Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения повышает эффективность блокады рецепторов CTLA-4 и PD-1 при иммунотерапии злокачественной меланомы в эксперименте

Резюме

Введение. Блокада иммунных контрольных точек (immune checkpoint blockade) для лечения пациентов со злокачественными новообразованиями успешно и широко внедряется в практической онкологии. По сути, это направление иммунотерапии представляет собой снятие супрессии с Т-клеток с помощью антител к ингибиторным рецепторам CTLA-4 или PD-1 (PD-L1), что позволяет реактивировать противоопухолевые Т-клеточные иммунные реакции и может приводить к значительным клиническим эффектам. Такая иммунотерапия позволяет спасти пациентов даже в IV стадии онкологического процесса. И все же эффективность чекпойнт-блокады недостаточно высока. Полная регрессия заболевания и полное выздоровление происходят лишь у небольшого процента пациентов. У большинства пациентов с солидными опухолями, получавших терапию чекпойнт-блокаторами, либо не было клинического эффекта, либо наблюдался частичный, относительно кратковременный эффект.

Одна из самых распространенных причин, препятствующих эффективной элиминации опухоли при чекпойнт-блокирующей терапии, состоит в том, что миелоидные клетки опухолевого микроокружения создают иммуносупрессивную среду внутри опухоли, защищая таким образом злокачественные клетки опухоли от противоопухолевых иммунных реакций, в частности от атаки цитотоксических Т- и НК-клеток.

Цель работы - исследование возможности повышения эффективности чекпойнт-блокирующей терапии антителами к CTLA-4 и PD-1 путем одновременного перепрограммирования миелоидных клеток опухолевого микроокружения из проопухолевого в противоопухолевое состояние с помощью TLR4-агониста.

Материал и методы. Использована экспериментальная модель меланомы B16F0 у мышей C57BL/6J. Чекпойнт-блокаду проводили сразу двумя антителами, специфичными к CTLA-4 и PD-1. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения индуцировали внутриопухолевым введением кислого пептидогликана (КПГ, агонист TLR4). Эффективность иммунотерапии оценивали по скорости роста солидной опухоли, размеру опухоли на 16-й день после инокуляции клеток B16F0, клеточному составу инфильтрата опухоли, а также по интенсивности транскрипции ключевых генов, определяющих поляризацию и функциональную активность миелоидных и Т-клеток, выделенных из ткани опухоли и очищенных сортировкой.

Результаты. Показано, что комбинированная иммунотерапия одновременно чекпойнт-блокирующими антителами к CTLA-4/PD-1 и агонистом TLR4 значительно замедляет рост меланомы B16F0, к 16-му дню уменьшает массу опухолей в 3 раза, индуцирует мощную инфильтрацию ткани опухоли T- и НК-клетками. В популяции инфильтрирующих опухоль Т-клеток доминируют CD8+-Т-клетки. Содержание CD8+-Т-клеток и НК-клеток в 1 мг ткани опухоли под влиянием комбинированной терапии чекпойнт-блокирующими антителами и TLR4-агонистом увеличилось в 11 раз. Очищенные из опухоли CD3+-T-клетки имели повышенную экспрессию генов ИФН-γ и гранзима А, что свидетельствует об их поляризации в Th1- и цитотоксические Т-клетки. Кроме того, при комбинированной терапии чекпойнт-блокаторами и TLR4-агонистом происходила усиленная инфильтрация опухоли моноцитами и нейтрофилами. После проведения комбинированной терапии выделенные из ткани опухоли и очищенные миелоидные CD11b+-клетки были поляризованы в противоопухолевое состояние, что подтверждалось повышенной экспрессией гена индуцибельной NO-синтазы и отсутствием активной экспрессии гена аргиназы-1.

Заключение. Комбинированная терапия злокачественной меланомы в экспериментальной модели чекпойнт-блокаторами совместно с агонистом TLR4 значительно более эффективна по сравнению с монотерапией этими же лекарственными агентами, использованными по отдельности.

Ключевые слова:противоопухолевая иммунотерапия; чекпойнт-блокада; опухолевое микроокружение; транскрипционное перепрограммирование миелоидных клеток; TLR-агонист

Для цитирования: Пичугин А.В., Подсвирова С.А., Ушакова Е.И., Спирин Д.М., Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения повышает эффективность блокады рецепторов CTLA-4 и PD-1 при иммунотерапии злокачественной меланомы в эксперименте. Иммунология. 2022; 43 (6): 673-690. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-673-690

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 20-15-00391.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Планирование и постановка экспериментов, анализ данных, редактирование статьи - Пичугин А.В.; постановка экспериментов - Подсвирова С.А.; статистическая обработка, редактирование статьи - Ушакова Е.И.; анализ данных, редактирование статьи - Спирин Д.М., Лебедева Е.С.; концепция исследования, дизайн экспериментов, анализ данных, написание статьи - Атауллаханов Р.И.

Введение

Иммунотерапия злокачественных новообразований имеет целью вернуть здоровье пациенту или, по крайней мере, остановить прогрессию онкологического заболевания, прицельно направив определенные иммунные механизмы на борьбу с имеющейся у пациента опухолью. Методы и средства, применяемые для иммунотерапии пациентов со злокачественными новообразованиями, весьма разнообразны. В последнее десятилетие в широкую практику онкологии вошла блокада иммунных контрольных точек, в оригинале - "immune checkpoint blockade". Это направление иммунотерапии базируется на исследованиях регуляции иммунных реакций через ингибирующие рецепторы Т-клеток, в частности через рецепторы CTLA-4 и PD-1 [1, 2].

