Дифференцированность иммуномодулирующих эффектов аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина и глюкозаминилмурамилдипептида на эффекторные функции и фенотип функционально значимых субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов в экспериментальной модели вирусно-бактериальной коинфекции

• Нестерова Ирина Вадимовна
• Чудилова Галина Анатольевна
• Чапурина Валерия Николаевна
• Ковалева Светлана Валентиновна
• Тараканов Виктор Александрович
• Тетерин Юрий Валерьевич
• Ломтатидзе Людмила Викторовна
• Пирогова Анна Ивановна

Резюме

Введение. Нетипично протекающие инфекционно-воспалительные заболевания, трудно поддающиеся стандартной терапии, связаны со все возрастающей частотой проявлений инфекционно-воспалительных заболеваний, ассоциированных с коинфицированием и антибиотикорезистентностью, что является серьезной клинической проблемой. Уточнение механизмов дефектного функционирования нейтрофильных гранулоцитов (НГ), ответственных за негативный синергизм вирусов и бактерий, актуально, а оценка возможности переориентирования функционального потенциала НГ под воздействием иммунотропных субстанций может позволить создать новые иммунотерапевтические подходы для более эффективного лечения вирусно-бактериальных коинфекций.

Цель исследования - в модели вирусно-бактериальной коинфекции в системе in vitro оценить влияние аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина и глюкозаминилмурамилдипептида на эффекторные функции НГ и фенотип функционально значимых субпопуляций CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ, СD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ.

Материал и методы. Проведено исследование 56 образцов периферической крови (ПК) условно-здоровых взрослых лиц. Последовательной инкубацией ПК c дцРНК, fMLP воспроизведена модель вирусно-бактериальной коинфекции. На модели коинфекции в системе in vitro проведена сравнительная оценка влияния гексапептида аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина (ГП) и глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) на фенотип и содержание НГ функционально значимых субпопуляций CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ и CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺; на активность NADРН-оксидаз НГ в NBT-тесте спонтанном и стимулированном Staphylococcus aureus (штамм 209); на фагоцитарную активность НГ в реакции со S. aureus (штамм 209) с тестированием доли активно-фагоцитирующих НГ (% ФАН), с определением доли неактивных НГ (%Н), доли сформировавшихся NET и доли НГ в апоптозе.

Результаты. Установлено, что ГП дополнительно стимулировал предварительно активированную в экспериментальной модели субпопуляцию НГ фенотипа СD64^-CD16^midCD32^brightCD11b^bright, достоверно уменьшал содержание НГ субпопуляции CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺, меняя ее фенотип на СD64^brightCD16^midCD32^midCD11b^mid. ГМДП не влиял на уровень НГ субпопуляции CD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺, однако вызывал снижение плотности экспрессии всех мембранных рецепторов СD64^-CD16^dimCD32^dimCD11b^dim-НГ до уровня таковых в группе сравнения 1. Параллельно произошло снижение содержания НГ активированной субпопуляции СD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺, которое сопровождалось изменением фенотипа на СD64^midCD16^dimCD32^midCD11b^mid.

Заключение. Выявленные дифференцированные эффекты ГП и ГМДП на трансформированные в экспериментальной модели вирусно-бактериальной инфекции фенотипы функционально значимых субпопуляций НГ могут служить основой для разработки различных иммунотерапевтических стратегий, ориентированных на восстановление нормального функционирования НГ в зависимости от глубины выявленных нарушений.

Ключевые слова:нейтрофильные гранулоциты; модель коинфекции; субпопуляции; фенотип; глюкозаминилмурамилдипептид; аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин

Введение

Все возрастающая частота проявлений сочетанной патологии, полимикробный синергизм коинфицирования являются трудноразрешимыми клиническими проблемами, так как стандартные терапевтические подходы не позволяют контролировать их течение, приводя к развитию антибиотикорезистентности и нетипично протекающих инфекционно-воспалительных заболеваний [1-3]. В настоящее время известно, что острая вирусная инфекция часто осложняется обострением хронической бактериальной инфекции или сопровождается присоединением бактериальной инфекции на фоне нейтропении, на возникновение которой влияют продуцируемые вирусами супрессирующие факторы. Нейтропения и нарушение эффекторных функций нейтрофильных гранулоцитов (НГ), таких как дефектность фагоцитарной функции и нарушение продукции активных форм кислорода (АФК), снижение продукции антимикробных пептидов, усиление апоптоза НГ, способствуют присоединению бактериальных инфекций. Этими обстоятельствами лишь частично можно объяснить нарушения функционирования иммунной системы и ассоциированных с ними нетипично протекающих вирусно-бактериальных коинфекций [4-6]. Кроме того, высокотоксичные повреждающие факторы некоторых вирусов (нейраминидаза, гликопротеин и т. д.), разрушая инфицированные клетки, снижая экспрессию паттерн-распознающих рецепторов, распознающих бактерии, способствуют развитию бактериальных осложнений [7]. Показано, что дисфункция НГ, вызванная вирусом гриппа A, способствует повышению восприимчивости к вторичной пневмококковой инфекции [8], а истощение НГ во время сочетанной инфекции вирусом гриппа A и S. pneumoniae увеличивает смертность [9]. НГ по-разному могут реагировать на микробные стимулы: дегрануляцией, в результате чего НГ секретируют медиаторы и протеолитические ферменты (MMP, MPO и NE), которые хранятся в цитоплазматических гранулах, продукцией АФК внутри- или внеклеточно, фагоцитозом патогенов, ограничивая их распространение, в то время как фагоцитоз клеточного дебриса и апоптотического материала может способствовать разрешению воспаления [9, 10]. НГ также могут ограничивать распространение микробов, образуя экстрацеллюлярные ловушки (NET) [10-14]. Наконец доказано, что НГ могут напрямую и косвенно взаимодействовать с другими клетками иммунной системы: альвеолярными макрофагами, дендритными клетками (ДК), натуральными киллерами (НК) и Т- и В-лимфоцитами [13].

