Характеристика лимфоцитов с MAGE-A4-специфичным TCR-подобным CAR-рецептором in vitro

Резюме

Введение. В настоящее время одним из перспективных вариантов CAR-T-технологии является разработка лимфоцитов с TCR-подобным CAR-рецептором, распознающих эпитопы опухоль-ассоциированных антигенов в комплексе с MHC, что открывает широкий выбор возможных антигенов-мишеней любой клеточной локализации.

В данной работе представлена характеристика in vitro лимфоцитов с TCR-подобным CAR-рецептором, специфичным к MAGE-A4 - раково-эмбриональному антигену, экспрессия которого наблюдается лишь в злокачественных новообразованиях и в иммунопривилегированных органах, что делает его перспективной мишенью для эффективной CAR-Т-клеточной терапии со сниженной нецелевой токсичностью.

Материал и методы. С помощью проточной цитометрии лимфоциты, трансдуцированные и нетрансдуцированные TCR-подобным CAR-рецептором, специфичным к MAGE-A4, изучены на предмет содержания субпопуляций клеточной памяти (по маркерам CD45RA и CD62L) и явлений клеточной активации и истощения (по маркерам CD69, CD95, PD-1, TIM3). Цитотоксичность полученных CAR-Т-клеток изучена колориметрическим методом по содержанию лактатдегидрогеназы. Эффекторная функция CAR-Т-лимфоцитов изучена после сокультивирования с клетками-мишенями по маркерам клеточной активации (4-1BB, CD69, CD40L, FasL) с помощью проточной цитометрии.

Результаты. CD4+- и CD8+-лимфоциты, трансдуцированные TCR-подобным CAR-рецептором, специфичным к MAGE-A4, отличались повышенным содержанием терминально дифференцированных эффекторных Т-клеток, а также активированных (по маркеру CD69) и истощенных (PD-1+TIM3+) клеток. Однако преимущественно данные клетки были представлены слабодифференцированными субпопуляциями Т-клеток памяти и не несли маркеров активации и истощения. Трансдуцированные культуры проявляли антиген-специфичные цитотоксические свойства, превышающие таковые для нетрансдуцированных культур. При этом цитотоксическая функция трансдуцированных клеток сопровождалась повышением количества клеток, несущих активационные иммуностимулирующие молекулы 4-1BB, CD69, CD40L.

Заключение. Полученные лимфоциты c TCR-подобным CAR, специфичным к MAGE-A4, проявляют противоопухолевые свойства in vitro и могут быть рекомендованы к дальнейшим доклиническим испытаниям в экспериментальных моделях in vitro и in vivo.

Ключевые слова:CAR; TCR-подобные CAR-T-клетки; MAGE-A4; GITR; субпопуляции Т-клеток памяти; Т-клеточная активация; Т-клеточное истощение

Для цитирования: Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Характеристика лимфоцитов с MAGE-A4-специфичным TCR-подобным CAR-рецептором in vitro. Иммунология. 2022; 43 (4): 401-411. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-401-411

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда (проект № 21-65-00004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Курилин В.В., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В; сбор и обработка материала - Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Алсаллум А.; статистическая обработка данных - Терещенко В.П.; написание текста - Терещенко В.П.; редактирование - Терещенко В.П., Кузнецова М.С., Сенников С.В.; утверждение окончательного варианта статьи - Сенников С.В.; ответственность за целостность всех частей статьи - Терещенко В.П.

Введение

В настоящее время активно разрабатываются методы персонализированного лечения пациентов со злокачественными новообразованиями с помощью лимфоцитов с генетически модифицированным антиген-специфичным клеточным рецептором. Бурное развитие данного научного направления привело к появлению и тестированию целого ряда генетически модифицированных лимфоцитов, к которым относятся Т-клетки с химерным антигенным рецептором (CAR-Т-клетки), специфичным к поверхностным молекулам опухолевых клеток [1-4], a также Т-клетки с искусственно внесенным Т-клеточным рецептором (TCR) желаемой специфичности (TCR-инженерные T-клетки) [5, 6].

CAR-T-лимфоциты распознают эпитопы поверхностно расположенных антигенов, количество которых оценивается в 14-26 % от всего протеома клетки [7-9], что существенно ограничивает выбор возможных эффективных и специфичных мишеней для противоопухолевой CAR-Т-терапии. Однако внутриклеточный домен химерного рецептора может быть модифицирован для проведения дополнительных сигналов, обеспечивающих устойчивость лимфоцита к иммуносупрессивному микроокружению опухоли и истощению [10-12].