Установлено, что моноклональные антитела (МкАт), блокирующие указанные рецепторы, можно применять для реактивации супрессированных Т-клеток в организме, пораженном злокачественным новообразованием [3-5]. Лекарственные препараты на основе МкАт, блокирующих рецепторы CTLA-4 и PD-1, а также лиганд PD-L1, разрешены для лечения пациентов с меланомой, немелкоклеточным и мелкоклеточным раком легких, раком мочевого пузыря и метастатическим гормон-резистентным раком предстательной железы [6-9], злокачественными новообразованиями головы и шеи, почечно-клеточным раком почек, уротелиальной карциномой, раком пищевода, желудка, толстой кишки, первичной карциномой печени, лимфомой Ходжкина, злокачественной плевральной мезотелиомой [10-15], трижды негативным раком молочной железы и гепатоцеллюлярной карциномой [16, 17].

Иммунотерапия чекпойнт-блокаторами эффективно стимулирует противоопухолевые реакции Т-клеток и позволяет спасти пациентов даже в IV стадии опухолевого процесса. И все же эффективность чекпойнт-блокады недостаточно высока. Полная регрессия заболевания и полное выздоровление происходят лишь у небольшого процента пациентов. У большинства пациетов с солидными опухолями, получавших терапию чекпойнт-блокаторами, либо не было клинического эффекта, либо наблюдался частичный, относительно кратковременный эффект.

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют, что при использовании чекпойнт-блокады у пациентов c распространенными онкологическими заболеваниями частичный лечебный эффект (partial response) наблюдался в 8-43 % случаев (широкий интервал значений отражает различия результатов в различных клинических исследованиях в зависимости от диагноза, стадии заболевания, варианта терапии и других факторов). Полное исчезновение проявлений болезни (complete response) достигалось довольно редко, этот показатель варьировал от 0 до 15 %. В частности, полное выздоровление достигалось у 2-3 % пациентов с меланомой после проведения блокады CTLA-4 и у 0,5-8 % пациентов с немелкоклеточным раком легких в результате лечения блокаторами PD-1 или PD-L1.

Какие факторы препятствуют успеху иммунотерапии? Как их распознать и преодолеть, чтобы достичь успеха? Поиск ответов на эти вопросы, а также разработка новых методов повышения эффективности противоопухолевой иммунотерапии вообще и чекпойнт-блокады в частности - это одно из самых актуальных направлений иммунологии и онкологии.

Именно в этом направлении выполнена работа, представленная в данной статье. Мы описываем результаты экспериментальной иммунотерапии, состоящей из комбинации чекпойнт-блокады с помощью МкАт к Т-клеточным рецепторам CTLA-4 и PD-1, нацеленной на реактивацию противоопухолевых Т-клеток, и транскрипционного перепрограммирования миелоидных клеток опухолевого микроокружения, имеющего целью включение противоопухолевой цитотоксической программы макрофагов и дендритных клеток в опухолевой ткани, а также устранение иммуносупрессивной среды внутри опухоли.

Перепрограммирование миелоидных клеток как новый подход в иммунотерапии опухолей, принципиальные идеи, клеточные и молекулярные механизмы, а также фармакологические средства для такой иммунотерапии были рассмотрены в нашей недавней статье [26].

Материал и методы

Экспериментальные животные. Мыши-самки линии C57BL/6J 8-10-недельного возраста были получены из питомника "Столбовая", содержались на стандартной диете в стандартных условиях вивария ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными локальным комитетом по этике (Резолюция 4/17 от 13.07.2017).

Реактивы и растворы. Использованы коллагеназа I типа (C0130, Sigma-Aldrich, США), коллагеназа IV типа (17104-019, GIBCO, США), ДНКаза (D4263-1VL, Sigma-Aldrich, США). В качестве агониста рецепторов TLR4 использован кислый пептидогликан из растений (КПГ) [27]. Использованы МкАт против мышиного рецептора CTLA-4 (BP0131, клон 9H10, Bio X Cell, США) и против мышиного рецептора PD-1 (BP0146, Bio X Cell, США). Также использованы PBS без магния и кальция - фосфатный буфер, содержащий 10 мМ Na3PO4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ хлористого калия, рН 7,3-7,5 (Amresco, США). Буфер для отмывки клеток (PBS-cell) составлен из PBS без магния и кальция с добавкой 10 мМ HEPES, 0,5 % бычьего сывороточного альбумина (БСА), 1 % глюкозы, рН 7,4. Буфер цитометрический (PBS-cyto) составлен из PBS без магния и кальция с добавкой 10 мМ HEPES, 0,5 % БСА, 0,01 % азида натрия, 0,35 мМ ЭДТА, рН 7,4. Его применяли для отмывки клеток от несвязавшихся и неспецифически связавшихся антител, а также во время инкубации клеток с антителами.

Культуры клеток in vitro. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) с 25 мМ HEPES, дополненной смесью заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы "ПанЭко", Россия), при 37 оС, в увлажненной атмосфере с содержанием 5 % СО2.

