Иммуногенность мультиантигенной вакцины, приготовленной из лизата злокачественных клеток опухоли или из ткани первичной солидной опухоли

Резюме

Введение. Персонализированная вакцинация антигенами опухоли - это одно из самых актуальных направлений в иммунотерапии онкологических больных. Для создания терапевтической вакцины используют различные технологические платформы. Наиболее прогрессивными считают вакцины на основе синтетических пептидов, копирующих мутантные неоантигены, а также вакцины, представляющие собой РНК- или ДНК-векторы, кодирующие неоантигены опухоли. Упомянутые технологические подходы весьма сложны и дороги, требуют значительного времени для их реализации. Мы разрабатываем предельно простой, малозатратный способ приготовления персонализированной противоопухолевой вакцины для его широкого применения в комплексном лечении онкологических больных. Наш подход состоит в использовании ткани опухоли в качестве источника опухолевых антигенов для персонализированной вакцины. Вакцины, приготовленные из ткани опухоли или из злокачественных клеток опухоли, мы называем "персонализированные мультиантигенные противоопухолевые вакцины".

Цель - изучить иммуногенность 2 вариантов мультиантигенной противоопухолевой вакцины, приготовленной из лизата ткани первичной солидной карциномы 4T1 или из чистой культуры злокачественных клеток карциномы 4T1.

Материал и методы. Исследованные в работе мультиантигенные вакцины были приготовлены из ткани солидной 4Т1-карциномы молочной железы мышей BALB/c или из чистой популяции злокачественных клеток 4T1-карциномы, выращенных в условиях культуры клеток in vitro. Гомогенат (лизат) ткани опухоли или 4T1-клеток дополняли молекулярными иммуноадъювантами из класса PRR-агонистов. Полученные композиции использовали для иммунизации мышей BALB/c. Иммуногены вводили внутрибрюшинно, 4-кратно, с интервалами 2 нед между инъекциями. Системные иммунные реакции против антигенов 4T1-карциномы, использованных в исследуемых иммуногенах, определяли по противоопухолевым Т-клеткам в селезенке и антителам в сыворотке крови мышей. Антиген-реактивные CD4-Т-клетки и CD8-Т-клетки памяти, а также Т-клетки-эффекторы, секретирующие интерферон-γ, анализировали методом ELISPOT. Антитела к антигенам поверхности клеток карциномы 4T1 анализировали методом проточной цитометрии, антитела к внутриклеточным антигенам карциномы 4T1 - методом иммуноферментного анализа.

Результаты. Мультиантигенные противоопухолевые вакцины на основе гомогената ткани опухоли 4T1 (Multivac-1), а также на основе лизата злокачественных клеток 4T1 (Multivac-4) продемонстрировали высокую иммуногенность. После нескольких инъекций указанных препаратов у мышей BALB/c развивались интенсивные Т-клеточные и антительные реакции против антигенов карциномы 4T1. Суммарный ответ по CD4-Т-клеткам (клетки-эффекторы + клетки памяти) в селезенке составил около 3000 T-клеток (в расчете на 1 млн Т-клеток) после иммунизации вакциной Multivac-1 и около 8000 Т-клеток при иммунизации вакциной Multivac-4. Суммарный ответ CD8-Т-клеток (клетки-эффекторы + клетки памяти) при иммунизации Multivac-1 около 3000 и Multivac-4 составил ~ 5000 Т-клеток. Оба вакцинных препарата индуцировали продукцию противоопухолевых антител. В ответ на вакцину Multivac-4 вырабатывалось существенно больше противоопухолевых антител, чем в ответ на вакцину Multivac-1.

Заключение. Использование ткани солидной опухоли или злокачественных клеток опухоли в качестве источника антигенов представляется перспективным технологическим направлением для приготовления персонализированной терапевтической противоопухолевой вакцины. Иммуногены, приготовленные из лизата ткани первичной солидной карциномы 4T1 или из чистой культуры злокачественных клеток карциномы 4T1, усиленные молекулярными адъювантами из класса PRR-агонистов, индуцируют сильные противоопухолевые адаптивные иммунные реакции в виде генерации CD4- и CD8-Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти, а также продукции специфических антител к антигенам карциномы 4T1.

Ключевые слова:противоопухолевая терапевтическая вакцина; Т-клеточные реакции; антитела к антигенам опухоли

Для цитирования: Ушакова Е.И., Федорова А.А., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Иммуногенность мультиантигенной вакцины, приготовленной из лизата злокачественных клеток опухоли. Иммунология. 2022; 43 (4): 389-400. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-389-400

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 20-15-00391.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Постановка экспериментов, статистическая обработка, редактирование статьи - Ушакова Е.И.; постановка экспериментов, редактирование статьи - Федорова А.А.; дизайн вакцины, анализ данных, редактирование статьи - Лебедева Е.С.; планирование и постановка экспериментов, анализ данных - Пичугин А.В.; концепция, дизайн экспериментов, анализ данных, написание статьи - Атауллаханов Р.И.

