Проблемы, связанные с нежелательной иммуногенностью биотехнологических лекарственных препаратов (терапевтических белков). Сообщение 1. Методические подходы к оценке иммуногенности

• Авдеева Жанна Ильдаровна
• Солдатов Александр Алексеевич
• Бондарев В.П.
• Меркулов Вадим Анатольевич
• Медуницын Н.В.

Резюме

В обзоре приведена информация, касающаяся вопросов, связанных с проявлением нежелательной иммуногенности биотехнологических лекарственных препаратов (терапевтических белков), предназначенных для лечения тяжелых хронических заболеваний. Приведены сведения о факторах, которые влияют на иммуногенность препарата, включая его структурные и физико-химические характеристики, а также опосредованные заболеванием и зависящие от пациента. Приведены общие сведения о клинических проявлениях иммунного ответа на препарат, принципы изучения иммуногенности и оценки рисков, связанных с клиническими последствиями проявления нежелательной иммуногенности терапевтических белков. Изложены методологические подходы к изучению иммунного ответа, индуцированного введением лекарственного препарата.

Ключевые слова:биотехнологические лекарственные препараты; терапевтические белки; антитела к лекарственному препарату; факторы риска; нежелательные реакции; клинические последствия; оценка иммуногенности

Количество разрабатываемых и внедряемых в клиническую практику биотехнологических лекарственных препаратов с каждым годом неуклонно растет. Указанные препараты успешно применяются для лечения онкологических, системных воспалительных аутоиммунных, инфекционных, аллергических и других заболеваний. Действующим веществом препаратов являются белки и полипептиды, которые получают, как правило, используя рекомбинантные системы экспрессии. В настоящее время для обозначения таких лекарственных препаратов используется термин "терапевтический белок".

Эффективность применения терапевтических белков, обусловленная таргентным действием на патогенетически значимые мишени, определяющие механизмы развития заболевания, подтверждается опытом успешного клинического применения препаратов [1-9]. Как правило, большинство нежелательных реакций (побочных эффектов), развивающихся при применении терапевтических белков, обусловлено их фармакологическими эффектами. Однако в связи с тем, что указанные препараты имеют белковую природу, они также характеризуются способностью индуцировать нежелательный иммунный ответ, что часто сопровождается клиническими последствиями: развитием побочных реакций, снижением или потерей эффективности терапевтического воздействия лекарственного препарата [10-15]. Частота и степень риска проявления нежелательной иммуногенности варьируют в зависимости от отдельных препаратов или их группы, с одной стороны, а также в зависимости от патологии, отдельных групп пациентов или их индивидуальных особенностей, с другой. При разработке новых терапевтических белков проводятся исследования по оценке потенциальной иммуногенности создаваемого препарата, оценке риска развития нежелательного иммунного ответа, а также выполняется комплексный анализ клинической значимости проявлений иммуногенности. Объем и тип исследований иммуногенного потенциала препарата до его регистрации зависят от риска потенциальной иммуногенности, установленной на этапе оценки качества, доклинических и клинических исследований. Пострегистрационные исследования иммуногенности планируются с учетом риска и тяжести проявления побочных реакций, связанных с иммуногенностью, наблюдаемых при проведении клинических исследований препарата на этапе его регистрации.

Принципы проведения исследований с целью оценки иммуногенности терапевтических белков регламентируются требованиями нормативных документов. Базовым является документ, разработанный Европейским медицинским агентством (ЕМА) - EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006 [16], который периодически обновляется на основе анализа опыта применения ранее зарегистрированных препаратов, накопления сведений о научных достижениях в области биотехнологии, совершенствования методических подходов к оценке качества биотехнологических препаратов [17-19]. При усовершенствовании и обновлении отечественных руководств по данной проблеме [20], а также при разработке руководства Евразийского экономического союза [21, 22] принципиально важным является вопрос гармонизации рекомендаций с международными документами.

В данном обзоре отражены основные положения, касающиеся нежелательной иммуногенности терапевтических белков, принципы проведения исследований по оценке их иммуногенности и комплексному анализу клинической значимости проявлений иммуногенности с учетом рекомендаций, приведенных в обновленном документе ЕМА [19].

Нежелательная иммуногенность терапевтических белков

Биотехнологические лекарственные препараты белковой природы (терапевтические белки), к которым относятся препараты рекомбинантных цитокинов и их рецепторов, антагонистов рецепторов цитокинов, препараты рекомбинантных факторов свертывания крови, гормоны, факторы роста, эритропоэтины, препараты моноклональных антител (МкАТ) и белков слияния (fusion proteins), как правило, применяются длительно для лечения хронических тяжело протекающих заболеваний.

При снижении или полном отсутствии синтеза определенных белков в организме больного указанные препараты применяются в качестве заместительной терапии указанных эндогенных белков. В частности, пациенты с гемофилией нуждаются в проведении постоянной заместительной терапии препаратами на основе рекомбинантных факторов свертывания, поскольку гемофилия обусловлена недостаточностью или полным отсутствием факторов свертывания крови (фактора VIII или IX), вследствие мутации соответствующих генов [23, 24]. При системных воспалительных аутоиммунных заболеваниях, таких как ревматоидный артрит, анкилозирующий спондилоартрит, псориаз и псориатический артрит, болезнь Крона, язвенный колит, в последние годы успешно применяются препараты МкАТ, препараты на основе модифицированных МкАТ (белки слияния - fusion proteins) и др., специфичные к провоспалительным цитокинам или их рецепторам: фактору некроза опухолей альфа (ФНОα), рецепторам интерлейкина-1 (ИЛ-1) или ИЛ-6, к антигену (АГ) CD20, экспрессированному на активированных В-лимфоцитах (В-Лф) и др. К таким препаратам относятся инфликсимаб - МкАТ к ФНОα; тоцилизумаб - МкАТ к рецептору ИЛ-6; абатасепт - молекула, состоящая из внеклеточного домена CTLA-4 (CD 152) и Fc-фрагмента IgG1 человека; этанерцепт - молекула, состоящая из рецептора ФНО и Fc-фрагмента IgG1 человека; анакинра - рекомбинантный антагонист рецептора ИЛ-1; ритуксимаб -МкАТ к CD20 на В-Лф и др. [25-32].

