Эффекты взаимодействия циркулирующих CD4+CСR6+-Т-клеток с В-лимфоцитами

Резюме

Введение. Хемокиновый рецептор CСR6 экспрессируется на части зрелых циркулирующих CD4+CD45RO+-Т-лимфоцитов и дает им потенциальную возможность мигрировать в пейеровы бляшки, воспаленную слизистую желудочно-кишечного тракта и кожу. В группу CD4+CD45RO+CCR6+-Т-лимфоцитов крови входят клетки с различными функциями, в частности провоспалительные Т-хелперы-17 (Th17) и Th1, а также противовоспалительные регуляторные FoxP3+-Т-клетки. Кроме того, в эту группу лимфоцитов входит небольшое количество клеток с фенотипом фолликулярных Т-хелперов (фTh) - профессиональных стимуляторов гуморального иммунного ответа.

Цель исследования - оценить способность CD4+CСR6+-Т-клеток крови оказывать помощь В-лимфоцитам, а также ответную реакцию субпопуляций Th на взаимодействие с В-клетками.

Материал и методы. Выделяли общий пул CD4+-Т-клеток, CD4+CD45RO+CCR6+-Т-клетки или наивные Тh (нTh) из крови взрослых здоровых доноров, культивировали их с аллогенными В-лимфоцитами и оценивали продукцию иммуноглобулинов и реакцию Т-клеток.

Результаты. Показано, что зрелые CD4+CСR6+-Т-клетки стимулируют продукцию IgM и IgG в смешанной культуре Т- и В-лимфоцитов сильнее, чем общий пул CD4+-Т-клеток или нTh. Взаимодействие CD4+CСR6+-Т-клеток с В-лимфоцитами приводит к экспансии Th17 и Th1/Th17 в культуре без заметного прироста количества Th1 и фTh. В то же время нTh или неразделенные CD4+-Т-клетки, активированные контактом с аллогенными В-лимфоцитами, преимущественно дифференцируются в фTh-подобные клетки.

Заключение. CD4+CСR6+-Т-клетки эффективно оказывают помощь В-лимфоцитам, что сопровождается экспансией Th17 и Th1/Th17, но не Th1 и фTh.

Ключевые слова:иммунный ответ; фолликулярные Т-хелперы; Т-хелперы-17; В-клетки; продукция антител

Для цитирования: Талаев В.Ю., Воронина Е.В., Светлова М.В., Заиченко И.Е., Бабайкина О.Н. Эффекты взаимодействия циркулирующих CD4+CСR6+-Т-клеток с В-лимфоцитами. Иммунология. 2022; 43 (3): 266-276. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-3-266-276

Финансирование. Исследование поддержано РФФИ, проект № 18-015-00028.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Дизайн исследования, написание статьи - Талаев В.Ю.; очистка, культивирование и окраска клеток - Воронина Е.В.; очистка клеток, проточная цитометрия - Светлова М.В.; культивирование и окраска клеток, ИФА - Заиченко И.Е.; культивирование клеток, ИФА - Бабайкина О.Н.

