Разработка критериев иммобилизации эритроцитов человека фенотипов R1R1 и R2R2 на твердой фазе при определении содержания анти-D-антител IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rho(D) методом иммуноферментного анализа

• Шведова Евгения Владимировна
• Лешина Светлана Анатольевна
• Давыдов Дмитрий Сергеевич
• Борисевич Игорь Владимирович
• Кудашева Эльвира Юрьевна

Резюме

Введение. Содержание анти-D-антител (Ат) IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) оценивают методом прямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием международного стандартного образца (МСО) анти-D-иммуноглобулина, коммерческих реагентов и антигенов (Аг) для приготовления иммуносорбента. Свежеприготовленные и консервированные D-положительные эритроциты I(0) группы крови человека фенотипов R1R1 и R2R2, полученные не менее чем от 3 доноров - это Аг, которые иммобилизуют на твердой фазе в лабораторных условиях. Особенности их распределения на твердой фазе при приготовлении иммуносорбента не изучены, данный этап воспроизведения метода не стандартизован.

Цель исследования - разработать критерии иммобилизации эритроцитов человека фенотипов R1R1 и R2R2 на твердой фазе при определении содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) методом прямого конкурентного ИФА.

Материал и методы. В работе использовали эритроциты доноров I(0) группы крови человека фенотипов R1R1 и R2R2, МСО анти-D-иммуноглобулина, стандартный образец иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-D-Ат IgG, биотинилированные моноклональные анти-D-Ат. Иммуносорбент готовили путем иммобилизации предварительно отмытых и гидролизованных папаином эритроцитов в лунках полистиролового планшета, количественную оценку их распределения на твердой фазе проводили с помощью микроскопии и компьютерной морфометрии. Для установления значений критериев иммобилизации проводили количественную оценку содержания анти-D-Ат IgG в растворах испытуемых образцов с известным содержанием анти-D-Ат IgG методом прямого конкурентного ИФА.

Результаты. Установлено, что эритроциты фенотипов R1R1 и R2R2 распределяются на поверхности твердой фазы неравномерно, со склонностью к агрегации в зависимости от фенотипа. Предложены формулы и рассчитаны площадь равномерного распределения эритроцитов на твердой фазе - относительная площадь (S_отн.), суммарная площадь агрегированных эритроцитов изученных фенотипов (∑S) и коэффициенты их распределения (К_расп.) на твердой фазе. Разработаны критерии иммобилизации Аг на твердой фазе: для эритроцитов фенотипа R1R1 S_отн. должна быть ≥ 88 %, К_расп. - ≤ 0,22; для эритроцитов фенотипа R2R2 S_отн. - ≥ 70 %, К_расп. - ≤ 0,23. Показано, что результаты определения содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) методом прямого конкурентного ИФА соответствуют критериям приемлемости при соблюдении установленных критериев иммобилизации эритроцитов.

Заключение. Разработанные критерии иммобилизации эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 рекомендуется использовать для стандартизации этапа приготовления иммуносорбента при определении содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) методом прямого конкурентного ИФА.

Ключевые слова:иммуноглобулин человека антирезус Rho(D); анти-D-антитела IgG; метод конкурентного ИФА; фенотипы эритроцитов R1R1 и R2R2; иммуносорбент; критерии иммобилизации

Введение

Прямой конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА) - один из методов количественного определения содержания анти-D-антител (Ат) IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) по отношению к международному стандартному образцу (МСО) анти-D-иммуноглобулина (в мкг или международных единицах, МЕ) [1, 2].

Метод основан на конкуренции биотинилированных моноклональных анти-D-Ат с анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) за связывание с антигенами (Аг), иммобилизованными на твердой фазе. Первым этапом воспроизведения метода, от которого зависит правильность и точность получаемых результатов содержания анти-D-Ат IgG в испытуемых препаратах, является приготовление иммуносорбента [3]. В соответствии с монографией Европейской фармакопеи, в качестве Аг для приготовления иммуносорбента рекомендовано использовать D-положительные эритроциты I(0) группы крови человека, полученные не менее чем от 3 доноров, только фенотипа R2R2, что ограничивает доступность метода. Кроме того, отсутствие визуальной и количественной инструментальной оценки распределения эритроцитов в иммуносорбенте не позволяет гарантировать корректность его приготовления, что может привести к получению недостоверных результатов анализа, а также увеличивать трудозатраты и расход дорогостоящих реагентов на следующих этапах постановки метода [4].