Введение

Персонализированная вакцинация антигенами опухоли - одно из самых актуальных направлений в иммунотерапии онкологических больных. Идея проста и привлекательна. Она состоит в использовании уникальных антигенов опухоли для индукции иммунных реакций против этой опухоли [1].

Для создания терапевтической вакцины используют различные технологические платформы. Наиболее прогрессивными считают вакцины на основе синтетических пептидов, копирующих мутантные неоантигены, а также вакцины, представляющие собой РНК- или ДНК-векторы, кодирующие неоантигены опухоли. Упомянутые технологические подходы весьма сложны и дороги, требуют значительного времени для их реализации. Так, стоимость персонализированной пептидной неоантигенной вакцины в США составляет 90-100 тыс. долларов, а ее изготовление на GMP-производстве занимает 3-6 мес. При этом нужно помнить, что неоантигенные пептиды для каждого больного уникальны, т. е. подобное производство невыгодно для фармпроизводителей. К тому же структура уникальных пептидов предсказывается сложными биоинформатическими методами на основе данных секвенирования ДНК опухоли и ДНК нормальной ткани больного. Секвенирование и биоинформатический анализ еще более усложняют и удорожают конструирование персонализированной неоантигенной противоопухолевой вакцины. Важно и то, что в среднем лишь треть из предсказанных биоинформатиками иммуногенных пептидов в реальности индуцирует иммунные реакции у пациента, т. е. методы предсказания неоантигенов на данном этапе развития технологии неоантигенных персонализированных вакцин пока далеки от желаемой эффективности [2-7].

Описанные выше сложности характерны для технологии конструирования любых неоантигенных вакцин, не только пептидных, но и вакцин на платформе ДНК- или РНК-векторов, кодирующих неоантигены опухоли данного больного. Необходимость поиска уникальных мутаций путем секвенирования ДНК, HLA-типирование пациента, поскольку неоантигены с разной аффинностью взаимодействуют с различными аллельными вариантами HLA-молекул, предсказание неоантигенов с помощью несовершенных биоинформатических алгоритмов, дороговизна и значительные затраты времени, необходимые для дизайна, конструирования и производства персонализированной вакцины - все эти непростые условия пока не позволили этому многообещающему направлению занять заметное место в практической онкологии. Несмотря на вполне успешные результаты клинических испытаний, неоантигенные вакцины еще не получили широкого применения [2-7]. Их перспективы в практической иммунотерапии пока неясны. Несомненно, необходима разработка других методов персонализированной вакцинации, более доступных для практического применения у миллионов больных.

В качестве практически доступной альтернативы, позволяющей дешево и быстро создать персонализированную противоопухолевую вакцину, мы разрабатываем технологию мультиантигенной вакцины из ткани опухоли. Опухоль содержит все антигены, отличающие эту новую ткань от здоровых тканей пациента. Антигены опухоли включают не только неоантигены, являющиеся продуктами соматических мутаций в злокачественных клетках опухоли, но и другие ассоциированные с опухолью антигены, в частности онкоэмбриональные, раково-тестикулярные, а также антигены с повышенным уровнем экспрессии и аберрантные гликоконъюгаты [1].

В работе мы сравниваем иммуногенность мультиантигенной вакцины, приготовленной из выращенных in vitro злокачественных клеток опухоли (Multivac-4), с аналогичной вакциной, приготовленной из ткани первичной опухоли, полученной путем хирургической резекции (Multivac-1). Обе вакцины индуцируют Т-клеточные и антительные реакции против злокачественных клеток опухоли. Особенности этих реакций анализируются в данной статье.

Материал и методы

Экспериментальные животные. Мыши линии BALB/c 8-10-недельного возраста были получены из питомника "Столбовая", содержались на стандартной диете в стандартных условиях вивария ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными местным комитетом по этике (Резолюция 4/17 от 13.07.2017).

Культуры клеток in vitro. Линия клеток 4T1 карциномы молочной железы (ATCC, США, Cat. No. CRL-2539) была получена от профессора М.Г. Агаджаняна (Institute for Molecular Medicine, Huntington Beach, CA). Суспензии клеток селезенки и костного мозга мыши получали в асептических условиях стандартными методами, описанными ниже. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) с 25 мМ HEPES, дополненной смесью заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы "ПанЭко", Россия), при 37 оС, в увлажненной атмосфере с содержанием 5 % СО2.

Мышей забивали дислокацией шейных позвонков. В асептических условиях выделяли селезенку. Клеточную суспензию готовили в фосфатном буфере с 0,5 % бычьего альбумина (ФБ-БСА). Фракцию мононуклеарных клеток получали методом центрифугирования в градиенте фиколла ("ПанЭко", Россия). Клетки отмывали ФБ-БСА. Для сортировки CD4- и CD8-Т-клеток суспензию окрашивали антителами CD4-PE и CD8-APC. Лейкоциты подсчитывали с окрашиванием CD45-BV510. Жизнеспособность суспензий определяли при окрашивании DAPI. Сортировку клеток проводили с помощью проточного цитометра-сортировщика BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США). Чистота полученных популяций CD4- и CD8-Т-клеток составляла 98 %.