Введение

CD4+CСR6+-клетки крови - это относительно малочисленная группа зрелых CD45RO+-Т-лимфоцитов, объединенных способностью к направленной миграции в пейеровы бляшки, воспаленную слизистую желудка и кишечника, а также в кожу. Такое направление миграции определяется продукцией в этих тканях хемокина CCL20 - лиганда рецептора CCR6 [1-4]. В функциональном отношении CD4+CСR6+-Т-лимфоциты крови являются гетерогенной группой и состоят из представителей различных субпопуляций. Из клеток с провоспалительными свойствами в состав CD4+CСR6+-Т-лимфоцитов входят практически все циркулирующие Th17, часть циркулирующих Th1, а также Th1/Th17 [5, 6], которые демонстрируют смешанные свойства двух первых субпопуляций: экспрессируют мастер-регулятор созревания Th17 ядерный фактор RORγt, хемокиновый рецептор CCR6 и ключевой Th17-цитокин интерлейкин-17А (ИЛ-17А) одновременно с мастер-регулятором Th1 T-bet, хемокиновым рецептором CXCR3 и ключевым Th1-цитокином интерфероном-γ (ИФН-γ) [7]. Также в состав CD4+CСR6+-Т-лимфоцитов входит часть циркулирующих зрелых регуляторных FoxP3+-Т-клеток (Трег), отвечающих за подавление иммунного ответа и воспаления [8]. Кроме того, малая часть CD4+CD45RO+CСR6+-Т-лимфоцитов крови в норме экспрессирует рецептор CXCR5, причем при гастрите и язвенной болезни, ассоциированной с Helicobacter pylori, доля CXCR5+-клеток в этой группе лимфоцитов увеличивается [9]. Экспрессия рецептора CXCR5 характерна для фолликулярных Th-клеток (фТh) и обеспечивает локализацию этих Т-хелперов в В-клеточных зонах лимфоидных органов, где продуцируется лиганд рецептора CXCR5 - хемокин CXCL13. Как известно, фТh являются профессиональными стимуляторами гуморального иммунного ответа. Они участвуют в формировании зародышевых центров фолликулов, поддерживают пролиферацию распознавших антиген В-лимфоцитов и защищают их от апоптоза, управляют дифференцировкой В-клеток в долгоживущие плазмациты и В-клетки иммунной памяти, а также стимулируют переключение изотипов антител и созревание их аффинитета [10-14]. Следует отметить, что определенную помощь В-лимфоцитам могут оказывать не только общеизвестные стимуляторы гуморального ответа, такие как фТh и Th2, но и другие CD4+-Т-клетки. Так, классические стимуляторы клеточного иммунного ответа Th1 могут усиливать продукцию IgM, IgA, IgG1, IgG2 и IgG3 человека [15], хотя повышенная активность Th1 ведет к угнетению гуморального иммунного ответа и даже к гибели В-лимфоцитов [16]. Созревающие в слизистой FoxP3+-Трег могут стимулировать локальную продукцию IgA, угнетая при этом продукцию IgG [17-19]. Наконец Th17 могут стимулировать синтез IgM, IgG и IgA [20] и продуцировать ИЛ-21, который также является ключевым цитокином фТh [13]. К тому же Th17 демонстрируют выраженную пластичность: в различных условиях они могут частично или полностью утрачивать свои свойства и превращаться в Th1/Th17, Th1, Трег [7, 21, 22] и фТh [23]. Так, в модели на мышах с мечеными Th17, у которых ген флуоресцентного белка YFP экспрессируется одновременно с геном Il17A, показано, что Th17, мигрировавшие в пейеровы бляшки кишечника, могут приобретать фенотип фТh, причем деплеция Th17 подавляет продукцию IgA в ответ на поступающий из кишечника антиген [23]. В модели Th17-индуцированного экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита Th17 в оболочках мозга в условиях тесного контакта с В-лимфоцитами экспрессируют Bcl-6 - ключевой ядерный фактор фТh, и стимулируют формирование эктопической лимфоидной ткани, приобретение В-клетками фолликулярного фенотипа и переключение изотипов антител [24]. В данной работе мы оценили способность CD4+CD45RO+CСR6+-Т-клеток крови оказывать помощь В-лимфоцитам и попытались идентифицировать вовлеченные в этот процесс субпопуляции CСR6+-Т-хелперов. Показано, что циркулирующие CD4+CD45RO+CСR6+-Т-клетки стимулируют продукцию антител в аллогенной смешанной культуре Т- и В-лимфоцитов сильнее, чем наивные Т-хелперы или неразделенные циркулирующие CD4+-Т-клетки, причем взаимодействие зрелых CD4+CСR6+-Т-клеток с В-лимфоцитами приводит к экспансии Th17 и Th1/Th17 в культуре без заметного прироста уровня Bcl-6 и количества клеток с фенотипом фТh.

Материал и методы

Характеристика доноров. В исследовании в качестве доноров периферической (венозной) крови приняли участие 25 здоровых добровольцев от 25 до 58 лет. Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (протокол № 1 от 12 февраля 2020 г.) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого". Письменное информированное согласие было получено от каждого донора перед забором крови.

Магнитная сепарация. Мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) выделяли из гепаринизированной крови доноров центрифугированием над слоем Диаколл-1077 (ДиаМ, Россия). Общий пул CD4+-T-клеток, нTh и B-клетки выделяли из МНПК магнитной сепарацией с негативной селекцией, используя наборы EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit, EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Isolation Kit и EasySep Human B Cell Enrichment Kit (StemCell Technologies, Канада), в соответствии с инструкциями производителя. CD4+CCR6+-Т-клетки выделяли из общего пула очищенных CD4+-T-лимфоцитов магнитной сепарацией с позитивной селекцией, используя отдельные реагенты из набора EasySep Human Th17 Cell Enrichment Kit (StemCell Technologies, Канада), как описано ранее [6]. Для этого CD4+-T-клетки в изотоническом фосфатном солевом буфере (PBS) с 2 % инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (PAA Laboratories, Австрия) и 1 мM этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) инкубировали 5 мин при комнатной температуре с EasySep Human CCR6+ Positive Selection Cocktail II (StemCell Technologies, Канада), способным связывать CCR6 с магнитными бусами. Затем к клеткам добавляли магнитные бусы EasySep Releasable RapidSpheres (StemCell Technologies, Канада) и инкубировали 5 мин. Объем суспензии доводили до 2,5 мл и отделяли связавшиеся с бусами клетки на магните EasySep (StemCell Technologies, Канада). Ресуспендировали полученные клетки в PBS с 2 % ЭТС и 1 мM ЭДТА и вновь разделяли на магните для избавления от остатков CCR6--клеток. Затем отделяли магнитные бусы от поверхности клеток с помощью EasySep Release Buffer (StemCell Technologies, Канада) и удаляли свободные бусы с помощью магнита. Полученные клетки дважды отмывали и ресуспендировали в среде RPMI-1640 (Gibco, Великобритания) с 10 % ЭТС. Чистоту клеток оценивали с помощью лазерной проточной цитометрии (см. ниже).

