Изменение функциональных свойств дендритных клеток при контакте с микроорганизмами родов Bacillus, Lactiplantibacillus и Limosilactobacillus

Резюме

Введение. Ранее для отбора кандидатов на роль бактериальных векторов для живых пероральных вакцин мы сравнили эффективность фагоцитоза и индукции созревания дендритных клеток (ДК) под действием 8 различных бактерий и дрожжей, способных к постоянной или временной персистенции в желудочно-кишечном тракте. Показано, что ДК наиболее эффективно поглощают микроорганизмы родов Bacillus, Lactiplantibacillus и Limosilactobacillus, причем микроорганизмы рода Bacillus эффективнее индуцируют созревание ДК.

Цель исследования - оценить действие микроорганизмов родов Bacillus, Lactiplantibacillus и Limosilactobacillus на функциональные свойства ДК.

Материал и методы. Моноцитарные ДК человека стимулировали инактивированными бактериями и оценивали продукцию цитокинов и способность ДК стимулировать лимфоциты в аллогенной смешанной культуре с чистыми CD4+-Т-клетками.

Результаты. Микроорганизмы рода Bacillus стимулируют продукцию интерлейкина(ИЛ)-6, ИЛ-1β и ИЛ-10 ДК. Преинкубация ДК с этими бактериями усиливает трансформацию CD4+-Т-лимфоцитов в лимфобласты и подавляет продукцию ИЛ-10 и интерферона-γ (ИФН-γ) в смешанной культуре с Т-лимфоцитами. Преинкубация ДК с B. licheniformis вызывает умеренное увеличение продукции ИЛ-17 в смешанной культуре, а преинкубация ДК с B. cereus увеличивает экспрессию гена RORc, а также вызывает небольшое увеличение количества CD25+FOXP3+-Т-клеток без стойкого прироста экспрессии гена FOXP3. Лактобациллы слабо стимулируют продукцию цитокинов ДК и не влияют на их способность индуцировать бласттрансформацию CD4+-Т-клеток и генерацию CD25+FOXP3+-Т-клеток. Преинкубация ДК с Lactiplantibacillus plantarum вызывает небольшое ослабление продукции ИЛ-10 в смешанной культуре, тогда как преинкубация ДК с Limosilactobacillus fermentum не влияет на продукцию этого цитокина, но ослабляет продукцию ИФН-γ и ИЛ-17.

Заключение. Микроорганизмы рода Bacillus вызывают умеренное усиление стимулирующих свойств ДК. Лактобациллы слабо влияют на продукцию цитокинов ДК и умеренно ослабляют их способность стимулировать провоспалительную активность Т-лимфоцитов.

Ключевые слова:дендритные клетки; Т-лимфоциты; регуляторные Т-клетки; цитокины; микроорганизмы кишечника

Для цитирования: Талаев В.Ю., Заиченко И.Е., Светлова М.В., Воронина Е.В., Бабайкина О.Н., Соловьева И.В., Белова И.В., Точилина А.Г. Изменение функциональных свойств дендритных клеток при контакте с микроорганизмами родов Bacillus, Lactiplantibacillus и Limosilactobacillus. Иммунология. 2022; 43 (5): 504-514. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-504-514

Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Написание статьи - Талаев В.Ю.; работа с дендритными клетками - Заиченко И.Е., Воронина Е.В.; проточная цитометрия - Светлова М.В.; работа с микроорганизмами - Заиченко И.Е., Бабайкина О.Н., Соловьева И.В., Белова И.В., Точилина А.Г.

Введение

Один из возможных способов создания вакцин для индукции иммунной защиты слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) - использование бактериальных векторов, несущих искусственно внедренные протективные антигены возбудителей инфекций. Представляется очевидным, что при создании живых пероральных вакцин в качестве бактериальных векторов целесообразно использовать микроорганизмы, которые будут вызывать безопасную колонизацию ЖКТ и при этом эффективно индуцировать иммунный ответ в слизистой.