Приготовление антиген-презентирующих дендритных клеток in vitro. Дифференцировку дендритных клеток и макрофагов костного мозга мышей осуществляли in vitro в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (Sigma, США). В асептических условиях выделяли бедренные и большие берцовые кости мышей. Костный мозг вымывали шприцом (игла 25G) в чашку Петри с раствором ФБ-БСА и тщательно суспендировали. Клетки отмывали ФБ-БСА. Эритроциты удаляли осмотическим лизисом. Ядросодержащие клетки культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл ГМ-КСФ и 50 мкМ β-ME при 37 оС и 5 % CO2. Через 3-4 дня в культуры вносили равный объем ПС с теми же добавками. На 7-й день дендритные клетки активировали LPS из E. coli в конечной концентрации 0,1 мкг/мл и нагружали антигеном. В качестве антигена использовали лизат клеток 4T1 в конечной концентрации 10 мкг/мл (по белку). Концентрацию белка в лизате определяли методом Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, США). Для презентации антигенов в комплексе с MHC-II активированные дендритные клетки нагружали лизатом опухолевых клеток 4T1. Для презентации антигенов в комплексе с MHC-I активированные дендритные клетки культивировали совместно с клетками карциномы 4T1.

Иммунизация мультиантигенной вакциной против карциномы 4T1. Вакцинные антигены получали из ткани опухоли 4T1 или линии злокачественных клеток 4T1, выращенных в культуре in vitro. Для создания солидной опухоли мышам BALB/c подкожно вводили клетки карциномы 4T1 в количестве 15 тыс. клеток на мышь. При достижении размеров опухолей 5-7 мм мышей выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков. Ткань опухоли получали в асептических условиях, измельчали и лизировали с помощью замораживания-оттаивания. Лизат замораживали до использования. Линию клеток 4T1 карциномы поддерживали регулярными пересевами в ПС. Клетки карциномы 4T1 получали из культуры in vitro, лизировали с помощью замораживания-оттаивания. Лизат замораживали до использования. В лизат гомогената опухолевой ткани или лизат клеток 4T1 добавляли молекулярные адъюванты, агонисты PRR, действие которых детально исследовано и описано нами ранее [8, 9, 14-18]. Одна доза вакцины для иммунизации мышей BALB/c весом 20-25 г содержала лизат из 50 мг ткани опухоли 4T1 или лизат из 5 млн клеток 4T1, дополненные 10 мкг кислого пептидогликана из растений (агонист TLR4), 4 мкг сополимера полиинозиновой и полицитидиловой кислот (агонист TLR3) и 1,6 мкг неметилированного CpG-олигонуклеотида (агонист TLR9).

Вакцина Multivac-1 была приготовлена на основе лизата ткани опухоли 4T1, а вакцина Multivac-4 - на основе лизата клеток 4T1. Иммунизацию мышей BALB/c вакцинами серии Multivac проводили внутрибрюшинно, 4-кратно, с интервалом 2 нед между иммунизациями. Через 2 нед после последней иммунизации у мышей брали кровь для анализа антител и забивали дислокацией шейных позвонков, выделяли селезенки, в которых методом ELISPOT исследовали количество CD4- и CD8-Т-клеток, секретирующих интерферон(ИФН)-γ.

Анализ Т-клеточных реакций, специфичных к антигенам карциномы 4T1. Антиген-специфический ответ Т-клеток оценивали по секреции ИФН-γ. Специфический Т-клеточный ответ индуцировали в совместной культуре Т-клеток с антиген-презентирующими дендритными клетками, предварительно нагруженными лизатом клеток 4Т1, как описано выше, или совместно с клетками карциномы 4T1. В лунки планшета для ELISPOT (BD TM ELISPOT Mouse IFN-γ, кат. 551083, BD Bioscience, США) помещали 30 тыс. CD4- или CD8-Т-клеток, очищенных с помощью проточного сортировщика FACS Aria II, культивировали совместно с 50 тыс. дендритных клеток. Для активации CD8-Т-клеток в совместную культуру Т-клеток и дендритных клеток вносили 10 тыс. клеток карциномы 4Т1. Совместные культуры инкубировали в течение 36 ч при 37 °C и 5 % CO2, после чего выявляли клетки, секретирующие ИФН-γ, в соответствии с инструкцией производителя. Фотографии каждой лунки делали с помощью микроскопа Levenhuk DTX 700 LCD (США), количество спотов считали с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Количество ИФН-γ-секретирующих антиген-реактивных Т-клеток представляли в расчете на 1 млн CD4- или CD8-Т-клеток.