В последние годы в зарубежных лабораториях для аттестации МСО анти-D-иммуноглобулина были использованы и D-положительные эритроциты фенотипа R1R1 как наиболее часто встречаемые в популяции европеоидов (40,76 %) в сравнении с эритроцитами фенотипа R2R2 (14,11 %) при условии соблюдения критериев валидации метода [5, 6]. Приготовление иммуносорбента с использованием эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 не стандартизовано, проводится в условиях каждой лаборатории самостоятельно [7, 8]. Таким образом, для стандартизации этапа приготовления иммуносорбента необходимо изучить особенности распределения эритроцитов человека фенотипов R1R1 и R2R2 на твердой фазе и установить критерии их иммобилизации при количественном определении содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) методом конкурентного прямого ИФА.

Цель исследования - разработать критерии иммобилизации эритроцитов человека фенотипов R1R1 и R2R2 на твердой фазе при количественном определении содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) методом конкурентного прямого ИФА.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи: приготовить в условиях лаборатории иммуносорбенты с иммобилизованными D-положительными эритроцитами I(0) группы крови человека фенотипов R1R1 и R2R2, полученными не менее чем от 3 доноров, изучить особенности их распределения на поверхности твердой фазы с помощью микроскопии, компьютерной морфометрии и оценить содержание анти-D-Ат IgG в растворах образцов с известным содержанием анти-D-Ат IgG методом прямого конкурентного ИФА по отношению к МСО.

Материал и методы

Исследование проводили с использованием пулов консервированных D-положительных эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 (ID-DiaCell I-II-III 5 %, ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России) и свежеприготовленных на станции переливания крови (ОБУЗ "Брянская станция переливания крови", Россия); 3-го МСО анти-D-иммуноглобулина с активностью 297 МЕ/ампула (16/332, NIBSC, Великобритания); стандартного образца (СО) иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-D-Ат IgG (Y0000540, EDQM, Франция); растворов МСО анти-D-Ат IgG (30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/мл), приготовленных последовательным двукратным разведением из МСО; растворов испытуемых образцов с известным содержанием анти-D-Ат IgG (30; 15; 7,5; 3,75; 1,88 МЕ/мл), приготовленных добавлением раствора МСО в раствор СО иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-D-Ат IgG; раствора биотинилированных моноклональных анти-D-Ат (BRAD-5, 02/230, NIBSC, Великобритания); твердой фазы - полиcтироловых прозрачных 96-луночных микропланшетов с максимальной сорбционной емкостью (650 нг белка/см²) (MaxiSorp, Nunc, кат. № 44-2404-21, США); фосфатного буферного раствора (ФБР) (Sigma Aldrich, кат. № 806544, США); авидина/стрептавидина, конъюгированного с щелочной фосфатазой (Sigma Aldrich, кат. № Е2636, США); субстрата паранитрофенилфосфата (Sigma Aldrich, кат. № 7653, США); бычьего сывороточного альбумина (БСА) (Sigma Aldrich, кат. № А7030, США); папаина (Sigma Aldrich, кат. № P3375, США); раствора глютаральдегида (Sigma Aldrich, кат. № G5882, США); натрия гидроксида (Merck, кат. № 106469, США); глюкозы (Sigma Aldrich, кат. № G7528, США); натрия цитрата (Sigma Aldrich, кат. № S4641, США); натрия ЭДТА (Sigma Aldrich, кат. № Е4884, США); кислоты борной (Merck, кат. № 1.00165, США).

Иммуносорбент готовили следующим образом. Отбирали по 3 мл эритроцитов каждого фенотипа в 2 отдельные пробирки. Проводили процедуру отмывания эритроцитов добавлением 10 мл ФБР (рН 7,4) в пробирку с последующим центрифугированием при 1200 g в течение 3 мин и удалением супернатанта. Процедуру отмывания повторяли 3 раза. Отмытые эритроциты подвергали гидролизу добавлением в отношении 1 : 1 10 % раствора папаина в ФБР (рН 5,4) и инкубированием в течение 10 мин при температуре 37 °С. Затем эритроциты отмывали, как описано выше. Далее готовили 0,2 % суспензию эритроцитов в ФБР (рН 7,0), содержащем глюкозу (0,18 %), натрия цитрат (0,1 %), натрий ЭДТА (0,07 %) и борную кислоту (0,01 %). Вносили по 50 мкл суспензии эритроцитов в лунки микропланшетов и центрифугировали при 120 g в течение 3 мин при температуре 4 °С. Затем вносили в каждую лунку 100 мкл 0,05 % раствор глютаральдегида в ФБР (рН 7,4), выдерживали 10 мин и удаляли. Лунки планшетов промывали 3 раза добавлением 300 мкл ФБР (рН 7,4) в каждую лунку.