Клетки мышиной меланомы линии B16F0 (кат. CRL-6322, ATCC, США) культивировали в ПС в пластиковых чашках Петри до монослоя, занимающего 80 % поверхности. Адгезированные клетки B16F0 снимали со дна чашки раствором трипсин-ЭДТА ("ПанЭко", Россия), отмывали центрифугированием в PBS-cell (1260 об/мин, 4 °С, 10 мин), определяли концентрацию жизнеспособных клеток на проточном цитофлуориметре BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США) с использованием флуоресцентных микросфер с известной концентрацией. Для нового пассажа использовали 1/6-1/10 часть от полученного количества клеток B16F0. Пересевы культуры делали дважды в неделю. Для инокуляции мышам готовили суспензию клеток B16F0 в концентрации 2 млн клеток в 1 мл PBS.

Экспериментальная модель меланомы у мышей. Протоколы иммунотерапии. Клетки меланомы B16F0 в количестве 2 105 клеток в 100 мкл PBS без магния и кальция инокулировали мышам C57BL/6J подкожно в область бедра с помощью инсулинового шприца (игла 30G). На 6-й день после введения клеток B16F0 опухоли становились пальпируемы. Размеры индивидуальных опухолей измеряли каждые 2-3 дня с помощью цифрового штангенциркуля. Объем опухоли определяли по формуле:

V = l × w2/2, где V - объем, l - длина, w - ширина.

После первого измерения (день 6) мышей разделяли на 4 группы таким образом, чтобы медиана и среднее значение объема опухолей были приблизительно равными во всех группах. Протоколы лечения в группах различались. Группа 1 - контрольная, мыши получали инъекции физиологического раствора 0,9 % NaCl внутрибрюшинно. Группа 2 - мышей лечили инъекциями фармацевтического агониста TLR4 (КПГ). Группа 3 - для лечения мыши получали инъекции чекпойнт-блокирующих МкАт (анти-PD-1 + анти-CTLA-4). Группа 4 - комбинированная терапия инъекциями TLR4-агониста и чекпойнт-блокирующих МкАт (анти-PD-1 + анти-CTLA-4). Агонист TLR4 (КПГ) вводили в ткань опухоли в дозе 3 мкг в объеме 20 мкл. Инъекции TLR4-агониста мыши получали через 6, 9, 12 и 15 дней после инокуляции клеток меланомы B16F0. Чекпойнт-блокирующие МкАт (анти-PD-1 + анти-CTLA-4) вводили внутрибрюшинно в объеме 200 мкл, содержащем 250 мкг каждого из указанных МкАт. Лечебные инъекции антител проводили через 7, 10 и 13 дней после инокуляции клеток B16F0. На 16-й день эксперимент останавливали (рис. 1).

Срок остановки эксперимента на 16-й день после инокуляции клеток меланомы B16F0 выбран не случайно. К этому времени опухоли у контрольных животных достигали объема ~300 мм3, что позволяло иметь как минимум 3-4 достоверных измерения в динамике роста опухоли. Кроме того, одним из важных показателей иммунотерапии было влияние на клеточный состав опухоли. К 16-му дню опухоли были достаточного размера для всестороннего анализа клеточного состава и функциональных свойств клеток опухолевого микроокружения, выделенных сортировкой. К тому же на этой стадии развития опухоли еще не были поражены зонами некроза, что тоже рассматривалось как положительный фактор для аккуратного изучения клеточного состава опухоли.

Приготовление суспензии клеток опухоли. Мышей выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков. Опухоли извлекали в асептических условиях, сразу помещали в среду RPMI-1640, с помощью ножниц и пинцета быстро измельчали до гомогенного состояния. Полученную тканевую массу помещали в среду RPMI-1640 с коллагеназами I и IV типов и ДНКазой, инкубировали в течение 1 ч на шейкере при 37 оС и 5 % CO2 для энзиматического расщепления стромальных элементов и получения суспензии клеток опухоли. По завершении энзиматической стадии к суспензии добавляли PBS/БСА до объема 15 мл и центрифугировали при 1260 об/мин 10 мин, 4 °C. Клеточный осадок суспендировали в 1 мл PBS/БСА и переносили на ситечко с ячейками 70 мкм, протирая поршнем и промывая PBS/БСА до конечного объема 30 мл. Клетки осаждали центрифугированием при 1260 об/мин 10 мин, 4 °C, осадок ресуспендировали.

Проточная цитофлуориметрия и сортировка чистых популяций клеток. Для определения содержания различных типов клеток в опухоли клеточную суспензию окрашивали двумя панелями МкАт, позволяющих анализировать лимфоидные и миелоидные типы клеток, соответственно (табл. 2 и 3). Клетки инкубировали в течение 15 мин при 4 °C в темноте, в присутствии флуорохром-меченных МкАт, после чего клетки отмывали в PBS-cyto и добавляли 200 мкл суспензии калибровочных микросфер, в которую также вносили DAPI (1 мкг/мл) для отличия живых и мертвых клеток. Анализ окрашенных клеток проводили на проточном цитофлуориметре-сортировщике BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США). Результаты обрабатывали с помощью программы FCS Express 6 De Novo Software (Dotmatics, США).

Из суспензии клеток опухоли выделяли чистые популяции миелоидных CD3-CD11b+CD45+-клеток и CD3+CD11b+CD45+-Т-клеток для дальнейшей характеристики их функционального состояния. Очищенные популяции получали методом сортировки на проточном цитофлуориметре-сортировщике BD FACS Aria II. Чистота сортированных популяций составляла 95%.

