Особенности иммунного ответа на опухолевые штаммы EL-4 у мышей линий C57BL/6, В10.D2 (R101) и BALB/c

Резюме

Введение. Иммунная система обеспечивает противоопухолевый иммунитет, или иммунный надзор за опухолью. Для терапии опухолей часто используется сингенная адоптивная иммунотерапия, которая бывает неэффективна ввиду слабой иммуногенности опухолевых антигенов для собственной иммунной системы. Теоретически аллогенная адоптивная иммунотерапия должна быть значительно более эффективной.

Цель работы - исследовать динамику субпопуляций Т-лимфоцитов и НК-клеток при введении опухолевых штаммов EL-4 у мышей линий C57BL/6, В10.D2 (R101) и BALB/с.

Материал и методы. Исследование проводили на линейных мышах C57BL/6, BALB/c и В10.D2 (R101). Аллогенных мышей линий BALB/c и B10.D2 (R101) иммунизировали живыми клетками опухолевого штамма EL-4 внутрибрюшинно, сингенных мышей линии C57BL/6 - внутрикожно с последующей плотной перевязкой опухоли и реиммунизацией через 2 мес. Для оценки иммунного ответа на опухоль в селезенке на 3-и, 12-е и 15-е сутки определяли клеточность и субпопуляционный состав Т- и НК-клеток методом проточной цитофлуориметрии.

Результаты. Первичный иммунный ответ на опухолевые штаммы EL-4 у сингенных мышей линии C57BL/6 заключался в увеличении численности Т-клеточных субпопуляций - центральных Т-хелперов и цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) памяти - в селезенке на 7-е сутки. Также с 7-х суток почти в 2 раза увеличивался уровень НК-клеток. При вторичном иммунном ответе отмечалось снижение численности Т-лимфоцитов, Т-хелперов и эффекторных клеток памяти (CD4+-TEM и CD8+-TEM) в селезенке в ранние сроки после реиммунизации с дальнейшим увеличением численности общей субпопуляции ЦТЛ, а также субпопуляций центральных и эффекторных ЦТЛ памяти через 1 нед, причем численность эффекторных ЦТЛ памяти к 7-м суткам в селезенке превышало их число в контроле в 2,5 раза, а численность НК-клеток увеличивалась к концу 1-й недели, сохраняясь повышенной до 12-х суток. Ни у одной из реиммунизированных мышей в течение срока наблюдения (400 сут) не отмечено роста опухоли. У аллогенных мышей линии B10.D2 (R101) после введения EL-4 в селезенке выявлено снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток в ранние сроки. Увеличение численности ЦТЛ было выявлено на 12-е сутки, численность НК-клеток увеличивалась к 13-м суткам. У аллогенных мышей линии BALB/с также наблюдалось снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток в ранние сроки после иммунизации, увеличение численности всех Т-лимфоцитов отмечалось с конца 1-й недели и сохранялось до 13-х суток, увеличение числа Т-хелперов и ЦТЛ - с 7-х до 11-х суток.

Заключение. Максимальная экспансия эффекторных ЦТЛ у сингенных мышей C57BL/6 мышей отмечалась на 7-е сутки, а у аллогенных мышей - позже: на 11-е сутки у мышей линии BALB/c и на 12-е сутки у мышей линии B10.D2 (R101). Следовательно, именно в эти сроки можно ожидать наибольший терапевтический эффект от переноса эффекторных субпопуляций ЦТЛ при проведении адоптивной иммунотерапии.

Ключевые слова:сингенные лимфоциты; аллогенные лимфоциты; EL-4; иммунизация; реиммунизация; адоптивная иммунотерапия

Для цитирования: Донецкова А.Д., Никонова М.Ф., Шарова Н.И., Комогорова В.В., Литвина М.М., Гринько Е.K., Киреев Б.В., Донецков А.Д., Митин А.Н. Особенности иммунного ответа на опухолевые штаммы EL-4 у мышей линий C57BL/6, В10.D2 (R101) и BALB/с. Иммунология. 2022; 43 (5): 558-570. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-558-570

Финансирование. Исследование проведено в рамках выполнения аванпроекта Фонда перспективных исследований (договор № 6/088/2016-2017ав от 15.08.2016). Работа Донецковой А.Д. выполнена при поддержке Программы стратегического академического лидерства РУДН.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Донецкова А.Д., Митин А.Н.; сбор и обработка материала - Донецкова А.Д., Никонова М.Ф., Шарова Н.И., Гринько Е.K.; анализ цитометрических данных - Комогорова В.В., Литвина М.М., Митин А.Н.; статистическая обработка - Киреев Б.В., Донецков А.Д.; написание и редактирование текста - Донецкова А.Д., Митин А.Н.

