Иммуноглобулины (Ig) человека - группа иммунобиологических лекарственных препаратов, основным действующим веществом которых являются IgG плазмы крови, обладающие специфичностью в отношении широкого спектра антител донорской популяции либо антительной активностью против определенного инфекционного или неинфекционного антигена [1].
Независимо от специфичности антител, сконцентрированных в основном действующем веществе препаратов Ig человека, его состав должен быть представлен преимущественно фракцией IgG (≥ 95%), визуализируемой в электрическом поле в виде интенсивной линии преципитации IgG с присутствием не более четырех дополнительно определяемых линий других фракций плазмы крови человека (альбумина, IgA, IgM и др. ) - примесей [2-7].
Исключением служат препараты Ig человека, обогащенные Ig классов А и М, присутствие которых в составе основного действующего вещества обеспечивает эффективность применения лиофилизатов для приготовления раствора для приема внутрь в комплексной терапии вирусных и бактериальных кишечных инфекций у детей с 1 мес и взрослых и растворов для инфузий для лечения бактериальных инфекций при одновременном использовании антибиотиков1.
1 Государственный реестр лекарственных средств Министерства здравоохранения Российской Федерации. Доступен по ссылке: http://grls.rosminzdrav.ru/grls.aspx.
Методы кинетической нефелометрии, иммуноферментного анализа (ИФА) и радиальной иммунодиффузии (РИД) по Манчини широко используются в клинико-диагностических лабораториях для определения содержания Ig классов G, A, M в биологических жидкостях человека (сыворотка крови и/или спинномозговая жидкость) для контроля иммунного статуса пациента, а также в комплексной диагностике ряда патологий. Указанные иммунохимические методы перспективны и для количественной оценки содержания классов Ig в лекарственных препаратах Ig человека.
Единственным подверждением пригодности указанных методов для оценки содержания примеси IgA в препаратах Ig человека всех форм введения и/или изучения состава основного действующего вещества препаратов Ig человека нормальных [IgG + IgM + IgA] является экспериментальное обоснование возможности использования аналитических методик для решения поставленных задач.
Цель исследования - теоретическое и экспериментальное обоснование выбора перспективных методик с использованием наборов иммунохимических реагентов для оценки количественного содержания Ig классов А, М и G в препаратах Ig человека.
Материал и методы
Пробы Ig человека с известным содержанием Ig классов G, А и М использовали в качестве испытуемых образцов. Пробы № 1 - IgA (0,9 мг/мл), № 2 - IgA (0,3 мг/мл), № 3 - IgA (0,1 мг/мл), № 4 - IgM (0,5 мг/мл), № 5 - IgM (0,2 мг/мл), № 6 - IgM (0,09 мг/мл), № 7 - IgG (53,4 мг/мл). Кроме того, исследованы пробы № 8 - Плацебо (0,9% раствор натрия хлорида), № 9 - "ОСО 28-442 ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России количественного содержания иммуноглобулинов классов G, A, M" (ОСО 28-442). ОСО 28-442 калиброван по отношению к международному стандартному образцу WHO International Standard Immunoglobulins G, A and M, Human Serum, NIBSC 67/86. ОСО 28-442 представляет собой нормальную сыворотку крови человека, полученную от 1000 здоровых доноров и разлитую по 2,0 мл во флаконы без добавления стабилизаторов и консервантов. Значения аттестуемых характеристик ОСО 28-442 составляют: IgG - 7,19 ± 0,29 мг/мл (метод нефелометрии); 6,60 ± 0,58 мг/мл (метод РИД); 8,35 ± 1,19 мг/мл (метод ИФА); IgA - 1,25 ± 0,06 мг/мл (метод нефелометрии); 1,31 ± 0,12 мг/мл (метод РИД); 1,76 ± 0,38 мг/мл (метод ИФА); IgМ - 0,52 ± 0,04 мг/мл (метод нефелометрии); 0,51 ± 0,08 мг/мл (метод РИД); 1,03 ± 0,17 мг/мл (метод ИФА).