Современные представления о многофункциональности НГ связывают с различными субпопуляциями НГ [15-18]. От фенотипических особенностей НГ - плотности рецепторов, экспрессируемых на поверхностной мембране, в частности Fc?γRs (CD64, CD16, CD32) и Mac-1 (CR3/CD11b), зависит способность клеток определять степень и тип инициируемых ими эффекторных программ, оказывающих микробицидное, модулирующее, регуляторное активирующее или супрессирующее, а возможно, и гиперэргическое повреждающее действие и тем самым влияющих на течение и исход инфекционного процесса [10, 15, 18].

FcγRs представляет суперсемейство иммуноглобулиновых структурно и функционально родственных рецепторов (FcγRI, FcγRII, FcγRIII), имеющих общие высококонсервативные внутриклеточные сигнальные компоненты на основе тирозина - мотивы активации (ITAM) или мотивы ингибирования (ITIM), которые обладают способностью передавать иммуностимулирующие или иммуносупрессивные сигналы после перекрестного связывания рецепторов с иммунными комплексами, содержащими IgG [10, 18, 19]. При FcR-сшивании происходит активация киназ Syk и Src, что инициирует образование реакционноспособных АФК, активацию NADPH-зависимого оксидазного комплекса, вызывая быстрое генерирование супероксидных анионов, которые осуществляют прямую цитотоксическую активность или способствуют образованию промежуточных активных соединений кислорода и азота, включая гидроксильный радикал (OHO), хлорноватистую кислоту (HOCl) и пероксинитрит (ONOO^-), а также перекись водорода [20]. Выделение антимикробных молекул НГ в ответ на FcR-сшивание представляет собой один из самых мощных иммунных механизмов в организме человека. Помимо этого, после опосредованной FcγR клеточной активации происходит увеличение внутриклеточной концентрации Ca²⁺ и высвобождение предварительно сформированных молекул, хранящихся в специализированных гранулах. В цитоплазматических гранулах содержатся протеазы (эластаза, катепсины и коллагеназы), антимикробные пептиды и белки (лизоцим, дефензины, лактоферрин), ферменты (миелопероксидаза, щелочная фосфатаза), липидные медиаторы (лейкотриены), а также клеточные поверхностные рецепторы, в том числе Fc?γRs и CD11b [18, 21]. Выделение этих медиаторов в зоне воспаления свидетельствует об активации НГ и представляет собой важный эффекторный механизм, посредством которого НГ опосредуют свою активность in vivo в отношении вторгающихся патогенов.

CD64 (FcγRI) является единственным Fc-рецептором человека с высокой аффинностью к моновалентному IgG. СD64 конститутивно экспрессируется на ранних стадиях гранулоцитопоэза, а на зрелых и неактивированных НГ представлен на очень низком уровне (~1400 рецепторов на клетку), хранится внутри клетки и мобилизуется на поверхность при праймировании, являясь признанным маркером наличия воспалительных процессов и инфекции. CD64 считается цитоактивирующим рецептором: его связывание с IgG индуцирует клеточные ответы, включая фагоцитоз, высвобождение медиаторов воспаления, активацию NADPH-оксидаз, образование АФК, запуск АЗКЦ [22, 23]. Связывание FcγRI с патогеном, опсонизированным IgG, может привести к возникновению сложного набора активирующих и ингибирующих эффектов. Например, связывание мономерного IgG обеспечивает низкоинтенсивный тонический сигнал через FcγRI, который необходим для полной передачи сигналов рецептора ИФН-γ в клетке. Взаимодействие FcγRI с более крупными высокоавидными комплексами может приводить к фагоцитозу, образованию АФК, а также к синтезу и высвобождению воспалительных цитокинов. Описаны противовоспалительные эффекты, вызванные взаимодействием FcγRI с иммунными комплексами, такие как ингибирование передачи сигналов ИФН-γ, а также блокада TLR4 и подавление секреции ИЛ-10 [24-26]. Известно, что НГ через FcγRI способны активировать макрофаги, В-лимфоциты, стимулируя антителообразование, оказывают регулирующие влияния на НК-клетки. Показано, что при бактериальной инфекции количество НГ, экспрессирующих FcγRI, увеличивается под влиянием цитокинов острой фазы воспаления ИЛ-6, ИЛ-8, Г-КСФ, ИФН-γ.

CD32 (FcγRIIa) - низкоаффинный рецептор для IgG на мембранной поверхности НГ в ответ на патогены или цитокины запускает Ca²⁺-транзит и сигналлинг фосфорилирования тирозина, что приводит к активации сборки NADPH-оксидазного комплекса. Кроме того, CD32 опосредует эндоцитоз, стимуляцию секреторной активности, цитотоксических механизмов и иммуномодулирующих функций НГ [27].

CD16 (FcγRIIIb) - низкоаффинный рецептор с низким сродством к IgG, отвечающий за цитотоксическую функцию НГ. CD16 не является рецептором фагоцитоза, но связывание FcγRIIa с FcγRIIIb, соединение CD16 с IgG инициирует сигнальные каскады, которые продуцируют разнообразные ответы, включая АЗКЦ, фагоцитоз, дегрануляцию, кислородный взрыв и пролиферацию [28]. Высокая экспрессия молекул CD16 свидетельствует о повышенной функциональной активности НГ. Снижение или отсутствие CD16 на мембранной поверхности НГ может указывать на незрелость НГ и/или на обратную дифференцировку НГ, ведущую к уменьшению общего числа лейкоцитов, вплоть до лейкопении, что может приводить к некрозу тканей или возникновению бактериальной инфекции. Кроме того, показано, что на поверхностной цитоплазматической мембране НГ, подвергающихся апоптозу, происходит шеддинг - слущивание молекул CD16 с мембраны [10, 18, 28]. В то же время показано, что рецептор CD16 способен функционировать совместно с CD11b/CD18-рецептором и усиливать FcγRII-опосредованную интернализацию.

CD11b (Mac-1, CR3b) - поверхностный антиген (α-субъединица молекулы адгезии β₂-интегрина), трансмембранный гетеродимерный рецептор для CR3b-компонента комплемента. Нейтрофильный CD11b представляет собой маркер фагоцитоза активированных НГ. CD11b хранится во внутриклеточных гранулах и дополнительно экспрессируется на поверхности НГ после активации, что способствует устойчивому прикреплению НГ к эндотелию, их трансэндотелиальной миграции в ткани - в локусы воспаления. Повышение уровня экспрессии молекул CD11b НГ наблюдается при различных инфекциях и свидетельствует об активации НГ [29]. CD11b - сигнальный партнер для различных рецепторов: fMLP-рецептора, CD14 и FcγRs. Он связан с актиновым цитоскелетом НГ и сигнальными белками, способен регулировать хемотаксис, миграцию, адгезию, фагоцитоз, респираторный взрыв и дегрануляцию НГ. Нарушение экспрессии CD11b на НГ нарушает регуляторные механизмы иммунной системы. Блокирование CD11b приводит к дефекту активации FcγRs и нарушению фагоцитарной функции НГ [30].