Смешанные культуры Т- и В-клеток. CD4+-T-клетки, нTh или CD4+CCR6+-T-клетки высевали с аллогенными B-лимфоцитами в 96-луночные круглодонные планшеты (Costar, США) в среде RPMI-1640 с 10 % ЭТС. Кроме того, высевали контрольные монокультуры всех используемых клеток. B-клетки высевали по 2,5 - 105 клеток на лунку, T-клетки - по 5 - 104 клеток на лунку. Конечный объем во всех лунках составлял 200 мкл. Культуры инкубировали 5 сут при 37 °C и 5 % CO2. Затем клетки из культур собирали для анализа фенотипа с помощью лазерной проточной цитометрии. Среду из культур также собирали и оценивали в ней концентрацию общего IgG и IgM с помощью наборов "IgG общий-ИФА-БЕСТ" и "IgM общий-ИФА-БЕСТ" (Вектор-Бест, Россия) в соответствии с инструкциями производителя.

Фенотипический анализ. Для контроля эффективности магнитной сепарации аликвоты свежевыделенных Т-клеток ресуспендировали в PBS с 0,09 % NaN3 и окрашивали флуоресцентно меченными моноклональными антителами (МкАт) к молекулам CD4 (клон ЛТ4, Сорбент, Россия), CD45RO (UCHL1, BioLegend, США), CD196/CCR6 (R6H1, eBioscience, США) или CD45RA (2H4-RD1, Beckman Coulter, США) в течение 20 мин при 4 °C. Очищенные В-клетки в аналогичных условиях окрашивали МкАт к молекулам CD45 и CD19 (SJ25C1, BD Biosciences, США). Затем клетки отмывали, фиксировали в 1 % растворе параформальдегида (Sigma, США) и анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCalibur (BD Biosciences, США), гейтируя лимфоциты по показателям прямого и бокового светорассеивания (FSC/SSC).

Клетки из смешанных и контрольных культур отмывали, ресуспендировали в PBS с 0,09 % NaN3 и окрашивали МкАт к молекулам CD4 (ЛТ4, Сорбент, Россия), CD45RO (UCHL1, BioLegend, США), CD185/CXCR5 (MU5UBEE, eBioscience, США), CD197/CCR7 (3D12, eBioscience, USA). В отдельных экспериментах также использовались МкАт к молекулам CD278/ICOS, CD279/PD-1 и CD134/OX-40 (eBioscience, США). Для оценки экспрессии ядерного фактора Bcl-6 клетки окрашивали МкАт к CD4 и CXCR5, фиксировали и пермеабилизировали с помощью набора FoxP3 Fixation Permeabilization Kit (eBioscience, США) в соответствии с инструкциями производителя и, затем, окрашивали МкАт к Bcl-6 (BCL-UP, eBioscience, США). Анализ проводили на проточных цитофлуориметрах FACSCalibur или FACSCanto II (BD Biosciences, США). Клетки последовательно выделяли в общий гейт лимфоцитов и лимфобластов, в гейт CD4+-клеток, а затем разделяли клетки этого гейта на малые лимфоциты и лимфобласты. Квадранты для каждого типа гейтированных клеток устанавливали по контролям окрашивания, допуская присутствие ≤ 0,35 % клеток в любом квадранте, соответствующем отсутствующему в контроле антителу.

Оценка внутриклеточных цитокинов. В 5-суточные смешанные культуры Т- и В-клеток и в контрольные монокультуры Т-клеток вносили по 25 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетата (ФМА) (Serva, Германия), 1 мкг/мл иономицина (Sigma, США) и 5 мкг/мл брефелдина А (BioLegend, США). Культуры инкубировали 4 ч при 37 °C и 5 % CO2, затем клетки собирали, отмывали и окрашивали МкАт к СD4 (ЛТ4, Сорбент, Россия) и CD19 (HIB19, eBioscience, США). После этого клетки фиксировали в 200 мкл 4 % параформальдегида, отмывали 0,1 % раствором сапонина (Sigma, США), ресуспендировали в 100 мкл 0,1 % сапонина и окрашивали МкАт к ИФН-γ (4S.B3, eBioscience, США) и ИЛ-17A (eBio64DEC17, eBioscience, США). Анализ проводили на проточном цитофлуориметре FACSCalibur, оценивая количество ИФН-γ+- и ИЛ-17A+-клеток в гейте CD4+CD19--клеток.

Статистический анализ. Вариационные ряды проверяли на соответствие нормальному распределению и проводили анализ с помощью зависимого t-теста Стьюдента для парных образцов. При множественном сравнении использовали поправку Бонферрони. Данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего.

Результаты

Взаимодействие Т- и В-клеток исследовали в смешанных культурах, состоящих из В-лимфоцитов и различных групп Т-лимфоцитов, выделенных из крови взрослых здоровых доноров. Для засева культур использовали общий пул CD4+-T-клеток (рис. 1А), CD4+СD45RA+CD45RO- наивные Т-лимфоциты (рис. 1Б) и CD19+-В-лимфоциты (рис. 1Г) с чистотой > 95 %. Кроме того, из состава CD4+-Т-лимфоцитов выделяли группу CCR6+-клеток. Поскольку выраженной экспрессией CCR6 обладают исключительно зрелые Т-клетки, конечный продукт сепарации содержал зрелые CD4+CD45RO+CСR6+-лимфоциты с чистотой > 90 % (рис. 1В).