Пробу образцов подготовили следующим образом: для методики кинетической нефелометрии пробы № 1-8 использовали без разведения; пробу № 9 (ОСО 28442) - в разведении 1/10; для оценки содержания IgG методом ИФА использовали разведения: № 9 (ОСО 28442) - 1/1969, 1/2953, 1/4429, 1/6644, 1/9966; № 1-3 -1/10 000, 1/15 000, 1/22 500, 1/33 750, 1/50 625; IgA: № 9 (ОСО) - 1/3000, 1/4500, 1/6750, 1/10 125, 1/15 187; № 1-3 - 1/40, 1/60, 1/80, 1/100, 1/120; IgM: № 9 (ОСО 28-442) - 1/2000, 1/3000, 1/4500, 1/6750, 1/10 125; для методики радиальной иммунодиффузии по Манчини использовали следующие разведения: № 1-8, № 9 (ОСО 28-442) - без разведения, 1/2, 1/4, 1/8.
В работе использованы наборы реагентов Beckman Coulter: "Иммуноглобулин M в низкой концентрации (Low Concentration Immunoglobulin M, IGMLC)", "Иммуноглобулин А в низкой концентрации (Low Concentration Immunoglobulin А, ЮАЪС), "Иммуноглобулин G (Immunoglobulin G, IGG)" - в методике кинетической нефелометрии для количественного определения содержания Ig классов G, А и М; наборы реагентов "Моно-РИД-G, A, M. Сыворотки диагностические моноспецифические против IgG(H), IgA(H), IgM (H) сухие" (ФГУП "НПО "Микроген") - в методике радиальной иммунодиффузии по Манчини; наборов реагентов "IgG общий - ИФА-БЕСТ", (Вектор-БЕСТ); "IgM общий - ИФА-БЕСТ", (Вектор-БЕСТ); "IgА общий - ИФА-БЕСТ", (Вектор-БЕСТ) - в методике ИФА с использованием анализатора Multiskan GO (Thermo Scientific).
Диаметры колец преципитации измеряли с использованием программного обеспечения для общего анализа различных двумерных изображений Image-Pro®Premier. Все экспериментальные исследования проводили в Испытательном центре экспертизы качества медицинских иммунобиологических препаратов ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России на (аттестованном, калиброванном) оборудовании, прошедшем метрологическую поверку. Статистические параметры рассчитывали с достоверностью 95% с помощью формул и табличных данных [8].
Все наборы реагентов использовали согласно инструкциям производителя. Каждое определение проводили 2 аналитика в 10 повторах.
Результаты
Для экспериментального доказательства пригодности аналитических методик кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини с использованием коммерческих наборов иммунохимических реагентов для определения количественного содержания Ig классов G, А и М в лекарственных препаратах Ig человека оценивали такие их характеристики, как правильность, повторяемость (сходимость), внутрилабораторная (промежуточная прецизионность).
Все три изученные методики отвечают критерию правильности, так как аттестованные значения содержания IgA, IgM и IgG в ОСО находятся внутри соответствующих доверительных интервалов среднего значения (табл. 1-3), а также удовлетворяют критерию сходимости, поскольку максимальные значения коэффициентов вариации результатов определения содержания IgG, IgA, IgM в образцах препаратов и ОСО 28-442, полученные каждым аналитиком, не превышают допустимых значений RSD (табл. 4-12).
&hide_Cookie=yes)
&hide_Cookie=yes)
&hide_Cookie=yes)
&hide_Cookie=yes)
&hide_Cookie=yes)
&hide_Cookie=yes)
Методики кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини отвечают критерию промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности, так как максимальные значения общего коэффициента вариации содержания IgA, IgM, IgG, рассчитанные исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не превышают допустимых значений общего RSD. Средние значения двух параллельных серий определений статистически эквивалентны, например, tрасч меньше табличного значения. Существенных различий в точности данных, полученных двумя аналитиками, нет - Fрасч меньше табличного значения (табл. 13-18).
