Суперкатионные пептидные дендримеры как векторы для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих

Резюме

Введение. Использование нуклеиновых кислот (НК) для модуляции экспрессии генов или введения нового гена - кардинальное направление в современной биомедицинской науке. Однако такие манипуляции требуют использования эффективных средств доставки, которые могли бы обеспечить трансмембранный перенос, стабильность нуклеотидной цепи и средства доставки. Перспективными соединениями-носителями для доставки НК в клетки являются суперкатионные дендримерные пептиды (КДП), обладающие разветвленной структурой, обусловленной наличием ε-амидных связей, и относительно стабильные в условиях биологической среды.

Цель работы - конструирование и синтез нетоксичных КДП, способных эффективно проникать в клетки млекопитающих и стимулировать внутриклеточное введение модельных ДНК-плазмид. Анализ связи между структурой и стимулирующей активностью КДП. Оценка участия шаперонных молекул нуклеолина и нуклофозмина в трансмембранном переносе КДП.

Материал и методы. Пептиды синтезировали твердофазным методом, очищали методом высокоэффективой жидкостной хроматографии и анализировали масс-спектрометрией. Для оценки цитотоксичности был проведен МТТ-тест на клетках линии HeLa и ФЭЧ. Изучали взаимосвязь между структурой КДП и их трансфекционной активностью, которая была охарактеризована в культурах клеток HeLa и A549 по экспрессии репортерных генов люциферазы и зеленого флуоресцирующего протеина. Изучение транспортной активности и анализ внутриклеточной локализации проводили методом конфокальной флуоресцентной микроскопии с применением специфичных флуоресцентно меченных антител и флуоресцентно меченного КДП.

Результаты. Синтезированные молекулы КДП имели 3 функциональных участка (модуля): N-концевой катионный фрагмент, представленный остатками аргинина, центральный фрагмент, представленный гидрофобным ядром из остатков лизина с короткими гидрофобными вставками, и С-концевой гидрофобный фрагмент. Последний участок содержит остаток цистеина, удобный для присоединения репортерной группы. Исследование позволило установить взаимосвязь между трансфекционной активностью пептидов и их структурой, зарядом и гидрофобностью C-концевого фрагмента. Показано, что шаперонные молекулы нуклеолин и нуклеофозмин участвуют в процессе трансмембранного переноса КДП в ядро клетки.

Заключение. Получены новые дендримерные пептиды, перспективные для доставки молекул НК в клетки млекопитающих. Установлена роль шаперонных белков нуклеолина и нуклеофозмина во внутриядерной транслокации КДП. Ввиду того что в клетках большинства злокачественных новообразований повышен уровень экспрессии шаперонных белков нуклеофозмина, нуклеолина, NPM, NCL, предполагается, что такие пептидные конструкции можно рассматривать и как потенциальные противоопухолевые агенты.

Ключевые слова:дендримеры; катионные пептиды; твердофазный синтез; невирусные векторы; генная терапия; нуклеиновые кислоты; РНК-интерференция; трансфекция; нуклеолин

Для цитирования: Кожихова К.В., Андреев С.М., Успенская Д.В., Шатилова А.В., Турецкий Е.А., Шатилов А.А., Лушникова А.А., Вишнякова Л.И., Шиловский И.П., Смирнов В.В., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Суперкатионные пептидные дендримеры как векторы для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Иммунология. 2022; 43 (3): 320-332. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-3-320-332

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РНФ в рамках конкурса 2020 г. "Проведение инициативных исследований молодыми учеными" Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными, научный проект № 20-73-00368.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Разработка концепции и дизайна исследования - Кожихова К.В., Андреев С.М.; проведение экспериментов по токсичности и трансфекции - Успенская Д.В., Турецкий Е.А., Вишнякова Л.И.; синтез пептидов и их очистка - Шатилова А.В., Шатилов А.А.; расчеты гидрофобности, статистическая обработка - Шиловский И.П., Смирнов В.В.; дизайн экспериментов с мечеными пептидами - Лушникова А.А.; обсуждение концепции, правка и утверждение окончательного варианта статьи - Хаитов М.Р.

Благодарности. Авторы благодарят студентов-дипломников, принимавших участие в этой работе: Кумашеву Р.А. [ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет)] - участие в проведении трансфекции, Бабихину М.О. и Хохлову А.М. (ФГБОУ ВО РТУ МИРЭА Минобрнауки России) - участие в синтезе пептидов.