Блокирование неспецифических центров связывания. Вносили в лунки иммуносорбента 250 мкл 2 % раствора БСА в ФБР (рН 7,4) и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, по истечении времени раствор удаляли.

Внесение разведений испытуемых и стандартного образцов. Вносили по 25 мкл разведений растворов стандартного и испытуемых образцов. К каждому разведению добавляли в отношении 1 : 1 биотинилированные моноклональные анти-D-Ат. Все образцы вносились в 3 повторностях. После инкубации в течение 1 ч при температуре 37 °C образовавшийся иммунный комплекс Аг-Ат отмывали ФБР (рН 7,4) 3 раза от несвязавшихся Ат.

Инкубацию с конъюгатом проводили в течение 30 мин при температуре 24 °C после добавления в лунки иммуносорбента 50 мкл авидина/стрептавидина, конъюгированного с щелочной фосфатазой. После инкубации раствор удаляли и лунки промывали ФБР (рН 7,4) 3 раза.

Инкубацию с субстратом проводили в течение 10 мин в темном месте после добавления в лунки 100 мкл паранитрофенил фосфата. Реакцию останавливали внесением 50 мкл 3М раствора натрия гидроксида.

Учет результатов. Связавшиеся комплексы Аг-Ат детектировали при длине волны 405 нм. Расчеты проводили при построении калибровочного графика зависимости оптической плотности (ОП, относительные единицы, ОЕ) от концентрации растворов МСО (логарифм значений содержания анти-D-Ат IgG). Содержание анти-D-Ат IgG (МЕ/мл) в испытуемых образцах определяли по формулам (1-3):

где С_i - содержание анти-D-Ат IgG, при одном определении, МЕ/мл; А, В - коэффициенты уравнения линейной регрессии калибровочного графика; С_ст. - содержание анти-D-Ат IgG в растворе МСО, МЕ/мл; ОПи - оптическая плотность испытуемого образца, ОЕ; К - коэффициент разведения; С_изм. - среднее значение содержания анти-D-Ат IgG, рассчитанное по 3 определениям, МЕ/мл, n - количество определений.

Для оценки правильности рассчитывали величину степени извлечения R (%) по формуле (4):

где С_изм. - среднее значение содержания анти-D-Ат IgG в испытуемом образце, рассчитанное по 3 определениям, МЕ/мл; С_стеор. - за теоретическое значение принимали количество анти-D-Ат IgG в МСО, добавленных в раствор СО иммуноглобулина человека нормального, не содержащего анти-D-Ат IgG.

Критерии приемлемости результатов: 1) относительные значения содержания анти-D-Ат IgG в испытуемом образце - в интервале от 80 до 120 % (± 20 %) от установленного (номинального) значения (С_теор.); 2) коэффициент аппроксимации (R²) - ≥ 0,9; 3) коэффициент вариации (СV, %) 3 значений ОП, ОЕ для каждой концентрации не должен был превышать 20 % [9-11].

Оценку распределения эритроцитов на твердой фазе проводили с помощью микроскопии и компьютерной морфометрии. Цифровые снимки лунок микропланшетов получали при увеличении в 100 раз на базе микроскопа Axio Scope A1 с использованием цифровой фотокамеры и прикладного компьютерного обеспечения. Количественные морфометрические измерения проводили с помощью обработки цифровых фотоснимков с использованием лицензионной аналитической программы 3D Image-Pro Premier MediaCybernetics. Площадь с иммобилизованными эритроцитами и их агрегацию оценивали методом автоматической оценки абсолютной и относительной площади соответствующего цветового спектра по отношению к заданной при настройках пространственной калибровки общей площади снимка.

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics версии 20 и надстройки "Пакет анализа" Microsoft Excel 2016. Определение соответствия значений выборки нормальному распределению проводили с применением критерия Шапиро-Уилка и коэффициента аппроксимации линейной зависимости при сортировке значений выборки. Значимость различий данных оценивали с помощью t-критерия Стьюдента и U-критерия Манна-Уитни для независимых выборок.

Результаты

На микрофотографиях иммуносорбентов видно, что эритроциты фенотипа R1R1 распределялись неравномерно, в форме агрегатов разной величины и плотности, выявлялись зоны с отсутствием покрытия (рис. 1). Эритроциты фенотипа R2R2 образовывали более равномерный слой на поверхности твердой фазы (рис. 2).

Рис. 1. Микрофотография эритроцитов фенотипа R1R1

Рис. 2. Микрофотография эритроцитов фенотипа R2R2

На пространственных морфометрических изображениях иммуносорбентов площадь агрегированных эритроцитов фенотипа R1R1 (рис. 3) занимала бóльшую часть поверхности твердой фазы (пики желтого и красного цвета). Площадь равномерного распределения эритроцитов фенотипа R2R2 (рис. 4) составляла практически всю ее поверхность (пики зеленого цвета).