Обязательным условием индукции иммунного ответа в слизистой оболочке является перенос антигена из просвета кишечника к антиген-презентирующим клеткам (АПК) через слой слизи и эпителиальный барьер. Перенос антигенов через слой эпителия активно осуществляют специализированные М-клетки, а также столбчатые эпителиоциты. Кроме того, наиболее активные АПК - дендритные клетки (ДК) могут сами отбирать образцы пищевого и бактериального содержимого кишечника без участия эпителиальных клеток-посредников [1]. Этот процесс они осуществляют с помощью отростков, выходящих на люминальную поверхность кишечника между эпителиальными клетками без нарушения их плотных контактов [2].

Эксперименты по колонизации кишечника мышей флуоресцентно мечеными неинвазивными и непатогенными Bifidobacterium pseudocatenulatum показали, что бактериальный материал обнаруживается практически во всех ДК пейеровых бляшек уже через 1 ч после введения микроорганизмов, тогда как для переноса бактериального материала в мезентериальные лимфатические узлы требуется 24 ч [3]. Таким образом, бактерии, заселяющие ЖКТ, могут непосредственно контактировать с ДК, при этом эффективное поглощение бактерий и сопутствующее этому функциональное созревание ДК может способствовать запуску полноценного Т-зависимого иммунного ответа на антигены бактерий.

В процессе созревания ДК должны увеличить свою способность презентировать антигены и стимулировать Т-лимфоциты, в частности они должны приобрести способность индуцировать дифференцировку наивных CD4+-Т-клеток в различные типы зрелых Т-хелперов (Th) [4, 5]. Однако ДК, особенно ДК кишечника, также способны индуцировать дифференцировку CD4+-Т-лимфоцитов в регуляторные Т-клетки (Трег) - супрессоры иммунного ответа [6]. Предполагается, что сдвиг спектра созревающих Т-клеток от обычных Т-клеток-эффекторов к Трег может ослаблять иммунный ответ на экспонируемые бактериальным вектором антигены и способствовать развитию иммунологической толерантности.

Ранее для отбора кандидатов на роль бактериальных векторов для живых пероральных вакцин мы сравнили эффективность фагоцитоза и индукции фенотипического созревания ДК под действием 8 различных бактерий и дрожжей, способных к постоянной или временной персистенции в ЖКТ [7]. Показано, что ДК наиболее эффективно поглощают микроорганизмы родов Bacillus, Lactiplantibacillus и Limosilactobacillus, причем Bacillus эффективнее индуцируют созревание ДК. В то же время лактобациллы могут присутствовать в просвете кишечника в значительно больших концентрациях, чем микроорганизмы рода Bacillus. Следует отметить, что способность лактобацилл к заселению кишечника и длительной, теоретически не ограниченной во времени персистенции, с одной стороны, может увеличить продукцию вакцинных антигенов в организме при использовании лактобацилл в качестве бактериальных векторов, но, с другой стороны, значительно затруднит возможность ограничения срока действия вакцины и ее дозирования. В этом отношении способность микроорганизмов рода Bacillus вызывать лишь временную колонизацию кишечника представляется полезным свойством потенциального вакцинного вектора [7].

В данной работе мы оценили действие различных представителей родов Bacillus, Lactiplantibacillus и Limosilactobacillus на функциональные свойства ДК, а именно на продукцию ими цитокинов, а также на стимулирующие свойства ДК в аллогенной смешанной культуре с CD4+-Т-лимфоцитами. В смешанной культуре мы оценивали активацию Т-клеток и продукцию ими цитокинов, содержание клеток с фенотипом Трег, а также экспрессию генов ядерных факторов, связанных с созреванием Трег и Тh17.

Материал и методы

Микроорганизмы для стимуляции ДК. В работе использовали B. cereus штамм IP5832, B. subtilis штамм BKM B-911, B. licheniformis штамм G BKM B-1711 D и лактобациллы (семейство Lactobacillaceae) L. plantarum штамм 8RA-3, L. fermentum штамм 39 и L. fermentum штамм 90 ТС-4. Для характеристики микроорганизмов и контроля чистоты культур использовали традиционные бактериологические способы оценки культуральных, тинкториальных свойств и профиля ферментативной активности, видовую идентификацию проводили с помощью MALDI TOF масс-спектрометра Autoflex speed LRF (Bruker Daltonics, Германия) и программно-аппаратного комплекса BioTyper (Bruker Daltonics, Германия). Полногеномное секвенирование лактобацилл осуществляли с использованием секвенатора MiSeq (Illumina Inc., США).