Введение

Трансфекция клеток нуклеиновыми кислотами (НК) является эффективным способом введения нового гена, а также целенаправленного подавления экспрессии собственного или чужеродного гена. Способ регуляции генной экспрессии в формате РНК-интерференции [1] реализуется путем внутриклеточного введения малой интерферирующей РНК (миРНК) и охватывает широкий спектр применения - от фундаментальных исследований до разработок генно-терапевтических решений в области иммунологии и онкологии. Для проявления специфической активности НК/миРНК должны проникнуть в цитоплазму клетки-мишени, но выполнение этого условия осложнено тем, что свободная НК в биологической среде быстро разрушается эндогенными нуклеазами, а также тем, что из-за высокой гидрофильности и значительного отрицательного заряда молекулы НК затрудняется ее прохождение через клеточную мембрану. Данные факторы создают область повышенного внимания к критерию эффективности получаемых транспортеров НК. К перспективным транспортерам НК следует отнести катионные пептиды (КП), характеризующиеся высокой трансмембранной активностью, стабильностью при хранении, наличием регулярной структуры, что позволяет проводить анализ их подлинности и чистоты инструментальными методами. Рассматривая классификацию КП, способных проникать в клетки, выделяют следующие классы: фрагменты белков, нацеленные на связывание молекул НК, трансдукционные домены и сигнальные структуры белков, природные антимикробные пептиды (чаще их фрагменты), последовательности из вирусных и бактериальных адгезионных белков и пептиды оригинального дизайна, включая пептиды из фаговых библиотек [2]. Важно отметить, что устойчивость линейных КП к протеолизу весьма ограничена, поскольку α-амидные связи аминокислотной цепи легко расщепляются в биологической среде [3]. Для повышения протеолитической устойчивости применяют различные подходы: замену L-аминокислот на D-формы, модификацию пептидного скелета синтетическими фрагментами [4, 5]. Введение в пептиды остатков жирной кислоты увеличивает их сродство к липидным мембранам [6, 7], но приводит к снижению растворимости в водной среде.

В качестве альтернативных векторов применяются катионные дендримерные пептиды (КДП), представляющие собой разветвленные трехмерные структуры с плотным ядром и внешним слоем, состоящим из положительно заряженных групп. Наличие большого количества катионных групп позволяет КДП эффективно связывать и конденсировать НК в более компактные формы. Известно, что такие пептиды менее токсичны, чем линейные, и способны эффективнее проникать через клеточные мембраны [3, 8-11]. Кроме того, они более устойчивы к действию протеолитических ферментов из-за разветвленной структуры и наличия неприродных ε-пептидных связей. КДП являются полиэлектролитами: они обладают высокой растворимостью в водной среде даже при наличии в составе гидрофобных аминокислот, что важно при их системном введении [12]. Изменяя структуру терминальных групп, можно регулировать заряд, гидрофобность и в конечном счете фармакокинетику - КДП прочно связываются с мембранами, вызывая их временную деформацию, а затем проникают в клетки с помощью эндоцитоза, при этом не исключаются и иные механизмы, в том числе рецептор-зависимый путь [13, 14].

Цель данного исследования заключалась в конструировании, синтезе КДП, анализе связи - структура КДП/трансфекционная активность и оценке участия некоторых рецепторных молекул в трансмембранном транспорте КДП.

Материал и методы

Реагенты и растворители для пептидного синтеза и хроматографии. Диметилформамид (DMF), ацетонитрил, метиленхлорид, N-метилпирролидон, 4-метилпиперидин, N-метилморфолин (NMM), тиоанизол, 1,2-этандитиол, метил-трет-бутиловый эфир (Acros Organics, США), трифторуксусная кислота (Merck, Германия); смола для синтеза ChemMatrix® H-Rink amide (PCAS BioMatrix, Канада). Fmoc-защищенные аминокислоты, N-гидроксибензотриазол (HOBt), диизопропилкарбодиимид (DIC) - гексафторфосфат-бензотриазол-тетраметилуроний (HBTU) от Iris Biothech (Германия).

Культуры клеток. Клетки линий HeLa, A549 и ФЭЧ получены из коллекции клеточных культур Института вирусологии им. Д.И. Ивановского НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России. Клетки линии melIS получены из коллекции клеточных культур ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России.

Синтез пептидов. Для автоматического синтеза использовали синтезатор пептидов PS3 (Protein Technologies Inc., США), в случае ручного синтеза - стеклянные реакторы от Sigma-Aldrich (CША) и аналогичные реакторы, сделанные на заказ. При ручном варианте для реакции конденсации использовалась смесь DIC/HOBt, в автоматическом синтезе для конденсации использовали HBTU/NMM. Отщепление пептидов от смолы проводили в 95 % растворе TFA с добавлением тиоанизола, 1,2-этандитиола и деионизированной воды. Сырые пептидные продукты осаждали трет-бутил-этиловым эфиром, экстрагировали разбавленной уксусной кислотой и затем высушивали лиофильно.

Очистка пептидов. Сырые пептиды очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, используя препаративный хроматограф LC-20 Prominence Shimadzu (Япония), колонки Vydac 218TP1022 (Grace, Великобритания) в режиме линейного градиента: 0-70 % элюента A (25 мин) и 100-30 % элюента В при 30 мл/мин с детектированием при 226 нм. Элюент А содержал 0,1 % TFA/H2O; элюент B содержал чистый ацетонитрил. Чистоту пептидов анализировали с помощью масс-спектрометрии на приборе Microflex™ LT MALDI-TOF (Bruker Daltonics, США).