Анализ антител, специфично связывающихся с антигенами карциномы 4T1. Сывороточные антитела, связывающиеся с внутриклеточными антигенами клеток карциномы 4T1, исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали планшеты MaxiSorp (NUNC). В лунках планшета адсорбировали лизат клеточной линии 4T1. Для этого в каждую лунку вносили 100 мкл лизата с концентрацией 50 мкг/мл, инкубировали в течение 12 ч при 4 °С. После блокиро- вания 4 % БСА в лунки планшета вносили разведения исследуемых сывороток, инкубировали в течение 2 ч. Отмывали фосфатным буфером с 0,05 % Tween-20, затем инкубировали с козьими антителами к тяжелым и легким цепям IgG мыши, конъюгированными с биотином (Сat. No. 103008, Bio-Rad, США). Опять отмывали фосфатным буфером с 0,05 % Tween-20 и инкубировали со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Сat. No. 710005, Bio-Rad, США). Добавляли субстрат пероксидазы хрена - ТМБ. Реакцию останавливали раствором серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм.

Сывороточные антитела, связывающиеся с поверхностью клеток карциномы 4T1, анализировали методом проточной цитометрии. Клетки линии 4T1 инкубировали с различными разведениями сыворотки иммунных или контрольных мышей в течение 30 мин при 4 °С. Потом трижды отмывали буфером, после чего инкубировали в течение 30 мин при 4 °С с козьими антителами против мышиных IgG, конъюгированными с флуорохромом Alexa fluor-488 (Сat. No. A32723, Invitrogen, США). Флуоресценцию клеток 4T1 измеряли на проточном цитометре FACS Aria II.

Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения Graph-Pad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., США). Статистическую значимость между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Брауна-Форсайта или с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Шидака (значения p < 0,05 считались значимыми). На графиках представлены средние значения и стандартное отклонение.

Результаты

Генерация Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти в результате иммунизации мультиантигенной вакциной против 4T1-карциномы

Мышей иммунизировали вакциной Multivac 4-кратно, с интервалом 2 нед между иммунизациями. Через 2 нед после последней иммунизации у мышей брали кровь для анализа антител в сыворотке и выделяли селезенку. Приготовление суспензии клеток селезенки проводили общепринятыми методами в асептических условиях. C помощью сортировки на FACS-Aria II из суспензии клеток селезенки получали очищенные популяции CD4- и CD8-Т-клеток (чистота - 98 %).

На рис. 1 представлены результаты исследования Т-клеточных реакций в ответ на иммунизацию вакциной Multivac-4, приготовленной из лизата злокачественных клеток 4T1. Системный Т-клеточный ответ на иммунизацию анализировали по количеству Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти.

Т-клетки-эффекторы возникают в процессе иммунной реакции на антигены раньше клеток памяти. Клетки-эффекторы получают антигенную стимуляцию в организме вакцинированной мыши и потому не нуждаются в дополнительной стимуляции вне организма. Напротив, Т-клетки памяти уже прекратили пролиферацию и секрецию цитокинов, превратились в молчащие клетки памяти. Чтобы их выявить, Т-клетки памяти необходимо реактивировать ex vivo с помощью антиген-презентирующих клеток. В качестве антиген-презентирующих для CD4-Т-клеток мы использовали дендритные клетки, представляющие антигены опухоли 4T1 в комплексе с молекулами MHC-II. Для реактивации CD8-Т-клеток мы использовали антиген-презентирующие дендритные клетки, представляющие антигены 4T1 в комплексе с MHC-I.

Через 2 нед после последней иммунизации мышей BALB/c мультиантигенной вакциной Multivac-4 в селезенке мышей мы обнаружили большое количество Т-клеток, специфически реагирующих на антигены карциномы 4T1, т. е. иммунизация оказалась высокоэффективной. Т-клетки в селезенке демонстрировали мощный системный иммунный ответ против антигенов опухоли 4T1 (рис. 1). Количество CD4- и CD8-Т-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-γ, превышало 2000 (в расчете на 1 млн соответствующих Т-клеток). Количество антиген-реактивных Т-клеток памяти, способных распознавать антигены карциномы 4T1 и в ответ на это распознавание секретировать ИФН-γ, составило ~ 5500 (на 1 млн) для CD4-Т-клеток и ~ 3500 для CD8-Т-клеток.

Иммунизация другой мультиантигенной вакциной Multivac-1, изготовленной из гомогената ткани карциномы 4Т1, тоже оказалась эффективной в индукции системного Т-клеточного ответа против антигенов опухоли 4T1 (рис. 2). CD4-Т-клеток-эффекторов в селезенке было ~ 2000 (на 1 млн), и антиген-реактивных CD8-Т-клеток памяти - ~ 3000 (на 1 млн). Это довольно сильные Т-клеточные реакции и хорошая Т-клеточная память. Однако число CD8-Т-клеток-эффекторов и CD4-Т-клеток памяти оказалось небольшим. Причины невысокого количества этих клеток мы не анализировали в данной работе. Это могло быть связано с тем, что через 2 нед после иммунизации реакция CD4-Т-клеток была все еще в продуктивной фазе, в стадии клеток-эффекторов, еще не превратившихся в клетки памяти, а реакция CD8-Т-клеток, напротив, уже успела завершить эффекторную фазу и большинство антиген-специфических CD8-Т-клеток уже достигли стадии клеток памяти.