Введение

Иммунная система обеспечивает противоопухолевый иммунитет, или иммунный надзор за опухолью. К механизмам иммунного надзора за опухолями относятся непосредственное распознавание и уничтожение опухолевых клеток, предотвращение и ликвидация онкогенных вирусных инфекций, ослабление хронической воспалительной реакции и хронических инфекций, а также подавление пролиферации аберрантных клеток через сигнальные пути, запускаемые цитокинами [1-3].

На современном этапе с целью достижения контроля над злокачественным процессом в терапии опухолей все более активно используется иммунотерапия (биотерапия), представляющая собой лечение опухолей посредством пассивной и активной иммунизации, моноклональных антител, активированных лимфоцитов, цитокинов и их антагонистов [4].

Одним из наиболее перспективных, специфичных и эффективных методов лечения опухолей видится адоптивная иммунотерапия, включающая применение иммунокомпетентных клеток [5]. В ряде работ было показано, что адоптивная цитотерапия, включающая перенос лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (TIL), лимфокин-активированных киллеров (ЛАК) после экспансии in vitro или модификация Т-лимфоцитов путем трансфекции Т-клеточных рецепторов и химерных антигенных рецепторов (TCR-T- и CAR-T-клетки), эффективна при некоторых злокачественных новообразованиях [6-11]. Основные проблемы всех методов адоптивной клеточной терапии - трудоемкость и высокая стоимость получения клеток, способных оказывать противоопухолевое действие.

Предпосылкой к проведению данного исследования стало то, что для терапии опухолей используется сингенная адоптивная иммунотерапия, которая часто оказывается неэффективной ввиду слабой иммуногенности опухолевых антигенов для собственной иммунной системы [12]. Теоретически аллогенная адоптивная иммунотерапия должна быть значительно более эффективной, однако при переносе аллогенных клеток возникает вопрос отторжения клеток донора. Большая активность аллогенных опухоль-специфичных Т-лимфоцитов в случае преодоления или преобладания над реакцией отторжения позволит более активно элиминировать развившуюся опухоль ввиду сильной иммуногенности чужеродных опухолевых антигенов для иммунной системы донора. Вопрос отторжения аллогенных Т-клеток может быть решен путем создания костномозговых химер, толерантных к клеткам донора. В то же время известно, что любая опухоль экспрессирует разнообразные антигены, причем они могут отличаться у пациентов с одной и той же нозологической формой опухоли. В этом случае аллогенная адоптивная противоопухолевая терапия может оказаться неэффективной.

На первом (подготовительном) этапе работы нами проведена иммунизация опухолевыми клетками EL-4 мышей разных линий [C57BL/6, BALB/с и В10.D2(R101)], сингенных и аллогенных по отношению к данной опухолевой линии, с последующим исследованием иммунного ответа на опухоль и оценкой возможности проведения сингенной и аллогенной адоптивной иммунотерапии.

Материал и методы

Экспериментальные животные и клеточные культуры. Исследование проводилось на линейных мышах C57BL/6 и BALB/c в возрасте 6-8 нед, самках массой 18-20 г, полученных из питомника "Столбовая" ФГБУН НЦБМТ ФМБА России, а также на мышах линии В10.D2 (R101), любезно предоставленных экспериментально-биологической лабораторией ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России. Все процедуры с экспериментальными животными проводили в соответствии с правилами лабораторной практики ["Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" (ETS N123), приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 № 708н "Об утверждении правил лабораторной практики" и "Положение об этическом отношении к лабораторным животным ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России].

Живые опухолевые клетки лимфомы EL-4, полученные из коллекции опухолевых штаммов, созданной в экспериментально-биологической лаборатории ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России, перевивали в асцитной форме в сингенных мышах линии C57BL/6 по стандартной методике. Для этого 5×106 опухолевых клеток вводили внутрибрюшинно сингенной мыши линии C57BL/6 в 500 мкл PBS. Через 8 дней собирали асцитную жидкость, делая перитонеальный лаваж. Клетки трижды отмывали в PBS и подсчитывали количество опухолевых клеток в камере Горяева в присутствии эозина. Жизнеспособность клеток превышала 97%. В опытах использовали клетки после 1-го пассажа.