Не вызывает сомнения, что важную роль в реализации эффекторных функций и регуляторных влияний функционально значимых субпопуляций НГ: CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺, СD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ - играет кооперация рецепторов FcγRs и CD11b. Разнонаправленное повышение, нарушение или понижение экспрессии этих рецепторов может активировать или нарушать их взаимодействие и в то же время усиливать или ослаблять действие друг друга, что, по-видимому, и происходит при развитии нетипично протекающих инфекционно-воспалительных заболеваний, вызванных вирусно-бактериальной коинфекцией.

Нацеливание терапевтических стратегий на различные субпопуляции НГ может облегчить таргетное ингибирование или восстановление прововоспалительных функций НГ, или, действуя на нейтрофильный компартмент рецепторов, способствовать их активации, возможно, даже истощению этих клеток без ущерба для организма хозяина. В этой связи актуально уточнение механизмов неэффективной работы НГ при полимикробном синергизме вирусов и бактерий, а оценка возможности переориентировать функциональный потенциал НГ под воздействием иммунотропных субстанций может служить отправной точкой для разработки новых эффективных лечебных алгоритмов с включением иммунотропной терапии при вирусно-бактериальных коинфекциях.

Цель исследования - в созданной нами ранее экспериментальной модели вирусно-бактериальной коинфекции в системе in vitro оценить влияние аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина и глюкозаминилмурамилдипептида на эффекторные функции нейтрофильных гранулоцитов и фенотип функционально значимых субпопуляций CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ и СD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ.

Материал и методы

Пациенты и образцы для исследования. Проведено исследование 56 образцов периферической крови (ПК) условно-здоровых взрослых (7 женщин, 7 мужчин) в возрасте от 21 года до 32 лет. У всех участников было получено информированное согласие на участие в исследовании и забор крови согласно Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (WMA Declaration of Helsinki - Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013). Исследование одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО "Кубанский государственный медицинский университет" Минздрава России.

Группы исследования: группа сравнения 1 (интактные НГ, n = 14); группа сравнения 2 (n = 14) - модель вирусно-бактериальной коинфекции (последовательная инкубация НГ c дцРНК, с fMLP; группа исследования 1, n = 14) - оценка влияния гексапептида аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина (ГП) в модели вирусно-бактериальной коинфекции; группа исследования 2 (n = 14) - оценка влияния глюкозаминилмурамилдипептида (ГМДП) в модели вирусно-бактериальной коинфекции.

Дизайн исследования. Экспериментальное исследование проводили в 3 этапа. На I этапе была воспроизведена созданная нами ранее модель вирусно-бактериальной коинфекции [23]. С этой целью к образцам цельной ПК добавляли дцРНК (10^-7 М, Т 37 °С, в течение 60 мин) и затем fMLP (10^-7 М, Т 37 °С в течение 15 мин).

Для моделирования вирусно-бактериальной коинфекции в системе in vitro использованы субстанции: дцРНК, являющейся активатором врожденного иммунитета при вирусных инфекциях, индуктором интерферонов; fMLP, пептид многих бактерий, хемотаксический фактор НГ, который связывается с поверхностными мембранными рецепторами, индуцируя широкий спектр сигнальных путей и активность различных функций НГ, таких как хемотаксис, фагоцитоз, высвобождение микробицидных молекул из гранул НГ (антителозависимую клеточную цитотоксичность - АЗКЦ, NETоз) и генерацию АФК.

На II этапе оценивали влияние ГП и ГМДП на НГ в модели вирусно-бактериальной коинфекции: образцы ПК после преинкубации инкубировали при температуре 37 °С в течение 60 мин с ГП или с ГМДП, при этом конечная концентрация ГП составляла 10^-6 г/л, конечная концентрация ГМДП - 10^-6 г/л.

ГП обладает иммунорегуляторными свойствами, способен восстанавливать баланс окислительно-антиокислительных реакций, инактивировать свободнорадикальные и перекисные соединения. ГП связывается с рецепторами на клетках иммунной системы.

ГМДП - пептидогликан клеточной стенки бактерий, стимулирует функциональную (бактерицидную, цитотоксическую) активность макро- и микрофагоцитов, усиливает презентацию антигенов, пролиферацию лимфоцитов, продукцию специфических антител, поляризует Th1/Th2-лимфоциты в сторону Th1-ответа.

На III этапе во всех экспериментальных группах (после проведения преинкубации с дцРНК и fMLP (группа сравнения 2); дцРНК, fMLP и дополнительном воздействии ГП (группа исследования 1); дцРНК, fMLP и дополнительном воздействии ГМДП (группа исследования 2) и группе сравнения 1 оценивали влияние иммунотропных субстанций на микробицидную NADРН-зависимую функцию НГ; оценивали фагоцитарную - эффекторную функцию НГ: захват НГ бактериального антигена - Staphylococcus aureus (музейный штамм 209), образование NET, апоптоз НГ.

Лабораторные исследования. С помощью проточной цитометрии (FC 500, Beckman Coulter, США) определяли содержание НГ субпопуляций CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺, CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ и плотность экспрессии рецепторов - средняя интенсивность флуоресценции (MFI). Использованы конъюгаты МКАТ (Beckman Coulter International S.A., Франция) CD16-ECD, CD32-PE, CD11b-PC5, CD64-FITC. Субпопуляции CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ, CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ экспрессируют Fcγ-рецепторы и рецептор к компоненту С3 комплемента. Активация и взаимодействие этих рецепторов в зависимости от плотности их экспрессии могут запускать различные эффекторные свойства НГ: фагоцитоз, экзоцитоз внутриклеточных гранул, продуцирование АФК, АЗКЦ, образование NETs, выделение хемокинов и цитокинов [10, 26]. Статистически значимую разницу значений MFI обозначали терминами bright (яркий), mid (средний), dim (низкий) для выявления особенностей фенотипа субпопопуляций и динамики экспрессии каждой мембранной молекулы.

