Содержание про- и противовоспалительных цитокинов в динамике экспериментального пародонтита у крыс с хроническим болевым синдромом

• Брусенцова Анна Евгеньевна
• Ляшев Андрей Юрьевич
• Цыган Николай Васильевич
• Николас Елие Тзениос
• Ляшев Юрий Дмитриевич

Резюме

Введение. Несмотря на широкое распространение пародонтита и хронических болевых синдромов, особенно среди пациентов среднего и старшего возраста, влияние хронической боли на течение пародонтита остается малоизученной проблемой.

Цель исследования - анализ влияния предварительно сформированного хронического болевого синдрома на динамику про- и противовоспалительных цитокинов у крыс при развитии экспериментального пародонтита.

Материал и методы. Хронический болевой синдром у крыс Wistar моделировали двусторонней перевязкой седалищных нервов. Экспериментальный пародонтит моделировали по методу, предложенному А.И. Воложиным и С.И. Виноградовой. В работе сформированы следующие экспериментальные группы: интактные крысы, животные с хроническим болевым синдромом, ложнооперированные крысы, животные с экспериментальным пародонтитом, ложнооперированные крысы с экспериментальным пародонтитом, животные с хроническим болевым синдромом и экспериментальным пародонтитом. Животных выводили из эксперимента на 7, 14 и 21-е сутки после снятия нити. В плазме крови определяли содержание интерлейкинов (ИЛ) (ИЛ-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10), а также ФНОα и интерферона-γ.

Результаты. Моделирование хронического болевого синдрома или выполнение ложной операции не приводили к изменению содержания цитокинов в плазме крови. В работе установлено повышение концентрации про- и противовоспалительных цитокинов в плазме крови крыс с экспериментальным пародонтитом и у ложнооперированных животных с экспериментальным пародонтитом на всем протяжении эксперимента. На фоне хронического болевого синдрома у животных с экспериментальным пародонтитом показано более высокое по сравнению с группой, которой моделировали пародонтит без хронического болевого синдрома, содержание провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα) в плазме крови на протяжении всего эксперимента. Концентрация противовоспалительных ИЛ в этой группе была ниже, чем у крыс с экспериментальным пародонтитом: ИЛ-10 - на 7-21-е сутки, а ИЛ-4 - на 21-е сутки. Указанные изменения обусловлены влиянием хронического болевого синдрома на течение экспериментального пародонтита у животных.

Заключение. В исследовании установлены особенности течения пародонтита у крыс с хроническим болевым синдромом: увеличение концентрации провоспалительных и снижение содержания противовоспалительных цитокинов в плазме крови по сравнению с группой, в которой моделировали пародонтит.

Ключевые слова:хронический болевой синдром; пародонтит; цитокины

Введение

Несмотря на внедрение новых методов профилактики и лечения пародонтита существенного снижения распространенности этой патологии среди населения развитых стран мира не произошло. Частота хронического пародонтита у пациентов в возрасте 40-50 лет достигает 50 % [1, 2]. Как правило, у таких пациентов присутствует и соматическая патология, оказывающая негативное влияние на течение воспаления в пародонте. Соматические патологии серьезно нарушают качество жизни пациентов с пародонтитом, при этом частота их встречаемости составляет порядка 33 % [3]. Одной из таких форм патологии является хронический болевой синдром (ХБС). Несмотря на высокую медико-социальную значимость пародонтита и хронической боли, вопрос о влиянии ХБС на развитие пародонтита остается мало изученным. Ранее было показано изменение продукции про- и противовоспалительных цитокинов при болевых синдромах [4], а также влияние ведущего пародонтопатогена Porphyromonas gingivalis на болевую чувствительность при пародонтите [5], что также подтверждает актуальность исследования влияния ХБС на течение пародонтита. В связи с вышесказанным представляет интерес изучение особенностей динамики уровней маркеров воспаления при экспериментальном пародонтите (ЭП) у лабораторных животных с ХБС.

Цель исследования - анализ влияния предварительно сформированного ХБС на динамику про- и противовоспалительных цитокинов у крыс при развитии ЭП.

Материал и методы

Работа выполнена на 116 крысах-самцах Wistar массой 180-220 г. Лабораторных животных содержали в стандартных условиях при свободном доступе к пище и воде. Исследования выполнены с соблюдением положений, изложенных в Директиве Европейского парламента и Совета ЕС 2010/63/ЕС от 22 сентября 2010 г. о защите животных, использующихся для научных целей, Правил надлежащей лабораторной практики в Российской Федерации (приказ МЗ РФ № 199н от 01.04.2016) и Межгосударственными стандартами ГОСТ 33215-2014, ГОСТ 33216-2014 "Руководство по содержанию и уходу за лабораторными животными". Выполнение экспериментов по теме диссертационного исследования одобрено Региональным этическим комитетом (протокол заседания секции доклинических исследований РЭК № 2 от 19.10.2020).