TCR-инженерные Т-лимфоциты, как и естественные Т-лимфоциты, распознают комплекс пептид- MHC (рМНС), пептид в котором может быть получен от антигенов из любого клеточного компартмента. Среди них могут присутствовать онкогены, непосредственно обусловливающие развитие опухолевого процесса, в том числе неоантигены, антигены онкогенных вирусов и зародышевые раковые антигены (cancer germ-line antigens) [13]. При этом, однако, для успешной активации TCR-инженерных T-клеток требуется полноценный костимуляторный сигнал, реализация которого может быть затруднена в условиях иммуносупрессивного микроокружения опухоли. Эффективность противоопухолевой терапии TCR-инженерными Т-лимфоцитами может быть увеличена за счет последующей вакцинации pMHC-несущими агентами, например MHC-мономерами или антиген-представляющими клетками [14].

Возможным путем объединения преимуществ и устранения недостатков CAR-T-клеточной и TCR-инженерной клеточной терапии может быть применение лимфоцитов с TCR-подобным CAR-рецептором [12, 13], антиген-распознающий домен которого представлен scFv-фрагментом TCR-подобного антитела, специфичного к комплексу желаемого эпитопа и молекулы MHC, а внутриклеточный сигнальный домен может повторять таковой для CAR-T-клеток. Таким образом, лимфоциты с TCR-подобным CAR-рецептором могут быть нацелены на антигены любой клеточной локализации, а их функция может быть усилена за счет модификаций внутриклеточного сигнального домена CAR-рецептора и посттрансферной вакцинацией с помощью pMHC-несущих агентов [15-16].

В данной работе описано получение, а также фенотипические и функциональные свойства лимфоцитов с TCR-подобным CAR-рецептором, антиген-распознающая часть которого специфична к эпитопу p230-239 (GVYDGREHTV) опухолевого антигена MAGE-A4, а внутриклеточный домен содержит активационный мотив GITR (glucocorticoid-induced TNFR-related protein, TNFRSF18, CD357).

Высокий уровень MAGE-A4 обнаружен в злокачественных новообразованиях головы и шеи, пищевода, желудка, яичников, эндометрия и других органов [17]. При этом MAGE-A4 является раково-эмбриональным антигеном, экспрессия которого в нормальных условиях ограничена иммунопривилегированными органами - яичками и плацентой, что делает MAGE-A4 перспективной мишенью для противоопухолевой терапии со сниженной нецелевой токсичностью. Однако предыдущие попытки таргетирования MAGE-A4 на солидных новообразованиях с помощью белковых и пептидных вакцин, а также TCR-инженерных лимфоцитов проявили ограниченную клиническую эффективность [18, 19]. Таким образом, поиск альтернативных вариантов анти-MAGE-A4-терапии остается актуальным.

Предлагаемый подход с использованием активационного мотива GITR во внутриклеточном домене CAR-конструкции может обеспечить повышенную терапевтическую эффективность, поскольку GITR является мощным костимулятором Т-клеток [20], а его внутриклеточный сигнал, приводящий к активации NF-κB, не подвержен супрессорному влиянию сигналинга PD-1 [21].

К тому же мы надеемся, что выявленные в нашей работе особенности влияния трансдукции CAR-конструкции на CD4- и CD8-лимфоциты могут быть полезны при последующей разработке противоопухолевой терапии, основанной на генетически модифицированных лимфоцитах.

Материал и методы

TCR-подобная CAR-конструкция

Для трансдукции лимфоцитов человека использовали гаммаретровирусную конструкцию, кодирующую химерный антигенный рецептор, содержащий scFv-фрагмент мышиного TCR-подобного антитела, специфичного к комплексу эпитопа MAGE-A4 p230-239 (GVYDGREHTV) и молекулы HLA-A02:01, трансмембранный домен CD28, ζ-цепь CD3 и внутриклеточный домен GITR. Вирусные частицы были сконструированы и наработаны на базе кафедры иммунной генной терапии Университета Миэ под руководством профессора Х. Шику.

Получение T-лимфоцитов с TCR-подобными CAR-рецепторами

МНК выделяли из периферической крови 6 условно-здоровых доноров на градиенте плотности фиколлурографина. 1 - 106 МНК в 2 мл среды GT-T551 (Takara Bio, Япония) с добавлением 300 ед/мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия) и 6 мкл/мл сыворотки группы AB высевали в лунку 12-луночного планшета, заранее покрытого 400 мкл раствора, содержащего 25 мг/мл ретронектина (Takara Bio, Япония) и 5 мг/мл анти-CD3-антител (Biolegend, США). На 2-й и 3-й дни культивирования меняли половину среды. На 3-й день готовили планшеты для ретровирусной трансдукции. Растворы ретровирусов размораживали при 37 оС и разводили в 4 раза. 1 мл полученного раствора переносили в лунку 24-луночного планшета, заранее покрытого 25 мг/мл ретронектина (Takara Bio, Япония). Далее планшет центрифугировали с ускорением 2000 g 2 ч при 32 оС.