Экспериментальные процедуры. При отработке методики иммунизации мышей опухолевыми клетками было установлено, что для иммунизации аллогенных мышей приемлема внутрибрюшинная иммунизация, однако этот способ оказался непригоден для сингенных мышей. Для иммунизации сингенных мышей пришлось ограничить проникновение опухоли в подлежащие ткани с помощью перевязки опухолевого узла.

Аллогенных мышей линий BALB/c и B10.D2 (R101) иммунизировали живыми клетками опухолевого штамма EL-4 внутрибрюшинно в дозе 10,0 млн клеток на мышь. Для оценки первичного иммунного ответа аллогенных мышей линий B10.D2 (R101) и BALB/c выводили из эксперимента методом цервикальной дислокации на 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13 и 15-е сутки после иммунизации живыми клетками опухолевого штамма EL-4.

Сингенных мышей линии C57BL/6 иммунизировали живыми клетками опухолевого штамма EL-4 внутрикожно в дозе 0,1 млн клеток на мышь. При достижении опухолью размера 1,0 см по одному из диаметров для предупреждения ее дальнейшего распространения и гибели животных опухоль плотно перевязывали. В дальнейшем (через 2-3 сут) наблюдали отпадение опухоли. Для оценки первичного иммунного ответа мышей линии C57BL/6 выводили из эксперимента на 3, 7, 9 и 12-е сутки после иммунизации живыми клетками опухолевого штамма EL-4.

Через 2 мес после иммунизации проведена подкожная реиммунизация мышей линии C57BL/6 живыми клетками опухолевой линии EL-4 в подлопаточную область в дозе 1,0 млн клеток на мышь. Для оценки вторичного иммунного ответа иммунизированных сингенных мышей линии С57BL/6 выводили из эксперимента на 3, 5, 7, 9, 10 и 12-е сутки после повторной иммунизации.

Лабораторные исследования. У мышей извлекали селезенку, освобождали ее от соединительной ткани, гомогенизировали, выделяли клетки, лизировали эритроциты с помощью лизирующего буфера фирмы eBioscience (США), определяли численность и жизнеспособность клеток, предварительно окрашенных эозином, в камере Горяева, отмывали раствором PBS c 1,0 % BSA и 0,1 % ЭДТА и инкубировали с моноклональными антителами (МкАт) в растворе PBS с 1,0 % BSA и 0,1 % NaN3 в течение 30 мин при 4 °С. Использовали следующие сочетания МкАт: NK1.1-FITC, CD3-APC, CD4-PerCP, CD8-APCeFluor780, CD44-PECy7, СD62L-PE. Лазерную цитометрию осуществляли на проточном цитометре BD FACSCanto™ II (Becton Dickinson, США) в стандартном режиме. Анализ данных проводили с помощью программного обеспечения FlowJo X (США).

Статистическую обработку проводили с использованием методов непараметрического анализа. Количественные показатели представляли в виде Ме (LQ-UQ), где Ме - медиана, LQ - нижний квартиль, UQ - верхний квартиль. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использовали U-критерий Манна-Уитни. Различие групп полагали статистически значимым при р < 0,05. Обработку проводили в программном пакете StatSoft Statistica 12.0.

Результаты

Нами проведена оценка клеточности и количественного состава различных субпопуляций Т-лимфоцитов, НК и НКT-клеток. Цитотоксические Т-лимфоцитов (ЦТЛ) определяли методом проточной цитометрии по экспрессии маркеров CD3 и СD8, Т-хелперы - по экспрессии маркеров CD3 и CD4, наивные клетки (Тnaive) - по фенотипу CD62LhighCD44low/-, центральные Т-клетки памяти (ТСМ) - CD62LhighCD44high, эффекторные Т-клетки памяти (ТЕМ) - CD62Llow/-CD44high (рис. 1), НК-клетки - по экспрессии NK1.1, НКT - по коэкспрессии CD3 и NK1.1.

В табл. 1 представлена динамика содержания Т-клеток, наивных и эффекторных Т-лимфоцитов, НК и НКT-клеток в селезенке мышей линии C57BL/6 после первичного введения опухолевых клеток EL-4.