Рис. 3. Пространственное морфометрическое изображение эритроцитов фенотипа R1R1

Рис. 4. Пространственное морфометрическое изображение эритроцитов фенотипа R2R2

На рис. 5 площадь равномерного распределения (пик 3) эритроцитов изученных фенотипов составляла для эритроцитов фенотипа R1R1 - 234,00 ± 3,94 пикселей (пикс.), для эритроцитов фенотипа R2R2 - 191,9 ± 12,16 пикс. Относительная площадь (S_отн., %), рассчитанная отношением значения (S3_, пикс.), к общей аналитической площади (S_общ. = 255 пикс.) по формуле (5) составляла для эритроцитов фенотипа R1R1 - 91,8 ± 3,6 % , для эритроцитов фенотипа R2R2 - 76,5 ± 7,5 %.

Рис. 5. Интенсивность распределения эритроцитов человека на твердой фазе

А - эритроциты фенотипа R1R1; Б - эритроциты фенотипа R2R2. По оси ординат - интенсивность распределения эритроцитов (пикс.); ось абсцисс - общая аналитическая площадь (пикс.); 1, 2, 3 - пики интенсивности распределения эритроцитов.

Коэффициенты распределения (К_расп.), характеризующие агрегацию эритроцитов изученных фенотипов на твердой фазе, рассчитанные как отношение значения суммы площадей пиков S2 и S1 к суммарному значению площадей всех пиков ∑S по формуле (6) составляли 0,218-0,221 для фенотипа R1R1 и 0,229-0,231 для фенотипа R2R2 (табл. 1).

Таблица 1. Площадь пиков распределения эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 на поверхности твердой фазы

На основе анализа сопряженных экспериментальных данных, полученных при количественной оценке распределения эритроцитов в приготовленном с использованием эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 иммуносорбенте, и результатов количественного определения анти-D-Aт IgG методом ИФА по отношению к МСО было установлено, что содержание анти-D-Ат IgG в растворах испытуемых образцов с известным содержанием анти-D-Ат IgG различались между собой незначительно [(U_факт > U_крит), p = 0,01] и соответствовали критерию приемлемости (± 20%). При этом относительная площадь распределения эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 составляла 91,8 ± 3,6 и 76,5 ± 7,5 %, коэффициент распределения эритроцитов - 0,219 ± 0,001 и 0,229 ± 0,0014 соответственно (табл. 2).

Таблица 2. Результаты оценки содержания анти-D-Ат IgG в растворах испытуемых образцов с использованием эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2

При этом графики зависимости значений ОП от содержания анти-D-Ат IgG в растворах МСО характеризовались линейностью, коэффициенты детерминации линейной регрессии (R²) были ≥ 0,9, величина относительного стандартного отклонения (СV, %) значений ОП не превышала 15 % и соответствовала установленным критериям приемлемости результатов (≤ 20 %), что подтверждало наличие линейной зависимости в аналитическом диапазоне от 1,88 до 30 МЕ/мл содержания анти-D-Ат IgG (рис. 6).

Рис. 6. Оценка линейности аналитического диапазона

Обсуждение

Основными этапами прямого конкурентного ИФА при определении содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) являются приготовление иммуносорбента, блокирование неспецифических центров связывания, внесение разведений испытуемых и стандартных образцов, инкубация с конъюгатом, субстратом и учет полученных результатов.

Для изучения особенностей распределения Аг эритроцитов на твердой фазе и разработки критериев их иммобилизации готовили иммуносорбенты в лабораторных условиях с использованием пулов D-положительных эритроцитов I(0) группы крови человека фенотипов R1R1 и R2R2, полученных не менее чем от 3 доноров.

С помощью микроскопии было установлено, что в приготовленном иммуносорбенте эритроциты фенотипа R2R2 распределялись на поверхности твердой фазы более равномерно, в отличие от эритроцитов фенотипа R1R1, которые проявляли склонность к агрегации. Указанные особенности подтверждались и при изучении пространственных морфометрических изображений, на которых интенсивно окрашиваются зоны агрегации эритроцитов фенотипа R1R1. Проведенные микроскопические исследования не позволяли нам провести количественную оценку распределения эритроцитов в приготовленном иммуносорбенте в связи с субъективностью метода.