При онкологических заболеваниях используют МкАТ, специфичные к факторам роста или рецепторам ростовых факторов, экспрессированным на опухолевых клетках, МкАТ или препараты на основе белков слияния, направленные к опухоль-ассоциированным АГ, а также препараты модифицированных МкАТ, стимулирующие активность противоопухолевого иммунитета [33-43]. К таким препаратам относятся трастузумаб, пертузумаб - МкАТ к рецептору эпидермального ростового фактора человека 2-го типа (HER-2); цетуксимаб и панитумумаб - МкАТ к рецептору эпидермального фактора роста (ЭФР); бевацизумаб - МкАТ к фактору роста эндотелия сосудов (ФРЭС); афлиберцепт - рекомбинантный белок слияния/fusion protein, специфичный к ФРЭС (VEGF-А, VEGF-В и PLGF); ритуксимаб, офа-тумумаб и обинутузумаб - МкАТ к CD20 на опухолевых В-Лф; алемтузумаб - МкАТ к CD52 на малигнизированных В- и Т-Лф; ипилимумаб - МкАТ, специфичные к АГ CTLA-4, экспрессированному на Т-Лф, ключевому регулятору активации Т-Лф; ниволумаб и пембролизу-маб - МкАТ, специфичные к рецептору PD-1, экспрессированному на Т-Лф, которые блокируют взаимодействие рецептора PD-1 с его лигандами PD-L1 и PD-L2, представленными на опухолевых клетках и др.

Указанные биотехнологические препараты применяются длительно. Клиническая эффективность препаратов обусловлена высокой избирательностью действия, в основе которого лежит их способность подавлять системные реакции воспаления при аутоиммунной патологии за счет ингибирования проявления биологического действия провоспалительных цитокинов или частичной элиминации гиперактивных клеток - продуцентов аутоантител. При заболеваниях онкологической природы эффективность препаратов проявляется за счет прямого цитотоксического действия на клетки-мишени, экспрессирующие соответствующие АГ, ассоциированные с опухолевым процессом; за счет подавления процессов, поддерживающих рост и пролиферацию опухолевых клеток и сосудов, васкуализирующих опухолевые ткани; за счет блокады биоактивных молекул, важных для реализации злокачественного фенотипа клеток или за счет индукции и активации противоопухолевого иммунитета, что обеспечивает элиминацию опухолевых клеток.

При распознавании иммунной системой человека антигенных детерминант терапевтического белка как чужеродных формируется иммунный ответ на лекарственный препарат при его клиническом применении. Как правило, иммунный ответ является комплексным, включает формирование АТ, специфичных к АГ компонентов лекарственного препарата, Т-клеток-эффекторов, а также активацию системы врожденного иммунитета.

Последствием развития иммунного ответа на лекарственный препарат может быть или кратковременное формирование транзиторных АТ, которые не проявляются клинически значимыми симптомами, или развитие комплексного стойкого иммунного ответа, который является причиной проявления тяжелых, угрожающих жизни состояний.

Клинически значимые последствия развития такого нежелательного иммунного ответа могут проявляться в снижении эффективности терапевтического белка, развитии тяжелых острых иммунных реакций (аллергические IgE-опосредованные реакции), а также перекрестной реактивности с эндогенным белком-аналогом при применении лекарственного препарата в качестве заместительной терапии.

На проявление иммуногенности терапевтического белка, т. е. на частоту формирования и выраженность иммунного ответа оказывает влияние множество факторов, включая те, которые зависят от состояния и особенностей пациента, опосредованы основным заболеванием или определяются характеристиками лекарственного препарата.

Факторы, влияющие на развитие иммунного ответа на терапевтический белок

Среди факторов, которые оказывают влияние на проявления иммуногенных свойств биотехнологических лекарственных препаратов, выделяют следующие: зависящие от пациента, опосредованные заболеванием или свойствами и характеристиками самого лекарственного препарата.

Факторы, зависящие от особенностей организма пациента

Генетические особенности отдельных лиц являются причиной вариабельности ответа на терапевтический белок у исследуемой популяции пациентов.

Различия на уровне молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) и Т-клеточного рецептора могут модифицировать процесс распознавания АГ; при этом стойкость и выраженность иммунного ответа может зависеть от генетических особенностей на уровне иммуномодулирующих факторов, например, эндогенных медиаторов (цитокинов) и их рецепторов.

Особого внимания требует вопрос оценки иммуногенности терапевтического белка при его применении в качестве заместительной терапии для пациентов с полной или частичной недостаточностью синтеза эндогенного белка, или в случае синтеза его модифицированной формы. Иммунная система пациента может воспринимать лекарственный препарат на основе неизмененной антигенной структуры белка его как неоантиген и будет распознавать его как чужеродный, отвечая развитием иммунного ответа.

Возраст пациента может влиять на развитие иммунного ответа на терапевтические белки. Различие в частоте и интенсивности иммунных реакций на биологический препарат можно ожидать у детей в зависимости от их возраста, поскольку известно, что уровень созревания иммунной системы у детей разных возрастных групп отличается. В связи с этим результаты исследования иммуногенности на этапе клинической разработки препарата не могут быть однозначно экстраполированы на пациентов, относящихся к другим возрастным группам. Клинические исследования препарата, предназначенного для педиатрической популяции, должны проводиться с участием пациентов разных возрастных групп. У пациентов пожилого возраста частота развития и клинические проявления иммунного ответа также могут отличаться.

Факторы, опосредованные особенностями заболевания

В зависимости от заболевания можно ожидать большую или меньшую частоту и выраженность развития нежелательного иммунного ответа на терапевтический белок. У пациентов с инфекционным процессом, аллергическими или аутоиммунными воспалительными заболеваниями возможно более частое развитие иммунного ответа на терапевтические белки за счет активации иммунной системы. При прогрессировании онкологических заболеваний, поздних стадиях ВИЧ-инфекции, развитии симптомов органной недостаточности, истощении организма вследствие дефицита питания, как правило, менее вероятно формирование иммунного ответа, что может быть связано с проявлениями вторичного иммунодефицитного состояния.

Сопутствующая терапия может либо снижать, либо повышать риск развития иммунного ответа на терапевтический белок. При применении иммунодепрессантов частота иммунных реакций на терапевтический белок, как правило, снижается. Однако, учитывая, что риск развития иммунного ответа на терапевтический препарат зависит от комплекса факторов, вывод о потенциальном влиянии одновременного применения иммуномодулирующих препаратов не являются однозначным (например, применение иммунодепрессантов после предшествующего или сопутствующего облучения при проведении радиационной терапии). На состояние иммунной системы может также оказывать влияние ранее проведенная терапия, что потенциально может отразиться в частоте развития и тяжести проявления иммунных реакций на терапевтический белок.

Факторы, связанные с терапией, такие как доза, схема и путь введения, могут влиять на развитие иммунного ответа на терапевтический белок. Препараты, вводимые внутривенно, могут быть менее иммуногенными, чем препараты, вводимые подкожно или внутримышечно. Ингаляционное, внутрикожное, а также внутриглазное введение может усиливать иммунные реакции, развивающиеся в ответ на терапевтический белок. При кратко-срочном введении препарата, как правило, вероятность развития нежелательного иммунного ответа ниже, чем при длительном применении. При повторном назначении препарата после значительного перерыва, а также в случае нарушения рекомендуемой схемы применения, возможно усиление иммунного ответа.