8 животных оставались интактными. Остальные составили следующие экспериментальные группы: 1-я группа (всего 18 особей, 6 в каждый срок эксперимента) - моделирование ХБС; 2-я группа (всего 18 особей, 6 в каждый срок эксперимента) - выполнение ложной операции на седалищных нервах; 3-я группа (всего 24 особи, 8 в каждый срок эксперимента) - моделирование ЭП; 4-я группа (всего 24 особи, 8 в каждый срок эксперимента) - моделирование ЭП у ложнооперированных крыс; 5-я группа (всего 24 особи, 8 в каждый срок эксперимента) - моделирование ЭП у животных с ХБС.

ХБС моделировали по описанной ранее методике [3]. Под хлоралгидратным наркозом (доза 400 мг/кг внутрибрюшинно) выполняли операцию по двусторонней перевязке седалищных нервов у крыс на уровне средней части бедра. Через 2 нед операционная рана заживала, и животных использовали в дальнейших экспериментах. Ложнооперированным животным выполняли аналогичную операцию без перевязки седалищных нервов. Ложнооперированных крыс и животных с ХБС выводили из эксперимента через 5, 6 и 7 нед после проведения операции. Выбор указанных сроков обусловлен протоколом эксперимента по изучению течения ЭП у крыс с ХБС.

ЭП моделировали по методу, предложенному А.И. Воложиным и С.И. Виноградовой (1990) [6]. Под наркозом накладывали нить из шовного материала в виде восьмерки на резцы нижней челюсти с последующим погружением лигатуры в зубодесневой желобок и ее фиксацией дополнительными узлами. Нить оставляли на 14 дней, а затем удаляли. Крыс выводили из эксперимента на 7, 14 и 21-е сутки после снятия нити передозировкой наркоза.

Ложнооперированным крысам и животным с ХБС моделировали ЭП через 2 нед после выполнения соответствующей операции, т. е. схема эксперимента была следующей: моделирование ХБС или ложная операция, затем спустя 2 нед моделирование ЭП, через 2 нед снятие нити с передних резцов, т. е. окончание моделирования ЭП, спустя 7, 14 или 21 день выведение животных из эксперимента (общая продолжительность эксперимента 5, 6 или 7 нед после моделирования ХБС или ложной операции).

После выведения животных из эксперимента у них забирали кровь. Ее центрифугировали и определяли в плазме концентрации цитокинов: интерлейкина(ИЛ)-1β, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНОα, ИФН-γ, методом иммуноферментного анализа (ИФА) на микропланшетном анализаторе INFINITE F50 (Tecan Austria GmbH, Австрия) с использованием стандартных наборов для ИФА компании Cloud-Clone Corp. (США).

При статистической обработке полученных результатов после проверки нормальности распределения изучаемых параметров вычисляли средние арифметические значения и их стандартные ошибки. Существенность различий средних величин оценивали по показателю Стьюдента. Статистическая обработка проводилась с помощью программного обеспечения MS Excel и Statistica 10.

Результаты

Моделирование ХБС и выполнение ложной операции по двусторонней перевязке седалищных нервов не сопровождались статистически достоверными изменениями концентрации в плазме крови исследованных цитокинов (p > 0,05) (см. таблицу).

Изменение содержания про- и противовоспалительных цитокинов в плазме крови у животных с экспериментальным пародонтитом (ЭП) или хроническим болевым синдромом (ХБС)

Примечание. ^ххх - p < 0,001 по сравнению с интактными крысами; * - p < 0,05; ** - p < 0,01; *** - p < 0,001 по сравнению с группой ЭП.