Трансфекционный тест. Для скрининга трансфекционной активности, способности синтетических пептидов в форме комплексов с НК осуществлять трансмембранный перенос, использовали тест, основанный на внутриклеточной доставке плазмиды pGL3, кодирующей репортерный ген люциферазы светлячка, в клетки линий HeLa и А549. 48-луночный планшет засевали клетками из расчета 80 тыс. клеток на лунку в 300 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия). Клетки инкубировали 24 ч при 37 °С в атмосфере 5 % CO2. Затем в лунки вносили трансфекционную смесь, содержащую в 40 мкл бессывороточной среды OptiMEM (Thermo Fisher, США) 0,25 мкг плазмиды pGL3 и 20 или 10 мкг исследуемого пептида или 0,3 мкл реактива Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher, США) (положительный контроль). Трансфекционную смесь инкубировали в течение 15 мин и вносили в лунки. Трансфекционная смесь для отрицательного контрольного образца содержала 0,25 мкг плазмиды без добавления трансфекционного агента. Клетки инкубировали в течение 24 ч, после чего среду отбирали, в лунки вносили по 150 мкл лизирующего буфера Glo (Promega, CША). Клеточный лизат переносили в пробирки, вносили 50 мкл субстрата люциферазы, показатель люминесценции определяли на люминометре GloMax 20/20 (Promega, США).

Для более детального изучения активности пептидов проводили опыт по трансфекции плазмиды ptagGFP2, кодирующей репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Для теста использовали клетки линии HEK293T. 48-луночный планшет засевали клетками из расчета 80 тыс. клеток на лунку в 300 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия). Клетки инкубировали 24 ч при 37 °С в атмосфере 5 % CO2. Затем в лунки вносили трансфекционную смесь, содержащую в 40 мкл бессывороточной среды OptiMEM (Thermo Fisher, США) 0,25 мг плазмиды ptagGFP2 и 20 или 10 мкг исследуемого пептида или 0,3 мкл реактива Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher, США) (положительный контроль). Трансфекционную смесь инкубировали в течение 15 мин, после чего отбирали клеточную среду, промывали клетки фосфатно-солевым буфером и вносили трансфекционную смесь в лунки. Трансфекционная смесь для отрицательного контрольного образца содержала 0,25 мг плазмиды без добавления трансфекционного агента. После инкубации в течение 1 ч в лунки вносили по 300 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия). Клетки инкубировали в течение 48 ч, клеточную среду собирали и отбрасывали, инкубировали клетки 10 мин в 100 мкл раствора трипсина. К клеточной суспензии прибавляли 1 мл фосфатно-солевого буфера, пропускали через клеточное сито с диаметром пор 70 мкм и центрифугировали 5 мин со скоростью 500 g. Надосадочную жидкость отбрасывали, клетки ресуспендировали в 300 мкл FACS-буфера (BD Biosciences, США) и исследовали с помощью проточной цитометрии на аппарате BD FACSCanto II (BD Biosciences , США).

Цитотоксичность. Для определения цитотоксичности полученных пептидов применялся описанный в литературе МТТ-тест [15]. Тест проводили на клетках линий HeLa и ФЭЧ. В 96-луночный планшет вносили клетки из расчета 15 тыс. клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия) и инкубировали в течение суток. Клеточную среду отбирали и вносили 100 мкл среды DMEM, содержащей один из исследуемых пептидов в концентрации 32, 63, 125, 250, 500, 1000 или 2000 мкг/мл. В положительный контрольный образец вносили 100 мкл воды деионизованной, в отрицательный контрольный образец вносили 100 мкл среды DMEM (ПанЭко, Россия). Образцы инкубировали в течение суток, вносили 25 мкл раствора 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ) в концентрации 4 мг/мл. Образцы инкубировали в течение 4 ч, после чего вносили лизирующий буфер, представляющий собой 20 % раствор додецилсульфата натрия (Sigma-Aldrich, США) в 0,02 н водном растворе серной кислоты. Образцы инкубировали 24 ч и проводили измерение светопоглощения при характеристической длине волны 570 нм и длине волны сравнения 650 нм.

Введение флуоресцентной метки в пептид NC-811. Флуорофор Cy5 (BioDye, Россия), содержащий малеимидный фрагмент, присоединяли к КДП по тиоловой группе С-концевого цистеина (мольное соотношение 1 : 1) в растворе ДМСО без доступа света в течение 4 ч при комнатной температуре и 12 ч при 4 °С. Неприсоединившийся краситель экстрагировали этилацетатом. Остаток промывали эфиром, высушивали и полученный синий порошок очищали на смоле Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich, США), используя 5 % уксусную кислоту как элюент. Масс-спектр лиофилизированного продукта показывал основной молекулярный пик с показателем m/z 2946, соответствующий к молекулярному иону целевого соединения. Меченый пептид имеет характерные полосы возбуждения и испускания при 650 и 670 нм соответственно.

