Особенности субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови и инфильтрирующих опухоль у больных плоскоклеточным раком головы и шеи

• Заботина Татьяна Николаевна
• Черткова Антонина Ивановна
• Циклаури В.Т.
• Короткова О.В.
• Захарова Елена Николаевна
• Табаков Дмитрий Владиславович
• Борунова Анна Анатольевна
• Панчук И.О.
• Задеренко И.А.
• Мудунов Али Мурадович
• Кадагидзе Заира Григорьевна

Резюме

Иммунная система играет важную роль в развитии, формировании и прогрессировании плоскоклеточного рака головы и шеи (ПКРГШ), в связи с чем актуальным является сравнение исходного состояния системного и локального иммунитета и ассоциации субпопуляционного состава лимфоцитов с распространенностью процесса и выживаемостью больных ПКРГШ.

Материал и методы. У 29 первично операбельных больных ПКРГШ до оперативного лечения методом проточной цитометрии проводили иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови (ПК) и лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ЛИО).

Результаты. Показано, что у больных с ранними стадиями ПКРГШ в ПК наблюдалось повышение доли НК-клеток, CD16⁺Perforin⁺- и СВ11b⁺-лимфоцигов, а также цитотоксического потенциала (ЦТП) CD8⁺-клеток. У пациентов с III-IV стадиями заболевания повышалось количество активированных CD25⁺-лимфоцигов и снижалось соотношение Т-клетки-эффекторы/регуляторные Т-клетки (Тэфф/Treg) в отличие от группы сравнения. У умерших пациентов, в отличие от выживших, была повышена доля регуляторных CD4⁺CD25⁺CD127^-/low-Т-клеток (Treg) и снижена величина соотношения Тэфф/Treg. У выживших пациентов был повышен ЦТП CD8⁺-лимфоцигов и увеличена доля CD8⁺Perforin^high-лимфоцитов. В составе ЛИО отмечалось значительное повышение по сравнению с периферической кровью супрессорных CD4⁺- и CD8⁺-популяций Т-клеток. Выявлены также повышение по сравнению с периферической кровью доли CD8⁺- и СD⁺-Т-клеток, экспрессирующих ингибиторный рецептор PD-1, а также высокая экспрессия PD-L1 и PD-L2 на опухолевых клетках.

Заключение. Полученные результаты указывают на необходимость одновременного изучения иммунных клеток периферической крови и клеток, инфильтрирующих опухолевую ткань.

Ключевые слова:плоскоклеточный рак головы и шеи; лимфоциты периферической крови; лимфоциты, инфильтрирующие опухоль; эффекторные лимфоциты; регуляторные лимфоциты

Злокачественные опухоли головы и шеи - группа опухолевых заболеваний, включающих рак различных отделов глотки и гортани, а также околоносовых пазух, полости рта (губы, десны, язык, дно полости рта, твердое нёбо и слизистая оболочка щек). Рак полости рта (РПР) является одним из 10 наиболее распространенных в мире злокачественных опухолей. Во многих случаях его диагностируют на поздних стадиях (III-IV), что значительно ухудшает прогноз заболевания. Постановка диагноза на ранних стадиях РПР значительно повышает эффективность лечения. В 90% случаев РПР определяется как плоскоклеточная карцинома с различным уровнем дифференцировки и склонностью к метастазированию в лимфатические узлы. Наиболее частые локализации опухоли - язык, дно полости рта и нижняя губа [1]. В России по уровню заболеваемости рак полости рта и глотки занимает 9-е место среди других злокачественных новообразований у мужчин и 18-е - у женщин [2]. Ключевую роль в развитии, формировании и прогрессировании ПКРГШ играет иммунная система [3]. Показано, что инфильтрация опухоли иммунными клетками может являться благоприятным прогностическим фактором. Имеются сообщения о том, что при высокой инфильтрации ПКРГШ лимфоцитами, эффективность химиорадиотерапии выше, чем при низком содержании лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ЛИО) [4, 5]. С другой стороны, по данным различных авторов, ПКРГШ входит в число наиболее иммуносупрессивных опухолей человека. Иммуносупрессия обеспечивается как растворимыми, так и клеточными факторами, способствующими прогрессивному росту опухоли и быстрому рецидиву заболевания [6-8].

Учитывая значимое влияние иммунной системы на развитие ПКРГШ, и то, что данная форма рака характеризуется отсутствием специфических биомаркеров [1], актуальным является изучение показателей исходного состояния иммунной системы и их ассоциации с распространенностью процесса и выживаемостью больных ПКРГШ.

Цель - определить основные показатели системного и локального врожденного и адаптивного иммунитета у больных ПКРГШ до лечения и установить их связь со стадией заболевания и выживаемостью пациентов.

Задачи:

1. Изучить субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови (ПК) у больных ПКРГШ до лечения в отличие от группы сравнения.

2. Определить взаимосвязь субпопуляционного состава лимфоцитов ПК со стадией заболевания.