Подготовку проб микроорганизмов проводили как это описано ранее [7]. Бактерии рода Bacillus выращивали на мясопептонном агаре (НИЦФ, Россия), собирали из 3 односуточных культур и дважды отмывали в физиологическом растворе центрифугированием при 3800 g, 5 мин. Концентрацию бактерий определяли по стандарту мутности МакФарланда и доводили до 109 клеток/мл. Из полученной суспензии отбирали аликвоту для посева с целью уточнения концентрации, а остальные бактерии инактивировали автоклавированием при 1,2 атм в течение 7 мин. Лактобациллы выращивали на среде МРС-1 (HiMedia, Индия) дважды отмывали и проводили инактивацию прогреванием при 70 оС в течение 45 мин. Инактивированные микроорганизмы отмывали и разводили в забуференном фосфатами физиологическом растворе до необходимой в эксперименте концентрации, используя уточненные показатели концентрации по результатам высева проб микроорганизмов, отобранных перед инактивацией.

Получение и стимуляция ДК. Незрелые ДК (нДК) и CD4+-Т-лимфоциты получали из крови взрослых здоровых доноров, как это было описано ранее [7, 8]. Письменное информированное согласие получено от каждого донора перед забором крови. Исследование одобрено Локальным этическим комитетом ФБУН ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (протокол № 3 от 24 марта 2020 г.) и проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого".

Мононуклеарные клетки периферической крови (МНПК) выделяли центрифугированием над слоем Diacoll-1077 (ДиаМ, Россия), засевали в 48-луночные планшеты (Costar, США) по 2 - 106 клеток на лунку и инкубировали при 37 °C и 5 % CO2 в полной питательной среде (ППС) следующего состава: среда RPMI-1640 (Gibco, Великобритания) с 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (РАА, Австрия).

Через 2 ч неприлипшие клетки удаляли, а адгезировавшиеся моноциты культивировали в ППС с 20 нг/мл ИЛ-4 (Sci.store.ru, Россия) и 100 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (Sci.store.ru, Россия). ИЛ-4 и ГМ-КСФ повторно добавляли в культуры в той же концентрации на 3-й день культивирования. На 7-й день полученные из моноцитов нДК переводили в свежую ППС и инкубировали 48 ч с микроорганизмами в концентрации 106 бактерий/мл при 37 °C и 5 % CO2.

Негативным контролем являлись нДК, инкубированные без стимуляторов. Положительным контролем созревания являлись ДК, инкубированные 48 ч с 25 нг/мл ИЛ-1β, 25 нг/мл ИЛ-6, 50 нг/мл фактора некроза опухоли α (ФНОα) и 1 мкг/мл простагландина E2. Такие стимулированные цитокинами ДК далее обозначены как ДК-ЦТК.

После культивирования ДК ресуспендировали и суспензию клеток центрифугировали при 400 g 10 мин. Надосадки собирали и хранили при -70 оС до определения содержания цитокинов. ДК отмывали и ресуспендировали в ППС в концентрации 2 - 105 клеток/мл для создания смешанных культур.

Смешанная культура CD4+-Т-лимфоцитов и ДК. CD4+-Т-лимфоциты выделяли из МНПК магнитной сепарацией с негативной селекцией с помощью набора EasySep Human CD4+ T Cell Isolation Kit (Stemcell, Канада) согласно инструкции производителя. Чистоту выделения контролировали с помощью окрашивания клеток антителами к CD4, меченными FITC (Сорбент, Россия), и лазерной проточной цитометрии на приборе FACSCalibur (BD Biosciences, США). Использовались пробы клеток, содержащие не менее 95 % CD4+-Т-лимфоцитов.

ДК, инкубированные и не инкубированные с бактериями, засевали в лунки плоскодонных 96-луночных планшетов по 2 - 104 клеток на лунку в 100 мкл ППС. В лунки с ДК вносили по 2 - 105 CD4+-Т-клеток в 100 мкл ППС. Кроме того, засевались контрольные лунки: CD4+-Т-клетки без ДК и без бактерий, CD4+-Т-клетки с бактериями без ДК и все варианты ДК без Т-клеток. Конечный объем во всех лунках доводили ППС до 200 мкл. Каждый вариант засевали в 2 повторах.