Рис. 1. Репрезентативные результаты контроля чистоты клеток, выделенных магнитной сепарацией

А - CD4+-Т-клетки; Б - нTh; В - CD4+CCR6+-Т-клетки; Г - В-клетки. Указана доля целевых групп от общего количества клеток.

Для оценки хелперной активности Т-клеток по отношению к В-лимфоцитам определяли общее содержание IgM и IgG в среде 5-суточных смешанных культур и сравнивали с концентрацией иммуноглобулинов в контрольных монокультурах В-лимфоцитов. Показано, что все использованные группы CD4+-Т-клеток эффективно усиливают продукцию IgM и IgG, однако наибольшее усиление продукции антител этих изотипов наблюдалось в смешанных культурах с CD4+CСR6+-Т-клетками (рис. 2).

Рис. 2. Концентрация IgM и IgG в среде культур CD4+-Т-клеток и В-лимфоцитов и кратность увеличения концентрации IgM или IgG в смешанных культурах Т- и В-лимфоцитов по сравнению с контрольными монокультурами В-клеток (индекс стимуляции - ИС)

Для засева смешанных культур использовали нTh (n = 6), общий пул CD4+-T-клеток (все Th, n = 19), а также зрелые CD4+CCR6+-T-клетки (CCR6+-Th, n = 19), полученные из тех же проб крови, что и общий пул CD4+-T-клеток. * - p < 0,03; ** - p < 0,01; *** - p < 0,0002 при сравнении действия CD4+CCR6+-T-клеток и неразделенных CD4+-T-клеток в парном t-тесте.

Для оценки вовлечения отдельных субпопуляций CСR6+-Т-хелперов в процесс взаимодействия с В-лимфоцитами мы оценили изменения содержания отдельных групп Т-клеток в смешанной культуре CD4+CСR6+-Т-клеток и В-лимфоцитов и сравнили с изменениями состава смешанных культур В-лимфоцитов с нTh или с общим пулом CD4+-T-клеток. Показано, что совместное культивирование Т- и В-клеток вызывало трансформацию существенной части лимфоцитов в крупные бластные клетки, практически отсутствующие в контрольных монокультурах (рис. 3А).

Рис. 3. Бласттрансформация Т-клеток при взаимодействии с В-лимфоцитами

А - схема гейтирования малых лимфоцитов (гейт Р1) и лимфобластов (гейт Р2); Р9 - общий гейт лимфоцитов и лимфобластов. Клетки из монокультуры CD4+CCR6+-Т-клеток (верхний график) и из смешанной культуры CD4+CCR6+-Т- и В-клеток (нижний график); Б - доля CD4+-лимфобластов от всех CD4+-клеток в культурах нTh, общего пула CD4+-T-клеток (все Th) и зрелых CD4+CCR6+T-клеток (CCR6+-Th), которые росли в монокультуре (Т без В), или в смешанной культуре с B-клетками (T с B); В - доля зрелых CD45RO+-клеток среди CD4+ малых лимфоцитов и CD4+-лимфобластов в тех же культурах. Тип Т-клеток, использованных для засева культур, обозначен под графиками; тип анализируемых клеток - в легенде. * - p<0,05; ** - p<0,001 в парном t-тесте с поправкой Бонферрони.

Анализ фенотипа лимфобластов показал, что в реакцию бласттрансформации в смешанных культурах с любыми группами Т-хелперов были вовлечены как CD19+-В-клетки (данные не приведены), так и CD4+-Т-клетки (рис. 3Б). Исходя из опыта предшествующих работ [25], мы предположили, что в 5-суточной культуре практически все Т-клетки, вовлеченные в процесс активации и созревания, будут иметь увеличенный размер и при цитометрическом анализе окажутся в гейте лимфобластов. Оценка экспрессии маркера зрелых Т-клеток CD45RO в смешанных культурах с нTh и с общим пулом CD4+-T-клеток подтвердила это предположение. Наиболее ярко связь бласттрансформации и фенотипического созревания проявлялась в культурах с нTh. В момент засева культур практически все эти незрелые клетки были лишены CD45RO (рис. 1Б) и не изменяли своего фенотипа в контрольных монокультурах в течение 5 сут культивирования (рис. 3В). В смешанных культурах большинство не вступивших в реакцию и, соответственно, оставшихся незрелыми клеток оказались локализованы в гейте малых лимфоцитов, а практически все созревшие CD45RO+-клетки оказались в гейте Т-лимфобластов. В смешанных культурах с общим пулом CD4+-T-клеток (исходно включающим существенную часть зрелых клеток) различия были менее выражены, но достоверный прирост экспрессии CD45RO также наблюдался лишь среди Т-лимфобластов в смешанных культурах (рис. 3В). Таким образом, Т-клетки, созревающие в этих смешанных культурах, при проточной цитометрии локализуются в гейте лимфобластов, тогда как степень зрелости малых лимфоцитов остается близкой к исходной. По-видимому, малые лимфоциты смешанных культур являются клетками, которые не смогли распознать аллельные варианты антигенов В-лимфоцитов своими Т-клеточными рецепторами и вступить в процесс активации и созревания. В связи с этим индуцированные В-клетками изменения мы искали в гейте Т-лимфобластов, тогда как малые Т-лимфоциты в смешанных культурах с нTh или с общим пулом CD4+-T-клеток рассматривались нами как своеобразный внутренний отрицательный контроль в дополнение к монокультуре Т-клеток.