Предсуществующие антитела представляют собой эндогенные перекрестно-реагирующие АТ, специфичные к эпитопам белков или гликанов, которые способны взаимодействовать с эпитопами терапевтических белков. Предсуществующие АТ могут формироваться в результате лечения препаратами на основе аналогичных или родственных белков, однако в ряде случаев они могут выявляться и у ранее нелеченных пациентов. Точное происхождение таких АТ чаще всего неизвестно.

Факторы, связанные с характеристиками лекарственного препарата

Иммуногенность терапевтических белков во многом зависит от его физико-химических свойств. Наличие чужеродных последовательностей в молекуле белка, посттрансляционные модификации, присутствие как родственных соединений (продукты деградации, окисления, агрегаты), так и производственных примесей (белки, липиды или ДНК клеток-продуцентов, микробные контаминанты) в лекарственном препарате определяют риск формирования иммунного ответа на терапевтический белок. Важная роль в плане иммуногенности отводится также условиям модификации терапевтического белка (пегилирование, создание слитых белков/ fusion proteins), выбору вспомогательных веществ и их взаимодействию между собой, с действующим веществом и материалами первичной упаковки (контейнеры, пробки) [19].

Структура белка и посттрансляционные модификации могут иметь важное значение в проявлении нежелательной иммуногенности терапевтического белка. Так, присутствие или отсутствие олигосахаридных групп в молекуле белка, а также структура углеводных фрагментов могут оказывать влияние как на физико-химические, так и на биологические свойства белка, что приводит к прямому или опосредованному влиянию на иммуногенные свойства терапевтического белка. Известно, что гликаны могут индуцировать иммунный ответ на себя (в частности гликаны нечеловеческого происхождения), кроме того, изменение конформационной структуры белка за счет их присутствия приводит к тому, что белок становится иммуногенным.

Терапевтические белки, которые являются аналогами эндогенных белков человека, при проведении заместительной терапии могут провоцировать развитие иммунного ответа за счет изменений в структуре белка или аминокислотной последовательности по сравнению с эндогенным белком человека. Такие изменения возможны вследствие посттрансляционных модификаций или они появляются на любом этапе производственного процесса, как при получении фармацевтической субстанции, так и при изготовлении готового лекарственного препарата. Подобные изменения возможны также при хранении препарата или в условиях его клинического применения.

При модификации молекул белка возможно изменение в аминокислотной последовательности Т-клеточных эпитопов, которые представлены в виде коротких линейных пептидов, что повлечет за собой различие эндогенного и терапевтического белка и послужит причиной индукции иммунного ответа. В связи с этим исследования по идентификации потенциальных Т-клеточных эпитопов важны для выбора новых белков или пептидов с целью разработки на их основе лекарственных препаратов.

Препараты на основе белков слияния (fusion proteins), являющиеся неаналоговыми терапевтическими белками, могут индуцировать иммунный ответ на неоэпитопы - чужеродные пептидные последовательности, например, в участках соединения (линкерах). Белки слияния/fusion proteins, состоящие из чужеродного и собственного белка, так же как химерные белки, требуют особого внимания и настороженности из-за потенциального присутствия чужеродного фрагмента, который способен провоцировать развитие иммунного ответа на собственный белок за счет распространения эпитопа (epitope-spreading) [44].

Следует отметить, что иммунологическая толерантность к эндогенным белкам вариабельна; как правило, к белкам с низким уровнем содержания толерантность слабее (низкодозовая толерантность) по сравнению с белками с более высоким содержанием. У здоровых лиц в ряде случаев выявляются аутоантитела к цитокинам и факторам роста, так как уровни концентрации циркулирующих цитокинов и факторов роста являются низкими.

При применении химически модифицированных белков развитие иммунного ответа возможно к полиэтиленгликолевой части пегилированных белков, кроме того, указывается на возможность выявления предсуществующих АТ против пегилированных белков.

Однако в ряде случаев пегилирование и гликозилирование белков может снижать иммуногенность терапевтического белка путем экранирования иммуногенных эпитопов и сохранения нативной конформации белка.

Состав, свойства и источник получения вспомогательных веществ и материалов первичной упаковки могут оказывать влияние на проявления иммуногенности терапевтических белков. В связи с этим выбор вспомогательных веществ при разработке лекарственного препарата чрезвычайно важен, так же как и выбор материалов первичной упаковки. Оптимальный состав вспомогательных веществ должен обеспечивать поддержание нативной конформации действующего вещества терапевтического белка, исключать отрицательное взаимодействие отдельных компонентов вспомогательных веществ между собой и с материалом первичной упаковки. Данное положение должно быть учтено при внесении изменений в состав вспомогательных веществ и изменении материалов первичной упаковки лекарственного препарата, поскольку возможно изменение структуры белка, образование агрегатов, появление механических частиц и т.д. Подобные изменения могут быть связаны, например, с выщелачиванием и поступлением примесей из контейнеров и укупорочных материалов и их последующим взаимодействием как с вспомогательными, так и с действующим веществом лекарственного препарата.

Не менее важны условия клинического применения препарата, такие как условия разведения в инфузионных растворах. Например, препарат МкАТ трастузумаб, специфичный к внеклеточному домену рецептора ЭФР человека 2-го типа (HER-2) не совместим с 5% раствором декстрозы, для его разведения используют 0,9% раствор натрия хлорида; тогда как препарат филграстим не совместим с 0,9% раствором натрия хлорида, для его разведения используют 5% раствор декстрозы. Следует также учитывать взаимодействие препарата с материалом инфузионного оборудования, которое может влиять на качество препарата, например, способствовать образованию агрегатов, опосредуя проявление его иммуногенности.

Денатурация и агрегация терапевтического белка может быть причиной развития иммунного ответа, что связано с образованием поливалентных эпитопов или появлением/демаскированием новых эпитопов, которые приобретают способность стимулировать иммунную систему. Кроме того, агрегация может усилить специфический иммунный ответ на неизмененный белок лекарственного препарата и стимулировать формирование АТ. Процесс очистки, формулирование и условия хранения, среди прочих факторов, могут приводить к образованию агрегатов или аддуктов. Агрегаты с высокой молекулярной массой более склонны к индукции иммунного ответа, чем агрегаты с низкой молекулярной массой, при этом удаление агрегатов, как правило, способствует снижению иммуногенности. Формирующиеся при образовании белковых агрегатов поливалентные эпитопы (повторяющиеся упорядоченные эпитопы), могут непосредственно активировать В-лимфоциты. При сшивании множества рецепторов В-клеток возможно образование специфических АТ не только к агрегированной, но и к мономерной форме терапевтического белка.