3. Выявить взаимосвязь субпопуляционного состава лимфоцитов ПК с выживаемостью пациентов.

4. Исследовать субпопуляционный состав лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (ЛИО), у больных ПКРГШ до лечения.

Материал и методы

Пациенты. В исследование включены больные ПКРГШ (n = 29; 14 женщин и 15 мужчин). У 18 пациентов диагностирован рак языка, у 9 - рак слизистой оболочки полости рта и у 2 - первично-множественное злокачественное образование (ПМЗО) слизистой оболочки полости рта. Средний возраст пациентов составил 43,5 года (от 15 до 84 лет). Все пациенты получили хирургическое лечение с последующей радио- и химиотерапией. Период наблюдения составил 36 мес. За это время умерли 11 больных. Группы сравнения составили здоровые доноры соответствующего пола и возраста (п = 77). Все пациенты дали информированное согласие на проведение иммунологического обследования.

Иммунологические исследования. Лимфоциты выделяли из периферической крови и образцов опухолевой ткани, полученной при оперативном вмешательстве. В полученной из опухолевой ткани клеточной суспензии определяли процентное содержание ЛИО. Лимфоциты выделяли по параметрам светорассеяния и экспрессии CD45. Субпопуляционный состав лимфоцитов ПК и ЛИО определяли методом проточной цитофлуориметрии на 5-параметровом проточном цитофлуориметре аналитического типа FACSCalibur производства компании BectonDickinson (США). Применяли 2-, 3- и 4-цветное окрашивание клеток с использованием панели моноклональных антител к поверхностным маркерам Т- и В-лимфоцитов, NK- и NKT-клеток, активированных лимфоцитов, регуляторных Т-клеток (CD3, CD4, CD8, CD28, CD11b, HLA-DR, CD25, CD16, CD56, CD19, CD127) и к внутриклеточному перфорину (Perforin) (BD Biosciences, BekmanCoulter). Проводили дополнительное гейтирование CD45⁺CD8⁺-лимфоцитов для определения CD8⁺CD11bCD28- и CD8⁺CD11b⁺CD28-клеток в составе CD8⁺-популяции. Цитотоксический потенциал (ЦТП) CD16⁺- и CD8⁺-лимфоцитов оценивали как долю (в %) Perforin-позитивных клеток в составе соответствующей популяции. У части больных определяли экспрессию PD-L1 и PD-L на опухолевых клетках.

Статистический анализ данных. Статистически результаты обрабатывали с помощью программы Statistica. 7.0. Анализ вида распределения показателей проводили с помощью критерия Шапиро-Уилка (n < 50) или Колмогорова и Смирнова (n > 50). Статистическую значимость различий между группами при распределении, отличном от нормального хотя бы у одной из групп, оценивали по непараметрическому двустороннему U-критерию Манна-Уитни (U). В этом случае показатели в обеих группах представлены в виде медианы (Me) и квартилей (25 и 75 процентили). При нормальном распределении показателей использовали t-критерий Стьюдента (St), результаты представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения: x (s). Взаимосвязь между показателями определяли с помощью корреляционного анализа Спирмена (коэффициент корреляции ρ). Уровень статистической значимости - 0,05.

Результаты

Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов ПК показало, что до лечения у больных ПКРГШ в целом по группе обнаруживаются некоторые отклонения от группы сравнения основных показателей адаптивного и врожденного иммунитета (табл. 1). Отмечалось статистически значимое снижение общего количества Т-клеток и их основных популяций: CD3⁺CD4⁺-и CD3⁺CD8⁺-Т-лимфоцитов. В то же время количество CD3 ^-CD16⁺CD56⁺-NK-клеток было повышено. В составе CD8⁺-лимфоцитов ПК пациентов, как и в контрольной группе, основную долю составляли цитотоксические клетки-эффекторы (CD8⁺CD11b⁺CD28). Процент регуляторных CD8⁺CD11bCD28- и CD4⁺CD25⁺CD127^-/low-Т-лимфоцитов не отличался от группы сравнения. Цитотоксический потенциал CD8⁺-лимфоцитов был повышен по сравнению с нормой, а CD16⁺-лимфоцитов не отличался от группы сравнения (см. табл. 1). Так как CD8⁺Perforin⁺-лимфоциты могут включать в свой состав Т-, NK- и NKT-клетки, был проведен корреляционный анализ взаимосвязи CD8⁺Perforin⁺-клеток с соответствующими популяциями. Отмечалась статистически значимая положительная корреляция количества CD8⁺Perforin⁺-лимфоцитов как с цитотоксическими CD8⁺CD11b⁺CD28^--Т-лимфоцитами (ρ = 0,487; p = 0,007), так и с CD3⁺CD16⁺CD56⁺-NKT-клетками (ρ = 0,456; p = 0,013). Определение уровня экспрессии перфорина на CD8⁺-лимфоцитах больных ПКРГШ (CD8⁺Perforin^high и CD8⁺Perforin^low) показало, что количество CD8⁺Perforin^hi8h-клеток (а) составляло 8,9% (4,1 и 12,1%), а CD8⁺Perforin^low (b) - 7,9% (5,4 и 9,2%); p_a-b = 0,557. Корреляционный анализ выявил положительную корреляцию CD8⁺Perforin^high-клеток с CD3⁺CD8⁺-Т-лимфоцитами (ρ = 0,522; p = 0,004) и NKT-клетками (ρ = 0,624; p = 0,000), а CD8⁺Perforin^low - с CD3CD8⁺-NK-клетками (ρ = 0,540; p = 0,003). У пациентов также обнаружено повышение процента лимфоцитов, экспрессирующих маркер CD11b. Определение величины соотношения количества клеток эффекторной популяции лимфоцитов CD3⁺CD8⁺ с количеством регуляторных CD4⁺-Т-клеток в ПК (CD3⁺CD8⁺/CD4⁺CD25⁺CD127^-/low - Тэфф/Treg) показало, что у пациентов этот показатель составлял 2,7 (1,9 и 4,1), а в группе сравнения - 3,6 (2,7 и 4,8). Различие было статистически значимым p = 0,024. Количество CD4⁺PD-1⁺- и CD8⁺PD-1⁺-лимфоцитов не отличалось от контрольных значений (см. табл. 1).