Судя по табл. 1, наибольшее количество Т-лимфоцитов в селезенке отмечалось на 7-е сутки - 39,4 млн (35,73-45,63 млн), однако их численность статистически не отличалась от численности Т-клеток в контроле - 34,4 млн (25,4-43,37 млн), р = 0,40. Численность центральных Т-хелперов и ЦТЛ памяти также увеличивалось на 7-е сутки (для Т-хелперов увеличение сохранялось и на 9-е сутки), а эффекторных Т-киллеров - на 7-12-е сутки (р < 0,05 в сравнении с контролем). Численность наивных Т-хелперов и ЦТЛ статистически значимо снижалось к 12-м суткам до 2,53 млн (2,3-3,36 млн) и 4,42 млн (4,17-4,82 млн) соответственно, р < 0,05 в сравнении с контролем. К концу 1-й недели почти в 2 раза увеличивалось число НК-клеток, которое составляло 7,46 млн (6,96-7,49 млн) при 4,06 млн (3,1-4,95 млн) в контроле, р = 0,005 (рис. 2). Однако, несмотря на увеличение численности некоторых субпопуляций лимфоцитов, первичный иммунный ответ на опухолевые клетки EL-4 у мышей линии C57BL/6 был неэффективен: у мышей, которым опухоль не перевязывали, отмечались ее рост и гибель животных через 3 нед после введения опухолевых клеток.

Для проверки наличия противоопухолевого иммунитета у иммунизированных мышей им через 2 мес после первой иммунизации повторно ввели опухолевые штаммы лимфомы EL-4 подкожно. Ни у одной из реиммунизированных мышей в течение срока наблюдения (400 сут) не отмечено роста опухоли [неиммунизированные мыши из группы контроля того же возраста, что и мыши экспериментальной группы, погибли на 24,0 (21,0-27,0) сут, р<0,001].

У части первично реиммунизированных мышей проведена оценка вторичного иммунного ответа (табл. 2).

При цитофлуориметрическом анализе селезенок мышей линии C57BL/6 после реиммунизации клетками EL-4 максимальная клеточность этого органа отмечалась на 9-е сутки: 156,4 млн (146-172 млн), что статистически значимо отличалось от соответствующего показателя в контрольной группе - 142 млн (124,5-154,8 млн), р = 0,038 (см. табл. 2).

Количество Т-лимфоцитов, Т-хелперов и эффекторных Т-хелперов памяти в селезенке не увеличивалось, наоборот, отмечалось их значимое снижение на 3-и сутки после реиммунизации, р < 0,05 в сравнении с контролем. В то же время отмечалось статистически значимое увеличение Т-хелперов, несущих маркер CD62L. Численность наивных Т-хелперов увеличивалась к 9-м суткам, а центральных Т-хелперов памяти - к 5-м суткам с максимальным значением на 7-е сутки, сохраняясь повышенным до 10-х суток. Что касается субпопуляции ЦТЛ, а также центральных ЦТЛ памяти, их максимальная численность отмечалась через 1 нед после реиммунизации (р < 0,05 в сравнении с контролем). Считается, что при вторичном противоопухолевом иммунном ответе наибольшее протективное значение имеет субпопуляция эффекторных ЦТЛ памяти: отмечалось статистически значимое увеличение численности этой субпопуляции клеток в селезенке к 7-м суткам до 2,93 млн (2,03-3,28 млн), что в 2,5 раза превышало их численность в контроле - 1,13 млн (0,68-1,42 млн), р = 0,000007. В то же время на 3-и сутки после реиммунизации выявлено снижение числа CD8+-TEM до 0,76 млн (0,52-0,96 млн), связанное, по-видимому, с их миграцией к месту введения опухолевых клеток EL-4. Численность НК-клеток увеличивалось к концу 1-й недели, сохраняясь повышенным до 12 сут (р < 0,05) в сравнении с контролем. Численность НКT-клеток также статистически значимо была увеличена на 7-е и 12-е сутки. Таким образом, отмечалось увеличение численности клеток в основных субпопуляциях лимфоцитов, способных осуществлять противоопухолевую защиту, на 7-е сутки после реиммунизации EL-4 (рис. 3).

На рис. 4 представлены результаты цитометрического исследования фенотипа ЦТЛ селезенки на 7-е сутки после реиммунизации мышей C57BL/6, показывающие повышение содержания эффекторных ЦТЛ памяти (CD3+CD8+CD62Llow/-CD44high-клеток), в сравнении с интактными мышами и мышами, однократно иммунизированными за 60 дней до анализа.

Для оценки первичного иммунного ответа у аллогенных животных: мышей линии B10.D2 (R101) и BALB/c - на клетки опухолевого штамма EL-4 проводилась их внутрибрюшинная иммунизация с оценкой общей клеточности и численности субпопуляций лимфоцитов в селезенке. Результаты исследования представлены в табл. 3.