У крыс с ЭП отмечается достоверное увеличение концентрации про- и противовоспалительных цитокинов на всем протяжении наблюдения (7, 14 и 21-е сутки) (p < 0,001) (см. табл.). Аналогичные изменения концентрации цитокинов в плазме крови показаны у ложнооперированных животных с ЭП. Моделирование ЭП крысам с ХБС сопровождается более значимым повышением содержания провоспалительных цитокинов уже на 7-е сутки после снятия нити: ИЛ-1β - на 13,1 % (p < 0,01), ИЛ-6 - на 40,5 % (p < 0,001), ФНОα - на 16,6 % (p < 0,05) по сравнению с группой ЭП. Не установлено статистически достоверных различий в содержании ИФН-γ и ИЛ-4 между животными с ЭП и животными с ЭП и ХБС (p > 0,05), а концентрация ИЛ-10 была ниже на 18 % (p < 0,01). На 14-е сутки эксперимента содержание провоспалительных цитокинов, кроме ФНОα и ИФН-γ, статистически достоверно выше, чем у животных с ЭП (p < 0,001). Концентрация противовоспалительного цитокина ИЛ-10, напротив, на 15,3 % (p < 0,05) ниже, чем в группе с ЭП. Через 21 сут после снятия нити у крыс с ЭП и ХБС концентрация ИЛ-1β на 15,8 %, а ФНОα - на 16,1 % выше, чем у крыс с ЭП (p < 0,05). Содержание противовоспалительных цитокинов ниже по сравнению с группой ЭП: ИЛ-4 - на 20,3 % (p < 0,01), а ИЛ-10 - на 21,3 % (p < 0,01). Аналогичные различия установлены при сравнении ложнооперированных животных с ЭП и группы с ЭП и ХБС.

Обсуждение

В работе установлено, что развитие ХБС у крыс после двусторонней перевязки седалищных нервов не сопровождается статистически достоверными изменениями содержания в крови исследованных про- и противовоспалительных цитокинов. Развитие хронического стресса, в том числе под влиянием болевого раздражителя, характеризуется нарушением баланса Th1/Th2, что может проявляться формированием иммуносупрессии [7, 8]. Однако, учитывая многообразие механизмов, вовлеченных в развитие стресса, действие стресс-индуцирующих гормонов на иммунный ответ может сопровождаться как стимуляцией, так и подавлением продукции про- и противовоспалительных цитокинов [9]. В частности, при стрессе отмечается активация глиальных клеток, которые продуцируют ИЛ-1 и ФНОα [10]. Отсутствие изменений в содержании про- и противовоспалительных цитокинов связано, по нашему мнению, с развитием в организме крыс с ХБС на 5-7-й неделях эксперимента адаптивных реакций, тормозящих влияние катехоламинов и глюкокортикоидов на продукцию цитокинов. Ранее показано, что при стрессе наблюдается синтез нейроактивных стероидов, метаболиты которых способны снижать повреждающее действие глюкокортикоидов [11].

Полученные результаты подтверждают данные клинических и экспериментальных исследований о повышении концентрации про- и противовоспалительных цитокинов в плазме крови при пародонтите [12, 13]. В работе установлено, что у животных с ЭП на фоне ХБС наблюдается более высокое по сравнению с группой ЭП содержание провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα) в плазме крови в разные периоды эксперимента.

При этом содержание противовоспалительных интерлейкинов, особенно ИЛ-10, было ниже, чем у крыс с ЭП. По-видимому, падение уровней ИЛ-10 и ИЛ-4 связано с истощением продукции противовоспалительных цитокинов при развитии ХБС. Ранее было показано повышение содержания противовоспалительных интерлейкинов у пациентов с хронической нейропатической болью [14]. Возможное истощение продукции противовоспалительных интерлейкинов у животных с ЭП и ХБС подтверждается и динамикой изменения концентрации ИЛ-4: на 7-е и 14-е сутки она достоверно не отличается от аналогичных значений у животных с ЭП, а на 21-е сутки эксперимента концентрация ИЛ-4 уже статистически достоверно ниже. Уменьшение концентрации ИЛ-10 снижает его тормозящий эффект на продукцию провоспалительных цитокинов [15], а также влияет на увеличение их концентрации. Повышение коэффициента ИЛ-1β/ИЛ-10 у крыс с ЭП и ХБС подтверждает большую выраженность воспалительных проявлений в этой группе [15].

ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα и ИФН-γ относятся к Th1-цитокинам и индуцируют клеточно-опосредованный иммунный ответ, стимулируя развитие воспалительных реакций. Th2-цитокины ИЛ-4 и ИЛ-10 активируют гуморальный иммунный ответ через стимуляцию В-лимфоцитов [16-18]. Известно, что развитие пародонтита связано с патогенным действием бактерий, в первую очередь микроорганизмов "красного комплекса" по Сокранскому: Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythensis, Treponema denticola [1]. Поэтому нарушение антибактериального иммунитета, проявляющееся изменением соотношения про- и противовоспалительных цитокинов, сопровождается более активным воспалительным процессом у животных с ХБС. Показано повышение резорбции альвеолярной кости под влиянием P. gingivalis у мышей с дефицитом ИЛ-10, что позволяет авторам сделать вывод о протективном действии ИЛ-10 при пародонтите [19]. Ранее установлена способность P. gingivalis персистировать в макрофагах, что усиливает системные и местные проявления воспаления, в том числе продукцию дефензинов [20-22], а также ее стимулирующее действие на свободнорадикальное окисление [23]. Также показано антиноцицептивное действие P. gingivalis, чем отчасти объясняется незначительная выраженность болевого синдрома при пародонтите [5]. Ранее установлена взаимосвязь между уровнем ноцицепции и содержанием интерлейкинов в плазме крови у крыс на 7-е сутки после антигенной стимуляции [24].

Представляет интерес установленная ранее корреляция увеличения продукции провоспалительных цитокинов ИЛ-1β и ИЛ-6 и повышения активности металлопротеиназ-2 и 9, которые играют ведущую роль в разрушении внеклеточного матрикса пародонта у пациентов с хроническим пародонтитом [25].

Заключение

Полученные в работе результаты раскрывают особенности изменения содержания про- и противовоспалительных цитокинов при развитии ЭП у экспериментальных животных с ХБС. Хотя, как установлено в работе, развитие ХБС не оказывает влияния на продукцию интерлейкинов, но он оказывает влияние на их содержание в плазме крови у крыс с ЭП. Уже на 7-е сутки эксперимента показано повышение концентрации ИЛ-1β, ИЛ-6, ФНОα. При этом установлено падение содержания ИЛ-10, который играет важную протективную роль при пародонтите. В дальнейшем указанная динамика нарушения продукции про- и противовоспалительных цитокинов сохраняется. Повышение продукции провоспалительных и снижение содержания противовоспалительных цитокинов у животных с ЭП и ХБС указывает на бóльшую выраженность воспалительной реакции у животных этой группы по сравнению с животными с ЭП. Полученные в работе результаты будут способствовать разработке патогенетически обоснованных методов лечения пародонтита у пациентов с болевыми синдромами.

Литература

1. Леонтьев В.К., Фаустов Л.А., Галенко-Ярошевский П.А., Попков В.Л. Хронический генерализованный пародонтит: клиническая и экспериментальная фармакотерапия метаболическими корректорами. Краснодар : Просвещение-Юг, 2012. 403 с.

2. Локтионов А.Л., Конопля А.И., Лунев М.А., Караулов А.В. Иммунные и оксидантные нарушения в патогенезе воспалительных заболеваний пародонта. Иммунология. 2015; 36 (5): 319-28.

3. Котиева И.М., Франциянц Е.М., Каплиева И.В., Бандовкина В.А., Козлова Л.С., Трепитаки Л.К., Погорелова Ю.А., Черярина Н.Д. Влияние хронической боли на некоторые метаболические процессы в коже самок мышей. Российский журнал боли. 2018; 4: 46-54. DOI: https://doi.org/10.25731/RASP.2018.04.027

4. Sturgill J., McGee E., Menzies V. Unique cytokine signature in the plasma of patients with fibromyalgia. J. Immunol. Res. 2014; 1: 1-5. DOI: https://doi.org/10.1155/2014/938576

5. Khan J., Puchimada P., Kadouri D., Zusman T., Javed F., Eliav E. The anti-nociceptive effects of Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Arch. Oral Biol. 2019; 102: 193-8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.archoralbio.2019.04.012

6. Воложин А.И., Виноградова С.И. Моделирование и лечение воспаления в пародонте. Патологическая физиология и экспериментальная терапия. 1990; 6: 49-51.

7. Sesti-Costa R., Ignacchiti M.D., Chedraoui-Silva S., Marchi L.F., Mantovani B. Chronic cold stress in mice induces a regulatory phenotype in macrophages: correlation with increased 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase expression. Brain Behav. Immun. 2012; 26: 50-60. DOI: https://doi.org/10.1016/j.bbi.2011.07.234

8. Ahmad S.F., Zoheir K.M., Ansari M.A., Korashy H.M., Bakheet S.A., Ashour A.E., Attia S.M. Stimulation of the histamine 4 receptor with 4-methylhistamine modulates the effects of chronic stress on the Th1/Th2 cytokine balance. Immunobiology. 2015; 220: 341-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.imbio.2014.10.014

9. Woda A., Picard P., Dutheil F. Dysfunctional stress responses in chronic pain. Psychoneuroendocrinology. 2016; 71: 127-35. DOI: https://doi.org/10.1016/j.psyneuen.2016.05.017

10. Pekny M., Pekna M. Astrocyte reactivity and reactive astrogliosis: costs and benefits. Physiol. Rev. 2014; 94: 1077-98. DOI: https://doi.org/10.1152/physrev.00041.2013

11. Marklund N., Peltonen M., Nilsson T.K., Olsson T. Low and high circulating cortisol levels predict mortality and cognitive dysfunction early after stroke. J. Intern. Med. 2004; 256: 15-21.