Активность NADРН-оксидазы НГ оценивали в спонтанном (NBTсп) и стимулированном (NBTст) NBT-тесте. В NBTст в качестве индуктора использовали взвесь S. aureus (штамм 209) в разведении 1·10⁶ микробных тел/мл физраствора. Оценивали средний цитохимический индекс (СЦИсп и СЦИст), доля формазан-положительных клеток (% ФПКcт, % ФПКсп), коэффициент мобилизации (КМ) - соотношение % ФПКcт к % ФПКсп. Также для оценки функционирования НГ по отношению к S. aureus (штамм 209) использовали показатели: % ФАН (доля активно-фагоцитирующих НГ); % Н (доля неактивных НГ); доля НГ, образовавших NET (%); доля клеток, входящих в апоптоз (%).

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью компьютерных программах Microsoft Exel 2016 и StatPlus 2010. После оценки нормальности распределения лабораторных показателей использовали непараметрические статистические критерии Вилкоксона и Манна-Уитни. Результаты представляли в виде медианы (верхний и нижний квартиль) - Me (Q1;Q3). Статистически значимые различия определяли при p < 0,05.

Результаты

В образцах ПК группы сравнения 1 НГ в 96,11 (93,74; 97,22) % случаев были представлены субпопуляцией СD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-НГ и лишь в 0,21 (0,14; 1,92) % субпопуляцией СD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-НГ. Для преобладающей субпопуляции был характерен фенотип СD64^-CD16^dimCD32^dimCD11b^dim, а для субпопуляции СD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-НГ, имеющей дополнительно CD64-рецептор, с более высоким уровнем экспрессии CD16 (p < 0,05), CD32 (p < 0,05) и CD11b (p < 0,05) - фенотип СD64^dimCD16^midCD32^midCD11b^mid-НГ (табл. 1).

Таблица 1. Влияние гексапептида и глюкозаминилмурамилдипептида на содержание и фенотип субпопуляций СD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺ и СD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺ нейтрофильных гранулоцитов в модели вирусно-бактериальной коинфекции, Me (Q1; Q2)

Примечание. * - различия по сравнению с показателями интактных НГ у условно-здоровых взрослых (группа сравнения 1); p < 0,05; # - различия показателей группы исследования 1 и группы сравнения 2; p < 0,05; ^ - различия показателей группы исследования 2 и группы сравнения 2.

При моделировании вирусно-бактериальной коинфекции путем последовательной инкубации с дцРНК и fMLP (группа сравнения 2) выявлены стимулирующий эффект их совместного влияния на плотность экспрессии поверхностных мембранных рецепторов обеих субпопуляций НГ по отношению к показателям, определяемым в интактных образцах группы сравнения 1. Содержание СD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-НГ не менялось под действием дцРНК и fMLP, но при этом было выявлено повышение MFI молекул: СD16 (в 1,15 раза), СD32 (в 1,5 раза) и более значимое - СD11b (в 1,53 раза) (р₁ < 0,05; p₂ < 0,05; р₃ < 0,05), с трансформацией фенотипа в СD64^-CD16^midCD32^brightCD11b^mid-НГ. Увеличение в 19 раз содержания НГ активированной субпопуляции СD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-НГ (p < 0,05) сопровождалось повышением MFI всех изучаемых рецепторов: CD64 (в 1,1 раза), CD16 (в 1,4 раза), CD32 (в 1,6 раза), CD11b (в 1,8 раза) (р₁ < 0,05; p₂ < 0,05; р₃ < 0,05; p₄ < 0,05) - трансформацией фенотипа в СD64^midCD16^bright CD32^brightCD11b^bright-НГ (табл. 1, рис. 1).

Рис. 1. Трансформация субпопуляций СD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ, СD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ и их фенотипа в модели вирусно-бактериальной коинфекции в системе in vitro

* - различия показателей по сравнению с интактными значениями НГ у условно-здоровых взрослых (группа сравнения 1); p < 0,05.

При оценке эффектов ГП на трансформированный фенотип и содержание НГ в экспериментальной модели коинфекции установлены тенденции снижения содержания СD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-НГ (р > 0,05) с увеличением MFI CD32 в 1,3 раза (p < 0,05), активационного маркера CD11b в 1,2 раза (p < 0,05) и CD16 (р > 0,05) - СD64^-CD16^midCD32^brightCD11b^bright-НГ. При этом наблюдается и снижение в 1,3 раза содержания СD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-НГ с изменением фенотипических характеристик: достоверно возросла MFI СD64 в 1,3 раза (p < 0,05) и снизились MFI CD32 и CD11b, соответственно в 1,3 и в 1,5 раза (р₁ < 0,05; p₂ < 0,05), а также MFI CD16 (р > 0,05) - СD64^brightCD16^midCD32^midCD11b^mid-НГ (табл. 1; рис. 2).

Рис. 2. Эффекты гексапептида и глюкозаминилмурамилдипептида на фенотип СD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ и СD64⁺CD32⁺ CD16⁺CD11b⁺-НГ в модели вирусно-бактериальной коинфекции in vitro

# - различия показателей группы исследования 1 от показателей группы сравнения 2, p < 0,05; ^ - различия показателей группы исследования 2 от показателей группы сравнения 2.

Под влиянием ГМДП по сравнению с эффектами ГП в модели вирусно-бактериальной коинфекции показано, что ГМДП в системе in vitro также не влияет на содержание НГ субпопуляции CD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺, которая составляет 95,34 (91,3; 96,8)% (p > 0,05). Но под влиянием ГМДП иначе изменяется фенотип CD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-НГ: значимо снижается плотность экспрессии всех поверхностных мембранных рецепторов - в 1,2 раза CD16 (p < 0,05), в 2,2 раза CD32 (р < 0,05) и в 2,8 раз CD11b (р < 0,05) практически до показателей группы сравнения 1, приобретая фенотип СD64^-CD16^dimCD32^dimCD11b^dim (табл. 1; рис. 2).