Анализ колокализации меченого дендримерного пептида и клеточных белков. Для визуализации меченых пептида и белков клетки меланомы линии melIS культивировали 1 сутки в микроячейках (Lab Cell Imaging Slides, Eppendorf, Германия). Затем в каждую ячейку, кроме контрольных, добавляли по 0,5 мкг/мл меченого пептида (NC-811-Cy5), инкубировали в течение 2-6 ч и далее анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse Ni-U (Nikon, Япония). Для иммуногистохимического анализа клетки после их фиксации на стекле 4 % параформальдегидом в течение 10 мин пермеабилизовали 0,1 % Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich, США) в течение 10 мин и блокировали 1 % BSA (Sigma-Aldrich, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. Клетки метили флуоресцентно меченными моноклональными антителами к NCL/C23, NPM/B23 (Life Technology, США), используя систему визуализации CyGel SustainTM (Abcam, Великобритания).

Результаты

1. Дизайн и синтез пептидов. Основная задача данной работы состояла в получении пептидной конструкции с низкой токсичностью, стабильной в сывороточной среде, при этом структура должна демонстрировать значительную эффективность в стимуляции трансфекции. Наш план предполагал создание модульных конструкций. Одним из таких модулей является N-концевой суперкатионный участок, представленный остатками аргинина. Он необходим для взаимодействия с НК и с поверхностью клетки. Центральный модуль представлен гидрофобным ядром из остатков лизина и короткими гидрофобными/амфифильными вставками. С-концевой модуль также формирует гидрофобный участок, обеспечивающий дополнительное сродство с мембраной клетки, и содержит остаток цистеина со свободной тиольной группой, предназначенной для присоединения репортерной метки. Все синтезы были проведены твердофазным методом с использованием Fmoc-защиты для α-аминогрупп и высоконабухающей смолы Rink-amide ChemMatrix (Iris Biothech, Германия), что обусловлено объемной структурой этих пептидов. Выходы конечных продуктов (список в табл. 1) после очистки составляли 20-30 %.

Таблица 1. Структура и свойства суперкатионных дендримерных пептидов

Примечание. * Параметр гидрофобности - сумма индексов шкалы гидрофобности аминокислот [20]. ** Пептид с высокой цитотоксичностью. N-концевые гидрофобные фрагменты выделены подчеркиванием; С-концевые гидрофобные фрагменты выделены жирным шрифтом.

Почти все пептиды содержали короткие гидрофобные фрагменты, как в N-, так и в С-концевых участках КДП с целью повышения гидрофобности и гибкости звеньев дендримера в качестве своеобразных шарниров для облегчения подвижности катионного модуля пептида. Пептид NC-811, как один из самых простых полученных нами КДП, не содержал таких вставок и потому был использован в качестве контрольного соединения для сравнения трансфекционной активности.

2. Анализ трансфекционной активности. Результаты иcследований с помощью люциферазного теста отражены в табл. 1. Мы проанализировали связь между гидрофобностью отдельных участков КДП и трансфекционной активностью. В табл. 1 приведены предсказанные параметры гидрофобности N- и C-концевых участков, основанные на сумме индексов гидрофобности аминокислот [16], входящих в состав этих участков. Анализ диаграмм (рис. 1), построенных на основе этих данных, указывает на определенную тенденцию: слишком высокая гидрофобность и слишком высокий суммарный заряд снижают эффективность трансфекции. Это, по-видимому, связано с "залипанием" пептида на мембране и/или повышением его токсичности, что отмечалось ранее [4]. Интересно, что повышение гидрофобности С-концевого участка дает более значимый вклад в стимуляцию трансфекции. Пептиды, показавшие наибольшую активность в этом тесте, обладают суммарным зарядом +12 при физиологическом значении рН. Этот тест, однако, не позволяет учесть гибель трансфецированных клеток под воздействием КДП, а также различие в интенсивности экспрессии репортерного гена в зависимости от механизма трансфекции. Для более детального изучения активности пептидов было проведено исследование методом проточной цитометрии с использованием гена, кодирующего GFP, в качестве репортерного гена. Настройки гейтинга и примеры распределения интенсивности флуоресценции в канале FITC представлены на рис. 2. Следует обратить внимание на разницу в интенсивности экспрессии репортерного гена при липофекции (рис. 2В) и трансфекции пептидами (рис. 2Г-Д). При сравнимой численности популяций трансфецированных клеток липофекция демонстрирует значительно больший разброс значений с более высоким уровнем экспрессии. Такое различие может указывать на различие в механизмах трансмембранного переноса.