Культуры инкубировали 5 сут при 37 оС и 5 % СО2, затем клетки осаждали центрифугированием планшетов при 300 g в течение 10 мин, отбирали надосадки и хранили их при -70 оС до определения содержания цитокинов. Оставшиеся в лунках клетки ресуспендировали в PBS с 0,09 % NaN3 для иммунофлуоресцентного окрашивания или в лизирующем буфере (Macherey-Nagel, Германия) для выделения РНК.

Проточная цитометрия. Клетки окрашивали флуоресцентно мечеными моноклональными антителами к CD3 и CD25 (Сорбент, Россия), отмывали, затем фиксировали и пермеабилизировали с помощью набора FOXP3 Ficsation Permeabilization kit (eBioscience, США) согласно протоколу производителя для окрашивания ядерных белков. Затем окрашивали ядерный фактор FOXP3 (forkhead box P3) с помощью соответствующих меченых антител (eBioscience, США). Клетки анализировали на лазерном проточном цитофлуориметре FACSCalibur (ВD, США), последовательно выделяя гейты малых лимфоцитов и лимфобластов по показателям прямого и бокового светорассеивания (FSC и SSC) и гейты CD3+-Т-клеток. Затем в этих гейтах определяли количество клеток с фенотипом CD25+FOXP3- и CD25+FOXP3+.

Иммуноферментный анализ. Концентрации цитокинов в надосадках ДК определяли с помощью наборов "Интерлейкин-6-ИФА-Бест", "Интерлейкин-1 бета-ИФА-Бест", "Интерлейкин-10-ИФА-Бест" и "Рецепторный антагонист ИЛ-1-ИФА-Бест" (Вектор-Бест, Россия). Концентрации цитокинов в надосадках смешанных культур определяли с помощью наборов "Интерлейкин-10-ИФА-Бест", "гамма-Интерферон-ИФА-Бест" (Вектор-Бест, Россия) и "ИФА-ИЛ-17А" (Цитокин, Россия). Анализ проводили в соответствии с инструкциями производителей.

Реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция (ОТ-ПЦР). РНК выделяли из клеток смешанных культур с помощью набора NucleoSpin RNA XS (Macherey-Nagel, Германия) согласно инструкции производителя. Количество транскриптов оценивали в одностадийной относительной количественной ОТ-ПЦР в реальном времени на приборе Stratagene Mx3005P (Agilent Technologies, США) с помощью реагентов Applied Biosystems, США: набора TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents kit, праймеров и меченых проб TaqMan gene expression assay reagents для определения экспрессии генов RORc (Hs01076112_m1), FOXP3 (Hs01092117_m1) и B2M (ген β2-микроглобулина). Нормализацию осуществляли по уровню B2M. Калибраторами служили пробы лимфоцитов без ДК и микроорганизмов.

Статистический анализ. Нормальность распределения оценивали с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Поскольку распределение большинства вариационных рядов не соответствовало нормальному, результаты представлены как медиана ± 2-й и 3-й квартили. Достоверность различий оценивали по критерию Вилкоксона для парных образцов.

Результаты

Поскольку видовая идентификация использованных в работе микроорганизмов с помощью традиционных бактериологических методов затруднительна, для характеристики микроорганизмов использовали пролетную масс-спектрометрию. Анализ результатов масс-спектрометрии с помощью программно-аппаратного комплекса BioTyper подтвердил видовую принадлежность и чистоту использованных в работе микроорганизмов родов Bacillus, Lactiplantibacillus и Limosilactobacillus (рис. 1).

Лактобациллы также были охарактеризованы с помощью полногеномного секвенирования, нуклеотидные последовательности депонированы в международной базе данных GenBank под номерами LBDF00000000, LBDG00000000, LBDH00000000.