Производственные примеси присутствующих в фармацевтической субстанции или готовом лекарственном препарате терапевтических белков, с одной стороны, могут индуцировать иммунный ответ на себя, с другой - выполняя роль адъювантов, стимулировать развитие иммунного ответа на другие АГ. К таким производственным примесям относятся белки клеток-хозяина, липиды или ДНК клеток-продуцентов, белки потенциальных контаминирующих агентов и др.

Изучение нежелательной иммуногенности

Основной целью исследования иммуногенности терапевтических белков является установление ее клинической значимости, т. е. определение влияния нежелательного иммунного ответа на фармакокинетику, фармакодинамику, эффективность и безопасность лекарственного препарата. Основные факторы, которые определяют способность индуцированных АТ вызывать клинические последствия, включают эпитоп, к которому формируются АТ, аффинность и класс иммуноглобулина сформированных АТ, а также способность иммунных комплексов активировать систему комплемента [19].

Нежелательная иммуногенность препаратов может проявляться развитием как гуморального, так и клеточного иммунного ответа. О развитии клеточного ответа могут свидетельствовать реакции гиперчувствительности замедленного типа или формирование цитотоксических Т-Лф.

Прогностическая значимость доклинических исследований на животных по оценке иммуногенности терапевтического белка считается низкой, поскольку белки человека характеризуются видовой специфичностью и распознаются организмом животного как чужеродные, чем и обусловлена неизбежность развития иммунного ответа животных на белки человека [45-48]. Однако в рамках изучения хронической токсичности и фармакокинетики на экспериментальных животных должна быть проведена оценка формирования АТ к лекарственному препарату с целью интерпретации результатов этих исследований. Доклинические исследования проводят согласно рекомендациям, изложенным в отечественных и зарубежных руководствах [20-22, 49].

Для оценки риска иммуногенности и выявления клеточно-опосредованного иммунного ответа используют тесты in vitro, позволяющие оценить участие клеток врожденной и адаптивной системы иммунитета в развитии иммунного ответа. При разработке новых препаратов и оценке риска их иммуногенности следует учитывать возможность использования новых экспериментальных моделей (in silico, in vitro и in vivo).

Стратегия изучения иммунного ответа на терапевтические белки и методы оценки антител

При проведении клинических исследований по оценке иммуногенности препарата основное внимание, как правило, направлено на выявление индуцированных АТ и их характеристику, поскольку частота их формирования и свойства имеют большое значение для определения клинической значимости АТ в плане безопасности и эффективности применения лекарственного препарата.

Исследования по оценке нежелательной иммуногенности терапевтических белков необходимо проводить поэтапно. На первом этапе используют методы скрининга для идентификации образцов крови, полученных от пациентов, участвующих в клинических исследованиях, на наличие АТ. На последующем этапе проводят исследования с целью подтверждения наличия АТ и дальнейшей их характеристики; при этом определяют класс и подкласс выявленных иммуноглобулинов (изотип), их аффинность, специфичность, а также нейтрализующую способность путем использования функциональных тестов [19].

Методы для скрининга

Первым этапом оценки иммуногенности является исследование образцов с использованием скрининговых методов. Очень важен выбор методов для скрининга с учетом их чувствительности и способности выявлять во всех серопозитивных образцах все клинически значимые АТ, включая подклассы иммуноглобулинов (IgM и IgG). При этом желательно, чтобы уровень ложноположительных результатов был низким (не более 5%), ложноотрицательных результатов быть не должно.

Методики, используемые для скрининга, направленные на выявление взаимодействия между АГ и АТ, должны базироваться на разных научных принципах. Оптимальным является использование методик, характеризующихся достаточно высокой производительностью, т. е. не требующих больших временных затрат. При этом необходимо учитывать соответствующие особенности методик, определенные их ограничения, мешающие факторы, которые могут повлиять на конечные результаты анализа (табл. 1).

Например, иммуноферментный анализ (ИФА), основанный на прямом связывании АТ с АГ, который иммобилизован на поверхности пластиковых лунок, часто является самым простым для выполнения методом, однако он характеризуется высокой частотой ложноположительных результатов. Кроме того, при тестировании образцов, содержащих низкоаффинные АТ, отмечается высокая частота ложноотрицательных результатов. Во избежание вышеуказанных проблем могут быть использованы другие методы, например, модифицированный ИФА (brindging assays); электро-хемилюминесценция или поверхностный плазмонный резонанс и др.

Следует учитывать, что при использовании некоторых скрининговых методик возможно маскирование эпитопов, которое приводит к получению ложноотрицательных результатов; данная проблема также требует особого рассмотрения и использования дополнительных процедур, предотвращающих маскирование эпитопа.

Внимания требуют реагенты, используемые при выполнении анализа, например, такие блокирующие реагенты, как BSA или молоко, которые содержат гликаны, отличные от человека. Указанные гликаны иногда могут присутствовать в составе белковых препаратов, полученных с использованием клеток животных, и индуцировать выработку соответствующих АТ. При использовании указанных блокирующих реагентов АТ, направленные к этим гликанам, при выполнении методики могут быть не выявлены.

Сложности при проведении скрининговых исследований могут быть связаны с наличием в тестируемых образцах сыворотки или плазмы веществ, которые за счет матриксного эффекта могут приводить к получению ложноположительных, отрицательных результатов или некорректному определению уровня содержания АТ. Подобный эффект могут проявлять компоненты комплемента или его рецепторы, маннозосвязывающий белок, Fc-рецепторы, растворимые молекулы-мишени и ревматоидный фактор. Чтобы ослабить потенциальное влияние эффекта матрикса, могут быть использованы корректирующие процедуры с учетом ограничений соответствующих методик.

На конечные результаты по определению АТ могут оказать влияние явления интерференции за счет присутствия в образцах остаточного содержания лекарственного препарата (терапевтического белка). Вследствие образования иммунных комплексов с индуцированными АТ результаты по определению концентрации исследуемых АТ могут быть занижены.

Для преодоления данной проблемы могут быть использованы различные методические приемы, например, такие как диссоциация иммунных комплексов при низких значениях рН, удаление остаточного содержания лекарственного препарата путем абсорбции на твердой фазе, длительный период инкубации при проведении анализа, значительные разведения образцов при использовании высокочувствительных методов. Следует отметить, что в некоторых случаях остаточное содержание лекарственного препарата может быть удалено путем использования лектинов или ксеногенных АТ.

Проблемы, связанные с интерференцией остаточного содержания терапевтического белка, могут быть решены путем отбора проб для оценки АТ, спустя достаточное время после введения препарата, что позволяет элиминироваться ему из кровотока до отбора проб. Однако такой подход не должен значительно усложнять процесс обнаружения АТ и влиять на схему лечения пациента.

Влияние матриксных компонентов и остаточного содержания терапевтического белка на результаты анализа следует оценивать при валидации методик, используемые подходы не должны оказывать негативного влияния на эффективность методики и конечные результаты исследования.