Содержание НГ активированной субпопуляции СD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺, выявленное в модели вирусно-бактериальной коинфекции, под влиянием ГМДП уменьшилось в 1,5 раза (р < 0,05), однако оставалось выше показателя группы сравнения 1. Кроме того, наблюдалась трансформация фенотипа в СD64^midCD16^dimCD32^midCD11b^mid за счет снижения в 1,8 раз MFI CD16 (р < 0,05) и MFI CD11b (р < 0,05) до показателей группы сравнения 1, тенденции уменьшения MFI CD11 (р > 0,05), при этом MFI СD64 не менялся (табл. 1; рис. 2).

В модели вирусно-бактериальной коинфекции обнаружено значительное увеличение спонтанной (р < 0,05) и индуцированной (р < 0,05) активности NADPH-оксидаз под влиянием дцРНК и fMLP. Соответственно, уровень спонтанной активности по СЦИ увеличился до 0,5 (0,36; 0,78) против 0,19 (0,17; 0,23) (р < 0,05), а % ФПК до 19,0 (16,0; 22,0) % против 3,45 (1,5; 3,5) % у условно-здоровых лиц (р < 0,05). В стимулированном NBT-тесте уровень активности NADPH-оксидаз увеличился по СЦИ до 0,60 (0,41; 0,80) против 0,30 (0,28; 0,34) (р < 0,05), а по % ФПК до 11,5 (8,25; 21,0) % против 3,45 (1,0; 5,25) % у условно-здоровых лиц (р < 0,05). КМ характеризовался выраженной, но не достоверной, тенденцией к снижению (табл. 2).

Таблица 2. Влияние гексапептида и глюкозаминилмурамилдипептида на NADPH-зависимый микробицидный потенциал, фагоцитарную активность, формирование NETs, апоптоз нейтрофильных гранулоцитов в системе in vitro в модели вирусно-бактериальной коинфекции, Me (Q1; Q2)

При оценке фагоцитарной функции НГ в модели вирусно-бактериальной коинфекции выявлено, что при времени нагрузки НГ S. aureus 120 мин отмечалось снижение содержания активно фагоцитирующих НГ - % ФАН до 40,5 (22,8; 43,3) % против 50,5 (47,3;56,3) % у лиц группы сравнения 1 (р < 0,05), наблюдалось увеличение в 3 раза содержания НГ, вошедших в апоптоз, до 12,5 (10,25; 14,25) % против 4,0 (1,75; 6,50) в группе сравнения (р < 0,05). У 65 % НГ, находившихся в апоптозе, в цитоплазме определялось большое количество S. aureus (от 6 до ≥12 микробов) (рис. 3).

Рис. 3. Фагоцитоз, апоптоз, NETоз нейтрофильных гранулоцитов в модели вирусно-бактериальной коинфекции in vitro

А - фагоцитоз; Б - апоптоз НГ; В - NET НГ, индукция Staphylococcus aureus.

Содержание НГ, формирующих NET, было в пределах показателей группы сравнения 1 (р > 0,05) (табл. 2, см. рис. 3).

Выявлены различные эффекты влияния ГП и ГМДП на эффекторную функцию НГ в модели вирусно-бактериальной коинфекции. При оценке эффектов ГП в модели вирусно-бактериальной коинфекции на активность NADPH-оксидаз выявлено лишь снижение в спонтанном NBT-тесте %ФПКсп с 19,0 (16,0; 22,0) % до 11,0 (4,0;13,5) % (р < 0,05), однако при этом показатели оставались выше уровня таковых у условно-здоровых лиц (р < 0,05). Оценивая влияние ГП на фагоцитарную функцию НГ в модели вирусно-бактериальной коинфекции, было показано восстановление содержания ФАН НГ до уровня группы сравнения 1 - % ФАН повысилcя с 40,5 (22,8; 43,3) % до 61,0 (55,6; 72,0) % (р < 0,05) (табл. 2). Выявлено значительное уменьшение содержания неактивных НГ - до 22,50 (15,25; 26,75) %, что ниже, чем в группе сравнения 1 и в экспериментальной модели коинфекции (р₁ > 0,05; р₂ > 0,05). Наблюдалось снижение в 2 раза доли НГ, вошедших в апоптоз, до 5,5 (2,75; 11,0) %, что не отличалось от показателей группы сравнения 1 - 4,0 (1,75; 6,50) % (р > 0,05) и было ниже, чем в экспериментальной модели коинфекции (р < 0,05). Доля НГ, образовавших NET, составила 2,0 (1,0; 3,5) %, оставаясь на уровне показателей группы сравнения 1 и модели вирусно-бактериальной коинфекции (р₁ > 0,05; р₂ > 0,05) (табл. 2).

Показано, что при оценке изменений спонтанной и индуцированной активности NADPH-оксидаз НГ под влиянием ГМДП в модели вирусно-бактериальной коинфекции установлено лишь достоверное снижение %ФПК в спонтанном NBT-тесте с 19,0 (16,0; 22,0) % до 8,0 (4,5;10,5) % (р < 0,05), не достигающее уровня условно-здоровых лиц (р < 0,05). Под влиянием ГМДП в модели вирусно-бактериальной коинфекции было показано повышение % ФАН в 2 раза - с 40,5 (22,8; 43,3) % до 80,0 (70,5; 86,5) % (р < 0,05), что значительно превысило уровень, наблюдаемый у лиц группы сравнения 1 - 50,5 (47,3;56,3) % (р < 0,05) и в модели вирусно-бактериальной инфекции - 40,5 (22,8; 43,3) % (р < 0,05). Имело место уменьшение содержания неактивных НГ - до 14,0 (8,75; 19,0), что было значительно ниже, чем в группе сравнения 1 и в группе сравнения 2 (р₁ > 0,05; р₂ > 0,05). Наблюдалось снижение в 3,6 раза содержания НГ, вошедших в апоптоз, до 3,5 (2,0; 7,0) % против 12,5 (10,25; 14,25) % в модели вирусно-бактериальной коинфекции, при этом содержание НГ в апоптозе не отличалось от показателей группы сравнения 1 - 4,0 (1,75; 6,50) (р > 0,05). Содержание НГ, формирующих NETs, оставалось на уровне показателей группы сравнения 1 и модели вирусно-бактериальной коинфекции (р₁ > 0,05; р₂ > 0,05) (табл. 2).