При использовании зрелых CCR6+-Т-хелперов установить прирост степени зрелости было невозможно (рис. 3В), поскольку до засева все эти клетки уже были зрелыми (рис. 1В). В экспериментах с этими культурами поиск изменений проводился как в гейте малых лимфоцитов, так и в гейте лимфобластов (при анализе содержания фТh) или в общем гейте лимфоцитов и лимфобластов (при определении содержания продуцентов цитокинов).

Анализ экспрессии хемокиновых рецепторов на Т-лимфоцитах показал, что в смешанных культурах нTh с В-лимфоцитами малые Т-лимфоциты сохраняют фенотип незрелых Т-клеток CCR7+CXCR5-, тогда как Т-лимфобласты преимущественно приобретают фенотип CCR7-CXCR5+, характерный для фТh (рис. 4А). Меньшее количество Т-лимфобластов приобретает фенотип CCR7-CXCR5-, характерный для других типов зрелых Т-хелперов. Следует отметить, что CXCR5+- фТh-подобные лимфобласты, созревающие из нTh в смешанных культурах, также демонстрировали другие фенотипические признаки фТh: высокие уровни экспрессии молекул ICOS, OX-40 и PD-1, тогда как малые Т-лимфоциты в тех же культурах обладали низким уровнем экспрессии этих молекул (рис. 4Г).

Рис. 4. Содержание CCR7+CXCR5--, CCR7-CXCR5+-, CCR7+CXCR5+- и CCR7-CXCR5--клеток среди малых CD4+-лимфоцитов и CD4+-лимфобластов в культурах, созданных из нTh (А), общего пула CD4+-T-клеток (Б) или зрелых CD4+CCR6+-T-клеток (В), росших в монокультуре или в смешанной культуре с B-лимфоцитами

Набор хемокиновых рецепторов указан под графиками, тип анализируемых клеток - в легенде. Достоверные отличия от показателей монокультуры (* - p < 0,05; ** - p < 0,001) и лимфобластов от малых лимфоцитов смешанной культуры († - p < 0,05; †† p < 0,001) в парном Т-тесте с поправкой Бонферрони. Пример экспрессии CXCR5, CCR7, ICOS, PD-1 и OX40 на CD4+-клетках в монокультуре нTh и в смешанной культуре нTh с В-клетками (Г)

Индуцированное В-клетками созревание фТh-подобных клеток также регистрировалось в смешанных культурах с общим пулом CD4+-T-клеток, о чем можно судить по росту доли CCR7-CXCR5+-клеток среди Т-лимфобластов по сравнению с малыми Т-лимфоцитами контрольных и смешанных культур (рис. 4Б). Кроме того, в этих смешанных культурах регистрировалось значительное количество Т-лимфобластов с фенотипом CCR7+CXCR5+, характерным для циркулирующих фТh или пре-фТh. В то же время количество клеток с фенотипом CCR7-CXCR5- среди Т-лимфобластов было ниже, чем среди малых Т-лимфоцитов.

При взаимодействии В-клеток и зрелых CCR6+-Т-хелперов достоверного прироста содержания CCR7-CXCR5+-фТh-подобных клеток не наблюдалось ни среди Т-лимфобластов, ни среди малых Т-лимфоцитов смешанных культур по сравнению с контрольной монокультурой CCR6+-Т-хелперов (рис. 4В). В смешанных культурах среди Т-лимфобластов наблюдался лишь небольшой прирост исходно малочисленных незрелых CCR7+CXCR5--клеток и CCR7+CXCR5+-пре-фТh, однако наиболее многочисленной группой Т-клеток как среди лимфобластов, так и среди малых лимфоцитов являлись CCR7-CXCR5--эффекторы.

Полученные результаты подтверждаются анализом экспрессии репрессора транскрипции Bcl-6, критически необходимого для созревания фТh. Содержание Т-хелперов, одновременно экспрессирующих CXCR5 на мембране и Bcl-6 в ядре, существенно увеличивалось среди Т-лимфобластов в смешанных культурах, созданных из В-клеток и нTh (рис. 5А, Б). Небольшой и недостоверный рост доли CXCR5+Bcl-6+-клеток наблюдался среди лимфобластов в смешанных культурах с общим пулом CD4+-T-клеток. В культурах со зрелыми CCR6+-Т-хелперами CXCR5+Bcl-6+-Т-клетки практически отсутствовали как среди лимфобластов, так и среди малых лимфоцитов (рис. 5Б).