Все использованные микроорганизмы рода Bacillus вызывали значительное усиление продукции провоспалительного цитокина ИЛ-1β и противовоспалительного ИЛ-10 в культурах ДК (рис. 2). B. subtilis и B. licheniformis также индуцировали сильную продукцию ИЛ-6, тогда как B. cereus вызывал относительно слабый рост продукции этого полифункционального цитокина. Кроме того, B. cereus и B. subtilis индуцировали небольшое усиление продукции рецепторного антагониста ИЛ-1 (РАИЛ-1). Микроорганизмы семейства Lactobacillaceae оказывали слабое влияние на продукцию дендритными клетками про- и противовоспалительных цитокинов. Все использованные лактобациллы не усиливали продукцию ИЛ-1β и слабо, но достоверно увеличивали продукцию ИЛ-6 и ИЛ-10. L. fermentum 39 и L. plantarum вызывали небольшой прирост продукции РАИЛ-1, тогда как L. fermentum 90 ТС-4 не влиял на его продукцию.

Для оценки действия микроорганизмов на способность ДК стимулировать Т-лимфоциты-хелперы использовали аллогенную смешанную культуру, в которой отвечающими клетками были очищенные CD4+-Т-лимфоциты, а стимуляторами - ДК, инкубированные с бактериями в течение 2 сут перед посевом смешанных культур.

Активация Т-лимфоцитов ДК вызывала трансформацию контактирующих с ними лимфоцитов в лимфобласты (рис. 3А), которые затем идентифицировали с помощью проточной цитометрии (рис. 3Б). В контрольных культурах Т-лимфоцитов с бактериями без ДК практически все клетки сохраняли малые размеры, характерные для неактивированных лимфоцитов. Выделенные в гейты CD3+-лимфоциты и CD3+-лимфобласты использовали для анализа экспрессии CD25 на наружной мембране и ядерного фактора FOXP3 внутри клеток (рис. 3В).

B. cereus достоверно усиливал способность ДК индуцировать трансформацию CD4+-Т-лимфоцитов в лимфобласты, в результате чего доля лимфобластов увеличивалась с 24,3 % в смешанных культурах с нДК до 34,4 % в смешанных культурах с ДК, предварительно инкубированными с B. cereus (рис. 4А). Преинкубация ДК с B. subtilis вызывала менее выраженное и недостоверное увеличение количества лимфобластов, тогда как преинкубация ДК с лактобактериями не влияла на способность ДК индуцировать бласттрансформацию CD4+-Т-клеток.

Оценка количества малых Т-лимфоцитов и Т-лимфобластов с фенотипом активированных Т-клеток CD25+FOXP3- показала, что в монокультурах Т-лимфоцитов количество этих клеток ничтожно (рис. 4А). Добавление бактерий непосредственно в культуры чистых CD4+-Т-клеток не увеличивало доли активированных лимфоцитов, и лишь стимуляция Т-клеток ДК существенно увеличивала долю Т-клеток с фенотипом CD25+FOXP3-. Зрелые ДК-ЦТК по сравнению с нДК вызывали дополнительный достоверный прирост количества CD25+FOXP3--Т-лимфобластов в смешанных культурах. Преинкубация ДК с бактериями рода Bacillus приводила к небольшому и недостоверному приросту содержания CD25+FOXP3--Т-лимфобластов, тогда как преинкубация ДК с лактобациллами не влияла на долю CD25+FOXP3--Т-лимфобластов. Содержание малых CD25+FOXP3--Т-лимфоцитов в смешанных культурах было небольшим и не зависело от типа стимулирующих ДК (рис. 4А).

Преинкубация ДК с B. cereus вела к небольшому достоверному росту содержания клеток с фенотипом CD25+FOXP3+, который характерен для Трег. Преинкубация с лактобациллами не влияла на этот параметр (рис. 4Б). Следует отметить, что рост количества CD25+FOXP3+-Т-клеток также наблюдался в культурах, стимулированных зрелыми ДК-ЦТК. Анализ экспрессии гена FOXP3 на 5-е сутки культивирования смешанных культур не выявил различий его экспрессии между культурами, стимулированными нДК, ДК-ЦТК и ДК, преинкубированными с B. cereus (рис. 4В). Это свидетельствует о том, что увеличение доли клеток с фенотипом Трег в смешанных культурах не сопровождалось стойким усилением экспрессии гена ядерного фактора FOXP3.