Изучение зависимости субпопуляционного состава лимфоцитов ПК от стадии заболевания выявило определенные различия в отклонениях показателей от контроля между группами больных с ранними (I-II стадии - группа А; n = 16) и поздними (III-IV стадии - группа B; n = 13) стадиями ПКРГШ. При этом у пациентов с I-II стадиями отклонения от группы сравнения были значительно более выражены, чем у пациентов с III-IV стадиями (табл. 2). Только у больных с ранними стадиями ПКРГШ (группа А) наблюдалось статистически значимое повышение процента CD8⁺CD28⁺-лимфоцитов; CD3^-CD16⁺CD56⁺-NK-клеток; CD16⁺-клеток, экспрессирующих перфорин (CD16⁺-Perforin⁺), CD11b⁺-лимфоцитов, а также ЦТП CD8⁺-клеток и снижение величины соотношения CD4/CD8. Количество CD3⁺-Т-клеток было снижено в обеих группах, но в группе А снижение было обусловлено уменьшением числа CD3⁺CD4⁺-Т-клеток, а в группе В - CD3⁺CD8⁺-Т-лимфоцитов. В группе B также было снижено общее количество CD8⁺-клеток и повышена доля лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер CD25. Определение соотношения Тэфф/Treg показало, что у пациентов с ранними стадиями заболевания этот показатель не отличался от группы сравнения, в то время как у больных с поздними стадиями он был статистически значимо снижен в отличие от группы сравнения. Количество CD4⁺PD-1⁺- и СВ8⁺РD-1⁺-лимфоцитов не отличалось от контрольных значений (см. табл. 2).

Иммунофенотипирование лимфоцитов ПК также выявило значительные различия в процентном содержании клеток некоторых популяций между группами выживших (группа С; n = 18) и умерших в течение периода наблюдения пациентов (группа D; n = 11) (табл. 3). Общее количество CD3⁺-Т-клеток было снижено в отличие от группы сравнения только у больных в группе D в результате снижения количества обеих популяций Т-клеток: CD3⁺CD4⁺ и CD3⁺CD8⁺. В группе С количество CD3⁺-H-клеток не отличалось от группы сравнения, была снижена только доля CD3⁺CD8⁺-Т-клеток. Только в группе D наблюдалось повышение количества CD3^-CD16⁺CD56⁺-NK-клеток, CD25⁺- и CD8⁺CD16⁺-лимфоцитов по сравнению с группой сравнения. В то же время у живых пациентов был повышен ЦТП CD8⁺-клеток и доля CD11b⁺-лимфоцитов, в то время как в группе D эти показатели не отличались от группы сравнения. Процент регуляторных CD4⁺CD25⁺CD127^/low-Т-клеток до лечения был повышен только у умерших больных (см. табл. 3). Наиболее значительные различия между группами С и D касались таких показателей, как доля активированных CD25⁺-лимфоцитов (р = 0,027), CD8⁺CD16⁺-клеток (р = 0,09), ЦТП CD8⁺-лимфоцитов (р = 0,033) и количества регуляторных CD4⁺CD25⁺CD127^/low-Т-клеток (р = 0,007). Определение соотношения Тэфф/Treg отдельно у живых (группа С) и умерших (группа D) пациентов выявило, что этот показатель статистически значимо снижен в отличие от группы сравнения только у больных группы D: 1,9 (0,96 и 3,3) и 3,6 (2,7 и 4,8) соответственно; р = 0,021. Этот показатель у больных группы С не отличался от группы сравнения: 3,4 (2,5 и 4,3) (см. табл. 3). Также установлено, что у выживших пациентов количество CD8⁺Perforin^high-лимфоцитов было статистически значимо выше, чем у умерших больных [9,8% (6,8 и 15,8) и 3,9% (1,9 и 9,1) соответственно; p = 0,013]. Различий между группами по количеству CD8⁺Perforin^low-лимфоцитов не отмечалось [6,7% (5,4 и 8,9) и 8,3% (5,1 и 12,8) соответственно; p = 0,175]. Количество CD4⁺PD-1⁺ и CD8⁺PD-1⁺-лимфоцитов не отличалось от контрольных значений.