В отсутствие статистически значимого изменения общей клеточности в селезенке мышей линии B10.D2 (R101) было выявлено снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток (кроме наивных Т- и НК-клеток) в ранние сроки (3-и сутки) после введения EL-4, статистически значимое для эффекторных субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4+-TЕМ и CD8+-TЕМ). С 5-е по 9-е сутки отмечалось значительное (4-5-кратное) увеличение числа центральных Т-хелперов памяти, достигающих 14,67 млн (11,99-19,77 млн) при 2,77 млн (1,44-3,01 млн) в контрольной группе (р=0,04).

Что касается субпопуляции ЦТЛ, статистически значимое увеличение числа CD3+CD8+-клеток было выявлено на 12-е сутки после иммунизации (табл. 3). Численность наивных ЦТЛ (CD8+-Tnaive) в течение времени наблюдения не только не увеличивалась, но и статистически значимо снижалось на 5-е и 12-13-е сутки после введения опухолевых клеток. Это может быть связано с их переходом в эффекторные субпопуляции. Численность эффекторных ЦТЛ памяти (CD8+-TЕМ) статистически значимо снижалась на 3-и сутки, начинала увеличиваться и достигала максимального значения на 12-е сутки - 28,46 млн (22,33-46,43 млн) [увеличение почти в 4 раза в сравнении с интактным контролем - 7,37 млн (3,07-10,06 млн), р = 0,04] с его дальнейшим снижением (рис. 5).

Численность НК-клеток в ранние сроки в селезенке мышей R101, привитых EL-4, существенно не изменялась, ее увеличение отмечалось только на 13-е сутки. Содержание НКT-клеток в течение всего периода наблюдения было снижено с минимальными значениями на протяжении 5-11-х суток.

Изменение численности основных эффекторных субпопуляций лимфоцитов мышей R101, привитых EL-4, нормализованное к интактному контролю, принятому за 1, представлено на рис. 3.

Пример цитометрического исследования "возрастного" фенотипа спленоцитов на 12-е сутки после иммунизации мышей B10.D2 (R101) приведен на рис. 6: уровень CD8+-TEM ЦТЛ (CD3+CD8+CD62Llow/-CD44high-клеток) повышен в сравнении с интактными мышами.

Цитофлуориметрический анализ клеток селезенок аллогенных мышей BALB/с после первичной иммунизации клетками EL-4 показал больше статистически значимых изменений (табл. 4). Общее число лимфоидных клеток селезенки у мышей линии BALB/с статистически значимо повышалось на 9-е и 11-е сутки после иммунизации, сопровождаясь статистически значимым увеличением численности Т-клеток и их цитотоксических субпопуляций. Увеличение числа всех Т-клеток отмечалось с 7-х суток, т. е. раньше, чем общей клеточности органа, и сохранялось до 13-х суток. Так же, как и у мышей линии R101, у мышей BALB/c наблюдалось снижение числа практически всех исследованных субпопуляций клеток (кроме наивных Т-клеток) в ранние сроки (3-и сутки) после введения опухолевых штаммов EL-4. Статистически значимое увеличение численности Т-хелперов отмечалось с 7-х суток, сохраняясь до 11-х суток и достигая пика с последующим резким снижением с 12-х суток. В этот же период отмечалось статистически значимое повышение числа ЦТЛ. При этом пик численности эффекторных ЦТЛ (CD8+-TЕМ) на 11-е сутки 35,82 млн (26,5-44,42 млн) почти в 8 раз превосходил их численность в контроле - 4,52 млн (3,8-5,16 млн) (р = 0,04).

Динамика численности НК-клеток имела волнообразный характер со снижением на 3-и сутки, возможно, обусловленным миграцией этих клеток на периферию - к месту введения опухолевых клеток, и статистически значимым повышением на 7-е сутки. Увеличение численности НКT-клеток в селезенке наблюдалось на 7-е и 11-е сутки после иммунизации.

На рис. 7 представлена динамика численности основных эффекторных субпопуляций лимфоцитов в селезенке мышей линии BALB/c после иммунизации опухолевым штаммом EL-4.

Таким образом, максимальная экспансия эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) у мышей линии B10.D2 (R101) отмечалась на 12-е сутки, а у мышей линии BALB/c - на 11-е сутки. Следовательно, именно в эти сроки можно ожидать наибольший терапевтический эффект от переноса эффекторных субпопуляций ЦТЛ при проведении аллогенной адоптивной иммунотерапии.