Методы для подтверждения наличия антител

Отобранные в результате скрининга образцы должны быть исследованы для подтверждения положительных результатов и исключения ложноположительных образцов. При выборе метода для подтверждения наличия АТ необходимо учитывать характеристики и ограничения методов, используемых для скрининга.

Общим подходом для подтверждения наличия АТ является добавление в образец перед исследованием избыточного количества АГ с последующим сравнением полученных результатов при добавлении и без добавления АГ и результатами скринингового анализа. Данная процедура должна приводить к ингибированию связывания АТ с АГ и снижению уровня детектируемых сигналов при анализе истинно положительных образцов.

АТ положительных образцов, должны быть охарактеризованы по их количественному содержанию (титр) и специфичности к терапевтическому белку. Следует учитывать, что АТ могут быть индуцированы также родственными соединениями и посторонними примесями, присутствующими в лекарственном препарате, компонентами, связанными с продуктом или связанными с процессом производства (например, белки клетки-хозяина). Методы по выявлению АТ, направленных против этих примесей, для тестирования образцов пациентов, также должны быть валидированы. Однако общим принципом разработки биотехнологических лекарственных препаратов является использование технологических приемов, обеспечивающих получение готового препарата с минимально допустимым уровнем производственных примесей, что снижает риск развития на них иммунного ответа.

Методы оценки нейтрализующей способности антител

Оценка нейтрализующей способности АТ является важной частью изучения иммуногенности, поскольку наличие таких АТ часто коррелирует со снижением клинического ответа на лекарственный препарат. Подавление специфической активности терапевтического белка нейтрализующими АТ, как правило, может быть опосредовано одним из следующих механизмов - связыванием АТ с эпитопом активного сайта или изменением конформации молекулы белка. Для определения нейтрализующей активности АТ применяют специфичные и чувствительные методы in vitro, которые основываются на использовании клеточных линий или оценке специфичности связывания с АГ без использования клеток (табл. 2).

Для оценки нейтрализующих АТ оптимальны методы, которые используются для определения специфической биологической активности терапевтического белка, однако указанные методы, как правило, требуют адаптации.

При выборе метода для анализа нейтрализующих АТ, базирующегося на тех или иных принципах, решающее значение имеет понимание механизма действия лекарственного препарата, антигена-мишени и эффекторного пути терапевтического воздействия. Для лекарственных препаратов-агонистов более адекватными являются методы, основанные на использовании клеточных культур, в то время как для препаратов на основе молекул-антагонистов - методы конкурентного связывания с лигандами, т. е. без использования клеток. Для препаратов МкАТ, которые проявляют свою активность посредством прямого связывания с антигеном-мишенью, более подходящим может быть метод конкурентного связывания. В то время как для препаратов МкАТ, клиническая эффективность которых обусловлена эффекторными функциями АТ, рекомендуется использовать методы на основе клеточных культур.

При оценке нейтрализующей способности АТ, как правило, выбирают одну концентрацию лекарственного препарата и проводят разведения исследуемого образца, определяя ингибирующее действие снижающейся концентрации АТ на анализируемый ответ, т. е. на проявления биологического действия препарата.

Используемые методы должны быть валидированы и установлено, что нейтрализация действительно связана с действием АТ, а не с другими ингибирующими компонентами, потенциально присутствующими в образце. С целью оценки специфичности АТ могут быть рассмотрены такие подходы, как истощение АТ или использование альтернативных стимулов (если результат зависит от нескольких стимулирующих факторов).

При интерпретации результатов необходимо учитывать, что специфичность связывания АТ не всегда коррелирует с их нейтрализующей активностью, в связи с этим выявление значительного количества связывающих АТ, может не свидетельствовать об их нейтрализующей биологической активности. В то же время более низкие концентрации таких АТ могут нейтрализовать действие определенного количества препарата.

Характеристика антител к терапевтическому белку

Если при проведении клинических исследований установлена индукция АТ у пациентов, следует провести оценку частоты выявления и титров АТ, изучить кинетику формирования и длительность персистенции АТ, их нейтрализующую способность, степень выраженности гуморального ответа, поскольку он может коррелировать с клиническими проявлениями последствий наличия АТ.

При определенных обстоятельствах, например в случае развития анафилактоидных реакций, необходимо провести дополнительную характеристику гуморального ответа, определить изотип и подклассы иммуноглобулина (IgG) или функциональную активность Т-клеток. При подозрении на развитие аутоиммунных реакций следует изучить перекрестную реактивность индуцированных АТ с соответствующими эндогенными белками.

Контрольные образцы и реагенты

При разработке и валидации методов решающее значение имеет выбор соответствующих положительных и отрицательных контролей, при этом особенно важен выбор положительного контроля.

Положительные контрольные образцы. В идеале положительный контроль АТ является образцом сыворотки, полученной от человека, которая содержит значительную концентрацию соответствующих АТ; объем сыворотки должен быть достаточным для проведения всех исследований, что часто бывает недоступно. В таких случаях могут быть использованы рекомбинантные АТ человека, специфичные к терапевтическому белку, или использована сыворотка животных, полученная при их иммунизации лекарственным препаратом.

Однако в связи с видовыми различиями использование АТ животных, например, при выполнении иммунохимических методик имеет значительные ограничения. Так, если методика предусматривает использование реагента, специфичного к иммуноглобулину человека, он не будет адекватно взаимодействовать с АТ иного происхождения. Результаты таких исследований не позволят адекватно оценить уровень АТ, содержащихся в образцах сыворотки или плазмы человека. При использовании в качестве положительного контроля сыворотки животных следует также учитывать, что их способность связываться с разными эпитопами может отличаться; это очень существенно в случае проведения сравнительной оценки иммуногенности референтного (оригинального) и биоподобного (биоаналогового) препаратов.

В связи с гетерогенностью структуры, специфичностью и авидностью иммуноглобулинов, содержащихся в стандартах образцах и исследуемых пробах, калибровка иммунологических методов является сложной задачей.

Калибровку указанных методов осуществляют, используя хорошо описанные и обоснованные подходы, например, такие как, представление данных ИФА в виде титра на основе стандартной процедуры расчета этой величины. Однако чувствительность методики и данные экспериментов, полученных методом добавок, должны быть представлены в количественных значениях.

Положительные контроли АТ для методов оценки нейтрализации должны обладать значительной нейтрализующей активностью. Желательно при валидации методики провести исследования с включением в качестве контроля ненейтрализующих (связывающих) АТ, если такие АТ имеются.

Для учета результатов оценки нейтрализующей способности АТ, как правило, используют значения разбавления образца (титра), требуемого для нейтрализации биологической активности препарата. Такие пороговые значения (близкие к минимальному пределу обнаружения) должны быть надлежащим образом обоснованы и валидированы для обнаружения всех положительных образцов с наличием нейтрализующих АТ.