Изучение субпопуляционного состава ЛИО показало, что в составе ЛИО превалировали CD3⁺-Т-клетки, а также их основные популяции CD3⁺CD4⁺- и CD3⁺CD8⁺-Т-лимфоциты (табл. 4). В то же время отмечалось значительное снижение процентного содержания клеток врожденного иммунитета (NK- и NKT-лимфоцитов) по сравнению с ПК. Выявлен также значительно более низкий процент как CD16⁺-, так и CD8⁺Perforin⁺-лимфоцитов и снижение ЦТП этих популяций клеток, особенно ЦТП CD8⁺-клеток. Содержание CD8⁺Perforin^high-клеток и CD8⁺Perforin^low-клеток в составе ЛИО: [5,4% (0,6 и 7,6)] и [1,7% (0,5 и 2,3)] соответственно было ниже, чем в ПК: CD8⁺Perforin^high-клеток - 8,9% (4,1 и 12,1%), CD8⁺Perforin^low-клеток - 7,9% (5,4 и 9,2%). Значительные различия наблюдались также в процентном содержании CD8⁺СD11b⁺CD28^-- и CD8⁺СD11b^-CD28^--Т-клеток в составе CD8⁺-лимфоцитов ПК и ЛИО. В ПК доля CD8⁺СD11b⁺CD28^--клеток почти в 8 раз превышала долю СВ8⁺СВ11Ь^-СБ28^--лимфоцитов, а для ЛИО это соотношение составило 0,16 (см. табл. 4, см. рисунок). Процентное содержание регуляторных CD4⁺CD25⁺CD127^-/low-Т-клеток в составе ЛИО было выше, чем в ПК (см. табл. 4, см. рисунок). Соотношение Тэфф/Treg составило для ЛИО 2,2 (1,5-3,8), в ПК - 2,7 (1,9-4,1). В опухолевой ткани доля CD8⁺- и CD4⁺-Т-клеток, экспрессирующих PD-1, была значительно выше, чем в ПК. Значительный процент опухолевых клеток экспрессировал также ингибиторные лиганды CD274 (PD-L1) и CD273 (PD-L2). Процент клеток, экспрессирующих данные маркеры, представлен в табл. 4.

Обсуждение

В настоящей работе проводилось одновременное определение показателей системного (лимфоциты ПК) и локального иммунитета (ЛИО) у больных ПКРГШ до лечения. Исследование субпопуляционного состава лимфоцитов ПК выявило, что у больных раком слизистой оболочки полости рта и раком языка в целом по группе наблюдаются отклонения ряда показателей системного иммунитета от нормы. Отмечалось статистически значимое снижение процента СD3⁺-Т-лимфоцитов и их популяций (CD3⁺CD4⁺ и CD3⁺CD8⁺) и повышение процента естественных киллеров (CD3^-CD16⁺CD56⁺). Можно предположить, что снижение процента Т-клеток в ПК связано с их перемещением в опухолевую ткань, а повышение количества НК-клеток, возможно, имеет компенсаторный характер. У пациентов также отмечалось повышение процента лимфоцитов, экспрессирующих маркер CD 11b. По данным ряда авторов, дифференцировка CD8⁺-Т-лимфоцитов в эффекторные (цитотоксические) клетки характеризуется приобретением CD11b+-фенотипа, и CD8⁺CD11b⁺CD28-Т-лимфоциты представляют собой клетки-эффекторы с высокой цитотоксической активностью [9-11]. Что касается НК-клеток, CD11b⁺-популяция обладает высокой цитолитической активностью, в то время как у НК-клеток, не экспрессирующих CD11b, цитотоксическая активность практически отсутствует [12]. Таким образом, повышение процента CD11b⁺-лимфоцитов в ПК является благоприятным фактором. Медиана ЦТП CD16⁺-лимфоцитов превышала 90% и соответствовала контрольному значению. Установлено также, что, хотя общее количество CD8⁺-лимфоцитов у пациентов не отличалось от группы сравнения, процент Perforin⁺-клеток в их составе (ЦТП) был повышен. Так как CD8⁺-лимфоциты, экспрессирующие Perforin, могут входить в состав Т-, NK- и NKT-клеток, был проведен корреляционный анализ связи CD8⁺Perforin⁺-клеток с соответствующими популяциями. Результаты корреляционного анализа показали, что повышение ЦТП CD8⁺-лимфоцитов, обнаруженное у пациентов, могло быть обусловлено цитотоксическими CD8⁺CD11b⁺CD28^--Т-клетками, а также CD3⁺CD16⁺CD56⁺-NKT-клетками. При этом высокий уровень экспрессии перфорина (CD8+Perfbrin^high) ассоциировался с CD3⁺CD8⁺-Т- и NKT-клетками, а низкий (CD8⁺Perforin^low) с CD3^-CD8⁺-NK-клетками. Таким образом, в ПК больных ПКРГШ обнаруживаются клетки эффекторного звена иммунитета, которые могут участвовать в противоопухолевом иммунном ответе. С другой стороны, на фоне снижения процента CD3⁺CD4⁺-Т-лимфоцитов в ПК отмечалась тенденция к увеличению количества регуляторных CD4⁺CD25⁺CD127^-/low-Т-клеток. Так, соотношение доли эффекторных CD3⁺CD8⁺-клеток с количеством регуляторных CD 3⁺CD8⁺/CD4⁺CD25⁺CD127^-/low-Т-клеток (Тэфф/Treg) у пациентов было статистически значимо снижено в отличие от группы сравнения [2,7 (1,9 и 4,1) и 3,6 (2,7 и 4,8) соответственно; p = 0,024]. Полученные результаты совпадают с данными K. Chikamatsu и соавт. [13], которые обнаружили повышение количества регуляторных Т-клеток на фоне снижения процента циркулирующих CD3⁺CD4⁺-Т-лимфоцитов у больных ПКРГШ. Дополнительный корреляционный анализ, проведенный в настоящем исследовании, выявил слабую статистически значимую ассоциацию повышения числа Treg с уменьшением количества CD3⁺CD4⁺-T-клеток (ρ = -0,376; p = 0,044), что также может указывать на тенденцию к повышению содержания Treg в составе CD3⁺CD4⁺-Т-лимфоцитов у больных ПКРГШ. В группе сравнения подобная тенденция не отмечалась (ρ = 0,112; p = 0,350). Количество CD4⁺PD-1⁺- и CD8⁺PD-1⁺-лимфоцитов ПК в целом по группе не отличалось от группы сравнения. Остальные показатели также были в пределах контрольных значений.