После центрифугирования раствор ретровируса удаляли и в лунки добавляли 1,5-2 - 105 полученных лимфоцитов (преимущественно CD3+-лимфоцитов после анти-CD3-стимуляции). Клетки в планшетах центрифугировали при ускорении 1000 g 10 мин при 32 оС. На 4-й день трансдукцию повторяли и через 4-5 ч клетки переносили в 6-луночные планшеты в 3,5 мл культуральной среды. На 7-й день полученные клетки использовали для изучения эффективности трансдукции и фенотипа трансдуцированных клеток. На 8-й день трансдуцированные клетки использовали для постановки тестов цитотоксичности.

Оценка эффективности трансдукции и фенотипа Т-лимфоцитов с TCR-подобным CAR

Оценку эффективности трансдукции и фенотипа Т-лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии для 6 условно-здоровых доноров. На 7-й день из лунок, содержащих трансдуцированные клетки, забирали аликвоты по 100 мкл. Для анализа эффективности трансдукции полученные аликвоты метили MHC-тетрамерами-PE (предоставлены профессором Х. Шику, Высшая школа медицины Университета Мие, Япония). Также пробы метили флуоресцентными антителами, специфичными к антигенам человека: анти-CD3-AF700, анти-CD4-Bv570, анти-CD8- PeCy7, анти-CD45RA-Bv711, анти-CD62L-AF488, анти-CD95(Fas)-PerCP-Cy5.5, анти-CD69-AF647, анти-PD-1- Bv421, анти-TIM3-APC/Cy7 (Biolegend, США).

Для выявления клеток с поврежденной мембраной клетки метили витальным красителем Zombie Aqua (Biolegend, США). Меченые пробы инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре, затем отмывали в 2 мл PBS c NaN3 и анализировали на проточном цитометре Attune NxT (Thermo Fisher Scientific, США). Гейтирование интересующих маркеров проводили по FMO-контролям (fluorescence-minus-one). Анализ данных проточной цитометрии проводили с использование программного обеспечения FlowJo v10.8.1 (BD Bioscience, США).

Оценка цитотоксичности Т-лимфоцитов с TCR-подобным CAR in vitro

Цитотоксичность изучали колориметрическим методом по содержанию лактатдегидрогеназы (ЛДГ) с помощью коммерческого набора CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (Promega, США) согласно инструкции производителя. Кратко: полученные после трансдукции генно-модифицированные клетки культивировали совместно с клетками-мишенями, представляющими собой клетки опухолевых линий, экспрессирующие или неэкспрессирующие целевой антиген. В качестве антиген-экспрессирующих (MAGE-A4+) опухолевых клеток-мишеней использовали линию меланомы человека NW-Mel-38. В качестве антиген-негативного контроля - линию клеток рака толстой кишки человека HCT-116 (MAGE-A4-).

Перед проведением теста цитотоксичности осуществляли калибровку для выявления оптимального количества клеток-мишеней, клеток-эффекторов и оптимальной временной точки анализа. Далее для изучения цитотоксичности в плоскодонные 96-луночные планшеты высевали по 4 - 103 клеток соответствующих опухолевых линий. Через 17-18 ч к опухолевым клеткам добавляли по 20 - 103 клеток (соотношение эффектор : мишень = 5 : 1) из трансдуцированных или нетрансдуцированных культур. После 7-8 ч совместного культивирования из лунок забирали 50 мкл среды, которую анализировали на содержание ЛДГ. Полученную цитотоксичность CAR-трансдуцированных культур сравнивали с цитотоксичностью нетрансдуцированных культур.

Оценка экспрессии маркеров активации и цитотоксичности на лимфоцитах после культивирования с клетками-мишенями

Полученные после трансдукции лимфоциты с TCR- подобным CAR-рецептором культивировали совмест- но с клетками-мишенями (NW-Mel-38, SK-Mel-37 - MAGE-A4+, HCT-116 - MAGE-A4-) в соотношении 10 : 1 (эффектор : мишень) в течение 4-5 ч. После этого клетки собирали и метили MHC-тетра- мерами-PE и моноклональными антителами: анти-CD3-AF700, анти-CD4-Bv570, анти-CD8-PeCy7, анти-CD69-AF647, анти-CD154(CD40L)-PerCP/Cy5.5, анти-CD178(FasL)-BV421™, анти-CD137(4-1BB)-BV711™ (Biolegend, США). Гейтирование маркеров интереса проводили с использованием FMO-контролей. Анализ данных проточной цитометрии выполняли с использованием программного обеспечения FlowJo v10.8.1 (BD Bioscience, США).