Обсуждение

С развитием представлений о механизмах противоопухолевого иммунитета и прогрессом биотехнологий расширяются возможности терапевтического влияния на иммунную систему с целью достижением контроля над злокачественным процессом [13-17]. Современные иммунотерапевтические методы в сочетании со стандартным лечением (хирургическое удаление опухоли, химиотерапия) позволяют продлить продолжительность безрецидивного периода и улучшить качество жизни пациентов со злокачественными новообразованиями [18-20].

В настоящей работе на модели перевиваемой опухоли EL-4 нами проведено исследование опухоль-специфического иммунного ответа у мышей линий C57BL/6, В10.D2 (R101) и BALB/c с оценкой возможности проведения сингенной и аллогенной адоптивной иммунотерапии в дальнейшем. Установлено, что первичный иммунный ответ на опухолевые штаммы EL-4 у сингенных мышей линии C57BL/6 заключается в увеличении численности Т-клеточных субпопуляций (центральных Т-хелперов и ЦТЛ памяти) в селезенке на 7-е сутки. Численность основной противоопухолевой субпопуляции - эффекторных ЦТЛ также увеличивается на 7-е сутки, сохраняясь повышенной до 12-х суток. Также с 7-х суток почти в 2 раза увеличивается число НК-клеток - лимфоцитов врожденного иммунитета, осуществляющих быстрый киллинг опухоли без "двойного распознавания". Однако в случае сингенных опухолей НК-клетки, одной из функций которых является устранение опухолевых клеток, лишенных молекул MHC класса I, не работают: лимфомы устойчивы к их цитотоксическому эффекту [21, 22]. Таким образом, несмотря на увеличение численности некоторых субпопуляций лимфоцитов, первичный иммунный ответ на опухолевые клетки EL-4 у мышей линии C57BL/6 является неэффективным: отмечался рост опухоли и гибель мышей через 3 нед после введения опухолевых клеток. Это было показано еще в 1960-1980-е гг. Также у мышей линии C57BL/6, которым вводили клетки лимфомы EL-4, отмечалось снижение функциональной активности лимфоцитов селезенки в ответ на митогены - КонА и ФГA [23, 24].

Вторичный иммунный ответ на опухолевые штаммы EL-4 мы оценивали после реиммунизации мышей линии C57BL/6 (с предварительной перевязкой развивающейся опухоли для предупреждения ее дальнейшего распространения на 7-8-е сутки - при достижении опухолью размера 1,0 см по одному из диаметров). В данном случае отмечалось статистически зачимое снижение количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов и эффекторных клеток памяти (CD4+-TEM и CD8+-TEM) в селезенке в ранние сроки после реиммунизации с дальнейшим увеличением численности всей субпопуляции цитотоксических лимфоцитов, а также числа центральных и эффекторных ЦТЛ памяти через 1 нед, причем численность эффекторных ЦТЛ памяти к 7-м суткам в селезенке превышала их количество в контроле в 2,5 раза. Как и при первичном ответе на опухоль, численность естественных киллеров увеличивалось к концу 1-й недели, сохраняясь повышенным до 12-х суток. Таким образом, отмечалось увеличение численности практически всех значимых субпопуляций цитотоксических клеток на 7-е сутки после реиммунизации EL-4. Ни у одной реиммунизированной мыши в течение срока наблюдения (400 сут) не отмечено роста опухоли.

После введения опухолевых клеток EL-4 в селезенке аллогенных мышей линии B10.D2 (R101), как и у реиммунизированных сингенных мышей, выявлено снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток в ранние сроки, что, вероятно, связано с задержкой клеток в регионарных лимфатических узлах, дренирующих область введения опухолевых клеток. Обращает на себя внимание значительное увеличение численности субпопуляции центральных Т-хелперов памяти на 5-9-е сутки. Однако статистически значимое увеличение числа ЦТЛ было выявлено только на 12-е сутки после иммунизации. К этому же времени численность субпопуляции эффекторных ЦТЛ достигала своего максимального значения. Численность НК-клеток также увеличивалась только на 13-е сутки.

Введение опухолевых клеток EL-4 аллогенным мышам B10.D2 (R101) и BALB/с в норме приводит к развитию у них эффективного иммунного ответа, полному отторжению клеток опухоли и выживанию реципиентов с формированием у них иммунной памяти в течение первых 2 нед, причем у мышей линии B10.D2 (R101) отторжение происходит несмотря на то, что трансплантационные различия клеток опухоли и клеток хозяина представлены единственной молекулой гистосовместимости H-2Kb [25].