Рис. 1. Зависимость эффективности трансфекции от гидрофобности N- и C-концевых фрагментов (А) и от суммарного заряда (Б) пептида

Рис. 2. Проточно-цитометрический анализ клеток HEK293T, трансфецированных плазмидой ptagGFP2

А - суммарная популяции клеток HEK293T; Б - единичные клетки; В - популяции клеток с флуоресценцией в FITC-канале (GFP-положительные клетки) в положительном контрольном образце с трансфекцией липофектамином; Г - образец с трансфекцией с использованием пептида KK-46; Д - образец с трансфекцией с использованием пептида NC-811; Е - образец с трансфекцией с использованием пептида D-24. Горизонтальной линией отмечена сортировка клеток с флуоресценцией в FITC-канале (расположены ниже линии).

3. Анализ цитотоксичности КДП. Цитотоксическое действие пептидов на различные клеточные культуры исследовали с помощью МТТ-теста в широком диапазоне концентраций, рассчитывая ингибирующую цитотоксическую концентрацию IC50 (табл. 1). Следует отметить, что природа клеток не оказывала сильного влияния на чувствительность к КДП. Диапазон IC50 к большинству пептидов лежал в интервале 0,100-2000 мкг/мл. В то же время введение в С-концевую часть КДП длинного остатка жирной кислоты (пептид КК-61) и катионного амфифильного фрагмента в N-конец КДП заметно повышало их токсичность. Следует обратить внимание, что зависимость токсического действия пептида NC-811 на клетки HeLa от его концентрации выражалась в немонотонной кривой со снижением токсичности при повышении концентрации (рис. 3). Возможно, что при высоких концентрациях пептид образует агрегаты с понижением эффективной концентрации.

Рис. 3. Кривая титрования токсичности пептида NC-811 в отношении клеток HeLa

4. Анализ внутриклеточной локализации КДП. Мы предположили, что хорошими неспецифическими мишенями для суперкатионных пептидов являются анионные структуры или кластеры на поверхности и внутри клеток, такие как гепарансульфат, шаперонные белки, нуклеолин/С23 (NCL) и нуклеофозмин/В23 (NPM), присутствующие во всех клетках и регулирующие ключевые клеточные функции [17]. С учетом этих соображений был изучен внутриклеточный транспорт суперкатионного пептида NC-811, содержащего флуоресцентную метку, и проведена оценка возможности его взаимодействия с клеточными белками NCL и NPM путем анализа их колокализации в клетках melIS (рис. 4).

Рис. 4. Колокализация меченого суперкатионного пептида NC-811 и меченых нуклеолина (NCL), нуклеофозмина (NPM) и белка р53 в ядре клеток melIS

А - NC-811-Cy5 (красный), NCL-YeG (желто-зеленый); Б - P53-GFP (зеленый), NC-811-Cy5 (красный); В - NPM-GFP (зеленый), NC-811-Cy5 (красный).

На фотографиях (см. рис. 4) видны идентичные формы пятен в местах локализации меченого пептида и, соответственно, меченых NCL и NPM (см. рис. 4А и 4В). Совместная локализация меченого р53 и NC-811 (см. рис. 4Б) указывает на их расположение в ядре. Ранее было показано, что пептид NC-811 с большой вероятностью способен блокировать РСВ-инфекцию, поскольку вход вируса в клетку опосредован нуклеолином и сульфатированными протеогликанами [18, 19]. Таким образом, эти данные дают большие основания считать вероятное участие этих белков в транспорте катионных пептидов в клетку.

Обсуждение

При проектировании пептидов выбор остатков аргинина (R) в качестве терминальных групп во всех КДП был обусловлен следующими факторами. Экспериментально было установлено, что при трансфекции синтезированный нами КДП NC-811 с терминальными остатками аргинина - (R)8(K)4(K)2KAC, демонстрировал более высокую активность, чем пептид-аналог (К)8(K)4(K)2KAC (NC-798). В последнем пептиде имеется единственная замена концевого аргинина (R) на лизин (K). Ключом к пониманию такой повышенной активности именно R-пептидов может служить особенность структуры гуанидиновой группы аргинина, описанная ранее [20]. В водной среде гуанидиновый катион, содержащий 3 заряженные аминогруппы, формирует планарную псевдоароматическую структуру с 3 сопряженными связями при очень высоком pK. Такой ион образует прочные водородные связи с молекулами воды, расположенными в той же плоскости, образуя амфифильный катион с гидрофобным анфасом. Он способен взаимодействовать с гидрофобными ароматическими аминокислотными остатками в мембранных белках (триптофаном, тирозином), а также активно связываться с карбоксилат-анионами (с атомами кислорода) аспарагиновой и глутаминовой кислот. Между тем, у K-пептидов аминокатион имеет совсем иную структуру, аммонийную, где между этими катионами доминируют силы отталкивания. Катионы R-пептидов в водной среде не проявляют взаимного электростатического отталкивания, как следствие, наблюдается энергетически выгодное спаривание гуанидиновых групп в плоскостной ориентации (π-π-стэкинг-взаимодействие). Принимая во внимание этот факт, становится очевидным, что связывание R-пептида с мембраной намного сильнее, чем у K-пептида. Так, ранее показано, что разветвленные дендримерные пептиды, содержащие только 2 остатка аргинина, способны прочнее связываться с мембранами и проникать в клетки более эффективно, чем пептиды с 2 остатками лизина [20]. Молекулярные кластеры аргинина в водных растворах имеют гидрофобную поверхность за счет сопряжения трех метиленовых групп [21, 22]. Мы полагаем, что транспорт R-пептида в клетку может идти за счет различных вариантов эндоцитоза, как по энергонезависимому пути, так и за счет взаимодействия с анионными центрами клеточных белков, гепарансульфатом, NCL и NPM, играющими роль низкоаффинных рецепторов [18]. Но эффективность интернализации пептида, по-видимому, зависит от оптимальной величины положительного заряда и достаточного количества гидрофобных участков, играющих важную роль в проникновении через мембраны клетки.