Зависимость исходных показателей системного иммунитета от стадии заболевания, т. е. от увеличения степени распространенности опухолевого процесса (группа А - I-II стадии и группа B - III-IV стадии), выявило, что увеличение опухолевой нагрузки организма сопровождалось изменениями системного иммунитета. У пациентов с I-II стадиями ПКРГШ отмечалось повышение процента CD8⁺CD28⁺-, CD11b⁺-, NK- и CD16⁺Perforin⁺-лимфоцитов, а также ЦТП CD8⁺-клеток в отличие от группы сравнения, что в определенной степени может указывать на реакцию иммунной системы на опухоль на ранних стадиях ее развития. На поздних стадиях заболевания все эти показатели снижались до нормы или до значений ниже нормы, включая общее число CD8⁺-лимфоцитов и количество CD3⁺CD8⁺-Т-клеток, которые у больных группы А были в пределах контрольных значений. У пациентов с III-IV стадиями также отмечалось повышение доли CD3⁺CD4⁺-X-клеток и лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер CD25, что, возможно, указывает на развитие воспалительного процесса. Общее количество Т-клеток было снижено у пациентов обеих групп, но в группе А оно было связано со снижением доли CD3⁺CD4⁺X-клеток, а в группе B - CD3⁺CD8⁺-Т-лимфоцитов. Снижение числа CD3⁺CD8⁺-Т-лимфоцитов у пациентов с III-IV стадиями ПКРГШ привело к снижению величины соотношения Тэфф/Treg, что может означать увеличение значимости регуляторных Т-клеток при прогрессировании заболевания. Таким образом, обнаруженные в данной работе значительные различия в субпопуляционном составе лимфоцитов ПК в зависимости от стадии ПКРГШ могут указывать на наличие системного противоопухолевого иммунного ответа на ранних стадиях заболевания и снижение его активности в процессе опухолевого роста.