В нашем исследовании иммунный ответ на EL-4 у аллогенных мышей линии BALB/с заключался в статистически значимом повышении клеточности селезенки на 9-е и 11-е сутки после иммунизации. Увеличение численности Т-лимфоцитов отмечалось с конца 1-й недели и сохранялось до 13-х суток. Как и у реиммунизированных сингенных мышей и мышей линии R101, у мышей BALB/c наблюдалось снижение численности практически всех исследованных субпопуляций клеток в ранние сроки после иммунизации. Статистически значимое увеличение численности Т-хелперов и ЦТЛ отмечалось с 7-х до 11-х суток с последующим снижением.

Заключение

Таким образом, нами исследованы условия формирования специфической цитотоксической активности противоопухолевого иммунного ответа. Было показано, что максимальная экспансия эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов у сингенных мышей C57BL/6 мышей отмечалась на 7-е сутки, а у аллогенных мышей - позже: на 11-е сутки у мышей линии BALB/c и на 12-е сутки у мышей линии B10.D2 (R101), причем аллогенные Т-лимфоциты способны вызывать более интенсивный иммунный ответ. Следовательно, именно в эти сроки можно ожидать наибольший терапевтический эффект от переноса эффекторных субпопуляций ЦТЛ при проведении аллогенной адоптивной иммунотерапии.

Литература

1. Old L.J. Tumor immunology: the first century. Curr. Opin. Immunol. 1992; 4 (5): 603-37. DOI: https://www.doi.org/10.1016/0952-7915(92)90034-c

2. Schreiber R.D., Old L.J., Smyth M.J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 2011; 331 (6024): 1565-70. DOI: https://www.doi.org/10.1126/science.1203486

3. Borroni E.M., Grizzi F. Cancer Immunoediting and beyond in 2021. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22 (24): 13275. DOI: https://www.doi.org/10.3390/ijms222413275

4. Sheu B.C., Hsu S.M., Ho H.N., Lin R.H., Huang SC. Tumor immunology - when a cancer cell meets the immune cells. J. Formos Med. Assoc. 1999; 98 (11): 730-5. PMID: 10705688.

5. June C.H. Principles of adoptive T-cell cancer therapy. J. Clin. Invest. 2007; 117 (5): 1204-12. DOI: https://www.doi.org/10.1172/JCI31446

6. Lindemann A., Herrmann F., Oster W., Mertelsmann R. Lymphokine activated killer cells. Blut. 1989; 59 (4): 375-84. DOI: https://www.doi.org/10.1007/BF00321208

7. Paijens S.T., Vledder A., de Bruyn M., Nijman H.W. Tumor-infiltrating lymphocytes in the immunotherapy era. Cell Mol. Immunol. 2021; 18 (4): 842-59. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41423-020-00565-9

8. Mortezaee K., Majidpoor J. NK and cells with NK-like activities in cancer immunotherapy-clinical perspectives. Med. Oncol. 2022; 39 (9): 131. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s12032-022-01735-7

9. Johnson L.A., Morgan R.A., Dudley M.E., Cassard L., Yang J.C., Hughes M.S., Kammula U.S., Royal R.E., Sherry R.M., Wunderlich J.R., Lee C.C., Restifo N.P., Schwarz S.L., Cogdill A.P., Bishop R.J., Kim H., Brewer C.C., Rudy S.F., VanWaes C., Davis J.L., Mathur A., Ripley R.T., Nathan D.A., Laurencot C.M., Rosenberg S.A. Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen. Blood. 2009; 114 (3): 535-46. DOI: https://www.doi.org/10.1182/blood-2009-03-211714

10. Jogalekar M.P., Rajendran R.L., Khan F., Dmello C., Gangadaran P., Ahn B.C. CAR T-Cell-Based gene therapy for cancers: new perspectives, challenges, and clinical developments. Front Immunol. 2022; 13: 925985. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2022.925985

11. Ottaviano G., Qasim W. Genome-Edited T Cell Therapies. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 2022; 36 (4): 729-44. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.hoc.2022.03.006

12. Melief C.J.M., Kast W.M. T-cell immunotherapy of tumors by adoptive transfer of cytotoxic T-lymphocytes and by vaccination with minimal essential epitopes. Immunol. Rev. 1995; 146: 167-77. DOI: https://www.doi.org/10.1111/j.1600-065x.1995.tb00081.x

13. Ahmed A., Tait S.W.G. Targeting immunogenic cell death in cancer. Mol. Oncol. 2020; 14 (12): 2994-3006. DOI: https://www.doi.org/10.1002/1878-0261.12851