Определение экспрессии генов в очищенных сортировкой клеточных популяциях, выделенных из ткани опухоли. Экспрессию целевых генов анализировали методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Очищенные сортировкой клетки осаждали центрифугированием (1260 об/мин, 10 мин, 4 °C). Надосадочную жидкость удаляли, осадок миелоидных клеток лизировали в 200 мкл лизирующего буфера с гуанидин-изотиоцианатом из набора реагентов "РНК-экстран" (Синтол, Россия), затем выделяли РНК по протоколу производителя. Осадок Т-клеток лизировали в 500 мкл буфера RLT из набора реагентов "RNeasy Mini Kit" (Qiagen, Германия). Реакцию обратной транскрипции проводили, используя коммерческий набор "ОТ-1" (Синтол, Россия), согласно инструкции производителя. ПЦР-РВ проводили в объеме 25 мкл, в реакцию добавляли 14 pM каждого праймера, 3 pM зонда, 2,5 е.а. ДНК-полимеразы SynTaq, 2,5 мМ MgCl2, 0,25 мМ DNTPs.

Для детекции флуоресценции использовали специфичные зонды Taq-man с меткой FAM либо интеркалирующий краситель Sybr Green I (R-402, Синтол, Россия). Амплификацию проводили на приборе DTprime-4 (ДНК-технология, Россия).

Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения Graph-Pad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., США). Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Брауна-Форсайта или с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Шидака (различия считались значимыми при p < 0,05).

Результаты

В использованной модели сингенной меланомы у мышей C57BL/6J в месте подкожной инокуляции злокачественных клеток B16F0 у всех без исключения животных вырастала солидная опухоль. В течение 16 суток средний объем возникающих опухолей достигал значений ~300 мм3 (рис. 2). Экспериментальная иммунотерапия проводилась по схеме, представленной на рис. 1, в трех вариантах: 1) лечение одновременно двумя МкАт, блокирующими рецепторы CTLA-4 и PD-1 (далее - монотерапия МкАт); 2) лечение агонистом TLR4 (далее - монотерапия TLR4); 3) комбинированное лечение чекпойнт-блокирующими МкАт CTLA4/PD-1 и агонистом TLR4 [далее - комботерапия или (МкАт + TLR4)].

Монотерапия МкАт достоверно задерживала рост опухолей B16F0. Внешний размер опухолей, измеренный при жизни животных, под влиянием чекпойнт-блокирующих МкАт уменьшался в среднем на 22,5 % (p = 0,0243, рис. 2А). После аутопсии опухоли можно было выделить и взвесить. Средняя масса опухолей в группе мышей, леченных двумя МкАт против CTLA-4 и PD-1, была в среднем на 50 % (p = 0,0177, рис. 2Б) меньше средней массы опухолей у контрольных мышей, получавших инъекции физиологического раствора.

Лечение агонистом TLR4 с целью перепрограммирования миелоидных клеток опухолевого микроокружения оказывало такой же противоопухолевый эффект, как чекпойнт-блокада. Под влиянием агониста TLR4 рост солидной меланомы достоверно замедлялся. В группе мышей, получавших монотерапию агонистом TLR4, внешний размер опухоли был уменьшен на 22,2 % (p = 0,0128), по сравнению с опухолями в контрольной группе. Средняя масса выделенных опухолей в группе мышей, получивших монотерапию TLR4, снижалась на 44 % (p = 0,0438) по сравнению с опухолями в контрольной группе.

Статистическую значимость различий между группами определяли с помощью двухфакторного дисперсионного анализа ANOVA с использованием критерия Шидака. На графике А представлены средние значения и стандартное отклонение. На графике Б представлены медианы и минимальные/максимальные значения для каждой группы.

Комбинированная терапия (МкAт + TLR4) оказала самое сильное противоопухолевое действие. Ингибирование роста опухоли составило 63 % (p = 0,0001) по внешнему размеру опухолей и 80,5 % (p = 0,0007) по массе опухолей. Лечебное действие комбинированного лечения чекпойнт-блокирующими антителами и перепрограммирующим агонистом TLR4 было достоверно более сильным по сравнению с лечебным действием чекпойнт-блокаторов или агониста TLR4, использованных по отдельности (см. рис. 2, p = 0,0001).

Сокращение размеров опухолей под влиянием использованной нами иммунотерапии сопровождалось изменением клеточного состава опухолевого микроокружения. Первое, что со всей очевидностью выявлялось при цитометрии клеточной суспензии, полученной из опухоли, - это усиленная инфильтрация лейкоцитами (рис. 3-5). В результате монотерапии МкАт или монотерапии агонистом TLR4 количество CD45+-лейкоцитов, инфильтрирующих опухоль, возрастало в среднем в 2,3 (p = 0,0497) или в 2 (p = 0,0056) раза соответственно. Каждый миллиграмм опухолевой ткани под влиянием иммунотерапии чекпойнт-блокаторами или TLR4-агонистом дополнительно инфильтрировали ~4000-5000 лейкоцитов крови. Большая часть вновь пришедших клеток была представлена миелоидными CD11b+-клетками, среди которых доминировали CD11b+Ly6ChighF4/80int-моноциты. Интересно, что TLR4-агонист индуцировал приход нейтрофильных CD11b+Ly6G+-гранулоцитов, чего не наблюдалось при монотерапии чекпойнт-блокаторами. Очевидной была и тенденция к нарастанию содержания резидентных CD11b+Ly6CintF4/80high-макрофагов и CD11c+MHC-II+-дендритных клеток.