Статистическая обработка данных

Статистическую обработку данных выполняли с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 9 (GraphPad Software, США). Полученные данные проверяли на нормальность тестами Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Далее данные анализировали подходящими статистическими методами. Использованные статистические методы указаны в подписях к рисункам.

Результаты

Эффективность трансдукции и фенотип лимфоцитов, трансдуцированных TCR-подобным CAR-рецептором

После трансдукции клеток условно-здоровых доноров анти-MAGE-A4 TCR-подобной CAR-конструкцией с помощью проточной цитометрии внутри каждого образца были проанализированы эффективность трансдукции и фенотип трансдуцированных и нетрансдуцированных CD4- и CD8-Т-лимфоцитов по маркерам клеток памяти (CD45RA, CD62L), маркерам клеточной активации (CD69, CD95, PD-1) и истощения (PD-1, TIM-3). Пример полученных цитометрических данных и схема гейтирования представлены на рис. 1.

Согласно цитометрическим данным, эффективность трансдукции CD3+-лимфоцитов анти-MAGE-A4 TCR-подобной CAR-конструкцией по реализуемому протоколу составила 40,52 ± 12,28 % (средняя и стандартное отклонение), с минимумом 22,1 % и максимумом 55,4 %.

Трансдукция значимо не влияла на жизнеспособность Т-лимфоцитов. Так, количество клеток с поврежденной мембраной среди CD3+-лимфоцитов составляло 5,52 ± 2,2 % для трансдуцированных клеток и 3,2 ± 1,2 % для нетрансдуцированных (средняя и стандартная ошибка средней). Однако среди трансдуцированных (CAR+) CD4+-лимфоцитов обнаружено значимо большее количество терминально дифференцированных эффекторных клеток (Temra, CD62L-CD45RA+) по сравнению с нетрансдуцированными (9,1 ± 3 % и 6,8 ± 3,1 % соответственно, средняя и стандартная ошибка средней, p = 0,042; t-тест для зависимых выборок, n = 6) (рис. 2).

При этом среди трансдуцированных CD4+-Т-лимфоцитов присутствовало значимо меньше центральных клеток памяти (Tcm, CD62L+CD45RA-), чем среди нетрансдуцированных (CAR-; 38,02 ± 3,78 % и 45,02 ± 4,5 % соответственно, средняя и стандартная ошибка средней, p = 0,018; t-тест для зависимых выборок, n = 6).

Для трансдуцированных CD8+-лимфоцитов отмечено значимое увеличение содержания эффекторных клеток памяти (Tem, CD62L-CD45RA-, 11,73 ± 2,82 для CAR+ и 7,92±2,14 для CAR-, средние и стандартная ошибка среднего, n = 6, p = 0,034, t-тест для зависимых выборок) и значимое снижение содержания центральных клеток памяти (Tcm, CD62L+CD45RA-, 23,4±5,43 для CAR+ и 26,96 ± 6,24 для CAR-, средние и стандартная ошибка среднего, n = 6, p = 0,023, t-тест для зависимых выборок).

Анализ функциональных маркеров выявил, что среди трансдуцированных лимфоцитов повышено количество клеток, несущих маркеры активации и истощения. Так, среди трансдуцированных CD4+-Т-лимфоцитов обнаружено значимо большее содержание клеток, несущих маркеры активации CD69 и PD-1 и имеющих фенотип клеточного истощения PD-1+TIM3+, по сравнению с нетрансдуцированными клетками (рис. 3, верхний ряд). Для трансдуцированных CD8+-лимфоцитов статистически значимое повышение было отмечено только для клеток с фенотипом клеточного истощения PD-1+TIM3+ (см. рис. 3, нижний ряд).

Эффекторные свойства Т-лимфоцитов с TCR-подобным CAR

Анализ цитотоксичности культур выявил, что цитотоксичность культур, трансдуцированных анти-MAGE-A4 TCR-подобной CAR-конструкцией, против MAGE-A4-экспрессирующей клеточной линии (NW-MEL-38) статистически значимо превышает цитотоксичность трансдуцированных культур против MAGE-A4-негативной клеточной линии (HCT-116) и цитоксичность нетрансдуцированных культур против MAGE-A4-экспрессирующей линии (рис. 4).