Добавление нДК в культуры CD4+-Т-лимфоцитов значительно усиливало продукцию ИЛ-10 и индуцировало продукцию ИФН-γ и ИЛ-17 лимфоцитами (рис. 5). Преинкубация ДК с микроорганизмами рода Bacillus, как и созревание ДК-ЦТК, многократно снижала способность ДК стимулировать продукцию ИЛ-10 в смешанной культуре (рис. 5А). Преинкубация ДК с L. plantarum вызывала лишь небольшое ослабление продукции ИЛ-10 в смешанной культуре, тогда как преинкубация ДК с L. fermentum не влияла на продукцию ИЛ-10 лимфоцитами.

ДК-ЦТК стимулировали продукцию ИФН-γ Т-клетками в 1,9 раза сильнее, чем нДК, тогда как ДК, преинкубированные с B. subtilis, B. licheniformis или L. fermentum, слабее, чем нДК, стимулировали продукцию ИФН-γ (рис. 5Б).

ДК-ЦТК в смешанных культурах вызывали сильную продукцию ИЛ-17, которая в 5,8 раз превышала контрольный уровень смешанных культур с нДК (рис. 5В). ДК, преинкубированные с B. licheniformis, стимулировали продукцию ИЛ-17 в 1,5 раза сильнее, чем нДК. В то же время микроорганизмы семейства Lactobacillaceae подавляли ИЛ-17-индуцирующую способность ДК. Преинкубация ДК с B. cereus не влияла на продукцию ИЛ-17 в смешанной культуре (рис. 5В), но значительно увеличивала экспрессию гена RORc (рис. 5Г).

Обсуждение

Ранее, в ходе отбора кандидатов на роль векторов для живых пероральных вакцин, мы показали, что ДК эффективно фагоцитируют B. cereus, L. plantarum и L. fermentum, но очень слабо поглощают E. coli и Enterococcus faecium. Грибы Saccharomyces boulardii и Candida albicans поглощались большим количеством ДК, но приносили в клетки относительно мало микробного материала. По способности индуцировать фенотипическое созревание ДК наибольшую активность проявила E. coli. За ней следовали C. albicans, B. cereus, S. boulardii, L. plantarum, и наименьшей активностью обладал L. fermentum [7].

Поскольку, по нашему мнению, основной функцией вакцинного вектора является доставка антигенов в АПК, для дальнейших исследований были выбраны бактерии родов Bacillus, Lactiplantibacillus и Limosilactobacillus, эффективно поглощаемые ДК.

В данной работе показано, что бактерии рода Bacillus стимулируют продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-1β, а также противовоспалительного ИЛ-10 в культурах ДК. B. cereus и B. subtilis также вызывали небольшое усиление продукции РАИЛ-1. Таким образом, мы наблюдали сбалансированное усиление продукции как провоспалительных, так и противовоспалительных цитокинов клетками врожденного иммунитета под действием микроорганизмов рода Bacillus. Тем не менее, мы считаем, что использовать эти микроорганизмы в качестве вакцинных векторов можно лишь после исследования локального провоспалительного действия экспериментальных вакцин в моделях in vivo.

Преинкубация ДК с микроорганизмами рода Bacillus изменяла способность ДК стимулировать CD4+-Т-лимфоциты в смешанной культуре. Так, B. cereus значительно усиливал способность ДК индуцировать трансформацию CD4+-Т-лимфоцитов в лимфобласты. Все использованные бактерии рода Bacillus многократно снижали способность ДК стимулировать продукцию противовоспалительного и иммуносупрессивного ИЛ-10 в культуре лимфоцитов, а B. subtilis и B. licheniformis также ослабляли способность ДК индуцировать продукцию ИФН-γ - ключевого Тh1-цитокина [9].

В то же время преинкубация ДК с B. licheniformis вызывала умеренное увеличение продукции в смешанной культуре ИЛ-17 - ключевого цитокина Тh17 [9]. Преинкубация ДК с B. cereus не оказывала заметного влияния на продукцию ИЛ-17, но увеличивала экспрессию гена RORc, который кодирует ядерный фактор транскрипции RORγt - ключевой фактор дифференцировки Тh17 [9].

По-видимому, контакт ДК с B. cereus вызывает слабое усиление Тh17-индуцирующих свойств ДК, в результате чего к 5-м суткам культивирования смешанных культур наблюдается лишь экспрессия мастер-регулятора созревания Тh17, но не основного продукта этих клеток - цитокина ИЛ-17.