Комбинированная терапия (МкAт + TLR4) вызывала наиболее значительные изменения клеточного состава опухолевого микроокружения. Общее количество CD45+-лейкоцитов в ткани опухоли увеличивалось в 3,4 раза (p = 0,0094). Во столько же раз увеличивалось содержание миелоидных CD11b+-клеток (p = 0,0028) и CD11b+Ly6ChighF4/80int-моноцитов (p = 0,0004). Происходила инфильтрация опухоли нейтрофильными CD11b+Ly6G+-гранулоцитами. Содержание этих клеток увеличивалось в 8,5 раз (p = 0,0019), достигая 18 % от всех лейкоцитов в ткани опухоли.

Примечательно содержание тканевых CD11b+Ly6CintF4/80high-макрофагов и CD11c+MHC-II+-дендритных клеток в опухоли после комбинированного лечения чекпойнт-блокирующими МкАт и агонистом TLR4 (рис. 4). Количество этих резидентных клеток в расчете на 1 мг опухолевой ткани не изменилось.

Анализ инфильтрации опухоли лимфоидными клетками показал (рис. 5), что в результате комбинированной терапии (МкАт + TLR4) количество Т- (p = 0,0065) и НК-клеток (p = 0,0081) в расчете на 1 мг опухолевой ткани выросло в среднем в 11 раз. Такой усиленной инфильтрации опухоли потенциально цитотоксическими клетками не наблюдалось ни при монотерапии чекпойнт-блокаторами, ни при перепрограммировании миелоидных клеток TLR4-агонистом. В случае монотерапии указанными агентами была видна лишь тенденция к повышенной инфильтрации опухоли T- и НК-клетками. Комбинированное воздействие двумя типами иммунотропных препаратов вызывало синергический ответ в виде агрессивной атаки опухоли инфильтрирующими Т- и НК-клетками.

Исследование фенотипа Т-клеток доказывает, что при комботерапии доминантной являлась инфильтрация опухоли CD8+-Т-клетками (p = 0,0377). Увеличение количества инфильтрирующих CD4+-Т-клеток тоже наблюдалось, но не достигало достоверных значений из-за индивидуальных разбросов (рис. 5). Повышенная инфильтрация ткани опухоли γδ-Т-клетками тоже была на уровне тенденций, причем не только при использовании комботерапии, но и при монотерапии как чекпойнт-блокаторами, так и агонистом TLR4.

Из каждой индивидуальной опухоли мы выделили очищенные популяции CD3+-Т-клеток и миелоидных CD11b+-клеток методом сортировки на проточном цитофлуориметре-сортировщике (рис. 6). Функциональные свойства выделенных клеточных популяций оценивали по уровню экспрессии функционально значимых генов (рис. 7-9).

По экспрессии мРНК ИФН-γ (ген Ifng) можно заключить, что инфильтрирующие опухоль CD3+-T-клетки были поляризованы в направлении Th1-ответа, что хорошо коррелирует с накоплением в инфильтрате CD8+-Т- и НК-клеток. Повышенная экспрессия ИФН-γ наблюдалась во всех трех группах мышей, получавших иммунотерапию - при лечении чекпойнт-блокирующими антителами, агонистом TLR4 или комбинацией чекпойнт-блокаторов с TLR4-агонистом (рис. 7).

Анализ экспрессии гранзима А (ген Gzma) позволяет оценить накопление функциональных цитотоксических Т- и НК-клеток (рис. 7). Достоверное повышение экспрессии мРНК гена Gzma произошло в опухолях мышей, получивших комбинированную терапию (МкАт + TLR4). Монотерапия МкАт и монотерапия TLR4, примененные по отдельности, не приводили к усилению экспрессии гена гранзима А.

Экспрессия генов Tgfb и Foxp3 в Т-клетках опухолей, полученных после проведения иммунотерапии чекпойнт-блокирующими МкАт, агонистом TLR4 или комбинацией этих двух видов лечения, оставалась на низком, фоновом, уровне (рис. 7). Это указывает на отсутствие заметного нарастания содержания Т-клеток-регуляторов в опухолевом микроокружении в результате проведенного противоопухолевого лечения.

Очищенные сортировкой миелоидные клетки, выделенные из индивидуальных опухолей, оценивали по экспрессии двух групп генов. Одна группа генов отражала провоспалительную активность миелоидных клеток опухоли - это гены, кодирующие фермент циклоoксигеназу-2 (ген Cox2) и цитокины ИЛ-1β, ФНОα (гены Il1b и Tnfa, соответственно, рис. 8). Другая группа генов кодирует факторы, по экспрессии которых можно судить о поляризации макрофагов в состояния М1 и М2, а дендритных клеток - в состояния D1 и D2. Это гены Inos, Arg1, Il10, Tgfb1, кодирующие, соответственно, индуцибельную NO-синтазу, аргиназу-1, цитокины ИЛ-10 и ТФРβ (рис. 9).

Результаты, представленные на рис. 8, свидетельствуют, что миелоидные клетки в микроокружении опухоли B16F0 после проведения иммунотерапии чекпойнт-блокирующими МкАт производят повышенное количество циклооксигеназы-2.Этот фермент участвует в синтезе простагландинов и является несомненным признаком провоспалительной активности миелоидных клеток. Лечение агонистом TLR4 не приводило к активной экспрессии гена Cox2. В опухолях мышей, получавших комбинированную терапию (МкAт + TLR4), экспрессия циклооксигеназы-2 активировалась примерно до того же уровня, как и при монотерапии чекпойнт-блокаторами.