Сравнение иммуногенности двух мультиантигенных вакцин Multivac-4 и Multivac-1

Прямое сравнение параметров иммунных реакций в ответ на два варианта мультиантигенной вакцины: Multivac-1 и Multivac-4 - представлено на рис. 3. Чтобы сопоставить уровень иммунной реакции на вакцинацию с уровнем естественной иммунной реакции на растущую опухоль 4T1, на тех же рисунках мы представили иммунные ответы мышей BALB/c на антигены прогрессивно растущей солидной карциномы 4T1, достигшей больших размеров (~ 1 см). Сравнение уровней Т-клеточных иммунных реакций показывает, что обе вакцины высокоэффективны. Суммарный ответ по CD4-Т-клеткам (клетки-эффекторы + клетки памяти) составил ~ 3000 T-клеток после иммунизации вакциной Multivac-1 и ~ 8000 Т-клеток при иммунизации вакциной Multivac-4. Суммарный ответ CD8-Т-клеток (клетки-эффекторы + клетки памяти) составил при иммунизации Multivac-1 ~ 3000, при иммунизации Multivac-4 - ~ 5000 Т-клеток.

Таким образом, обе вакцины вызывали интенсивные Т-клеточные реакции, направленные против антигенов 4T1-карциномы. Амплитуда реакций после введения Multivac-4 была выше, чем после введения Multivac-1. Реакция CD4-Т-клеток была выше приблизительно в 3 раза, а CD8 - приблизительно в 2 раза. При этом популяционная структура реагирующих Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти значительно различалась, возможно, это связано с различной динамикой ответов на Multivac-1 и Multivac-4. Так, через 2 нед после последней иммунизации отношение числа CD4-Т-клеток-эффекторов к числу CD4-Т-клеток памяти составило ~ 4 у мышей, вакцинированных Multivac-1, и ~ 1 у мышей, вакцинированных Multivac-4. Отношение числа CD8-Т-клеток-эффекторов к числу CD8-Т-клеток памяти составило ~ 0,25 и 1 у мышей, иммунизированных Multivac-1 и Multivac-4 соответственно. Это означает, что после вакцинации Multivac-1 превращение CD8-Т-клеток-эффекторов в CD8-Т-клетки памяти происходило быстрее, чем после вакцинации Multivac-4 (см. рис. 3).

Т-клеточная иммунная реакция в ответ на вакцины Multivac-1 и Multivac-4 оказалась значительно более интенсивной, чем Т-клеточная реакция на прогрессивно растущую опухоль 4T1. Особенно сильно отличалась реакция CD8-Т-клеток. Так, в селезенке мышей с прогрессивно растущей большой опухолью 4T1 мы обнаружили ~ 1500 CD4-Т-клеток-эффекторов и ~ 1000 CD4-Т-клеток памяти, и всего лишь ~ 500 CD8-Т-клеток-эффекторов и ~ 600 CD8-Т-клеток памяти. Суммарное количество противоопухолевых CD8-Т-клеток в организме мышей с большой опухолью 4T1 составило ~ 1000 против ~ 3000 и 5000 у мышей, вакцинированных Multivac-1 и Multivac-4, соответственно.

Антительная реакция на иммунизацию мультиантигенной вакциной

Наряду с Т-клеточными реакциями против антигенов 4T1-карциномы иммунизация мультиантигенными вакцинами Multivac-1 и Multivac-4 вызывала продукцию антител, специфично связывающихся с антигенами карциномы 4T1. На данном этапе исследования мы не работали с точно идентифицированными антигенами клеток 4T1, а лишь проверяли, индуцируют ли вновь созданные вакцинные препараты продукцию антител, способных связываться с какими-то поверхностными и внутриклеточными антигенами злокачественных клеток карциномы 4T1. Наличие в сыворотках иммунизированных мышей антител, способных связываться с антигенами на поверхности клеток 4T1, мы анализировали методом проточной цитометрии. Антитела, способные связываться с антигенами лизата клеток 4T1, исследовали с помощью ИФА.

Анализ взаимодействия сывороточных антител с антигенами лизата злокачественных клеток 4T1 показал, что иммунизация Multivac-4 вызывала накопление большого количества антител к внутриклеточным антигенам злокачественных клеток 4T1. Напротив, вакцина Multivac-1 индуцировала очень слабую реакцию антителообразования (рис. 4). При исследовании методом проточной цитометрии антител, связывающихся с антигенами на поверхности клеток 4T1, также оказалось, что иммунизация Multivac-4 индуцировала интенсивную продукцию антител, а после иммунизации Multivac-1 таких антител практически не обнаруживалось (рис. 5).