Как для скрининговых методов, так и для методов определения нейтрализующей активности АТ желательно использовать набор стандартных материалов, содержащих различные количества АТ (контроли низкого, среднего и высокого содержания АТ), которые можно использовать для установления характеристик и валидации аналитических методик. По возможности, набор стандартных материалов должен включать один или несколько образцов с низким содержанием АТ (близким к минимальному пределу обнаружения) и образцов АТ с низкой авидностью.

Отрицательные контрольные образцы. Отрицательные контроли необходимы для установления базовых значений оцениваемых показателей анализа и валидации методики. Исходные параметры значений для здоровых субъектов, как правило, довольно легко можно определить путем оценки результатов анализа образцов от достаточного числа таких лиц с целью получения статистически надежных данных.

При проведении клинических исследований по оценке иммуногенности для определения пороговых значений и принятия результата как положительного должны быть установлены исходные параметры на основании анализа результатов исследования контрольных образцов здоровых лиц или пациентов.

Следует учитывать, что в образцах проб некоторых пациентов могут присутствовать АТ, сформированные еще до начала лечения (предсуществующие АТ), или другие активные компоненты, которые могут давать ложноположительные результаты. Для правильной интерпретации результатов исследования образцов, полученных после лечения, необходим предварительный скрининг образцов до начала лечения.

Валидация методов и интерпретация результатов

Методики, используемые для скрининга, подтверждения наличия АТ, характеристики и определения нейтрализующей активности должны быть валидированы в соответствии с требованиями отечественных и международных документов [20, 50-52].

Важное значение при валидации методики имеет определение предельных разведений образцов, позволяющих достоверно оценить результат. Во избежание межлабораторной вариабельности предпочтительно, чтобы анализы при проведении клинических исследований были выполнены в централизованной лаборатории.

Валидационные исследования должны быть проведены для подтверждения того, что эффект матрикса, обусловленный реактивами или веществами, содержащимися в образцах, или интерференция за счет присутствия лекарственного препарата негативно не влияют на результаты выполненных исследований. Это можно осуществить путем проведения исследований восстановления, наблюдая за влиянием таких веществ, содержащихся в матриксе, на ответ, полученный в их отсутствие. Подобное исследование должно быть проведено в отношении всего диапазона разведений проб, используемых в анализах, и в некоторых случаях, по меньшей мере, в отношении предельных разведений, которые можно достоверно оценить [19].

Для того чтобы четко определить, какие образцы следует считать положительными и какие отрицательными, необходимо установить критерии для оцениваемых параметров, а также определить условия, позволяющие подтвердить положительный результат. Для определения порогового значения оцениваемого параметра, позволяющего оценить результат как положительный при выполнении иммунологического анализа, необходимо использовать данные, полученные при исследовании контрольных образцов здоровых лиц или образцов, полученных при обследовании пациентов до начала терапии.

Для определения такого порогового значения рекомендуется использовать статистические методы. Например, может быть использован статистический подход для установления отсекаемых значений ("cut-off"). Допускается также использование реальных данных для определения результата, например, удвоенное значение, установленное при изучении исходных параметров, которое будет принято в качестве минимального положительного значения.

Для положительных образцов необходимо определить титр АТ с использованием стандартного подхода и установить наибольшее разведение образца, при котором отмечается положительный результат. Другой вариант - провести учет результатов в единицах массы, используя положительный контроль АТ, но такой подход имеет определенные ограничения.

Оценка иммуногенности препаратов на основе конъюгированных и слитых белков (fusion proteins)

Предполагается, что в ответ на новые биотерапевтические молекулы, такие как сконструированные слитые белки (fusion proteins) и химически конъюгированные белки могут формироваться АТ, характеризующиеся различной специфичностью и степенью аффинности к различным эпитопам, которые способны вызывать различные клинические последствия. Характеристика специфичности индуцированных АТ является сложной задачей и может потребовать использования нескольких методик для определения иммунного ответа на различные фрагменты молекулы действующего вещества лекарственного препарата.

Одним из вариантов анализа специфичности АТ к индивидуальным фрагментам может быть использование конкурентного ингибирования при проведении подтверждающего анализа. Так, для пегилированного белка последовательность оценки иммуногенности будет включать скрининговый анализ с использованием в качестве АГ пегилированного терапевтического препарата; затем в подтверждающем анализе при тестировании положительных образцов будет использован цельный терапевтический препарат, непегилированный белок и фрагмент полиэтиленгликоля.

Оценка сравнительной иммуногенности лекарственных препаратов

При разработке биоподобных (биоаналогичных) препаратов (bisimilars) должны быть проведены сравнительные исследования иммуногенности в соответствии с рекомендациями отечественных и международных руководств [20, 21, 53-57]. В ряде случаев сравнительные исследования иммуногенности проводят и при внесении изменений в процесс производства биологического препарата путем сопоставления иммуногенного потенциала препаратов, полученных до и после внесения изменений [58]. Рекомендации по проведению указанных исследований также приведены в отечественных и международных документах [52, 59, 60].

Подходы к сравнительному изучению иммуногенности, включая выбор аналитических методик, отбор анализируемых проб и др., аналогичны при исследовании разработанного биоподобного и референтного препарата, а также препаратов, произведенных до внесения изменений в технологический процесс производства и полученных по измененной технологии [59, 60].

Тестирование на иммуногенность биоподобного и референтного препаратов проводят в рамках сравнительных клинических исследований с целью доказательства подобия препаратов, используя при анализе образцов методики, базирующиеся на одинаковых принципах. Аналогичным также должен быть режим отбора образцов у исследуемой популяции пациентов.

Желательно использовать методики, которые способны выявлять АТ, направленные против всех эпитопов молекулы, как биоподобного, так и референтного препаратов. Если для биоподобного и референтного препарата используются разные методики, должна быть проведена валидация методов с использованием двух

АГ (двух препаратов), для того чтобы исключить любое влияние на результаты анализа потенциальных различий между методиками в отношении их чувствительности и толерантности к лекарственному препарату. Доказательством сопоставимости иммуногенности исследуемых препаратов является сходная частота выявления АТ в исследуемых образцах и высокая степень соответствия между результатами анализа.

Согласно положениям указанных выше руководств, при тестировании образцов проб, полученных от пациентов, леченных биоподобным или референтным препаратами, допустимо использование одной методики, в которой биоподобный препарат используется в качестве АГ. В принципе, такой формат анализа позволяет обнаруживать все АТ к биоподобному препарату, но не обязательно в таком случае выявляются все АТ, направленные к референтному препарату. Если частота выявления и титры АТ к препарату выше при тестировании образцов, полученных от пациентов, получавших биоподобный препарат, должно быть сделано заключение, что указанный препарат является более иммуногенным. Данный вывод потребует проведения дополнительных исследований с целью выявления основной причины установленных различий, включая методологические вопросы.