Экспрессия провоспалительных цитокинов ФНОα и ИЛ-1β в миелоидных клетках опухоли тоже повышалась в результате лечения чекпойнт-блокаторами или их комбинацией с агонистом TLR4 (рис. 8). Монотерпия TLR4-агонистом такого провоспалительного эффекта не оказывала.

Исследование экспрессии генов, кодирующих индуцибельную NO-синтазу, аргиназу-1, цитокины ИЛ-10 и ТФРβ, со всей очевидностью показало, что комбинированная терапия (МкAт + TLR4) способствует перепрограммированию миелоидных клеток опухолевого микроокружения из промоторов опухолевого роста в клетки, обладающие противоопухолевой активностью. Происходит функциональная поляризация миелоидных клеток в противоопухолевое состояние, характерное для макрофагов М1 и дендритных клеток D1 (рис. 9). Достоверно более высокий уровень экспрессии индуцибельной NO-синтазы при использовании комбинированной иммунотерапии (МкAт + TLR4) свидетельствует о более высокой противоопухолевой эффективности комбинированного лечения по сравнению с монотерапией отдельно МкАт к PD-1/CTLA-4 или TLR4-агонистом.

Обсуждение

Рецепторы CTLA-4 и PD-1 экспонируются на поверхности активированных Т-клеток для естественной остановки процесса их размножения [28-29]. Бесконечная пролиферация опасна и потому недопустима. CTLA-4 и PD-1 - это своего рода молекулярные клавиши, посредством которых происходит торможение Т-клеточной реакции. При воздействии на эти рецепторы соответствующими лигандами пролиферация Т-клеток прекращается, функциональная активность этих клеток снижается или полностью затухает и даже может включаться процесс их самоликвидации - клеточная смерть. Злокачественная опухоль может использовать в своих интересах этот естественный механизм регуляции делений Т-клеток. На злокачественных клетках и на миелоидных клетках опухолевого микроокружения экспонируется избыток лигандов CTLA-4 и PD-1 [30-32]. Это позволяет злокачественным клеткам опухоли эффективно защищаться от атаки Т-клеток. Пришедшие в опухоль Т-клетки, потенциально способные распознать опухолевые антигены и элиминировать мутантные злокачественные клетки, подвергаются ингибированию и апоптозу.

Идея чекпойнт-ингибирующей терапии состоит в блокировании рецепторов CTLA-4 и/или PD-1 на поверхности Т-клеток или их лигандов на поверхности злокачественных и миелоидных клеток опухоли. Блокирование достигается с помощью терапевтических антител, специфично распознающих чекпойнт-ингибирующий рецептор или его лиганд на поверхности соответствующих клеток [33]. Практическое применение терапевтических антител к CTLA-4, PD-1, PD-L1/2 в течение прошедшего десятилетия показало, что идея чекпойнт-блокады работает, хотя и не всегда (см. табл. 1).

В результате чекпойнт-блокирующей терапии часть пациентов полностью исцеляется от злокачественного новообразования, и это само по себе экстраординарное достижение. У другой части пациентов наблюдается частичное, временное, улучшение. Рост опухоли приостанавливается на несколько недель или даже месяцев, а затем возобновляется с новой силой. Довольно большой процент пациентов со злокачественными новообразованиями вообще не отвечает на чекпойнт-блокирующую терапию. Причина, по-видимому, в том, что для ухода от иммунного контроля опухоли используют не только лиганды CTLA-4 и PD-1, но и множество других молекулярных механизмов. Блокирование лишь одного механизма из этого множества далеко не всегда позволяет добиться желанного результата - элиминации опухоли. Лишь у некоторых пациентов, в опухоли которых экспрессия лигандов CTLA-4 и PD-1 является главным механизмом защиты от иммунитета, разблокирование активности Т-клеток приводит к эффективной Т-клеточной атаке.

В остальных случаях, несмотря на реактивацию Т-клеток, опухоль использует другие механизмы защиты, которые Т-клетки преодолеть не могут. В ряду таких механизмов особое место занимают растворимые факторы, подавляющие иммунные реакции. Такие факторы производятся всеми типами клеток опухоли: злокачественными клетками, тканевыми макрофагами, дендритными клетками, миофибробластами, эндотелиальными клетками, тучными клетками и перицитами, а также клетками-мигрантами, пришедшими из крови в ткань опухоли, в частности моноцитами, нейтрофилами, регуляторными Т-клетками, миелоидными клетками-супрессорами. Многочисленные продукты этих клеток, такие как ТФРβ, ИЛ-10, простагландины, IDO и другие, создают в опухолевой ткани среду, в которой иммунная атака против опухоли невозможна [34-36]. В такой иммуносупрессивной среде реактивированные с помощью чекпойнт-блокирующих антител Т-клетки не способны выполнить свою функцию.

Как преодолеть проблему, как изменить среду внутри опухоли таким образом, чтобы Т-клетки могли выполнить свою задачу - ликвидировать опухоль? Новый терапевтический подход состоит в транскрипционном перепрограммировании миелоидных клеток опухолевого микроокружения - резидентных макрофагов и дендритных клеток опухоли, а также пришедших в опухоль миелоидных клеток инфильтрата [26]. Цель перепрограммирования состоит в конвертации многочисленных клеточных участников микроокружения опухоли из пособников прогрессивного роста опухоли в ее убийц. При таком перепрограммировании миелоидные клетки прекращают выделять иммуносупрессивные субстанции и, напротив, производят иммуностимулирующие цитокины и хемокины, а также цитостатические факторы, ингибирующие размножение, и цитотоксические вещества, убивающие злокачественные клетки [37-42].

