunity. 2001; 15 (4): 569-78. DOI: https://doi.org/10.1016/s1074-7613(01)00206-0

15. Yoshimoto T., Yoshimoto T., Yasuda K., Mizuguchi J., Nakanishi K. IL-27 suppresses Th2 cell development and Th2 cytokines production from polarized Th2 cells: a novel therapeutic way for Th2-mediated allergic inflammation. J. Immunol. 2007; 179 (7): 4415-23. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.179.7.4415

16. Diveu C., McGeachy M.J., Boniface K., Stumhofer J.S., Sathe M., Joyce-Shaikh B. et al. IL-27 blocks RORc expression to inhibit lineage commitment of Th17 cells. J. Immunol. 2009; 182 (9): 5748-56. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.0801162

17. Pot C., Jin H., Awasthi A., Liu S.M., Lai C.Y., Madan R. et al. Cutting edge: IL-27 induces the transcription factor c-Maf, cytokine IL-21, and the costimulatory receptor ICOS that coordinately act together to promote differentiation of IL-10-producing Tr1 cells. J. Immunol. 2009; 183 (2): 797-801. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.0901233

18. Pflanz S., Hibbert L., Mattson J., Rosales R., Vaisberg E., Bazan J.F. et al. WSX-1 and glycoprotein 130 constitute a signal-transducing receptor for IL-27. J. Immunol. 2004; 172 (4): 2225-31. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.172.4.2225

19. Wang S., Miyazaki Y., Shinozaki Y., Yoshida H. Augmentation of antigen-presenting and Th1-promoting functions of dendritic cells by WSX-1(IL-27R) deficiency. J. Immunol. 2007; 179 (10): 6421-8. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.179.10.6421

20. Furusawa J., Mizoguchi I., Chiba Y., Hisada M., Kobayashi F., Yoshida H. et al. Promotion of expansion and differentiation of hematopoietic stem cells by interleukin-27 into myeloid progenitors to control infection in emergency myelopoiesis. PLoS Pathog. 2016; 12 (3): e1005507. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1005507

21. Seita J., Asakawa M., Ooehara J., Takayanagi S., Morita Y., Watanabe N. et al. Interleukin-27 directly induces differentiation in hematopoietic stem cells. Blood. 2008; 111 (4): 1903-12. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2007-06-093328

22. Galkina E., Ley K. Immune and inflammatory mechanisms of atherosclerosis (*). Annu. Rev. Immunol. 2009; 27: 165-97. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.021908.132620

23. Балмасова И.П., Царев В.Н., Ющук Е.Н., Доровских А.С., Малова E.C., Караков К.Г., Эльбекьян К.С., Арутюнов С.Д. Заболевания пародонта и атеросклероз: микроэкологические, метаболические и иммунологические механизмы взаимосвязи. Иммунология. 2020; 41 (4): 370-80. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-4-370-380

24. Schonbeck U., Sukhova G.K., Gerdes N., Libby P. T(H)2 predominant immune responses prevail in human abdominal aortic aneurysm. Am. J. Pathol. 2002; 161 (2): 499-506. DOI: https://doi.org/10.1016/S0002-9440(10)64206-X

25. Galle C., Schandene L., Stordeur P., Peignois Y., Ferreira J., Wautrecht J.C. et al. Predominance of type 1 CD4⁺ T cells in human abdominal aortic aneurysm. Clin. Exp. Immunol. 2005; 142 (3): 519-27. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2249.2005.02938.x

26. Hirase T., Hara H., Miyazaki Y., Ide N., Nishimoto-Hazuku A., Fujimoto H. et al. Interleukin 27 inhibits atherosclerosis via immunoregulation of macrophages in mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2013; 305 (3): H420-9. DOI: https://doi.org/10.1152/ajpheart.00198.2013

27. Koltsova E.K., Kim G., Lloyd K.M., Saris C.J., von Vietinghoff S., Kronenberg M. et al. Interleukin-27 receptor limits atherosclerosis in Ldlr-/-mice. Circ. Res. 2012; 111 (10): 1274-85. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCRESAHA.112.277525