Обсуждение

Представленные в данной работе результаты нашего исследования имеют много полезных и интересных следствий. Идея использовать ткань опухоли для создания противоопухолевой вакцины оказалась продуктивной. Эта идея не нова, имеются вполне успешные примеры [10-13]. Вместе с тем наши предшественники не предложили метода получения противоопухолевой вакцины, пригодного для широкого внедрения в практическую онкологию. Для масштабного практического применения необходима новая технология, не требующая дорогостоящих измерений, вычислений, синтезов и промышленных производств, поскольку все это нереально для создания уникальной вакцины для каждого пациента. Наша работа, описанная в этой статье, как раз и посвящена разработке такой простой технологии приготовления вакцины, вполне пригодной для тиражирования при лечении многих тысяч онкологических пациентов.

Для изготовления персонализированной вакцины мы использовали антигенный материал, содержащийся в самих злокачественных клетках опухоли. Нам оставалось лишь получить мультиантигенный лизат, что позволяет обезвредить опухолевые клетки и одновременно вскрыть содержащиеся в них антигены. Наличия антигенов недостаточно для эффективной индукции иммунных реакций против этих антигенов. По этой причине мы дополнили мультиантигенный лизат молекулярными адъювантами, исследования которых опубликованы в наших прежних сообщениях [14-18].

Иммунизация лабораторных мышей двумя вариантами мультиантигенной вакцины показала, что этот подход эффективен. В организме мышей удалось индуцировать сильные адаптивные иммунные реакции против опухоли. При этом важно, что происходила системная генерация Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти, а также продукция противоопухолевых антител.

Мы не случайно сосредоточили свое внимание на генерации CD4- и CD8-Т-клеток, секретирующих ИФН-γ. Хорошо известно, что такая поляризация Т-клеточных реакций особенно эффективно защищает от злокачественной опухоли, поскольку она отражает поляризацию в направлении дифференцировки Т-хелперов 1-го типа (Th1) и цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ). В свою очередь Th1-поляризация гарантирует продукцию высокоаффинных антител, относящихся к изотипам, необходимым для опосредованной антителами противоопухолевой атаки НК-клеток и фагоцитов. Представленные в данной работе результаты иммунизации препаратами Multivac-1 и Multivac-4 показывают высокую иммуногенность этих вакцинных композиций в плане индукции Th1- и CD8-Т-клеточных ответов против опухоли, антигены которой были использованы в составе этих вакцин.

По ряду признаков, иммунные реакции в ответ на Multivac-1 несколько уступают реакциям на Multivac-4 (см. рис. 1-3). Это вполне ожидаемый результат. Для приготовления Multivac-4 использован лизат клеток опухолевой линии 4T1, т. е. материал, на 100 % состоявший из злокачественных клеток. А вакцинный препарат Multivac-1 приготовлен из гомогената ткани опухоли, полученной после хирургической резекции. В ткани опухоли доминируют злокачественные клетки, но они не способны сформировать растущую ткань без помощи нормальных клеток - фибробластов, макрофагов, дендритных и эндотелиальных клеток, перицитов сосудов. Кроме того, в ткани опухоли имеются клетки-мигранты, пришедшие из кровотока, клетки инфильтрата. Все упомянутые типы клеток - необходимые участники опухолевого микроокружения. Без них опухоль не может существовать и прогрессивно расти.

Понятно, что для приготовления вакцины лучше использовать 100 % суспензию злокачественных клеток, а не ткань опухоли. Нужные для иммунизации опухолевые антигены содержатся именно в злокачественных клетках. Дополнительный материал в виде незлокачественных клеток и компонентов стромы - это ненужный балласт при изготовлении противоопухолевой вакцины. Однако именно материал хирургически резецированной опухоли - самый доступный в практической онкологии материал, который можно было бы использовать для приготовления персонализированной противоопухолевой вакцины. Результаты нашей работы доказывают, что ткань опухоли, полученная путем хирургической резекции, вполне пригодна для создания персонализированной вакцины типа Multivac.

Мы показали, что мультиантигенные вакцины Multivac-1 и Multivac-4 эффективно индуцируют генерацию Т-клеток-эффекторов и Т-клеток памяти. Эти типы клеток являются стадиями единого процесса Т-клеточной адаптивной реакции в ответ на иммунизацию. Получив все необходимые сигналы активации, наивные Т-клетки размножаются и дифференцируются в Т-клетки-эффекторы. Именно последние защищают от опухоли, поскольку с их функциональной активностью связана продукция противоопухолевых цитокинов, цитотоксических клеток и высокоаффинных антител. Следовательно, эффективная продукция Т-клеток-эффекторов в ответ на иммунизацию Multivac-1 или Multivac-4 может обеспечить терапевтическое действие при лечении онкологического больного.