Обсуждение

В модели вирусно-бактериальной коинфекции, полученной при последовательном воздействии дцРНК, fMLP на ПК условно-здоровых взрослых лиц, выявлены профили количественных и фенотипических изменений субпопуляций CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ и CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ. Установлено, что субпопуляция CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ приобрела более активный фенотип СD64^-CD16^midCD32^brightCD11b^mid с повышенным уровнем экспрессии CD11b, CD16, CD32 в ответ на смоделированную вирусно-бактериальную нагрузку, что свидетельствует о том, что НГ условно-здоровых субъектов быстро индуцируют сборку мембранного рецепторного аппарата за счет предсинтезированных и хранящихся в гранулах рецепторов, необходимых для выполнения эффекторных функций [24].

Следует отметить появление в модели вирусно-бактериальной инфекции активированной субпопуляции CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ с увеличением количества клеток и более высоким MFI экспрессируемых рецепторов, чем у условно-здоровых субъектов - субпопуляции СD64^midCD16^brightCD32^brightCD11b^bright-НГ. Экспрессия молекулы CD64 на мембране НГ имеет прямую связь с активацией клеток бактериальным антигеном с транслокацией данной молекулы из гранулярного аппарата клетки на поверхностную мембрану НГ. Кроме того, рецепторы Fcγ, такие как CD64, могут связывать опсонизированные патогены и иммунные комплексы [25, 26]. Следовательно, возможно, что позже, во время первичной или повторной инфекции, когда присутствуют вирус-специфические IgG, активированные НГ могут увеличивать фагоцитоз связанных с IgG вирусных частиц и играть более выраженную роль в клиренсе вируса.

Экспериментальные данные по влиянию ГП и ГМДП в модели вирусно-бактериальной коинфекции в системе in vitro продемонстрировали неоднозначные эффекты на субпопуляции CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ и CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ.

Установлено, что ГП дополнительно активирует фенотип "сторожевой" субпопуляции - СD64^-CD16^midCD32^brightCD11b^bright-НГ, которая была до этого преактивирована в модели вирусно-бактериальной коинфекции. По нашему мнению, эта субпопуляция обладает протективным эффектом, направленным на предотвращение развития вирусно-бактериальной инфекции. Влияние ГП на субпопуляцию CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ имеет совершенно иной характер: значимо уменьшается содержание НГ данной субпопуляции, активированной в модели коинфекции, и меняется их фенотип на СD64^brightCD16^midCD32^midCD11b^mid. С нашей точки зрения, именно таким образом проявляется модулирующий эффект влияния ГП, сдерживающий активность гиперактивированной субпопуляции CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ.

ГМДП в экспериментальной модели вирусно-бактериального процесса демонстрирует иммуномодулирующие свойства. ГМДП, как и ГП, не влияет на содержание НГ субпопуляции CD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺. В то же время ГМДП приводит к снижению плотности экспрессии всех поверхностных мембранных рецепторов - СD64, CD16, CD32, CD11b - до показателей группы сравнения 1. На фоне снижения содержания активированной субпопуляции СD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-НГ под влиянием ГМДП наблюдалось изменение ее фенотипа в СD64^midCD16^dimCD32^midCD11b^mid.

Некоторые сходства и различия в интенсивности проявлений иммуномодулирующих эффектов ГП и ГМДП, по-видимому, обусловлены особенностями их связывания с разными рецепторами НГ, что активирует различные механизмы сигналлинга, направленного в первую очередь на активацию эффекторных и регуляторных функций НГ. Так, ГП, являясь синтетическим аналогом активного центра полипептидного гормона тимуса тимопоэтина, связывается с двумя видами рецепторов НГ.

Тимопоэтин оказывает физиологические эффекты на иммунную систему, связываясь с ацетилхолиновым рецептором [31]. Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (NACHR) представляют собой пентамерные катионные каналы, экспрессируемые клетками нейронального типа. NACHR также обнаруживаются на 3 типах лейкоцитов: нейтрофильных, базофильных, эозинофильных гранулоцитах [32]. В экспериментальных исследованиях на мышах показано, что воздействие на NACHR может модулировать функциональную активность НГ [33]. Кроме того, получены убедительные данные, свидетельствующие о прямом связывании пентапептида аргинил-лизил-аспартил-валил-тирозина, синтетического аналога активного центра тимопоэтина, с молекулами HLA класса II - HLA-DR. Использование в эксперименте флуоресцентно меченого пентапептида продемонстрировало его прямое связывание с HLA-DR, а специфичность связывания подтверждена ингибированием немеченым пентапептидом. Молекулярный анализ дополнил это открытие об изменении сайта связывания в бороздке HLA-DR и наличии валина (Val), выступающего как якорь 1 типа, необходимый для связывания пентапептида с HLA-DR [34].

Принимая во внимание, что гексапептид аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинина (действующее вещество препарата Имунофан^®) и пентапептид аргинил-лизил-аспартил-валил-тирозин (действующее вещество препарата Тимопентин, ТР-5) позиционируются разработчиками и исследователями как синтетические аналоги активного центра типопоэтина, данные, приведенные выше, свидетельствуют о существования 2 путей рецепторного связывания ГП и НГ - связывание с HLA-DR и с NACHR. При этом ГП демонстрирует мягкие иммуномодулирующие эффекты на НГ, восстанавливая их эффекторную фагоцитарную функцию и позитивно трансформируя фенотип функционально значимых субпопуляций.

ГМДП связывается с совершенно иными рецепторами, в частности с цитозольным внутриклеточным рецептором NOD2. NOD2 реагирует на молекулярную сигнатуру бактериального пептидогликана, называемого мурамилдипептидом (МДП), присутствующего как в грам-положительных, так и в грам-отрицательных бактериях. NOD2 напрямую связывается с МДП, что приводит к развитию иммунного ответа через активацию NF-κB [35].

В настоящее время раскрыты более сложные пути иммунотропного действия МДП. Они, как и различные фрагменты пептидогликанов, активируют разные транскрипционные программы и сигнальные пути, опосредованные PG STAT1, IRF5, cJun и p65, NF-κB, которые индуцируют экспрессию различных генов, частности генов про- и противовоспалительных цитокинов, интерферонов и т.д. [36].