&hide_Cookie=yes)
&hide_Cookie=yes)
В результате оценки характеристик методики кинетической нефелометрии сформулированы следующие критерии приемлемости: общее RSD (для двух аналитиков) содержания IgА, рассчитанное исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 15,0%; общее RSD (для двух аналитиков) содержания иммуноглобулинов М, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 15,0%; общее RSD (для двух аналитиков) содержания IgG, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 10,0%; средние значения двух параллельных серий определений должны быть статистически эквивалентны, а различия в точности данных, полученных двумя аналитиками, отсутствовать.
&hide_Cookie=yes)
В методиках ИФА сформулированы следующие критерии приемлемости: общее RSD (для двух аналитиков) содержания IgА, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 20,0%; общее RSD (для двух аналитиков) содержания IgM, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 25,0%; общее RSD (для двух аналитиков) содержания IgG, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 10,0%. Средние значения двух параллельных серий определений должны быть статистически эквивалентны. Различия в точности данных, полученных двумя аналитиками, должны отсутствовать.
&hide_Cookie=yes)
В результате оценки характеристик методики РИД по Манчини сформулированы следующие критерии приемлемости: общее RSD (для двух аналитиков) содержания IgA, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 10,0%; общее RSD (для двух аналитиков) содержания IgМ, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 15,0%; общее RSD (для двух аналитиков) содержания IgG, рассчитанное, исходя из средневзвешенного значения дисперсии, не должно превышать 10,0%. Средние значения двух параллельных серий определений должны быть статистически эквивалентны. Различия в точности данных, полученных двумя аналитиками, должны отсутствовать.
Таким образом, аналитические методики кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини с использованием коммерческих наборов иммунохимических реагентов пригодны для количественного определения содержания Ig классов G, А и М в лекарственных препаратах Ig человека.
Обсуждение
Коммерческие наборы иммунохимических реагентов для кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини, разрешенные к применению в нашей стране, отличаются аналитическими и диагностическими характеристиками в зависимости от вида тестируемой жидкости, составом калибраторов (калибровочных проб) и контрольных сывороток и референс-материала(ов), по отношению к которому они аттестованы (калиброваны).
Несмотря на отсутствие в инструкциях по применению изученных наборов иммунохимических реагентов информации о возможности применения в качестве испытуемых образцов лекарственных препаратов, теоретически их можно использовать и для оценки содержания классов Ig в лекарственных препаратах Ig человека.
Для решения этой задачи исследователь (аналитик) должен выбрать метод оценки, исходя из предполагаемого содержания определяемого класса Ig в препарате, данных о производителе и наименования набора иммунохимических реагентов требуемого аналитического диапазона, вида тестируемой биологической жидкости (сыворотка крови и/или спинномозговая жидкость), наименования соответствующего стандартного образца состава и/или свойств, разведения испытуемых и стандартного образцов, порядка расчета (вычисления) содержания класса Ig в лекарственном препарате.
В соответствии с инструкциями по применению препаратов Ig человека для внутривенного введения, разрешенных к применению в нашей стране, предполагаемое содержание примеси составляет от 0 до 2,5 мг/мл2.
В составе основного действующего вещества препаратов Ig человека нормальных [IgG + IgA + IgM], растворов для инфузий содержание классов Ig должно быть следующим: IgG - 38 мг/мл, IgA - 6 мг/мл, IgM - 6 мг/мл, лиофилизатов для приготовления раствора для приема внутрь: IgG - 30-42 г/л, IgA - 4-8,0 г/л, IgM - 4,5-8,0 г/л. Соответственно, для оценки содержания примеси IgА в препаратах Ig человека для внутривенного введения целесообразно использовать наборы реагентов для определения содержания IgА методом кинетической нефелометрии в спинномозговой жидкости с низким аналитическим диапазоном, например, от 0,00025 до 0,42 мг/мл - (для IgA). Для испытаний препаратов Ig, обогащенных IgG, IgM и IgA, можно применять реагенты с более высокой аналитической чувствительностью, предназначенные для сыворотки крови, например, 0,333-216,0 мг/мл (для IgG), 0,067-0,0252 (IgA) мг/мл, 0,042-144,0 мг/мл (IgM).