При этом среди трансдуцированных CD4+-лимфоцитов было отмечено статистически значимое повышение доли клеток, несущих маркеры активации CD40L, CD69 и FasL, при сокультивировании с MAGE-A4+-клеточными линиями (NW-MEL-38, SK-MEL-37 и SK-MEL-37, соответственно) по сравнению с культурами без клеток-мишеней (для CD40L, CD69 и FasL), клетками-мишенями, негативными по экспрессии MAGE-A4 (для CD69 и FasL), и культурами с нетрансдуцированными клетками в качестве эффекторов (для CD40L, CD69; рис. 5, верхний ряд).

Для трансдуцированных CD8+-лимфоцитов, сокультивированных с MAGE-A4+-клеточной линией SK-MEL-37, отмечено статистически значимое повышение доли клеток, экспрессирующих маркеры 41BB, CD40L и CD69, по сравнению с CD8+-лимфоцитами, культивируемыми без клеток-мишеней, с клетками-мишенями, негативными по MAGE-A4, и с нетрансдуцированными CD8+-лимфоцитами, сокультивированными с SK-MEL-37 (см. рис. 5, нижний ряд). При сокультивировании CD8+-лимфоцитов с MAGE-A4+-клеточной линией NW-MEL-38 отмечено статистически значимое повышение доли клеток, экспрессирующих CD40L, по сравнению с CD8+-лимфоцитами, культивируемыми без клеток-мишеней, с клетками-мишенями, негативными по MAGE-A4, и с нетрансдуцированными CD8+-лимфоцитами, сокультивированными с NW-MEL-38. Также при сокультивировании трансдуцированных CD8+-лимфоцитов с линией NW-MEL-38 отмечено статистически значимое повышение доли CD69-экспрессирующих клеток по сравнению с CD8+-лимфоцитами, культивируемыми с клетками-мишенями, негативными по MAGE-A4, и с нетрансдуцированными CD8+-лимфоцитами, сокультивированными с NW-MEL-38.

Обсуждение

В данной работе представлена характеристика CD4+- и CD8+-лимфоцитов после трансдукции TCR-подобной CAR-конструкцией, антиген-распознающий домен которой специфичен к раково-эмбриональному антигену MAGE-A4, а внутриклеточный домен содержит активационный мотив GITR.

В рамках работы было выявлено, что трансдукция Т-лимфоцитов предложенной CAR-конструкцией приводила к сдвигу количественного соотношения субпопуляций клеток памяти в сторону более дифференцированных [22], а также к увеличению экспрессии ряда молекул активации и истощения. Так, трансдуцированные CD4+-лимфоциты отличались от нетрансдуцированных значимо большим содержанием терминально дифференцированных эффекторных клеток (Temra) и значимо меньшим содержанием центральных клеток памяти (Tcm) (см. рис. 2). Трансдуцированные CD8+-лимфоциты содержали меньше Tcm, но больше эффекторных клеток памяти (Tem).

Среди трансдуцированных CD4+-лимфоцитов отмечено значимо больше клеток, несущих маркер активации CD69, отражающий наличие CD3-стимуляции [23], что может говорить о тоническом сигналинге с CD3-ζ-домена CAR-рецептора [24] (см. рис. 3). Также для трансдуцированных CD4+-лимфоцитов отмечено значимо увеличенная доля клеток с активированным фенотипом PD-1+TIM3- [25] и фенотипом клеточного истощения PD-1+TIM3+ [26]. Для трансдуцированных CD8+-лимфоцитов отмечено лишь увеличенная доля клеток с фенотипом истощения PD-1+TIM3+.

Таким образом, трансдукция и тонический сигналинг с используемой CAR-конструкции стимулировали дальнейшее продвижение некоторых лимфоцитов по пути активация-дифференцировка-истощение. При этом если клеточное истощение в результате тонического CD3-ζ-сигналинга является хорошо известным феноменом для CAR-T-клеток [24], то увеличение доли более дифференцированных Т-клеток памяти нуждается в дальнейшем изучении. Возможно, оно связано с костимуляторным GITR-сигналингом, обеспечиваемым примененной конструкцией. При этом данный эффект был более выражен для CD4+-лимфоцитов. Однако все же большая часть как трансдуцированных CD4+-, так CD8+-лимфоцитов была представлена низкодифференцированными субпопуляциями наивных Т-лимфоцитов (Tnaive) и центральных лимфоцитов памяти, не несла маркеров активации и истощения, что относится к факторам, увеличивающим эффективность противоопухолевой терапии [27].