Изучение состояния иммунной системы при злокачественных опухолях в первую очередь направлено на определение связи показателей иммунитета с выживаемостью пациентов. В настоящем исследовании иммунофенотипирование лимфоцитов ПК до лечения выявило значительные различия в процентном содержании клеток некоторых популяций между группами живых (группа С) и умерших в течение периода наблюдения пациентов (группа D). В результате снижения количества клеток обеих популяций Т-лимфоцитов: CD3⁺CD4⁺ и CD3⁺CD8⁺, у больных в группе D было снижено общее количество CD3⁺-Т-клеток в отличие от группы сравнения. В группе С был снижен только процент CD3⁺CD8⁺-Т-клеток и общее количество CD3⁺-T-клеток не отличалось от группы сравнения. В отличие от группы сравнения в группе D наблюдалось повышение количества клеток врожденного иммунитета: CD3^-CD16⁺CD56⁺-NK-клеток и CD8⁺CD16⁺-лимфоцитов. У выживших пациентов в отличие от группы сравнения наблюдалось повышение ЦТП CD8⁺-клеток и доли CD11b⁺-лимфоцитов. Процентное содержание активированных CD25⁺-лимфоцитов, CD8⁺CD16⁺-клеток и регуляторных CD4⁺CD25⁺CD127^-/low-Т-клеток в ПК было статистически значимо выше у умерших пациентов по сравнению с выжившими больными. В то же время у выживших пациентов ЦТП CD8⁺-лимфоцитов, процент CD8⁺Perforin^high -лимфоцитов (CD3⁺CD8⁺H'-клеток-эффекторов) и CD11b⁺-клеток, а также соотношение Тэфф/Treg были статистически значимо выше, чем у умерших больных. Это может указывать на то, что у выживших больных до лечения отмечалось повышение активности эффекторного звена противоопухолевого иммунитета. Следует отметить также, что повышение до лечения ЦТП CD8⁺-лимфоцитов, процента CD11b⁺-клеток и снижение величины соотношения Тэфф/Treg отмечалось как у живых пациентов, так и на ранних стадиях заболевания, что может указывать на положительное значение этих показателей при ПКРГШ. Процент CD25⁺-клеток был повышен до лечения как у умерших больных, так и при III-IV стадиях заболевания, что, возможно, как говорилось выше, связано с развитием воспаления и может иметь неблагоприятное значение. Значимыми популяциями, подавляющими противоопухолевый иммунный ответ, являются регуляторные Т-клетки. Снижение соотношения Тэфф/Treg обнаружено на поздних стадиях заболевания и у умерших больных. К тому же количество Treg до лечения у умерших пациентов было выше, чем в группе сравнения и у живых пациентов. В дополнительном исследовании мы обнаружили также, что из 10 пациентов со значениями Treg, превышающими норму, умерли 7 (70%), а из 19 больных со значениями в пределах или ниже нормы умерли 4 (21%). Для анализа различия частот в группах использовали двусторонний точный критерий Фишера. Различие между группами было статистически значимым: p = 0,017. В клинических исследованиях разных авторов было продемонстрировано повышение количества Treg в ПК и в опухолевой ткани при ПКРГШ. Авторы предполагают, что эта популяция клеток вносит значимый вклад в иммуносупрессивное опухолевое микроокружение при ПКРГШ [14-16]. В настоящем исследовании до лечения в целом по группе не обнаружено повышения Treg в ПК пациентов с ПКРГШ, однако увеличение числа этих клеток ассоциировалось с поздними стадиями заболевания и с повышенной смертностью пациентов. Следовательно, можно предположить, что повышение доли регуляторных Т-клеток в ПК до лечения является неблагоприятным прогностическим фактором.

Анализ опухолевого микроокружения у больных с различными злокачественными новообразованиями, включая ПКРГШ, показал, что значительное число солидных опухолей имеет Т-клеточный фенотип. Высокий процент Т-клеток (медиана - 89,3%, в ПК - 66,9%) и их популяций, обнаруженный в настоящем исследовании в опухолевой ткани, согласуется с этим утверждением. Полученные в настоящем исследовании результаты показали, что в опухолевой ткани в составе CD8⁺ ЛИО был значительно повышен процент CD8⁺CD28CD11b^--лимфоцитов по сравнению с ПК (см. рисунок). Показано, что почти все CD28^--Т-клетки являются CD11b-позитивными [17] и экспериментальные исследования продемонстрировали, что экспрессия CD 11b на CD8⁺-Т-лимфоцитах ассоциируется с приобретением ими цитотоксической активности [10]. По данным A. Caruso и соавт. [18], Т-клетки, которые не экспрессируют молекулу CD11b (CD8+CD28CD11b), играют важную роль в развитии иммунодефицита у ВИЧ-инфицированных пациентов. Показано также, что CD8⁺-Т-клетки, не экспрессирующие после активации ни CD 11b- ни CD28-молекулы, способны проявлять супрессорную активность [19]. Повышение доли этих клеток в составе CD8⁺-ЛИО сочеталось со значительным снижением доли CD8⁺CD11b⁺CD28^--цитотоксических клеток-эффекторов, количество которых в ПК не отличалось от группы сравнения (см. рисунок).

Данные о прогностической значимости Treg ЛИО при ПКРГШ противоречивы. Имеются сообщения как о благоприятном, так и о неблагоприятном значении этих клеток для исхода заболевания при данной форме опухоли [20, 21]. В настоящем исследовании обнаружено, что доля регуляторных CD4⁺CD25⁺CD127^-/low-Т-клеток в опухоли была значительно выше, чем в ПК (см. рисунок). А. Lechner и соавт. [22] также обнаружили повышение числа регуляторных CD25⁺/CD127^-H'-клеток в опухолевой ткани по сравнению с ПК у больных ПКРГШ. H.B. Jie и соавт. [23] продемонстрировали, что частота регуляторных CD4⁺FOXP3⁺CD25^high-Т-клеток, экспрессирующих ингибиторные рецепторы CTLA-4, TIM-3 и PD-1 и иммуносупрессивные молекулы LAP и CD39, была повышена в опухолевой ткани, а не в ПК, и их супрессорная активность была выше, чем у циркулирующих Treg.