12. Григорович Э.Ш., Поморгайло Е.Г., Хомутова Е.Ю., Степанов С.С. Клинические варианты хронического генерализованного пародонтита, генетический полиморфизм и системная продукция воспалительных цитокинов. Стоматология. 2015: 94 (5): 11-6. DOI: https://doi.org/10.17116/stomat2018594511-16

13. Петрухина Н.Б., Зорина О.А., Ших Е.В., Картышева Е.В., Кудрявцев А.В., Беркутова И.С. Изменение провоспалительных цитокинов у пациентов с хроническим пародонтитом на фоне метаболического синдрома в зависимости от пола и возраста. Стоматология. 2018; 97 (6): 38-44. DOI: https://doi.org/10.17116/stomat20189706138

14. Luchting B., Rachinger-Adam B., Heyn J., Hinske L., Kreth S., Azad S. Antiinflammatory T-cell shift in neuropathic pain. J. Neuroinflamm. 2015; 12 (1): 12. DOI: https://doi.org/10.1186/s12974-014-0225-0

15. Колесникова Н.В., Самойленко Е.С. Роль цитокинов в патогенезе инфекционного эндокардита. Иммунология. 2020; 41 (3): 262-8. DOI: https://doi.org/10.33029/0205-4952-2020-41-3-262-268

16. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. Санкт-Петербург : Фолиант, 2008.

17. Malkiel S., Barlev A.N., Atisha-Fregoso Y., Suurmond Y., Diamond B. Plasma cell differentiation pathways in systemic lupus erythematosus. Front. Immunol. 2018; 9: 427. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.00427

18. Yoshimoto T. The hunt for the source of primary interleukin-4: how we discovered that natural killer T cells and basophils determine T helper type 2 cell differentiation in vivo. Front. Immunol. 2018; 9: 716. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2018.00716

19. Sasaki H., Okamatsu Y., Kawai T., Kent R., Taubman M., Stashenko P. The interleukin-10 knockout mouse is highly susceptible to Porphyromonas gingivalis induced alveolar bone loss. J. Periodontal Res. 2004; 39 (6): 432-41.

20. Балмасова И.П., Царев В.Н., Ющук Е.Н., Доровских А.С., Малова E.C., Караков К.Г., Эльбекьян К.С., Арутюнов С.Д. Заболевания пародонта и атеросклероз: микроэкологические, метаболические и иммунологические механизмы взаимосвязи. Иммунология. 2020; 41 (4): 370-80. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-4-370-380

21. Li L., Michel R., Cohen J., Decarlo A., Kozarov E. Intracellular survival and vascular cell-to-cell transmission of Porphyromonas gingivalis. BMC Microbiol. 2008; 8: 26-36. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2180-8-26

22. Гурьянова С.В., Колесникова Н.В., Гудима Г.О., Лежава Н.Л., Караулов А.В. Динамика иммунологических и микробиологических показателей ротовой жидкости при терапии кариеса. Иммунология. 2021; 42 (4): 386-94. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-4-386-394

23. Lonn J., Ljunggren S., Klarstrom-Engstrom K., Demirel I., Bengtsson T., Karlsson H. Lipoprotein modifications by gingipains of Porphyromonas gingivalis. J. Periodontal Res. 2018; 53 (3): 403-13. DOI: https://doi.org/10.1111/jre.12527

24. Абрамова А.Ю., Перцов С.С. Корреляционные зависимости между показателями ноцицептивной чувствительности и уровнем цитокинов в биологических средах у крыс при введении липополисахарида. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2014; 157 (5): 548-53.

25. Кушлинский Н.Е., Соловых Е.А., Караогланова Т.Б., Баяр У., Герштейн Е.С., Трошин А.А., Максимовская Л.Н., Янушевич О.О. Матриксные металлопротеиназы и воспалительные цитокины в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с различными конструкционными материалами. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2012; 153 (1): 82-7.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)