В данной статье мы представили результаты комбинированного воздействия, в котором использованы два варианта противоопухолевой иммунотерапии - реактивация Т-клеток с помощью чекпойнт-блокирующих антител и перепрограммирование миелоидных клеток опухоли с помощью агониста TLR4. В экспериментальной модели злокачественной меланомы у лабораторных мышей мы показали, что такая комбинация двух вариантов иммунотерапии имеет значительные преимущества по сравнению с каждым из этих вариантов, использованных самостоятельно.

Примененная нами комбинированная иммунотерапия индуцировала значительно более мощную противоопухолевую иммунную атаку, чем при монотерапии чекпойнт-блокаторами. По сравнению с ложным лечением в контрольной группе (физраствор) после комбинированной иммунотерапии чекпойнт-блокаторами и TLR4-агонистом инфильтрация опухоли клетками иммунной системы увеличивалась более чем на порядок. В результате комбинированной терапии (МкAт + TLR4) количество CD8+-Т-клеток и НК-клеток в расчете на 1 мг опухолевой ткани возрастало в 11 раз. По сравнению с монотерапией чекпойнт-блокаторами комбинированное лечение привлекало в опухоль в 3-5 раз больше CD8+-Т-клеток и НК-клеток (см. рис. 5).

При комбинированной терапии (МкAт + TLR4) происходила не просто усиленная инфильтрация опухоли CD8+-Т-клетками. Очень важно, что Т-клетки инфильтрата имели высокий уровень экспрессии мРНК ИФН-γ и гранзима А (см. рис. 7). Это означает, что комбинированное лечение привлекает в опухоль большое количество функционально активных Т-клеток с повышенной цитотоксической активностью и поляризацией Т-клеточной реакции по Th1-типу, что является наиболее эффективным типом противоопухолевой защиты. В дополнение к этим, оптимальным, характеристикам иммунной атаки заслуживает внимания низкий уровень экспрессии генов цитокина ТФРβ и транскрипционного фактора FoxP3, характерных для регуляторных Т-клеток [43]. Следовательно, комбинированная терапия (МкAт + TLR4) индуцировала мощную атаку опухоли цитотоксическими Т-клетками и НК-клетками без усиления иммуносупрессивного механизма в виде Т-регуляторов.

Усиленная инфильтрация опухоли Т-клетками и НК-клетками, индуцированная комбинированной терапией (МкAт + TLR4), также сопровождалась повышенной инфильтрацией моноцитами и гранулоцитами. По сравнению с контрольной группой в результате комботерапии содержание моноцитов в опухоли возрастало в ~3 раза, а нейтрофильных гранулоцитов - в 8,5 раз. Следовательно, комбинированная терапия индуцировала в ткани опухоли воспалительную реакцию, в основе которой активация эндотелия кровеносных капилляров и посткапиллярных венул в опухолевой ткани, экспрессия на эндотелии рецепторов адгезии для рекрутирования из кровотока всех типов клеток, содержание которых в опухоли существенно возросло, а именно нейтрофилов, моноцитов, НК-клеток и Т-клеток. В этом ряду мы расположили типы клеток в такой последовательности, в какой они мигрируют из кровотока в ткань при классическом воспалении [44].

Подробно динамику миграции разных типов клеток в ткань опухоли B16F0 в результате комботерапии мы не исследовали. Можем только констатировать сам факт усиленной воспалительной клеточной инфильтрации и состав инфильтрата на 16-й день комботерапии. В воспалительном инфильтрате опухоли к этому сроку комбинированной терапии содержалось приблизительно 2500 гранулоцитов, 3500 моноцитов, 750 CD4+-T-клеток, 1500 CD8+-T-клеток, 35 γδ-T-клеток и 400 НК-клеток в расчете на 1 мг ткани опухоли (см. рис. 3).

Исследование экспрессии ключевых генов в очищенной популяции миелоидных клеток доказывает, что под влиянием комбинированной терапии (МкAт + TLR4) мигрирующие в опухоль моноциты и нейтрофильные гранулоциты были поляризованы в противоопухолевое состояние. Оказавшиеся в ткани моноциты принято называть воспалительными моноцитами опухоли, но по сути это новые макрофаги [45]. Усиленная экспрессия в этих клетках гена Inos и отсутствие активной экспрессии гена Arg1 однозначно указывают на поляризацию этих клеток в состояние М1, для которого характерна продукция цитотоксических противоопухолевых субстанций, в частности активных форм кислорода, перекисей, NO, пероксинитрита и других [46-48]. Аналогично, усиленная экспрессия гена Inos в нейтрофилах свидетельствует об их поляризации в противоопухолевое состояние, которое обозначают N1 [49-51].

Следовательно, не только Т-клетки, но и миелоидные клетки, усиленно инфильтрирующие опухоль B16F0 в результате комбинированной терапии чекпойнт-блокирующими антителами и агонистом TLR4, поляризованы в противоопухолевое состояние и обладают самыми агрессивными противоопухолевыми молекулярными механизмами. Неудивительно, что такой результат комбинированной иммунотерапии привел к значительному уменьшению размеров злокачественной меланомы B16F0 у мышей C57BL/6J (рис. 2).