28. Peshkova I.O., Fatkhullina A.R., Mikulski Z., Ley K., Koltsova E.K. IL-27R signaling controls myeloid cells accumulation and antigen-presentation in atherosclerosis. Sci. Rep. 2017; 7 (1): 2255. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-017-01828-8

29. Mellak S., Ait-Oufella H., Esposito B., Loyer X., Poirier M., Tedder T.F. et al. Angiotensin II mobilizes spleen monocytes to promote the development of abdominal aortic aneurysm in Apoe-/-mice. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2015; 35 (2): 378-88. DOI: https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.114.304389

30. Teo F.H., de Oliveira R.T.D., Villarejos L., Mamoni R.L., Altemani A., Menezes F.H. et al. Characterization of CD4(+) T cell subsets in patients with abdominal aortic aneurysms. Mediators Inflamm. 2018; 2018: 6967310. DOI: https://doi.org/10.1155/2018/6967310

31. Wei Z., Wang Y., Zhang K., Liao Y., Ye P., Wu J. et al. Inhibiting the Th17/IL-17A-related inflammatory responses with digoxin confers protection against experimental abdominal aortic aneurysm. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2014; 34 (11): 2429-38. DOI: https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.114.304435

32. Juvonen J., Surcel H.M., Satta J., Teppo A.M., Bloigu A., Syrjala H. et al. Elevated circulating levels of inflammatory cytokines in patients with abdominal aortic aneurysm. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1997; 17 (11): 2843-7. DOI: https://doi.org/10.1161/01.atv.17.11.2843

33. Middleton R.K., Lloyd G.M., Bown M.J., Cooper N.J., London N.J., Sayers R.D. The pro-inflammatory and chemotactic cytokine microenvironment of the abdominal aortic aneurysm wall: a protein array study. J. Vasc. Surg. 2007; 45 (3): 574-80. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jvs. 2006.11.020

34. Xiong W., Zhao Y., Prall A., Greiner T.C., Baxter B.T. Key roles of CD4⁺ T cells and IFN-gamma in the development of abdominal aortic aneurysms in a murine model. J. Immunol. 2004; 172 (4): 2607-12. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.172.4.2607

35. King V.L., Lin A.Y., Kristo F., Anderson T.J., Ahluwalia N., Hardy G.J. et al. Interferon-gamma and the interferon-inducible chemokine CXCL10 protect against aneurysm formation and rupture. Circulation. 2009; 119 (3): 426-35. DOI: https://doi.org/10.1161/CIRCULATIONAHA.108.785949

36. Xiong W., MacTaggart J., Knispel R., Worth J., Persidsky Y., Baxter B.T. Blocking TNF-alpha attenuates aneurysm formation in a murine model. Journal of immunology. 2009; 183 (4): 2741-6. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.0803164

37. Xanthoulea S., Thelen M., Pottgens C., Gijbels M.J., Lutgens E., de Winther M.P. Absence of p55 TNF receptor reduces atherosclerosis, but has no major effect on angiotensin II induced aneurysms in LDL receptor deficient mice. PLoS One. 2009; 4 (7): e6113. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0006113

38. Shimizu K., Shichiri M., Libby P., Lee R.T., Mitchell R.N. Th2-predominant inflammation and blockade of IFN-gamma signaling induce aneurysms in allografted aortas. J. Clin. Invest. 2004; 114 (2): 300-8. DOI: https://doi.org/10.1172/JCI19855

39. Xu J., Ehrman B., Graham L.M., Eagleton M.J. Interleukin-5 is a potential mediator of angiotensin II-induced aneurysm formation in apolipoprotein E knockout mice. J. Surg. Res. 2012; 178 (1): 512-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jss.2011.12.016

40. Romain M., Taleb S., Dalloz M., Ponnuswamy P., Esposito B., Perez N. et al. Overexpression of SOCS3 in T lymphocytes leads to impaired interleukin-17 production and severe aortic aneurysm formation in mice - brief report. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2013; 33 (3): 581-4. DOI: https://doi.org/10.1161/ATVBAHA.112.300516

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)