Культуры, трансдуцированные TCR-подобным анти-MAGE-A4-CAR, обладали значимо большей способностью к уничтожению MAGE-A4-экспрессирующей клеточной линии по сравнению с нетрансдуцированными культурами и их способностью уничтожать MAGE-A4-негативные опухолевые клетки, что говорит об антиген-специфичной цитотоксичности полученных Т-лимфоцитов c TCR-подобным CAR-рецептором (см. рис. 4).

При этом реализация цитотоксической функции сопровождалась повышением доли трансдуцированных CD4+- и CD8+-лимфоцитов, несущих активационные и эффекторные молекулы. Так, доля трансдуцированных CD4+- и CD8+-лимфоцитов, несущих CD40L - мощный активатор Т-, B-, дендритных и неиммунных клеток [28, 29], было увеличено после сокультивирования с экспрессирующими MAGE-A4 опухолевыми линиями, но не после сокультивирования с MAGE-A4--клетками.

Данного явления не наблюдалось для нетрансдуцированных лимфоцитов (см. рис. 5). Также среди трансдуцированных CD4+- и CD8+-лимфоцитов, сокультивированных с MAGE-A4+-линиями опухолевых клеток, наблюдалось увеличение доли CD69+-клеток до уровня, превышающего уровень после трансдукции (см. рис. 3, рис. 5), что может говорить о возникновении эффективного надпорогового CD3-сигналинга при активном распознавании мишеней CAR-рецептором.

При сокультивировании с MAGE-A4--клетками и использовании нетрансдуцированных клеток в качестве эффекторов данных явлений не наблюдалось. Доля трансдуцированных CD4+- и СD8+-лимфоцитов, несущих FasL, демонстрировало схожую с маркерами CD40L и CD69, но менее выраженную тенденцию. Возможно, это связано с тем, что для CAR-T-клеток, как и для обычных лимфоцитов, основным является перфорин-гранзимовый механизм цитотоксичности [30]. Костимуляторная молекула 4-1BB, сигналинг которой способен выводить лимфоциты из состояния истощения [24], была обнаружена на значимо большем количестве трансдуцированных CD8+-лимфоцитов, сокультивированных MAGE-A4+ линией SK-MEL-37, чем при сокультивировании с MAGE-A4- клетками и использовании нетрансдуцированных клеток в качестве эффекторов.

Таким образом, согласно полученным данным, при сокультивировании с опухолевыми клетками, несущими антиген-мишень, полученные CD4+- и CD8+-лимфоциты, несущие MAGE-A4-специфичный TCR-подобный CAR, усиливали свое активированное состояние путем увеличения доли клеток, несущих иммуностимуляторные и эффекторные молекулы. Также стоит отметить, что сигнальные домены изученных костимуляторных молекул (4-1BB, CD40L) [18-25] сейчас активно используются для разработки высокоэффективных CAR-T-клеток, и, соответственно, их экспрессия в полученных трансдуцированных лимфоцитах может способствовать повышенной эффективности полученных CAR-T-клеток.

Заключение

В проведенном исследовании выполнена характеристика in vitro одного из перспективных вариантов CAR-Т-лимфоцитов - с TCR-подобным CAR-рецептором, специфичным к опухоль-ассоциированному антигену MAGE-A4 и несущим активационный мотив GITR в сигнальной части. Отмечены явления истощения лимфоцитов под действием трансдукции и передачи сигнала от внесенного CAR-рецептора, а также увеличения доли более дифференцированных Т-клеток памяти среди трансдуцированных CD4+- и CD8+-лимфоцитов. Однако большая часть трансдуцированных лимфоцитов была представлена низкодифференцированными субпопуляциями Т-клеток памяти и не несла маркеров активации и истощения, что относится к факторам, увеличивающим эффективность противоопухолевой терапии. Полученные лимфоциты с TCR-подобным CAR, специфичным к MAGE-A4, проявляли антиген-специфичную цитотоксичность, сопровождающуюся увеличением доли клеток, несущих иммуностимуляторные молекулы, что может способствовать повышенной эффективности используемых клеток. Таким образом, полученные MAGE-A4-специфичные TCR-подобные CAR-Т-клетки могут быть рекомендованы к дальнейшему изучению их свойств и эффективности в условиях in vitro и in vivo.