Воспроизведение методики кинетической нефелометрии не требует предварительного разведения испытуемых образцов, так как определение проводится с помощью автоматизированных аналитических систем, имеющих калибровочную систему и статистические программы расчета содержания концентрации Ig соответствующего класса.
Чувствительность ИФА наборов реагентов также позволяет использовать их для оценки содержания примеси IgА, а также для изучения состава основного действующего вещества препаратов Ig человека нормальных [IgG + IgA + IgM], но для каждого наименования набора необходимо экспериментальным путем подбирать разведения испытуемых образцов, обосновывать методику разведения испытуемого препарата с учетом данных по валидации и выбранного диапазона значений калибровочной кривой.
Экспериментально подтверждено, что методика РИД по Манчини пригодна для оценки содержания классов Ig в составе основного действующего вещества препаратов Ig человека нормальных [IgG + IgM + IgA] Использование современного программного обеспечения для измерения диаметра колец преципитации вместо визуальной оценки с помощью линейки позволяет исключить субъективность получаемых результатов.
Получение достоверных результатов, не зависящих от выбранных методик и наборов иммунохимических реагентов, возможно только, если при испытании препарата используют стандартные образцы свойств и/или состава основного действующего вещества. Например, использование "ОСО 28-442 ФГБУ "Научный центр экспертизы средств медицинского применения" Минздрава России количественного содержания Ig классов G, A, M", который является стандартным образцом состава и свойств основного действующего вещества.
Критерием приемлемости результатов испытаний служит соответствие содержания Ig классов G, A, M аттестованным величинам ОСО. Содержание классов Ig в лекарственном препарате вычисляют, сравнивая со стандартным образцом, аттестованным по содержанию Ig классов G, А и М в мг/мл, используя значения концентраций, полученные методом кинетической нефелометрии, а также калибраторы (калибровочные пробы) и/или контрольные сыворотки и референс-материал(ы), входящие в состав набора, только для оценки правильности его работы. При сомнениях или разногласиях окончательное заключение о содержании класса Ig принимают на основании результатов, полученных при испытаниях методом кинетической нефелометрии. Следовательно, аналитические методики кинетической нефелометрии, иммуноферментного анализа и РИД по Манчини пригодны (могут быть применены) для количественного определения состава основного действующего вещества препаратов Ig человека нормальных [IgG + IgA + IgM], а также для оценки количественного содержания примеси IgA в лекарственных препаратов Ig человека (за исключением препаратов Ig человека нормальных [IgG + IgA + IgM]).
Заключение
Таким образом, аналитические методики кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини отвечают критериям правильности, повторяемости (сходимости), внутрилабораторной (промежуточной прецизионности) при оценке количественного содержания классов Ig в испытуемых пробах с известным содержанием соответствующих классов Ig человека.
Методики кинетической нефелометрии, ИФА и РИД по Манчини с использованием коммерческих иммунохимических наборов реагентов целесообразно применять для оценки содержания примеси IgA в препаратах Ig человека всех форм введения и/или изучения состава основного действующего вещества препаратов Ig человека нормальных [IgG + IgM + IgA] после валидационных исследований. Получение достоверных результатов, не зависящих от производителя и наименования набора иммунохимических реагентов, выбранной методики, возможно в случае, если одновременно в испытании используют стандартный образец свойств и/или состава основного действующего вещества, аттестованный по отношению к международному стандартному образцу.
Теоретические и экспериментальные исследования явились основой для разработки общей фармакопейной статьи "Количественное определение содержания классов иммуноглобулинов G, А и М в препаратах иммуноглобулинов человека", включенной в Государственную фармакопею Российской Федерации XIV издания (ГФ РФ XIV) [9]. В соответствии с требованиями фармакопейной статьи ГФ РФ XIV "Иммуноглобулин человека для внутривенного введения" оценка содержания IgА стала обязательной для анализа качества указанной группы препаратов [2].