Интересно, что в смешанных культурах с ДК, преинкубированными с B. cereus, наблюдалось небольшое увеличение количества Т-клеток с фенотипом CD25+FOXP3+. Как известно, этот фенотип характерен для Трег - супрессоров иммунного ответа, причем стабильная экспрессия ядерного фактора FOXP3 является критическим условием не только созревания, но и сохранения супрессорной функции Трег [10]. В то же время известно, что активация обычных FOXP3--Т-клеток приводит к транзиторной экспрессии ядерного фактора FOXP3 с пиком подъема на 3-й день после активации и падением до исходных значений к 10-му дню культивирования. При этом транзиторная экспрессия FOXP3 не приводит ни к угнетению провоспалительной активности Т-клеток, ни к формированию у них супрессорных свойств [11].

Проведенная нами оценка экспрессии гена FOXP3 на 5-й день роста смешанных культур не выявила усиления экспрессии этого гена под действием преинкубации ДК с B. cereus. Следует отметить, что контрольные зрелые ДК-ЦТК также индуцировали небольшой прирост содержания CD25+FOXP3+-Т-клеток без роста экспрессии гена FOXP3 на 5-й день после засева смешанных культур. При этом все остальные показатели смешанной культуры с ДК-ЦТК демонстрировали сильный провоспалительный, а не толерогенный потенциал этих ДК: ДК-ЦТК эффективно стимулировали бласттрансформацию Т-клеток и активность Тh1 и Тh17, но значительно слабее, чем нДК, стимулировали продукцию лимфоцитами ИЛ-10 - цитокина, играющего важную роль в супрессорной функции индуцибельных FOXP3+-Трег [10].

Как уже было отмечено выше, преинкубация с B. cereus также подавляла способность ДК индуцировать продукцию ИЛ-10 в смешанной культуре. Учитывая вышеизложенное, мы считаем, что рост содержания CD25+FOXP3+-Т-клеток в смешанных культурах с ДК, преинкубированными с B. cereus, не является признаком усиления генерации функционально полноценных и стабильных Трег.

Лактобациллы при действии на ДК демонстрировали признаки своего рода иммунологической нейтральности со склонностью к умеренному подавлению провоспалительных реакций Т-клеток. В отличие от бактерий рода Bacillus, способных лишь к временной персистенции в кишечнике, лактобациллы являются облигатными компонентами микрофлоры слизистых оболочек человека и содержатся в кишечнике в чрезвычайно большом количестве, не вызывая ни воспаления, ни иммуносупрессии.

Как уже было отмечено выше, лактобациллы хорошо поглощаются незрелыми ДК, но обладают низкой активностью в индукции их фенотипического созревания. Добавление L. plantarum и L. fermentum слабо стимулировало продукцию цитокинов в культурах ДК и не влияло на способность ДК индуцировать бласттрансформацию CD4+-Т-клеток. Также мы не обнаружили выраженного толерогенного или иммуносупрессивного действия лактобацилл в использованных моделях.

Эти бактерии слабо усиливали продукцию ИЛ-10 в культурах ДК и не влияли на способность ДК индуцировать генерацию CD25+FOXP3+-Т-клеток в смешанной культуре. Преинкубация ДК с L. plantarum вызывала небольшое ослабление продукции ИЛ-10 Т-лимфоцитами в смешанной культуре, тогда как преинкубация ДК с L. fermentum не влияла на продукцию этого супрессорного цитокина, но ослабляла продукцию Т-клетками провоспалительных цитокинов ИФН-γ и ИЛ-17.

Заключение

Микроорганизмы рода Bacillus стимулируют функциональную активность ДК, усиливая продукцию этими клетками про- и противовоспалительных цитокинов, увеличивая способность ДК индуцировать бласттрансформацию CD4+-Т-лимфоцитов и ослабляя способность ДК индуцировать продукцию ИЛ-10 Т-клетками. Лактобациллы оказывают слабое действие на продукцию цитокинов ДК и умеренно ослабляют их способность стимулировать провоспалительную активность Т-лимфоцитов.