Хорошо известно, что основной механизм интернализации многих макромолекул в эукариотические клетки опосредуется клеточными рецепторами. Это относится и к природным пептидам. Например, тафтсин, катионный тетрапептид, стимулятора фагоцитоза и хемотаксиса, проникает в клетку после взаимодействия с клеточным рецептором нейропилином [23]. Положительно заряженные участки, сформированные из катионных аминокислотных остатков, часто присутствуют во внешней белковой оболочке вирусов (например, РСВ, ВИЧ) и электростатические взаимодействия этих протеинов дают заметный вклад в их связывание с клеткой и в интернализацию. КДП, очевидно, способны электростатически взаимодействовать с анионными кластерами на клетках-мишенях путем связывания как с фосфолипидными мембранами, так и с рецепторными молекулами. При этом, помимо эффективности интернализации комплекса КДП-плазмида, существенное влияние на экспрессию гена в составе плазмиды оказывают кинетика их высвобождения из эндосомы и дальнейшая внутриклеточная локализация. Высокая скорость интернализации в сочетании с низкой скоростью высвобождения плазмиды из эндосомы и наработки репортерного протеина, вероятно, указывает на макропиноцитоз как основной механизм трансфекции комплексов НК с КДП, в отличие от липоплексов липофектамина, для которых характерен путь клатрин-зависимого эндоцитоза. Последний характеризуется более высокой скоростью высвобождения плазмиды из эндосом и, как следствие, более высоким уровнем экспрессии репортерного гена, однако взаимодействие с сывороточными белками существенно ограничивает применение таких комплексов in vivo. Существенно, что введение цистеина в С-концевой участок КДП может значительно повышать эффективность трансфекции [24].

NCL и гепарансульфат (имеет сильный отрицательный заряд) были идентифицированы как клеточные корецепторы для РСВ [19], причем способные взаимодействовать с одними и теми же природными лигандами. Молекулы КДП могут связываться с рецепторным NCL как за счет электростатических взаимодействий, так и путем формирования стабильных водородных связей. Например, белок эндостатин является мощным ингибитором ангиогенеза с гепарин-зависимой активностью, и NCL выступает как функциональный рецептор эндостатина, опосредуя его интернализацию в эндотелиальные клетки. Важно, что именно катионный кластер на поверхности эндостатина, собранный из остатков аргинина, дает основной вклад в высокоаффинное взаимодействие с клеткой и опосредует антиангиогенную и противоопухолевую активность этого белка [25]. В этой связи имеется некая аналогия с катионным кластером в N-концевом участке молекул КДП и их функциональной активностью. В клетках большинства злокачественных образований повышен уровень экспрессии шаперонных белков NPM и NCL, причем гликозилированный NCL гиперэкспрессирован и на поверхности опухолевых клеток. Поэтому эти белки являются предпочтительными мишенями для суперкатионных КДП [26].

Заключение

Полученные результаты показывают, что суперкатионные дендримерные пептиды способны эффективно переносить олигонуклеотиды в цитоплазму и ядро эукариотической клетки. Установлен ряд структурных параметров, которые определяют эффективность трансфекции. Успех процесса зависит от величины положительного заряда пептида, свойств терминального аминокислотного остатка, наличия и распределения гидрофобных участков (гидрофобного момента). Основные преимущества использования дендримерных пептидов по сравнению с линейными заключаются в их устойчивости к ферментативной деградации и значительно меньшей токсичности. Ранее нами было показано, что время полураспада линейного и дендримерного пептидов в сывороточной среде (кровь человека) могут различаться на порядки (10 мин для линейного пептида LL-37 и 15 ч для дендримерного аналога NC-811 [18]). Клинические испытания уже показали эффективность применения КДП для доставки молекул миРНК при лечении инфекции, вызванной SARS-CoV-2, с помощь препарата, действующего на основе РНК-интерференции [27]. Такие пептиды также рассматриваются как потенциальные противоопухолевые агенты, индуцирующие апоптоз трансформированных клеток и резко снижающие их пролиферативную активность [24].