Независимо от подхода, используемого для оценки иммуногенности биоподобного препарата по сравнению с референтным, рекомендуется, чтобы методики были перекрестно валидированы с использованием обоих АГ, положительных контролей с наличием АТ, кроме того, желательно включить в исследование клинические образцы для демонстрации сходства свойств препаратов.

Заключение

Научные достижения в области технологии рекомбинантных ДНК, совершенствование процессов производства биотехнологических препаратов, включая эффективные способы очистки рекомбинантного белка, позволяют разрабатывать современные высокоэффективные лекарственные препараты. Указанные препараты, которые определяют термином "терапевтические белки", успешно применяются для лечения пациентов с тяжелыми длительно протекающими заболеваниями. Однако, поскольку препараты имеют белковую природу и применяются длительно, несмотря на усилия разработчиков препарата по выбору соединений с низким иммуногенным потенциалом, нельзя полностью исключить возможность развития нежелательных иммунно-опосредованных реакций на терапевтический белок.

На этапе доклинических исследований определяют риск развития иммунного ответа, но только результаты клинических исследований позволяют оценить истинный иммуногенный потенциал биотехнологического лекарственного препарата. С этой целью должно быть проведено изучение иммунного ответа на препарат, исследована корреляция между формированием АТ и клиническими последствиями их присутствия в организме пациента, т. е. оценено их влияние на эффективность и безопасность препарата. При изучении гуморального иммунного ответа важны поэтапный подход в определении индуцированных АТ, подтверждение их наличия и последующая характеристика. Важна стратегия изучения иммунного ответа и выбор соответствующих чувствительных аналитических методик.

Принципы проведения исследований по оценке иммуногенности терапевтических белков регламентируются отечественными и зарубежными нормативными документами. Однако программа по созданию и изучению препарата, касающаяся иммуногенности, как одного из важнейших этапов изучения биотехнологического лекарственного препарата, разрабатывается в индивидуальном порядке. Соответствующие документы, стран с развитой регуляторной системой, отражающие указанные вопросы, периодически обновляются на основе новых научных знаний и анализа опыта применения препаратов. Совершенствование и гармонизация отечественной нормативной документации и документации Евразийского экономического союза с международными документами является актуальной задачей.

Литература

1. Сигидин Я. А., Лукина Г.В. Биологическая терапия в ревматологии. М. : Практическая медицина, 2009.

2. Насонов Е.Л., Каратеев А.Е., Клюквина Н.Г. Фармакотерапия. Е.Л. Насонов, В.А. Насонова (ред.). Ревматология : национальное руководство. М. : ГЭОТАР-Медиа, 2008: 178-251.

3. Насонов Е.Л., Денисов Л.Н., Станислав М.Л., Ильина А.Е. Перспективы фармакотерапии ревматоидного артрита: моноклональные антитела. Науч.-практ. ревматология. 2012; 52 (3): 75-82.

4. Buttman M., Rieckmann P. Treating multiple sclerosis with monoclonal antibodies. Exp. Rev. Neurother. 2008; 8: 433-55.

5. Heier J.S., Antoszyk A.N., Pavan P.R., Leff S.R. et al. Ranibizumab (Lucentis) for treatment of neovascular age-related macular degeneration. Ophthalmology. 2006; 113: 633-42.

6. Gallon L., Chhabra D. Anti-CD20 monoclonal antibody (rituximab) for the of reccurent idiopathic membranous nephropathy in a renal transplant patient. Am. J. Transplant. 2006; 6: 3017-21.

7. Callhoff J., Sieper J., Weiss A., Zink A. et al. Efficacy of TNF blockers in patients with ankylosing spondylitis and nonradiographic axial spondyloarthritis: a meta-analysis. Ann. Rheum. Dis. 2015; 74: 1241-8.

8. Baeten D., Baraliakos X., Braun J., Sieper J. et al. Anti-interleukin-17A monoclonal antibody secukinumab in treatment of ankylosing spondylitis: a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 2013; 382 (9906): 1705-13.

9. Garnock-Jones K.P. Secukinumab: a review in moderate to severe plaque psoriasis. Am. J. Clin. Dermatol. 2015; 16 (4): 323-30.

10. Schellekens H. Immunogenicity of therapeutic proteins: clinical implications and future prospects. Clin. Ther. 2002; 24: 1720-40.

11. Foerder J., Wulffraat N., Kuis W. Immunogenicity of enbrel: clinical trial observations. Ann. Rheum. Dis. 2002; 6 (suppl. 1): 72.

12. de Vries M.K., Wolbink G.J., Stapel S.O., de Vrieze H. et al. Decreased clinical response to infliximab in ankylosing spondylitis is correlated with anti-infliximab formation. Ann. Rheum. Dis. 2007; 66: 1252-4.

13. DiMichele D. Inhibitor development in hemophilia B: an orphan disease in need of attention. Br. J. Haematol. 2007. 138 (3). 303-15.

14. Bartelds G.M., Krieckaert C.L., Nurmohamed M.T., van Schouwenburg P.A. et al. Development of antidrug antibodies against adalimumab and association with disease activity and treatment failure during long-term follow-up. JAMA. 2011; 305: 1460-8.

15. Calvez T., Chambost H., Claeyssens-Donadel S., d’Oiron R. et al. Recombinant factor VIII products and inhibitor development in previously untreated boys with severe hemophilia A. Blood. 2014; 124 (23): 3398-408.

16. Guideline on immunogenicity assessment of biotechnology-derived therapeutic proteins (EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006).

17. Guideline on immunogenicity assessment of monoclonal antibodies intended for in vivo clinical use (EMA/CHMP/ BMWP/86289/2010).

18. Guideline on Immunogenicity assessment of therapeutic proteins (EMEA/CHMP/BMWP/42832/2005 Rev 1).

19. Guideline on Immunogenicity assessment of therapeutic proteins (EMEA/CHMP/BMWP/14327/2006 Rev 1) Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) 18 May 2017.

20. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Т. I. М. : Гриф и К, 2013.

21. Нормативные правовые акты в сфере обращения лекарственных средств в рамках Евразийского экономического союза. Т. 3. Разработка и проведение исследований биологических лекарственных средств. М., 2017.

22. Правила проведения исследований биологических лекарственных средств Евразийского экономического союза. Решение Совета Евразийской экономической комиссии №" 89 от 03.11.2016. М., 2016.

23. Зозуля Н.И., Свирин П.В. Диагностика и лечение гемофилии. Национальные клинические рекомендации. В.Г. Савченко (ред.). М. : Национальное гематологическое общество, 2014. 38 с.