Т-клетки памяти возникают из Т-клеток-эффекторов на более поздних стадиях адаптивной иммунной реакции. Т-клетки памяти тоже очень важны для результата лечения. Формирование значительного пула Т-клеток памяти, способных распознать антигены опухоли и реактивироваться, превращаясь в новые Т-клетки-эффекторы, представляет собой очень важный фактор защиты от рецидива опухоли. Оставаясь в организме на годы, Т-клетки памяти обеспечат надежную защиту от возможного повторного роста опухоли. Они осуществят надежный иммунный контроль злокачественных клеток, способных оставаться в латентном состоянии в течение нескольких лет, а затем реактивироваться и давать новые очаги злокачественного роста.

Сравнение иммунных реакций мышей в ответ на иммунизацию Multivac-1 и Multivac-4 с иммунными реакциями на те же опухолевые антигены у мышей с прогрессивно растущей, большой опухолью показало (см. рис. 3), что вакцинные препараты индуцируют значительно более интенсивные иммунные реакции против опухоли. Следовательно, терапевтическая иммунизация противоопухолевыми вакцинами типа Multivac имеет значительный потенциал для формирования более сильных и более эффективных иммунных реакций, чем те реакции, которые развиваются в процессе роста опухоли.

Опухоль потому и растет, что выработала механизмы ухода от иммунного контроля. А терапевтическая вакцинация должна разорвать порочный круг иммуносупрессии, созданный и поддерживаемый опухолью. Вакцина должна индуцировать мощные противоопухолевые иммунные реакции вопреки сложившейся в организме неблагоприятной, иммуносупрессивной ситуации, переломить ход иммунной баталии в пользу больного.

В данной работе удалось индуцировать высокий уровень противоопухолевых иммунных реакций у интактных, здоровых мышей BALB/c. В реальной онкологической практике придется лечить больного, иммунная система которого сильно супрессирована, ослаблена, разрушена. С самого начала онкологического процесса опухоль возникает при функциональной несостоятельности иммунного контроля за возникающими мутантными клетками, способными к злокачественному росту. По мере прогрессивного размножения злокачественные клетки и рекрутированные ими клетки микроокружения (ассоциированные с опухолью макрофаги, дендритные клетки, миелоидные супрессоры, регуляторные Т-клетки) дополнительно супрессируют иммунную систему. Следовательно, у реального больного в онкологической практике нужно проводить иммунотерапию на фоне выраженной системной иммуносупрессии, а также в условиях дефицита каких-то важных звеньев иммунитета. Нам предстоит изучить эффективность иммунизации вакцинными препаратами типа Multivac в организме с дефектной иммунной системой на фоне иммуносупрессии, вызванной опухолью.

Обозначенная проблема иммуносупрессии - не единственная из тех, что придется решить применительно к иммунотерапии мультиантигенными вакцинами типа Multivac. Представленная работа - лишь первый шаг в данном направлении. В будущем предстоит оптимизировать состав вакцины, методику ее приготовления, дозу и способ введения, кратность, интервалы между введениями. Необходимо исследовать эффективность вакцины в организме с растущей опухолью, а также после ее резекции и при наличии множественных метастазов. Целесообразно изучить, как сочетается новый метод персонализированной вакцинации с другими методами лечения онкологической патологии: химиотерапией, таргетной терапией, хирургической резекцией, блокадой рецепторов, ингибирующих контрольные точки иммунитета, и другими современными методами иммунотерапии злокачественных новообразований.

Выводы

1. Из гомогената (лизата) злокачественных клеток, а также из ткани солидной опухоли можно приготовить эффективные иммуногены, индуцирующие интенсивные противоопухолевые реакции CD4- и CD8-Т-клеток и антителообразование.

2. Индуцированные иммунные реакции по своей интенсивности во много раз превышают спонтанно развивающиеся иммунные реакции на растущую опухоль.

3. Работу над мультиантигенными вакцинами типа Multivac целесообразно продолжить с целью их оптимизации и эффективного встраивания в текущие протоколы лечения пациентов с онкологической патологией.

Литература

1. Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. Вакцины для лечения злокачественных новообразований. Иммунология. 2019; 40 (4): 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-140

2. Sahin U., Derhovanessian E., Miller M., Kloke B.P., et al. Persona- lized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature. 2017; 547: 222-6. DOI: https://doi.org/10.1038/nature2300

3. Sahin U., Oehm P., Derhovanessian E., et al. An RNA vaccine drives immunity in checkpoint-inhibitor-treated melanoma. Nature. 2020; 585 (7823): 107-12. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2537-9

4. Blass E., Ott P.A. Advances in the development of personalized neoantigen-based therapeutic cancer vaccines. Nat Rev Clin Oncol. 2021; 18 (4): 215-29. DOI: https://doi.org/10.1038/s41571-020-00460-2

5. Ott P.A., Hu Z., Keskin D.B., et al. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma [published correction appears in Nature. 2018 Mar 14; 555 (7696): 402]. Nature. 2017; 547 (7662): 217-21. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22991