Литература

1. Fire A., Xu S., Montgomery M., Kostas S., Driver S., Mello C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391: 806-11. DOI: https://doi.org/10.1038/35888

2. Milletti F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 2012; 17: 850-60. DOI: https://doi.org/10.1016/j.drudis.2012.03.002

3. Luo K., Li C., Wang G., Nie Y., He B., Wu Y., Gu Z. Peptide dendrimers as efficient and biocompatible gene delivery vectors: Synthesis and in vitro characterization. J. Control. Rel. 2011; 55 (1): 77-87. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2010.10.006

4. Takechi-Haraya Y., Saito H. Current understanding of physicochemical mechanisms for cell membrane penetration of arginine-rich cell penetrating peptides: Role of glycosaminoglycan Interactions. Curr. Prot. Pept. Sci. 2018; 19 (6): 623-30. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2010.10.006

5. Kumar V., Agrawal P., Kumar R., Bhalla S., Usmani S.S., Varshney G.C., Raghava G. P. Prediction of cell-penetrating potential of modified peptides containing natural and chemically modified residues. Front Мicrobiоl. 2018; 9: 725. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00725

6. Hofland H.E., Shephard L., Sullivan S.M. Formation of stable cationic lipid/DNA complexes for gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996; 93: 7305-9.

7. Турецкий E.A., Колоскова O.O., Носова A.С., Шиловский И.П., Себякин Ю.Л., Хаитов M.Р. Физико-химические свойства липосом на основе липопептидов и их комплексов с ми-РНК. Биомед. химия. 2017; 63 (5): 472-5. DOI: https://doi.org/10.18097/PBMC20176305472

8. Regberg J., Srimanee A., Erlandsson M., Sillard R., Dobchev D.A., Karelson M., Langel U. Rational design of a series of novel amphipathic cell-penetrating peptides. Int. J. Pharm. 2014; 464 (1-2): 111-6. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2014.01.018

9. Eggimann G.A., Blattes E., Buschor S., Biswas R., Kammer S.M., Darbre T., Reymond J.-L. Designed cell penetrating peptide dendrimers efficiently internalize cargo into cells. Chem. Comm. 2014; 50: 7254. DOI: https://doi.org/10.1039/C4CC02780A

10. Shcharbin D., Shcharbina N., Bryszewska M. Recent patents in dendrimers for nanomedicine: Evolution 2014. Recent patents on nanomedicine. 2014; 4 (1): 25-31. DOI: https://doi.org/10.2174/1877912304666140609233256

11. Никольский А.А., Шиловский И.П., Юмашев К.В., Вишнякова Л.И., Барвинская Е.Д., Ковчина В. И., Корнеев А. В., Туренко В.Н., Каганова М.М., Брылина В.Е., Никонова А. А., Козлов И. Б., Кофиади И.А., Сергеев И.В., Маерле А.В., Петухова О.А., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Влияние локального подавления экспрессии гена Stat3 на нейтрофильное воспаление легких в экспериментальной модели на мышах. Иммунология. 2021; 42 (6): 600-14. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-600-614

12. Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofeeva A.V., Gaisina A.R., Shatilov A.A., Turetskiy E.A., Andreev I.M., Smirnov V.V., Dvornikov A.S., Khaitov M.R. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org. Biomol. Chem. 2018; 16 (43): 8181-90. DOI: https://doi.org/10.1039/C8OB02039F

13. Allolio C., Magarkar A., Jurkiewicz P., Baxová K., Javanainen M., Mason P.E., Šachl R., Cebecauer M., Hof M., Horinek D., Heinz V., Rachel R., Ziegler C.M., Schröfel A., Jungwirth P. Arginine-rich cell-penetrating peptides induce membrane multilamellarity and subsequently enter via formation of a fusion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2018; 115: 11923-8. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1811520115

14. Takechi-Haraya1 Y., Ohgita T., Kotani M., Kono H., Saito C., Tamagaki-Asahina H., Nishitsuji K., Uchimura K., Sato T., Kawano R., Sakai-Kato K., Izutsu K., Saito H. Effect of hydrophobic moment on membrane interaction and cell penetration of apolipoprotein E-derived arginine-rich amphipathic α-helical peptides. Sci. Reports. 2022; 12: 4959. DOI:

https://doi.org/10.1038/s41598-022-08876-9

15. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J. Immun. Methods. 1983; 65: 55-63. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-1759(83)90303-4

16. Frommel C. The apolar surface area of amino acids and its empirical correlation with hydrophobic free energy. J. Theor. Biol. 1984; 111: 247-260. DOI: https://doi.org/10.1016/S0022-5193(84)80209-X