24. Воробьев А.И. (ред.). Руководство по гематологии. 3-е изд. М. : Ньюдиамед, 2005; 3.

25. Насонов Е.Л. Применение ингибиторов фактора некроза опухоли при ревматоидном артрите: место этанерцепта. Науч.-практ. ревматология. 2008; 5: 1-20.

26. Насонов Е.Л. Новые направления в лечении ревматоидного артрита: место ритуксимаба. Consilium Medicum. 2008; 2: 7-14.

27. Keystone E.C. Safety of biologic therapies-an update. J. Rheumatol. Suppl. 2005; 74: 8-12.

28. Hanauer S.B., Sandborn W.J., Rutgeerts P. et al. Human antitumor necrosis factor monoclonal antibody (adalimumab) in Crohn’s disease: the CLASSIC-I trial. Gastroenterology. 2006; 130 (2): 323-3; quiz 591.

29. Bongartz T. Tocilizumab for rheumatoid and juvenile idiopathic arthritis. Lancet. 2008; 371: 961-3.

30. Wyneski M.J., Green A., Kay M., Wyllie R. et al. Safety and efficacy of adalimumab in pediatric patients with Crohn disease. J. Pediatr. Gastrointerol. Nutr. 2008; 47: 19-25.

31. Tak P.P., Mease P.J., Genovese M.C., Kremer J. et al. Safety and efficacy of ocrelizumab in patients with rheumatoid arthritis and an inadequate response to at least one tumor necrosis factor inhibitor: Results of a forty-eight-week randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel-group phase III trial. Arthritis Rheum. 2012; 64 (2): 360-370. doi: 10.1002/art.33353.

32. Barr S., Steber W., Kindopp-Bugo K., Martin O. Infliximab therapy in the treatment of rheumatoid arthritis in clinical practice. Ann. Rheum. Dis. 2003; 62 (suppl. 1): 196.

33. Моисеенко В.М. Возможности моноклональных антител в лечении злокачественных опухолей. Практическая онкология 2002; 3 (4): 253-61.

34. Сакаева Д.Д., Гордиев М.Г. Рецептор эпидермального фактора роста как мишень молекулярно-направленной терапии у непредлеченных пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Злокачественные опухоли. 2016; 19 (3): 54-9.

35. Нуриев Р.И., Караулов А.В., Киселевский М.В. Новые стратегии лечения пациентов с онкологическими заболеваниями: иммунотерапевтический подход. Иммунология. 2017; 38 (1): 39-48.

36. McKeage K., Perry C. Trastuzumab. A review of its use in the treatment of metastatic breast cancer overexpressing HER2. Drugs. 2002; 62 (1): 209-43.

37. Vogel C.L., Cobleigh M.A., Tripathy D., Gutheil J.C. et al: Efficacy and safety of Trastuzumab as a single agent in firstline treatment of HER2 overexpressing metastatic breast cancer (HER2+/ MBC). J. Clin. Oncol. 2002; 3: 719-26.

38. Bouzin C., Brouet A., De Vriese J., Dewever J. et al. Effects of vascular endothelial growth factor on the lymphocyte-endothelium interactions: identification of caveolin-1 and nitric oxide as control points of endothelial cell anergy. J. Immunol. 2007; 178 (3): 1505-11.

39. Bevacizumab. Anti-VEGF monoclonal antibody, avastin, rhumab - VEGR. Drugs. 2002; 3 (1): 28-30.

40. Merelli B., Massi D., Cattaneo L., Mandala M. Targeting the PD1/PD-L1 axis in melanoma: biological rationale, clinical challenges and opportunities. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2014; 89 (1): 140-65.

41. Pardoll D.M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. 2012; 12: 252-64.

42. Quesada S., Peggs K. Exploiting CTLA-4, PD-1 and PD-L1 to reactivate the host immune response against cancer. Br. J. Cancer. 2013; 108: 1560-5.

43. Maio M., Grob J.J., Aamdal S., Bondarenko I. et al. Five-year survival rates for treatment-naive patients with advanced melanoma who received ipilimumab plus dacarbazine in a phase III trial. J. Clin. Oncol. 2015; 33 (10): 1191-6.

44. Tuohy V.K., Kinkel R.P. Epitope spreading: a mechanism for progression of autoimmune disease. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2000; 48 (5): 347-51.

45. Bugelski P.J., Treacy G. Predictive power of preclinical studies in animals for the immunogenicity of recombinant therapeutic proteins in humans. Curr. Opin. Mol. Ther. 2004; 6: 10-6.

46. Swanson S.J., Bussiere J. Immunogenicity assessment in nonclinical studies. Curr. Opin. Microbiol. 2012; 15: 337-47.

47. Buttel I.C., Chamberlain P., Chowers Y., Ehmann F. et al. Taking immunogenicity assessment of therapeutic proteins to the next level. Biologicals. 2011; 39: 100-9.

48. Koren E., Zuckerman L.A., Mire-Sluis A.R. Immune responses to therapeutic proteins in humans-clinical significance, assessment and prediction. Curr. Pharm. Biotechnol. 2002; 3: 349-60.

49. ICH topic S6 - Note for guidance on preclinical safety evaluation of biotechnology-derived pharmaceuticals (CPMP/ ICH/302/95).

50. Guideline on bioanalytical method validation (EMEA/CHMP/ EWP/192217/2009 Rev.1 Corr.*).

51. ICH harmonized tripartite guideline: Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1). 2005.

52. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Т. III. М. : ПОЛИГРАФ-ПЛЮС. 2014.

53. Руководство по экспертизе лекарственных средств. Т. IV М. : ПОЛИГРАФ-ПЛЮС. 2014.

54. The European Medicines Agency Similar biological medicinal products containing biotechnology-derived proteins as active substance: quality issues (EMEA/CHMP/BMWP/49348/2005).

55. The European Medicines Agency (2012). Guideline on similar biological medicinal products containing monoclonal antibodies - non-clinical and clinical issues - (EMA/CHMP/ BMWP/403543/2010).

56. Guidelines on evaluation of similar biotherapeutic products (SBPs). Annex 2. WHO Technical Report Series No. 977, 2013.

57. Guidance for Industry. Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Biosimilarity. February 2012.

58. Авдеева Ж.И., Волкова Р.А., Алпатова Н.А., Солдатов А.А. и др. Методические приемы и принципы оценки сопоставимости биотехнологических продуктов, полученных до и после внесения изменений в процесс производства. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2013; 46 (2): 18-21.

59. ICH Q5E Note for Guidance on Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process (CPMP/ ICH/5721/03).

60. Guideline on comparability of biotechnology-derived medicinal products after a change in the manufacturing process - nonclinical and clinical issues. (EMEA/CHMP/BMWP/101695/2006). London : European Medicines Agency, 2007.