Принимая во внимание, что ГМДП относится к МДП и реализует свои иммуномодулирующие свойства относительно НГ иным, чем ГП, путем, его эффекты выражены более сильно, чем влияние ГП. ГМДП демонстрирует более выраженные по интенсивности иммуномодулирующие эффекты на нарушенные функции НГ и на фенотип их субпопуляций, восстанавливая их эффекторную фагоцитарную функцию и позитивно трансформируя фенотип функционально значимых субпопуляций.

Заключение

Таким образом, в результате сравнительного изучения двух иммунотропных субстанций - гексапептида и глюкозаминилмурамилдипептида - в экспериментальной модели вирусно-бактериальной коинфекции in vitro получены разные по степени выраженности позитивные эффекты, позволяющие восстанавливать и/или активировать дефектную фагоцитарную функцию НГ, позитивно влиять на негативно трансформированный фенотип CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ и CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺-НГ, ориентируясь на выявленные дефекты.

Учитывая, что изучаемые субстанции являются активными компонентами российских лекарственных препаратов, разрешенных к использованию у детей и взрослых, выявленные позитивные иммуномодулирующие эффекты могут быть основой для разработки рациональных дифференцированных иммунотерапевтических стратегий, направленных на восстановление нормального функционирования НГ в зависимости от глубины выявленных нарушений: коррекцию эффекторных функций и фенотипа функционально значимых субпопуляций НГ при различных вирусно-бактериальных коинфекциях, что должно способствовать оптимизации лечения и преодолению антибиотикорезистентности.

Литература

1. Балмасова И.П., Малова Е.С., Ефратова Е.П. ВИЧ-инфекция и проблема коинфицирования ВИЧ/ВГС. Российский иммунологический журнал. 2019; 13 (2-1): 144-6. DOI: https://www.doi.org/10.31857/S102872210006430-8

2. Brealey J.C., Sly P.D., Young P.R., Chappell K.J. Viral bacterial co-infection of the respiratory tract during early childhood. FEMS Microbiology Letters. 2015; 362 (10): fnv062. DOI: https://www.doi.org/10.1093/femsle/fnv062

3. Bellinghausen C., Rohde G.G.U., Savelkoul P.H.M., Wouters E.F.M., Stassen F.R.M. Viral-bacterial interactions in the respiratory tract. J Gen Virol. 2016; 97 (12): 3089-102. DOI: https://www.doi.org/10.1099/jgv.0.000627

4. Кренев И.А., Берлов М.Н., Умнякова Е.С. Антимикробные белки и пептиды нейтрофильных гранулоцитов как модуляторы системы комплемента. Иммунология. 2021; 42 (4): 426-33. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-4-426-433

5. Grunwell J.R., Giacalone V.D., Stephenson S., Margaroli1 C., Dobosh B.S, Brown M.R., Fitzpatrick A.M., Tirouvanziam R. Neutrophil dysfunction in the airways of children with acute respiratory failure due to lower respiratory tract viral and bacterial coinfections. Sci Rep. 2019; 9: 2874. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41598-019-39726-w

6. Meskill, S.D., O’Bryant, S.C. Respiratory virus co-infection in acute respiratory infections in children. Current Infectious Disease Reports. 2020; 22 (3): 2-8. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s11908-020-0711-8

7. Alymova I.V., Portner A., Takimoto T., Boyd K.L., Babu Y.S., McCullers J.A. The novel parainfluenza virus hemagglutinin-neuraminidase inhibitor BCX 2798 prevents lethal synergism between a paramyxovirus and Streptococcus pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother. 2005; 49 (1): 398-405. DOI: https://www.doi.org/10.1128/AAC.49.1.398-405.2005

8. McNamee L.A., Harmsen A.G. Both influenza-induced neutrophil dysfunction and neutrophil-independent mechanisms contribute to increased susceptibility to a secondary Streptococcus pneumoniae infection. Infect Immun. 2006; 74: 6707-21. DOI: https://www.doi.org/10.1128/IAI.00789-06

9. Ellis G.T., Davidson S., Crotta S. , Branzk N., Papayannopoulos V., Wack A. TRAIL + monocytes and monocyte-related cells cause lung damage and thereby increase susceptibility to influenza - Streptococcus pneumoniae coinfection. EMBO Rep. 2015; 16: 1203-18. DOI: https://www.doi.org/10.15252/embr.201540473

10. Нестерова И.В., Чудилова Г.А., Ковалева С.В., Тараканов В.А., Ломтатидзе Л.В. Колесникова Н.В., Русинова Т.В., Евглевский А.А., Малиновская В.В. Нейтрофильные гранулоциты: отражение в зеркале современных представлений. Capricorn Publishing, UK, USA, Moscow, 2018. 338 с. ISBN: 978-0-9774757-8-0.

11. Warnatsc A., Tsourouktsoglou T.-D., Branzk N., Wang Q., Reincke S., Herbst S., Gutierrez M., Papayannopoulos V. Reactive oxygen species localization programs inflammation to clear microbes of different size. Immunity. 2017; 46 (3): 421-32 DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.immuni.2017.02.013

12. Branzk N., Lubojemska A., Hardison S.E., Wang Q., Gutierrez M.G., Brown G.D., Papayannopoulos V. Neutrophils sense microbe size and selectively release neutrophil extracellular traps in response to large pathogens. Nat Immunol. 2014; 15: 1017-25. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ni.2987

13. Mócsai A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 2013; 210 (7): 1283-99. DOI: https://www.doi.org/10.1084/jem.20122220

14. Castanheira F.V.S., Kubes P. Neutrophils and NETs in modulating acute and chronic inflammation. Blood. 2019; 133 (20): 2178-85. DOI: https://www.doi.org/10.1182/blood-2018-11-844530

15. Hong C.W. Сurrent understanding in neutrophil differentiation and heterogeneity. Immune Netw. 2017; 17 (5): 298-306. DOI: https://www.doi.org/10.4110/in.2017.17.5.298

16. Christoffersson G., Phillipson M. The neutrophil: one cell on many missions or many cells with different agendas? Cell Tissue Res. 2018; 371 (3): 415-23. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s00441-017-2780-z

17. Hellebrekers P., Vrisekoop N., Koenderman L. Neutrophil phenotypes in healthand disease. Eur J Clin Invest. 2018; 48 (2): e12943. DOI: https://www.doi.org/10.1111/eci.12943