На фоне высокого процента Т-клеток в составе ЛИО процентное содержание практически всех остальных определявшихся в работе популяций лимфоцитов было значительно ниже, чем в ПК. Ранее подобная закономерность была обнаружена нами и при раке молочной железы, раке яичников, меланоме, в том числе и при ПКРГШ [24]. В настоящее время стало очевидно, что ключевую роль в ускользании опухоли от иммунологического надзора играет взаимодействие ингибиторных рецепторов Т-клеток (CTLA-4, PD-1) и их лигандов (PD-L1). В ряде исследований было продемонстрировано, что определение экспрессии PD-L1 не только на опухолевых, но и на иммунных клетках в значительной степени может повысить предсказуемость положительного ответа на анти-PD-1-терапию. L.Q.M. Chow и соавт. [25] обнаружили, что при включении в анализ иммунных клеток наблюдалось повышение вероятности ответа у PD-L1-позитивных по сравнению с PD-L1-негативными пациентами. В настоящем исследовании мы обнаружили, что доля CD8⁺CD279⁺-(PD-1) и CD4⁺CD279⁺-(PD-1)-T-клеток в опухолевой ткани была повышена по сравнению с ПК. Значительная доля опухолевых клеток экспрессировала также ингибиторные лиганды CD274 (PD-L1) и CD273 (PD-L2).

Заключение

В настоящее время исследованию корреляции количества ЛИО и их популяций с прогнозом заболевания уделяется значительное внимание. Иммуносупрессия в опухолевом микроокружении обеспечивается как растворимыми, так и клеточными факторами, поддерживающими прогрессивный рост опухоли и быстрый рецидив заболевания [6-8]. Высокая доля как CD4⁺-, так и CD8⁺-регуляторных Т-клеток, резко сниженная доля цитотоксических CD8⁺CD11b⁺CD28^-Т-лимфоцитов, клеток врожденного иммунитета, снижение ЦТП CD8⁺- и CD16⁺-лимфоцитов, обнаруженные в настоящем исследовании, согласуются с данными различных авторов о том, что ПКРГШ входит в число наиболее иммуносупрессивных опухолей человека. Повышение, по сравнению с ПК, доли CD8⁺- и CD4⁺-Т-клеток, экспрессирующих ингибиторный рецептор PD-1, а также высокая экспрессия на опухолевых клетках PD-L1 и PD-L2 подтверждают это положение. Отсутствие различий в субпопуляционном составе ЛИО в зависимости от стадии заболевания и между выжившими и умершими пациентами также может указывать на иммуносупрессивное состояние локального иммунитета.

Полученные в данном исследовании результаты подтверждают, что наиболее полная информация о состоянии противоопухолевого иммунного ответа у онкологических пациентов может быть получена только при одновременном изучении иммунных клеток ПК и клеток, инфильтрирующих опухолевую ткань.

Литература

1. Rivera C. Essentials of oral cancer. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015; 8 (9): 11 884-94. URL: https://www.researchgate.net/publication/283455295_Essentials_Of_Oral_Cancer

2. Стандартизованные показатели онкоэпидемиологической ситуации 2016 г. Евразийск. онкол. журн. 2018; 6 (2): 49-62.

3. Schoenfeld J.D. Immunity in head and neck cancer. Cancer Immunol. Res. 2015; 3 (1): 12-7. doi: 10.1158/2326-6066.CIR-14-0205.

4. Balermpas P., Michel Y., Wagenblast, J., Seitz O. et al. Tumor-infiltrating lymphocytes predict response to definitive chemoradiotherapy in head and neck cancer. Br. J. Cancer 2014; 110: 501-9. doi: 10.1038/bjc.2013.640.

5. Nasman A., Romanitan M., Nordfors C., Grun N. et al. Tumor infiltrating CD8+ and Foxp3+ lymphocytes correlate to clinical outcome and human papillomavirus (HPV) status in tonsillar cancer. PLoS One. 2012; 7: e38711. doi: 10.1371/journal.pone.0038711.

6. Economopoulou P., Agelaki S., Perisanidis C., Giotakis E.I. et al. The promise of immunotherapy in head and neck squamous cell carcinoma. Ann. Oncol. 2016; 27 (9): 1675-85. doi: 10.1093/annonc/mdw226.

7. Ferris R.L., Whiteside T.L., Ferrone S. Immune escape associated with functional defects in antigen-processing machinery in head and neck cancer. Clin. Cancer Res. 2006; 12 (13): 3890-5. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-05-2750.

8. Jie H.B., Gildener-Leapman N., Li J., Srivastava R.M. et al. Intratumoral regulatory T cells upregulate immunosuppressive molecules in head and neck cancer patients. Br. J. Cancer. 2013; 109: 2629-35. doi: 10.1038/bjc.2013.645.