Литература

1. Lee D.W., Kochenderfer J.N., Stetler-Stevenson M., Cui Y.K., Delbrook C., Feldman S.A. et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet. 2015; 385: 517-28. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(14)61403-3

2. Maude S.L., Frey N., Shaw P.A., Aplenc R., Barrett D.M., Bu- nin N.J. et al. Chimeric antigen receptor T cells for sustained remissions in leukemia. N. Engl. J. Med. 2014; 371: 1507-17. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1407222

3. Киселевский М.В., Чикилева И.О., Ситдикова С.М., Вла- сенко Р.Я., Караулов А.В. Перспективы применения генетически модифицированных лимфоцитов с химерным Т-клеточным рецептором (CAR-T-клеток) для терапии солидных опухолей. Иммунология. 2019; 40 (4): 48-55. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-140064

4. Stepanov A.V., Markov O.V., Chernikov I.V., Gladkikh D.V., Zhang H., Jones T. et al. Autocrine-based selection of ligands for persona- lized CAR-T therapy of lymphoma. Sci. Adv. 2018; 4 (11): aau4580. DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv.aau4580

5. Sanderson J.P., Crowley D.J., Wiedermann G.E., Quinn L.L., Crossland K.L., Tunbridge H.M. et al. Preclinical evaluation of an affinity-enhanced MAGE-A4-specific T-cell receptor for adoptive T-cell therapy. Oncoimmunology. 2020; 9 (1): 1682381. DOI: https://doi.org/10.1080/2162402X.2019.1682381

6. Hiasa A., Hirayama M., Nishikawa H., Kitano S., Nukaya I., Yu S.S. et al. Long-term phenotypic, functional and genetic stability of cancer-specific T-cell receptor (TCR) αβ genes transduced to CD8+ T cells. Gene Ther. 2008; 15: 695-9. DOI: https://doi.org/10.1038/sj.gt.3303099

7. Bausch-Fluck D., Goldmann U., Müller S., van Oostrum M., Müller M., Schubert O.T. et al. The in silico human surfaceome. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2018; 115 (46): E10 988-97. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1808790115

8. Fagerberg L., Jonasson K., von Heijne G., Uhlén M., Berglund L. Prediction of the human membrane proteome. Proteomics. 2010; 10: 1141-9. DOI: https://doi.org/10.1002/pmic.200900258

9. Kulemzin S.V., Gorchakov A.A., Taranin A.V. Prostate cancer surface targets for CAR T cell therapy or metastatic prostate cancer in the CAR T cell era: My kingdom for the target! Cell. Ther. Transplant. 2019; 8:19-28. DOI: https://doi.org/10.18620/ctt-1866-8836-2019-8-4-19-28

10. Zhang H., Li F., Cao J., Wang X., Cheng H., Qi K. et al. A chimeric antigen receptor with antigen-independent OX40 signaling mediates potent antitumor activity. Sci. Transl. Med. 2021; 13 (578): eaba7308. DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aba7308

11. Golubovskaya V.M. GITR domain inside CAR co-stimulates activity of CAR-T cells against cancer. Front. Biosci. 2018; 23: 4703. DOI: https://doi.org/10.2741/4703

12. Tang X., Tang Q., Mao Y., Huang X., Jia L., Zhu J. et al. CD137 Co-stimulation improves the antitumor effect Of LMP1-specific chimeric antigen receptor T cells in vitro and in vivo. Oncotargets Ther. 2019; 12: 9341-50. DOI: https://doi.org/10.2147/OTT.S221040

13. Shafer P., Kelly L.M., Hoyos V. Cancer therapy with TCR-engineered T cells: current strategies, challenges, and prospects. Front. Immunol. 2022; 13: 835752. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.835762

14. Chodon T., Comin-Anduix B., Chmielowski B., Koya R.C., Wu Z., Auerbach M. et al. Adoptive transfer of MART-1 T-cell receptor transgenic lymphocytes and dendritic cell vaccination in patients with metastatic melanoma. Clin. Cancer Res. 2014; 20: 2457-65. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-13-3017

15. Akahori Y., Wang L., Yoneyama M., Seo N., Okumura S., Miyahara Y. et al. Antitumor activity of CAR-T cells targeting the intracellular oncoprotein WT1 can be enhanced by vaccination. Blood. 2018; 132: 1134-45. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2017-08-802926

16.Dragon A.C., Zimmermann K., Nerreter T., Sandfort D., Lahrberg J., Klöß S. et al. CAR-T cells and TRUCKs that recognize an EBNA-3C-derived epitope presented on HLA-B*35 control Epstein-Barr virus-associated lymphoproliferation. J. Immunother. Cancer. 2020; 8: e000736. DOI: https://doi.org/10.1136/jitc-2020-000736

17. Терещенко В.П., Сенников С.В. Опухолевые ксенотранс- плантаты как модель для доклинических испытаний генетически модифицированных клеточных препаратов. Иммунология. 2021; 42 (6): 730-41. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6- 730-741

18.Zajac P., Schultz-Thater E., Tornillo L., Sadowski C., Trella E., Mengus C. et al. MAGE-A antigens and cancer immunotherapy. Front. Med. 2017; 4: 18. DOI: https://doi.org/10.3389/fmed.2017.00018