18. Чудилова Г.А., Нестерова И.В. Фенотипический профиль CD64-CD16+CD32+CD11b+, CD64+CD16+CD32+CD11b+ субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов у здоровых новорожденных, условно-здоровых детей различных возрастных групп и условно-здоровых взрослых субъектов. Российский иммунологический журнал. 2019; 13 (1): 53-61. DOI: https://www.doi.org/10.31857/S10287221000 5021-8

19. Bournazos S., Ravetch J.V. Fcγ receptor pathways during active and passive immunization. Immunological reviews. 2015; 268 (1): 88-103. DOI: https://www.doi.org/10.1111/imr.12343

20. Martyn K.D., Kim M.J., Quinn M.T., Dinauer M.C., Knaus U.G. p21-activated kinase (Pak) regulates NADPH oxidase activation in human neutrophils Blood. 2005; 106 (12): 3962-9. DOI: https://www.doi.org/10.1182/blood-2005-03-0859

21. Brandsma A.M., Schwartz S.L., Wester M J., Valley C.C.,Blezer G.L.A.,Vidarsson B.G., Lidke K.A, Broekediane T.T., Lidke G.S., Leusen E.H.W. Mechanisms of inside-out signaling of the high-affinity IgG receptor FcγRI. Science Signaling. 2018; 11 (540). DOI: https://www.doi.org/10.1126/scisignal.aaq0891

22. Ioan-Facsinay A., de Kimpe S.J., Hellwig S.M., van Lent P.L., Hofhuis F.M., van Ojik H.H., Sedlik C., da Silveira S.A., Gerber J., de Jong Y.F., Roozendaal R., Aarden L.A., van den Berg W.B., Saito T., Mosser D., Amigorena S., Izui S., van Ommen G.J., van Vugt M., van de Winkel J.G., Verbeek J.S. FcgammaRI (CD64) contributes substantially to severity of arthritis, hypersensitivity responses, and protection from bacterial infection. Immunity. 2002; 16 (3): 391-402. DOI: https://www.doi.org/10.1016/s1074-7613(02)00294-7

23. Нестерова И.В., Чудилова Г.А., Русинова Т.В., Павленко В.Н., Юцкевич Я.А., Барова Н.К., Тараканов В.А. Ремоделлинг фенотипа субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов CD64-CD32+CD16+CD11B+Hr CD64+CD32+CD16+CD11b+Hг в созданной de novo экспериментальной модели вирусно-бактериальной инфекции в системе in vitro. Инфекция и иммунитет. 2021;11 (1): 101-10. DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-ROT-1517

24. El-Benna J., Dang P.M.-C., Gougerot-Pocidalo M.-A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin Immunopathol. 2008; 30: 279-89. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s00281-008-0118-3

25. Wang Y., Jönsson F. Expression, role, and regulation of neutrophil Fcγ receptors. Front Immunol. 2019; 10: 1958. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2019.01958

26. Bournazos S., Wang T.T., Ravetch J.V. The role and function of Fcγ receptors on myeloid cells. Microbiol Spectr. 2016; 4 (6): 10.1128/microbiolspec.MCHD-0045-2016. DOI: https://www.doi.org/10.1128/microbiolspec.MCHD-0045-2016

27. Rollet-Labelle E., Gilbert C., Naccache P.H. Modulation of human neutrophil responses to CD32 cross-linking by serine/threonine phosphatase inhibitors: cross-talk between serine/threonine and tyrosine phosphorylation. J Immunol. 2000; 164 (2): 1020-8. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.164.2.1020

28. Coxon A., Cullere X., Knight S., Sethi S., Wakelin M.W., Stavrakis G., Luscinskas F.W., Mayadas T.N. Fc gamma RIII mediates neutrophil recruitment to immune complexes. a mechanism for neutrophil accumulation in immune-mediated inflammation. Immunity. 2001; 14 (6): 693-704. DOI: https://www.doi.org/10.1016/s1074-7613(01)00150-9

29. van Spriel A.B, Leusen J.H., van Egmond M., Dijkman H.B., Assmann K.J., Mayadas T.N., van de Winkel J.G. Mac-1 (CD11b/CD18) is essential for Fc receptor-mediated neutrophil cytotoxicity and immunologic synapse formation. Blood. 2001; 97 (8): 2478-86. DOI: https://www.doi.org/10.1182/blood.v97.8.2478

30. Nimmerjahn F., Ravetch J.V. Fcgamma receptors as regulators of immune responses. Nat Rev Immunol. 2008; 8 (1): 34-47. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nri2206

31. Venkatasubramanian K., Audhya T., Goldstein G. Binding of thymopoietin to the acetylcholine receptor. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986; 83 (10): 3171-4. DOI: https://www.doi.org/10.1073/pnas.83.10.3171

32. Mulcahy M.J., Lester H.A. Granulocytes as models for human protein maker identification following nicotine exposure. J Neurochem. 2017; 142 (2): 151-61. DOI: https://www.doi.org/10.1111/jnc. 14010

33. Serov D., Tikhonova I., Safronova V., Astashev M. Calcium activity in response to nAChR ligands in murine bone marrow granulocytes with different Gr-1 expression. Cell Biol Int. 2021; 45 (7): 1533-45. DOI: https://www.doi.org/10.1002/cbin.11593

34. Liu Z., Zheng X., Wang J., Wang E. Molecular analysis of thymopentin binding to HLA-DR molecules. PLoS One. 2007; 2 (12): e1348. DOI: https://www.doi.org/10.1371/journal.pone.0001348

35. Lauro M.L., D’Ambrosio E. A., Bahnson B.J., Grimes C.L. The molecular recognition of muramyl dipeptide occurs in the leucine-rich repeat domain of Nod2. ACS Infect Dis. 2017; 14; 3 (4): 264-70. DOI: https://www.doi.org/10.1021/acsinfecdis.6b00154

36. Bersch K.L., DeMeester K.E., Zagani R., Chen S., Wodzanowski K.A., Liu S., Mashayekh S., Reinecker H.-C., Grimes C.L. Bacterial peptidoglycan fragments differentially regulate innate immune signaling. ACS Cent Sci. 2021; 7 (4): 688-96. DOI: https://www.doi.org/10.1021/acscentsci.1c00200

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)