Рис. 5. Bcl-6 и цитокины в Т-клетках смешанных культур

А - экспрессия CXCR5 и Bcl-6 в Т-клетках монокультуры нTh и смешанной культуры нTh с В-клетками; Б - доля Bcl-6+CXCR5+-клеток среди малых Т-лимфоцитов и Т-лимфобластов в культурах Т- и B-клеток. По оси абсцисс - тип Т-клеток, использованных для засева культур; тип анализируемых клеток - в легенде; В - доля продуцентов цитокинов среди CD4+CD19--Т-клеток в монокультурах CD4+CCR6+-T-клеток (CCR6+-Th без В) и в смешанных культурах этих клеток с В-лимфоцитами (CCR6+-Th с В). По оси абсцисс - профиль продукции цитокинов. * - p < 0,05 в парном t-тесте с поправкой Бонферрони.

Анализ способности Т-хелперов к продукции цитокинов после поликлональной активации ФМА и иономицином показал, что контакт CCR6+-Тh с В-лимфоцитами увеличивает долю продуцентов ИЛ-17А среди Т-клеток смешанной культуры (рис. 5В). Эти клетки принадлежали к субпопуляции Th17 с фенотипом ИФН-γ-ИЛ-17А+, а также к исходно малочисленной группе Th1/Th17, одновременно продуцирующих ИЛ-17А и ИФН-γ. В то же время доля Th1 с фенотипом ИФН-γ+ИЛ-17А- при контакте CCR6+-Тh с В-лимфоцитами существенно не изменялась.

Обсуждение

CD4+-Тh осуществляют помощь В-клеткам при индукции гуморального иммунного ответа на тимус-зависимые антигены в ходе непосредственных межклеточных взаимодействий. При этом В-клетка на молекулах главного комплекса гистосовместимости класса II (МНСII) представляет CD4+-Т-лимфоциту фрагменты антигенного материала, собранного при интернализации мембранных иммуноглобулиновых рецепторов, и активирует Т-лимфоцит, распознавший представленный антигенный эпитоп. В свою очередь, активированный Т-хелпер стимулирует В-клетку к размножению и созреванию в продуцирующий антитела плазмацит. При этом важную роль во взаимодействии Т- и В-лимфоцитов играют пары костимулирующих мембранных молекул ICOS/ICOSL и СD40/CD40L, а также цитокины, в первую очередь ИЛ-21 [12, 26, 27], который могут продуцировать как фТh, так и Th17. Предполагается, что в условиях аллогенной смешанной культуры Т-хелперы взаимодействуют с В-клетками аналогичным образом, однако вместо распознавания чужеродного антигенного пептида на МНСII, Т-лимфоцит распознает аллельные варианты МНСII аллогенных В-лимфоцитов. В данной работе использовали аллогенную смешанную культуру для исследования взаимодействия CCR6+-Тh с В-лимфоцитами. Показано, что зрелые CCR6+-Тh крови обладают выраженной способностью стимулировать В-лимфоциты к продукции антител, причем хелперная активность этих клеток больше, чем у нTh и общего пула циркулирующих CD4+-Т-лимфоцитов.

Как уже отмечалось выше, зрелые CD4+CСR6+-Т-клетки объединены способностью к миграции в слизистые оболочки и кожу, но гетерогенны по субпопуляционному составу. В частности, в эту группу входят Th17, Th1, регуляторные Т-клетки и немногочисленные фТh-подобные клетки, причем Th17 обладают выраженной пластичностью и могут репрограммироваться, т. е. утрачивать свои свойства и приобретать свойства других субпопуляций [7, 21-23]. Известно, что дифференцировка различных групп Т-хелперов определяется антиген-презентирующими дендритными клетками и спектром цитокинов Т-клеточной зоны лимфоидных органов. Исключением является созревание фТh, которое, по крайней мере на конечном этапе, требует взаимодействия с В-клетками в зоне смешанного расположения Т- и В-лимфоцитов [10, 25]. В связи с этим в данной работе мы решили определить, связана ли хелперная активность CD4+CСR6+-Т-клеток с активацией и экспансией CСR6+-фТh или с репрограммированием других типов Тh в фТh при контакте с В-лимфоцитами. Однако фенотипический анализ смешанных культур CD4+CСR6+-Т-клеток с В-лимфоцитами не обнаружил ни роста доли клеток с фенотипом фТh, ни перераспределения фТh-подобных клеток в группу активированных клеток (Т-лимфобластов), ни роста экспрессии мастер-регулятора фТh Bcl-6, тогда как в смешанных культурах В-клеток с общим пулом CD4+-T-клеток или с наивными Т-хелперами фТh становились наиболее многочисленной группой клеток, отреагировавших бласттрансформацией на контакт с В-лимфоцитами. В то же время в смешанных культурах CD4+CСR6+-Т-клеток с В-лимфоцитами наблюдалось значительное увеличение доли Th17 и Th1/Th17, что свидетельствует о преимущественном вовлечении этих групп CСR6+-Т-клеток во взаимодействие с В-лимфоцитами и отсутствии репрограммирования Th17 в фТh.