19. Kageyama S., Ikeda H., Miyahara Y., Imai N., Ishihara M., Saito K. et al. Adoptive transfer of MAGE-A4 T-cell receptor gene-transduced lymphocytes in patients with recurrent esophageal cancer. Clin. Cancer Res. 2015; 21: 2268-77. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-14-1559

20.He Y., Vlaming M., van Meerten T., Bremer E. The implementation of TNFRSF co-stimulatory domains in CAR-T cells for optimal functional activity. Cancers (Basel). 2022; 14: 299. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers14020299

21.Hauer J., Püschner S., Ramakrishnan P., Simon U., Bongers M., Federle C. et al. TNF receptor (TNFR)-associated factor (TRAF) 3 serves as an inhibitor of TRAF2/5-mediated activation of the noncanonical NF-κB pathway by TRAF-binding TNFRs. Proc. Natl Acad. Sci. 2005; 102: 2874-9. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0500187102

22.Brummelman J., Pilipow K., Lugli E. The single-cell phenotypic identity of human CD8+ and CD4+ T cells. Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2018; 341: 63-124. DOI: https://doi.org/10.1016/bs.ircmb.2018.05.007

23.Testi R., Phillips J.H., Lanier L.L. T cell activation via Leu-23 (CD69). J. Immunol. 1989; 143: 1123.

24.Long A.H., Haso W.M., Shern J.F., Wanhainen K.M., Murgai M., Ingaramo M. et al. 4-1BB costimulation ameliorates T cell exhaustion induced by tonic signaling of chimeric antigen receptors. Nat. Med. 2015; 21: 581-90. DOI: https://doi.org/10.1038/nm.3838

25.Hui E., Cheung J., Zhu J., Su X., Taylor M.J., Wallweber H.A. et al. T cell costimulatory receptor CD28 is a primary target for PD-1-mediated inhibition. Science. 2017; 355: 1428-33. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aaf1292

26.Yang R., Sun L., Li C.-F., Wang Y.-H., Yao J., Li H. et al. Galectin-9 interacts with PD-1 and TIM-3 to regulate T cell death and is a target for cancer immunotherapy. Nat. Commun. 2021; 12: 832. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-021-21099-2

27.Golubovskaya V., Wu L. Different subsets of T cells, memory, effector functions, and CAR-T immunotherapy. Cancers (Basel). 2016; 8: 36. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers8030036

28.Loskog A., Totterman T. CD40L - a multipotent molecule for tumor therapy. Endocr. Metab. Immune Disord. Drug Targets. 2007; 7: 23-8. DOI: https://doi.org/10.2174/187153007780059432

29.Karnell J.L., Rieder S.A., Ettinger R., Kolbeck R. Targeting the CD40-CD40L pathway in autoimmune diseases: humoral immunity and beyond. Adv. Drug Deliv. Rev. 2019; 141: 92-103. DOI: https://doi.org/10.1016/j.addr.2018.12.005

30.Mamonkin M., Rouce R.H., Tashiro H., Brenner M.K. A T-cell-directed chimeric antigen receptor for the selective treatment of T-cell malignancies. Blood. 2015; 126: 983-92. DOI: https://doi.org/10.1182/blood-2015-02-629527

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Редакционная коллегия журнала «Иммунология» и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России с прискорбием сообщают, что 11.03.2022 г. скончался Президент журнала «Иммунология», научный руководитель Института академик РАН Хаитов Рахим Мусаевич
Медицина сегодня
Съезд хирургов ФМБА России

Съезд хирургов ФМБА России " Высокотехнологичная медицинская помощь: концепция безопасности и единого хирургического пространства " 14-15 октября 2022 года, г. Санкт-Петербург Впервые в истории хирургическая безопасность будет изучена столь подробно! Отныне "S afe surgery "...

Председатель организационного комитета 17-го Национального конгресса терапевтов - министр здравоохранения Российской Федерации - Михаил Альбертович Мурашко

Председатель организационного комитета 17-го Национального конгресса терапевтов - министр здравоохранения Российской Федерации - Михаил Альбертович Мурашко В программе конгресса запланированы более 150 образовательных секций, симпозиумов, клинических разборов, мастер-классов...

Представляем оргкомитет 17-го Национального конгресса терапевтов

Уважаемые коллеги! Представляем оргкомитет 17-го Национального конгресса терапевтов (с международным участием) , который состоится 12-14 октября в МВЦ "Крокус Экспо" (павильон 3, Зал 20, г. Москва). · Президент Российского научного медицинского общества терапевтов,...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»