Для количественной оценки распределения эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 на поверхности твердой фазы был проведен морфометрический анализ с построением гистограмм. Была рассчитана относительная площадь (S_отн., %) равномерного распределения эритроцитов, выраженная в процентах по отношению к общей аналитической площади твердой фазы, суммарная площадь агрегированных эритроцитов изученных фенотипов (∑S), а также коэффициент их распределения (К_расп.), характеризующий плотность слоя, образованного агрегированными эритроцитами. Полученные значения использовали для установления критериев иммобилизации эритроцитов при определении содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) методом ИФА.

Далее проводили количественное определение содержания анти-D-Ат IgG в растворах испытуемых образцов с известным содержанием анти-D-Ат IgG методом прямого конкурентного ИФА по отношению к МСО с использованием эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2 для приготовления иммуносорбента. Установлено, что средние значения содержания анти-D-Ат IgG в испытуемых образцах отличались незначительно (U_факт > U_крит, p = 0,01) и отвечали критериям приемлемости (± 20 % от номинального значения) при следующих критериях иммобилизации:

· для эритроцитов фенотипа R1R1 S_отн. ≥ 88 %, К_расп. - ≤ 0,22;

· для эритроцитов фенотипа R2R2 S_отн. ≥ 70 %, К_расп. - ≤ 0,23.

Заключение

Таким образом, в результате проведенных исследований изучены особенности распределения эритроцитов, используемых в качестве Аг для иммобилизации на твердой фазе при приготовлении иммуносорбента, предложены формулы и рассчитаны относительная площадь (S_отн.) равномерного распределения эритроцитов фенотипов R1R1 и R2R2, суммарная площадь агрегированных эритроцитов изученных фенотипов (∑S) и коэффициент их распределения (К_расп.).

Разработанные критерии иммобилизации эритроцитов изученных фенотипов могут быть использованы специалистами для оценки корректности приготовления иммуносорбента в лабораторных условиях при определении содержания анти-D-Ат IgG в препаратах иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D) методом конкурентного прямого ИФА.

Литература

1. Trope S.J., Sands D., Rautmann G. International collaborative study to evaluate methods for quantification of anti-D in immunoglobulin preparations. Vox Sang. 2002; 83: 42-9. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1423-0410.2002.00169.x

2. Шведова Е.В., Кудашева Э.Ю., Климов В.И. Методы оценки специфической активности препаратов иммуноглобулина человека антирезус Rh_o(D): современное состояние проблемы. Иммунология. 2020; 41 (3): 256-1. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-3-256-261

3. Иванская Н.В., Кислых Е.Н., Максименок Е.В., Раевская Г.Е., Пилипенко В.Г. Практическое пособие по иммуноферментному анализу. URL: http://diaproph.com.ua/pdf/metodichky/rus/1_rus_imunoferment_analiz.pdf

4. Assay of Human Anti-D Immunoglobulin: European Pharmacopoeia. 10^th ed. Strasboung : Directorate for the Quality of Medicines of the Council of Europe, 2020.

5. WHO/BS/2018.2332 International collaborative study to calibrate proposed 3rd WHO International standard for anti-D Immunoglobulin. WHO Expert Committee on Biological Standardization, 2018. URL: https://www.who.int/biologicals/BS.2018.2332_3rd_IS_ANTI-D.pdf

6. Донсков С.И. Экспрессия антигена D. В кн.: Группы крови человека : руководство по иммуносерологии. Москва : Скороходов В.А., 2011: 1016 с.

7. Llopis F., Carbonell-Uberos F., Planelles M.D., Montero M., Plasencia I., Carillo C. A new microplate red blood cell monolayer technique for screening and identifying red blood cell antibodies. Vox Sang. 1996; 70: 152-6. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1423-0410.1996.tb01314.x

8. Thorpe S.J., Turner C.E., Heath A.C., Sands D. A competitive enzyme-linked immunoassay using erythrocytes fixed to microtitre plates for anti-D quantitation in immunoglobulin products. Vox Sang. 2000; 79: 100-7. DOI: https://doi.org/10.1159/000031220

9. Руководства ICH для фармацевтической отрасли. Качество. Береговых В.В. (ред.). Санкт-Петербург : Профессия, 2017: 768 с.

10. Bioanalytical method validation guidance for industry. U.S. Biopharmaceutics, May 2018. URL: http://www.fda.gov/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/default.htm

11. Супотницкий М.В., Елапов А.А., Борисевич И.В., Кудашева Э.Ю., Климов В.И., Лебединская Е.В., Корсун Л.В., Горбунова Е.В., Слободян В.Г., Меркулов В.А., Олефир Ю.В. Препараты крови человека и животных в аспекте показателей качества, эффективности и безопасности. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2015; (3): 33-48.