Учитывая специфический маршрут миграции CD4+CСR6+-Т-клеток и на основании результатов, описанных в данной статье, мы предполагаем, что циркулирующие CD4+CСR6+-Т-клетки, в первую очередь Th17 и Th1/Th17, после миграции в слизистую желудочно-кишечного тракта и ассоциированные с ней лимфоидные органы могут участвовать в стимуляции локальной продукции антител. Кроме того, на основании полученных данных можно предположить, что экспансия субпопуляций Th17 и Th1/Th17 в ходе защитного иммунного ответа или патологической, аутоиммунной реакции может частично зависеть от взаимодействия с В-лимфоцитами. С этим предположением согласуется недавно описанное уменьшение количества Th17 в результате медикаментозной деплеции В-клеток при ревматоидном артрите [28].

Заключение

Взаимодействие зрелых CD4+CСR6+-Т-клеток крови с В-лимфоцитами in vitro приводит к значительному усилению продукции антител и экспансии Th17 и Th1/Th17 без заметного прироста количества Th1 и фТh. В то же время наивные Тh-клетки или неразделенные CD4+-Т-клетки при взаимодействии с В-лимфоцитами преимущественно дифференцируются в фТh-подобные клетки. Полученные результаты свидетельствуют о потенциальной роли взаимодействия CD4+CСR6+-Т-клеток и В-лимфоцитов в развитии гуморального иммунного ответа и поддержании субпопуляции Th17.

Литература

1.Wang C., Kang S.G., Lee J., Sun Z., Kim C.H. The roles of CCR6 in migration of Th17 cells and regulation of effector T-cell balance in the gut. Mucosal Immunol. 2009; 2: 173-83. DOI: https://doi.org/10.1038/mi. 2008.84

2.Villablanca E.J., Cassani B., von Andrian U.H., Mora J.R. Blocking lymphocyte localization to the gastrointestinal mucosa as a therapeutic strategy for inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 2011; 140: 1776-84. DOI: https://doi.org/10.1053/j.gastro.2011.02.015

3.Wu Y.Y., Tsai H.F., Lin W.C., Hsu P.I., Shun C.T., Wu M.S., Hsu P.N. Upregulation of CCL20 and recruitment of CCR6+ gastric infiltrating lymphocytes in Helicobacter pylori gastritis. Infect. Immun. 2007; 75: 4357-63. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.01660-06

4.Harper E.G., Guo C., Rizzo H., Lillis J.V., Kurtz S.E., Skorcheva I. et al. Th17 cytokines stimulate CCL20 expression in keratinocytes in vitro and in vivo: implications for psoriasis pathogenesis. J. Invest. Dermatol. 2009; 129 (9): 2175-83. DOI: https://doi.org/10.1038/jid. 2009.65

5.Singh S.P., Zhang H.H., Tsang H., Gardina P.J., Myers T.G., Nagarajan V. et al. PLZF regulates CCR6 and is critical for the acquisition and maintenance of the Th17 phenotype in human cells. J. Immunol. 2015; 194: 4350-61. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1401093

6. Талаев В.Ю., Светлова М.В., Заиченко И.Е., Воронина Е.В., Бабайкина О.Н., Неумоина Н.В., Перфилова К.М., Уткин О.В., Филатова Е.Н. Цитокиновый профиль CCR6+ Т-хелперов, выделенных из крови пациентов с язвенной болезнью, ассоциированной с H. pylori-инфекцией. Современные технологии в медицине. 2020; 12: 33-40. DOI: https://doi.org/10.17691/stm2020.12.3.04

7.Mazzoni A., Maggi L., Liotta F., Cosmi L., Annunziato F. Biological and clinical significance of T helper 17 cell plasticity. Immunology. 2019; 158 (4): 287-95. DOI: https://doi.org/10.1111/imm.13124

8.Kleinewietfeld M., Puentes F., Borsellino G., Battistini L., Rötzschke O., Falk K. CCR6 expression defines regulatory effector/memory-like cells within the CD25+CD4+ T-cell subset. Blood. 2005; 105: 2877-86. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2004-07-2505

9. Талаев В.Ю., Талаева М.В., Воронина Е.В., Заиченко И.Е., Неумоина Н.В., Перфилова К.М., Бабайкина О.Н. Экспрессия хемокиновых рецепторов на Т-хелперах крови при заболеваниях, ассоциированных с Helicobacter pylori: хроническом гастродуодените и язвенной болезни. Инфекция и иммунитет. 2019; 9: 295-303. DOI: https://doi.org/10.15789/2220-7619-2019-2-295-303

10.Ma C.S., Deenick E.K., Batten M., Tangye S.G. The origins, function, and regulation of T follicular helper cells. J. Exp. Med. 2012; 209: 1241-53. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.20120994

11.Fazilleau N., Mark L., McHeyzer-Williams L.J., McHeyzer-Williams M.H. Follicular helper T cells: lineage and location. Immunity. 2009; 30: 324-35. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2009.03.003