14. Grivennikov S.I., Greten F.R., Karin M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 2010; 140 (6): 883-99. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.cell.2010.01.025

15. Aggarwal B.B., Vijayalekshmi R.V., Sung B. Targeting inflammatory pathways for prevention and therapy of cancer: short-term friend, long-term foe. Clin. Cancer Res. 2009; 15: 425-30. DOI: https://www.doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-08-0149

16. Атауллаханов Р.И., Ушакова Е.И., Аль Худур С.А., Пичугин А.В., Лебедева Е.С. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения - новый подход в иммунотерапии злокачественных новообразований. Иммунология. 2022; 43 (4): 375-88. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-375-388

17. Муругина Н.Е., Муругин В.В., Пащенков М.В. Противоопухолевая активность макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022- 43-50-548-557.

18. Couzin-Frankel J. Breakthrough of the year 2013. Cancer immunotherapy. Science. 2013; 342 (6165): 1432-3. DOI: https://doi.org/10.1126/science.342.6165.1432

19. Dougan M., Dranoff G. Immune therapy for cancer. Annu. Rev. Immunol. 2009; 27: 83-117. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev.immunol.021908.132544

20. St Paul M., Ohashi P.S. The roles of CD8+ T cell subsets in antitumor immunity. Trends Cell Biol. 2020; 30 (9): 695-704. DOI: https://doi.org/10.1016/j.tcb.2020.06.003

21. Oberoi P., Jabulowsky R.A., Bahr-Mahmud H., Wels W. EGFR-targeted granzyme B expressed in NK cells enhances natural cytotoxicity and mediates specific killing of tumor cells. PloS One. 2013; 8 (4): e61267. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0061267

22. Smithson G., Bittick T.H., Chervenak R., Lee S.J., Wolcott R.M. The role of NK cells in the regulation of experimental metastasis in a murine lymphoma system. Journal of leukocyte biology. 1991; 49 (6): 621-9. DOI: https://doi.org/10.1002/jlb.49.6.621

23. Brondz B.D. Interaction of immune lymphocytes with normal and neoplastic tissue cells. Folia. Biol. 1964; 10: 164-76. PMID: 14164363.

24. Фукс Б.Б., Малайцев В.В., Богданова И.М. Отсутствие генерализованной иммуносупрессии у мышей С57В1/6 при прогрессивном росте сингенной Т-лимфомы EL-4 и легочной карциномы Льюиса 3LL. Бюлл. экспер. биол. и мед. 1986; 101 (6): 725-8. PMID: 3089345.

25. Казанский Д.Б., Силаева Ю.Ю., Калинина А.А., Замкова М.А., Хромых Л.М., Персиянцева Н.А., Джолохава Л.Х. Трансплантационный и специфический противоопухолевый иммунитет в ретроспективе: новые модели, основанные на трансгенезе индивидуальных цепей Т-клеточного рецептора. Успехи молекулярной онкологии. 2016; 3 (1): 14-27. DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2016-3-1-14-27

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Редакционная коллегия журнала «Иммунология» и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России с прискорбием сообщают, что 11.03.2022 г. скончался Президент журнала «Иммунология», научный руководитель Института академик РАН Хаитов Рахим Мусаевич
Медицина сегодня
Уважаемые коллеги, до XI-го Национального конгресса с международным участием имени Н.О. Миланова "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология" осталось 3 дня

Уважаемые коллеги, до XI-го Национального конгресса с международным участием имени Н.О. Миланова "Пластическая хирургия, эстетическая медицина и косметология" осталось 3 дня! С 29 ноября по 1 декабря 2022 года в Москве пройдет XI Национальный конгресс "Пластическая хирургия,...

X конференция с международным участием "Креативная кардиология и кардиохирургия. Новые технологии диагностики и лечения заболеваний сердца"

6-7 декабря 2022 года состоится юбилейная X конференция с международным участием "Креативная кардиология и кардиохирургия. Новые технологии диагностики и лечения заболеваний сердца", которая будет проходить в очном и онлайн-формате в ФГБУ "НМИЦ ССХ им. А.Н. Бакулева"...

Приглашаем 1 и 2 декабря в Москву на яркий профессиональный праздник - итоговую всероссийскую Школу РОАГ!

Приглашаем 1 и 2 декабря в Москву на яркий профессиональный праздник - итоговую всероссийскую Школу РОАГ! Школа в Москве занимает особое место в образовательном цикле Школ РОАГ. На ней подводятся итоги прошедшего сезона, обсуждаются темы, которые вызывают наибольший интерес...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»