17. Понкратова Д.А., Лушникова А.А. Особенности структуры и экспрессии генов NPM NCL при меланоме кожи. Мол. Биол. 2019; 53 (4): 663-73. DOI: https://doi.org/10.1134/S0026898419040098

18. Kozhikhova K.V., Shilovskiy I.P., Shatilov A.A., Timofeeva F.V., Turetskiy E.A., Vishniakova L.I., Nikolskii A.A., Barvinskaya E.D., Karthikeyan S., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Andreev S.A., Khaitov M.R. Linear and dendrimeric antiviral peptides: Design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus. J. Mater Chem. B. 2020; 8: 2607-17. DOI: https://doi.org/10.1039/C9TB02485A

19. Feng Z., Xu L., Xie Z. Receptors for respiratory syncytial virus infection and host factors regulating the life cycle of respiratory syncytial virus. Front Cell Infect. Microbiol. 2022; 12: 858629. DOI: https://doi.org/10.3389/fcimb.2022.858629

20. Vazdar M., Heyda J., Mason P.E., Tesei J., Allolio C., Lund M., Jungwirth P. Arginine "magic": Guanidinium like-charge ion pairing from aqueous salts to cell penetrating peptides. Acc. Chem. Res. 2018; 51: 1455−64. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.accounts.8b00098

21. Chua B.Y., Zeng W., Jackson D.C. Simple branched arginine-based structures can enhance the cellular uptake of peptide cargos. Int. J. Pep. Therap. 2007; 13 (3): 431-7. DOI: https://doi.org/10.1007/s10989-006-9063-y

22. Das U., Hariprasad G., Ethayathulla A.S., Manral P., Das T.K., Pasha S., Mann A., Ganguli M., Verma A.K., Bhat R., Chandrayan S.K., Ahmed S., Sharma S., Kaur P., Singh T.P., Srinivasan A. Inhibition of protein aggregation: Supramolecular assemblies of arginine hold the key. PLoS ONE. 2007; 2 (11): e1176. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0001176

23. Huang J., Wang J., Li Y., Wang Z., Chu M., Wang Y. Tuftsin: A natural molecule against SARS-CoV-2 infection. Front. Mol. Biosci. 2022; 9: 859162. DOI: https://doi.org/10.3389/fmolb.2022.859162

24. Simeoni F., Morris M.C., Heitz F., Divita G. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. NAR. 2003; 31 (11): 2717-24.

25. Fu Y., Chen Y., Luo X., Liang Y., Shi H., Gao L., Zhan S., Zhou D., Luo Y. The heparin binding motif of endostatin mediates its interaction with receptor nucleolin. Biochemistry. 2009; 48 (49): 11655-63. DOI: https://doi.org/10.1021/bi901265z

26. Лушникова А.А., Морозова Л.Ф., Понкратова Д.А., Балбуцкий А.В., Андреев С.М., Михайлов А.Э., Хаитов М.Р. Применение катионных пептидов для индукции гибели клеток меланомы кожи человека. Патент. RU2620170 С1.

27. Khaitov M., Nikonova А., Shilovskiy I., Kozhikhova K., Kofiadi I., Vishnyakova L., Nikolsky A., Gattinger P., Kovchina V., Barvinskaya E., Yumashev K., Smirnov V., Maerle A., Kozlov I., Shatilov A., Timofeeva A., Andreev S., Koloskova O., Kuznetsova N., Vasina D., Nikiforova M., Rybalkin S., Sergeev I., Trofimov D., Martynov A., Berzin I., Gushchin I., Kovalchuk A., Borisevich S., Valenta R., Khaitov R., Skvortsova V. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14850

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Редакционная коллегия журнала «Иммунология» и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России с прискорбием сообщают, что 11.03.2022 г. скончался Президент журнала «Иммунология», научный руководитель Института академик РАН Хаитов Рахим Мусаевич
Медицина сегодня
II Всероссийская конференция с международным участием "Воспаление глаза" 12 ноября 2022 года, Москва

II Всероссийская конференция с международным участием "Воспаление глаза" 12 ноября 2022 года, Москва Воспалительные заболевания глаза - широко распространенная и многогранная проблема, с которой может столкнуться в своей практике любой специалист. Найти оптимальные алгоритмы...

"Интегративная дерматовенерология и косметология. Новые стандарты взаимодействия"

Масштабное событие в области дерматовенерологии и косметологии - II конференция InteDeCo 2022 "Интегративная дерматовенерология и косметология. Новые стандарты взаимодействия" - состоится 16-17 декабря 2022 года. Программа мероприятия пройдет на современной...

VIII Московский Городской Съезд педиатров с межрегиональным и международным участием "Трудный диагноз в педиатрии"

VIII Московский Городской Съезд педиатров с межрегиональным и международным участием "Трудный диагноз в педиатрии" Приглашаем педиатров, детских эндокринологов, реаниматологов, гинекологов, неонатологов, кардиологов, хирургов, урологов, психологов, специалистов по лучевой...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»