12.McHeyzer-Williams L., Pelletier N., Mark L., Fazilleau N., McHeyzer-Williams M.G. Folicular helper T-cells as cognate regulator of B cell immunity. Curr. Opin. Immunol. 2009; 21: 266-73. DOI: https://doi.org/10.1016/j.coi.2009.05.010

13.Wang C., Hillsamer P., Kim C.H. Phenotype, effector function, and tissue localization of PD-1-expressing human follicular helper T cell subsets. BMC Immunol. 2011; 12: 53. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2172-12-53

14.Crotty S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu. Rev. Immunol. 2011; 29: 621-63. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-031210-101400

15.Annunziato F., Romagnani S. Heterogeneity of human effector CD4+ T cells. Arthritis Res. Ther. 2009; 11: 257. DOI: https://doi.org/10.1186/ar2843

16.Mosmann T.R., Coffman R.L. Two types of mouse helper T-cell clone: implicationsfor immune regulation. Immunol. Today. 1987; 8: 223-7. DOI: https://doi.org/10.1016/0167-5699(87)90171-X

17.Tsuji M., Komatsu N., Kawamoto S., Suzuki K., Kanagawa O., Honjo T., Hori S., Fagarasan S. Preferential generation of follicular B helper T cells from Foxp3+ T cells in gut Peyer’s patches. Science. 2009; 323: 1488-92. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1169152

18.Cong Y., Feng T., Fujihashi K., Schoeb T.R., Elson C.O. A dominant, coordinated T regulatory cell-IgA response to the intestinal microbiota. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2009; 106: 19 256-61. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0812681106

19.Dullaers M., Li D., Xue Y., Ni L., Gayet In., Morita R., Ueno H., Palucka K.A., Banchereau J., Oh S. A T cell-dependent mechanism for the induction of human mucosal homing immunoglobulin A-secreting plasmablasts. Immunity. 2009; 30: 120-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2008.11.008

20.Annunziato F., Cosmi L., Santarlasci V. et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J. Exp. Med. 2007; 204: 1849-61. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.20070663

21.Damsker J.M., Hansen A.M., Caspi R.R. Th1 and Th17 cells: adversaries and collaborators. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2010; 1183: 211-21. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2009.05133.x

22.Murphy K.M., Stockinger B. Effector T cell plasticity: flexibility in the face of changing circumstances. Nat. Immunol. 2010; 11: 674-80. DOI: https://doi.org/10.1038/ni.1899

23.Hirota К., Turner J., Villa M., Duarte J.H., Demengeot J., Steinmetz O.M., Stockinger B. TH17 cell plasticity in Peyer’s patches is responsible for induction of T cell-dependent IgA responses. Nat. Immunol. 2013; 14: 372-9. DOI: https://doi.org/10.1038/ni.2552

24.Hartlehnert M., Börsch A.L., Li X., Burmeister M., Gerwien H., Schafflick D. et al. Bcl6 controls meningeal Th17-B cell interaction in murine neuroinflammation. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2021; 118: e2023174118. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2023174118

25. Талаев В.Ю., Плеханова М.В., Воронина Е.В., Бабайкина О.Н. Созревание Т-фолликулярных хелперов in vitro. Иммунология. 2015; 36 (6): 336-43.

26. Бязрова М.Г, Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Васильева Ю.В., Прилипов А.Г, Филатов А.В. Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (6): 501-10. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-501-510

27. Астахова Е.А., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Бязрова М.Г, Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Стимуляции В-клеток в системе ИЛ-21/CD40L в норме и у пациентов с общей вариабельной иммунной недостаточностью. Иммунология. 2021; 41 (6): 631-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640

28.Bounia C.A., Liossis S.C. B cell depletion treatment decreases Th17 cells in patients with rheumatoid arthritis. Clin. Immunol. 2021; 233: 108877. DOI: https://doi.org/10.1016/j.clim.2021.108877

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Редакционная коллегия журнала «Иммунология» и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России с прискорбием сообщают, что 11.03.2022 г. скончался Президент журнала «Иммунология», научный руководитель Института академик РАН Хаитов Рахим Мусаевич
Медицина сегодня
VI Научно-практическая конференция "Парадигмы лекарственной терапии у онкологических больных"

Уважаемые коллеги! Приглашаем Вас принять участие в VI Научно-практической конференции "Парадигмы лекарственной терапии у онкологических больных" ( https://mrrcconference.ru/ ), которая впервые состоится в Москве, в очном формате 08-09 сентября 2022 г. Адрес : г. Москва, ул...

XI Национальный конгресс "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология".

XI Национальный конгресс с международным участием имени Н.О. Миланова "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология" - Реконструкция формы. Управление временем С 29 ноября по 1 декабря 2022 года в Москве пройдет XI Национальный конгресс "Пластическая хирургия,...

XIII международный форум "Росмедобр-2022

15-17 сентября на площадке "Рэдиссон Славянская Отель и Бизнес-центр" в Москве состоится XIII международный форум "Росмедобр-2022. Инновационные обучающие технологии в медицине" - крупнейшее ежегодное событие в сфере медицинского образования в русскоязычном пространстве....


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»