Литература

1.Rescigno M. Intestinal dendritic cells. Adv. Immunol. 2010; 107: 109-38. DOI: https://doi.org/10.1016/B978-0-12-381300-8.00004-6

2.Rescigno M., Urbano M., Valzasina B., Francolini M., Rotta G., Bonasio R., Granucci F., Kraehenbuhl J.P., Ricciardi-Castagnoli P. Dendritic cells express tight junction proteins and penetrate gut epithelial monolayers to sample bacteria. Nat. Immunol. 2001; 2 (4): 361-7. DOI: https://doi.org/10.1038/86373

3.Hiramatsu Y., Hosono A., Konno T., Nakanishi Y., Muto M., Suyama A., Hachimura S., Sato R., Takahashi K., Kaminogawa S. Orally administered Bifidobacterium triggers immune responses following capture by CD11c+ cells in Peyer’s patches and cecal patches. Cytotechnology. 2011; 63 (3): 307-17. DOI: https://doi.org/10.1007/s10616-011-9349-6

4.Guermonprez P., Valladeau J., Zitvogel L., Théry C., Amigorena S.. Antigen presentation and T cell stimulation by dendritic cells. Annu. Rev. Immunol. 2002; 20: 621-67. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.20.100301.064828

5.Savina A., Amigorena S. Phagocytosis and antigen presentation in dendritic cells. Immunol Rev. 2007; 219: 143-56. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2007.00552.x

6.Weiner H.L., da Cunha A.P., Quintana F., Wu H. Oral tolerance. Immunol. Rev. 2011; 241 (1): 241-59. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2011.01017.x

7. Талаев В.Ю., Заиченко И.Е., Светлова М.В., Воронина Е.В., Бабайкина О.Н., Соловьева И.В., Белова И.В., Точилина А.Г. Взаимодействие дендритных клеток с микроорганизмами, способными заселять кишечник. Иммунология. 2022; 43 (4): 412-22. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-412-422

8. Талаев В.Ю., Воронина Е.В., Светлова М.В., Заиченко И.Е., Бабайкина О.Н. Эффекты взаимодействия циркулирующих CD4+CСR6+-Т-клеток с В-лимфоцитами. Иммунология. 2022; 43 (3): 266-76. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-3-266-276

9.Damsker J.M., Hansen A.M., Caspi R.R. Th1 and Th17 cells: adversaries and collaborators. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2010; 1183: 211-21. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2009.05133.x

10.Shevach E.M., Thornton A.M. tTregs, pTregs, and iTregs: similarities and differences. Immunol. Rev. 2014; 259 (1): 88-102. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12160

11.Gavin M.A., Torgerson T.R., Houston E. et al. Single-cell analysis of normal and FOXP3-mutant human T cells: FOXP3 expression without regulatory T cell development [published correction appears in Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2006; 103 (24): 9373]. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2006; 103 (17): 6659-64. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0509484103

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Редакционная коллегия журнала «Иммунология» и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России с прискорбием сообщают, что 11.03.2022 г. скончался Президент журнала «Иммунология», научный руководитель Института академик РАН Хаитов Рахим Мусаевич
Медицина сегодня
Уважаемые коллеги, до XI-го Национального конгресса с международным участием имени Н.О. Миланова "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология" осталось 3 дня

Уважаемые коллеги, до XI-го Национального конгресса с международным участием имени Н.О. Миланова "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология" осталось 3 дня! С 29 ноября по 1 декабря 2022 года в Москве пройдет XI Национальный конгресс "Пластическая хирургия,...

X конференция с международным участием "Креативная кардиология и кардиохирургия. Новые технологии диагностики и лечения заболеваний сердца"

6-7 декабря 2022 года состоится юбилейная X конференция с международным участием "Креативная кардиология и кардиохирургия. Новые технологии диагностики и лечения заболеваний сердца", которая будет проходить в очном и онлайн-формате в ФГБУ "НМИЦ ССХ им. А.Н. Бакулева"...

Приглашаем 1 и 2 декабря в Москву на яркий профессиональный праздник - итоговую всероссийскую Школу РОАГ!

Приглашаем 1 и 2 декабря в Москву на яркий профессиональный праздник - итоговую всероссийскую Школу РОАГ! Школа в Москве занимает особое место в образовательном цикле Школ РОАГ. На ней подводятся итоги прошедшего сезона, обсуждаются темы, которые вызывают наибольший интерес...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»