9. Fiorentini S., Licenziati S., Alessandri G., Castelli F. et al. CD11b expression identifies CD8+CD28+ T lymphocytes with phenotype and function of both naive/memory and effector cells. J. Immunol. 2001; 166 (2): 900-7.

10. McFarland H.I., Nahill S.R., Maciaszek J.W., Welsh R.M. CD11b (Mac-1): a marker for CD8+ cytotoxic T cell activation and memory in virus infection. J. Immunol. 1992; 149 (4): 1326-33. PMID:1500720.

11. Christensen J.E., Andreasen S.O., Christensen J.P., Thomsen A.R. CD11b expression as a marker to distinguish between recently activated effector CD8(+) T cells and memory cells. Int. Immunol. 2001; 13 (4): 593-600. PMID:11282998.

12. Fu B., Tian Z., Wei H. Subsets of human natural killer cells and their regulatory effects. Immunology. 2014; 141 (4): 483-9. doi: 10.1111/imm.12224.

13. Chikamatsu K., Sakakura K., Whiteside T.L., Furuya N. Relationships between regulatory T cells and CD8+ effector populations in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck. Head Neck. 2007; 29 (2): 120-7. doi: 10.1002/hed.20490.

14. Schaefer C., Kim G.G., Albers A., Hoermann K. et al. Characteristics of CD4+CD25+ regulatory T cells in the peripheral circulation of patients with head and neck cancer. Br. J. Cancer. 2005; 92: 913-20. doi: 10.1038/sj.bjc.6602407.

15. Lau K.M., Cheng S.H., Lo K.W., Lee S.A. et al. Increase in circulating Foxp3+CD4+CD25high regulatory T cells in nasopharyngeal carcinoma patients. Br. J. Cancer. 2007; 96: 617-22. doi: 10.1038/sj.bjc.6603580.

16. Strauss L., Bergmann C., Szczepanski M., Gooding W. et al. A unique subset of CD4+CD25highFoxp3+ T cells secreting interleukin-10 and transforming growth factor-beta1 mediates suppression in the tumor microenvironment. Clin. Cancer Res. 2007; 13 : 4345-54. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-0472.

17. Yamada H., Martin P.J., Bean M.A., Braun M.P. et al. Monoclonal antibody 9.3 and anti-CD11 antibodies define reciprocal subsets of lymphocytes. Eur. J. Immunol. 1985, 15: 1164. doi: 10.1002/eji.1830151204.

18. Caruso A., Fiorentini S., Licenziati S., Alessandri G. et al. Expansion of rare CD8+ CD28- CD11b- T cells with impaired effector functions in HIV-1-infected patients. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2000; 24 (5): 465-74. PMID:11035618.

19. Freedman M.S., Ruijs T.C., Blain M., Antel J.P. Phenotypic and functional characteristics of activated CD8+ cells: a CD11b-CD28-subset mediates noncytolytic functional suppression. Clin. Immunol. Immunopathol. 1991; 60 (2): 254-67.

20. Bron L., Jandus C., Andrejevic-Blant S., Speiser D.E. et al. Prognostic value of arginase-II expression and regulatory T-cell infiltration in head and neck squamous cell carcinoma. Int. J. Cancer. 2013; 132 (3): 85-93. doi: 10.1002/ijc.27728.

21. Tabachnyk M., Distel L.V., Buttner M., Grabenbauer G.G. et al. Radiochemotherapy induces a favourable tumour infiltrating inflammatory cell profile in head and neck cancer. Oral Oncol. 2012; 48 (7): 594-601. doi: 10.1016/j.oraloncology.2012.01.024.

22. Lechner A., Schlofier H., Rothschild S.I., Thelen M. et al. Characterization of tumor-associated T-lymphocyte subsets and immune checkpoint molecules in head and neck squamous cell carcinoma. Oncotarget. 2017; 8 (27): 44 418-33. doi: 10.18632/oncotarget.17901.

23. Jie H.B., Gildener-Leapman N., Li J., Srivastava R.M. et al. Intratumoral regulatory T cells upregulate immunosuppressive molecules in head and neck cancer patients. Br. J. Cancer. 2013; 109: 2629-35. doi: 10.1038/bjc.2013.645.

24. Заботина Т.Н., Короткова О.В., Борунова А. А., Табаков Д.В. и др. Многопараметровое исследование иммунофенотипа лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль у онкологических больных. Рос. онкол. журн. 2016; 21 (1-2): 51-4.

25. Chow L.Q.M., Haddad R., Gupta S., Mahipal A. et al. Antitumor activity of pembrolizumab in biomarker-unselected patients with recurrent and/or metastatic head and neck squamous cell carcinoma: results from the phase Ib KEYNOTE-012 expansion cohort. J. Clin. Oncol. 2016; 34 (32): 3838-45. doi: 10.1200/JCO.2016.68.1478.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)