6. Keskin D.B., Anandappa A.J., Sun J., et al. Neoantigen vaccine generates intratumoral T cell responses in phase Ib glioblastoma trial. Nature. 2019; 565 (7738): 234-9. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-018-0792-9

7. Lang F., Schrörs B., Löwer M., Türeci Ö., Sahin U. Identification of neoantigens for individualized therapeutic cancer vaccines. Nat Rev Drug Discov. 2022; 21 (4): 261-82. DOI: https://doi.org/10.1038/s41573-021-00387-y

8. Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Багаев А.В., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Комбинированная иммунотерапия метастатической карциномы у лабораторных мышей путем резекции первичного опухолевого узла и последующего перепрограммирования макрофагов и дендритных клеток с помощью агониста TLR4. Иммунология. 2021; 42 (5): 490-501. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-490-501

9. Багаев А.В., Рыбинец А.С., Федорова А.А., Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергизм агонистов TLR3 и TLR4 при перепрограммировании макрофагов в противоопухолевое состояние. Иммунология. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630

10. Shah N.J., Najibi A.J., Shih T.Y., et al. A biomaterial-based vaccine eliciting durable tumour-specific responses against acute myeloid leukaemia. Nat Biomed Eng. 2020; 4 (1): 40-51. DOI: https://doi.org/10.1038/s41551-019-0503-3

11. Shih T.Y., Blacklow S.O., Li A.W., et al. Injectable, Tough Alginate Cryogels as Cancer Vaccines. Adv Healthc Mater. 2018; 7 (10): e1701469. DOI: https://doi.org/10.1002/adhm.201701469

12. Wang H., Najibi A.J., Sobral M.C., et al. Biomaterial-based scaffold for in situ chemo-immunotherapy to treat poorly immunogenic tumors. Nat Commun. 2020; 11 (1): 5696. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-19540-z

13. Langellotto F., Dellacherie M.O., Yeager C., et al. A Modular Biomaterial Scaffold-Based Vaccine Elicits Durable Adaptive Immunity to Subunit SARS-CoV-2 Antigens. Adv Healthc Mater. 2021; 10 (22): e2101370. DOI: https://doi.org/10.1002/adhm.202101370

14. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Гараева А.Я., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Кооперативное взаимодействие сигнальных путей рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 в макрофагах мыши. Иммунология. 2018; 39 (1): 4-11. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11

15. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М.М., Атауллаханов Р.И. Комбинированное применение трех агонистов рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергически увеличивает выработку белков-цитокинов макрофагами мыши. Иммунология. 2018; 39 (4): 172-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-172-177

16. Чулкина М.М., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Гараева А.Я., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Cинергическая активация транскрипции генов INOS, IFN-β, IL12p40, IL6, TNF при одновременном воздействии на макрофаги агонистами рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2. Иммунология. 2018; 39 (4): 178-85. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018- 39-4-178-185

17. Лебедева Е.С., Джаруллаева А.Ш., Багаев А.В., Ерохова А.С., Чулкина М.М., Тухватулин А.И., Пичугин А.В., Логунов Д.Ю., Атауллаханов Р.И. Сочетанная стимуляция рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергически повышает защиту лабораторных мышей в модели летальной инфекции Salmonella enterica. Иммунология. 2018; 39 (5-6): 252-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-252-257

18. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Ataullakhanov R., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunology. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Редакционная коллегия журнала «Иммунология» и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России с прискорбием сообщают, что 11.03.2022 г. скончался Президент журнала «Иммунология», научный руководитель Института академик РАН Хаитов Рахим Мусаевич
Медицина сегодня
Ждем вас 2-3 декабря 2022 года на Зимней школе РОРР "Визуализация в педиатрии и неонатологии"

Новые знания от ведущих экспертов на Зимней школе РОРР "Визуализация в педиатрии и неонатологии"! Современная педиатрическая практика неотделима от научного и технического прогресса, достижения которого зачастую меняют подходы к диагностике и определению лечебной тактики. В...

Уважаемые коллеги, до XI-го Национального конгресса с международным участием имени Н.О. Миланова "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология" осталось 3 дня

Уважаемые коллеги, до XI-го Национального конгресса с международным участием имени Н.О. Миланова "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология" осталось 3 дня! С 29 ноября по 1 декабря 2022 года в Москве пройдет XI Национальный конгресс "Пластическая хирургия,...

X конференция с международным участием "Креативная кардиология и кардиохирургия. Новые технологии диагностики и лечения заболеваний сердца"

6-7 декабря 2022 года состоится юбилейная X конференция с международным участием "Креативная кардиология и кардиохирургия. Новые технологии диагностики и лечения заболеваний сердца", которая будет проходить в очном и онлайн-формате в ФГБУ "НМИЦ ССХ им. А.Н. Бакулева"...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»