Заключение

Основываясь на понимании механизмов, препятствующих эффективной иммунотерапии чекпойнт-блокирующими антителами, мы совместили чекпойнт-блокаду с перепрограммированием миелоидных клеток опухоли. Комбинированная терапия меланомы B16F0 у мышей C57BL/6J МкАт, блокирующими CTLA-4 и PD-1, совместно с перепрограммированием миелоидных клеток с помощью агониста TLR4 оказалась гораздо более эффективной по сравнению с чекпойнт-блокадой и использованнием TLR4-агониста по отдельности в виде монотерапии. Комбинированная иммунотерапия (МкAт + TLR4) индуцирует значительное подавление роста опухоли, в основе которого лежит мощная инфильтрация опухолевой ткани цитотоксическими CD8+-T-клетками, НК-клетками, а также моноцитами и нейтрофилами с профилем экспрессии генов, характерным для противоопухолевого состояния этих клеток.

Литература

1.Freeman G.J., Long A.J., Iwai Y., Bourque K., Chernova T., Nishimura H., Fitz L.J., Malenkovich N., Okazaki T., Byrne M.C., Horton H.F., Fouser L., Carter L., Ling V., Bowman M.R., Carreno B.M., Collins M., Wood C.R., Honjo T. Engagement of the PD-1 immunoinhibitory receptor by a novel B7 family member leads to negative regulation of lymphocyte activation. J. Exp. Med. 2000; 192 (7): 1027-34. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.192.7.1027 PMID: 11015443.

2.Leach D.R., Krummel M.F., Allison J.P. Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. Science. 1996; 271 (5256): 1734-6. DOI: https://doi.org/10.1126/science.271.5256.1734 PMID: 8596936.

3.Pauken K.E., Sammons M.A., Odorizzi P.M., Manne S., Godec J., Khan O., Drake A.M., Chen Z., Sen D.R., Kurachi M., Barnitz R.A., Bartman C., Bengsch B., Huang A.C., Schenkel J.M., Vahedi G., Haining W.N., Berger S.L., Wherry E.J. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science. 2016; 354 (6316): 1160-5. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aaf2807.

4.Huang A.C., Postow M.A., Orlowski R.J., Mick R., Bengsch B., Manne S., Xu W., Harmon S., Giles J.R., Wenz B., Adamow M., Kuk D., Panageas K.S., Carrera C., Wong P., Quagliarello F., Wubbenhorst B., D’Andrea K., Pauken K.E., Herati R.S., Staupe R.P., Schenkel J.M., McGettigan S., Kothari S., George S.M., Vonderheide R.H., Amaravadi R.K., Karakousis G.C., Schuchter L.M., Xu X., Nathanson K.L., Wolchok J.D., Gangadhar T.C., Wherry E.J. T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature. 2017; 545 (7652): 60-5. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22079 PMID: 28397821.

5.Paterson A.M., Brown K.E., Keir M.E., Vanguri V.K., Riella L.V., Chandraker A., Sayegh M.H., Blazar B.R., Freeman G.J., Sharpe A.H. The programmed death-1 ligand 1:B7-1 pathway restrains diabetogenic effector T cells in vivo. J. Immunol. 2011; 187 (3): 1097-105. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1003496 PMID: 21697456.

6.Schadendorf D., Hodi F.S., Robert C., Weber J.S., Margolin K., Hamid O., Patt D., Chen T.T., Berman D.M., Wolchok J.D. Pooled analysis of long-term survival data from phase II and phase III trials of ipilimumab in unresectable or metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 2015; 33 (17): 1889-94. DOI: https://doi.org/10.1200/JCO.2014.56.2736.

7.O’Mahony D., Morris J.C., Quinn C., Gao W., Wilson W.H., Gause B., Pittaluga S., Neelapu S., Brown M., Fleisher T.A., Gulley J.L., Schlom J., Nussenblatt R., Albert P., Davis T.A., Lowy I., Petrus M., Waldmann T.A., Janik J.E. A pilot study of CTLA-4 blockade after cancer vaccine failure in patients with advanced malignancy. Clin. Cancer Res. 2007; 13 (3): 958-64. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-06-1974 PMID: 17289891.

8.Fong L., Kwek S.S., O’Brien S., Kavanagh B., McNeel D.G., Weinberg V., Lin A.M., Rosenberg J., Ryan C.J., Rini B.I., Small E.J. Potentiating endogenous antitumor immunity to prostate cancer through combination immunotherapy with CTLA4 blockade and GM-CSF. Cancer Res. 2009; 69 (2): 609-15. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-08-3529 PMID: 19147575.

9.Sharma P., Pachynski R.K., Narayan V., Fléchon A., Gravis G., Galsky M.D., Mahammedi H., Patnaik A., Subudhi S.K., Ciprotti M., Simsek B., Saci A., Hu Y., Han G.C., Fizazi K. Nivolumab plus ipilimumab for metastatic castration-resistant prostate cancer: preliminary analysis of patients in the checkmate 650 trial. Cancer Cell. 2020; 38 (4): 489-99. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.08.007 PMID: 32916128.

10.Ferris R.L., Blumenschein G. Jr., Fayette J., Guigay J., Colevas A.D., Licitra L., Harrington K., Kasper S., Vokes E.E., Even C., Worden F., Saba N.F., Iglesias Docampo L.C., Haddad R., Rordorf T., Kiyota N., Tahara M., Monga M., Lynch M., Geese W.J., Kopit J., Shaw J.W., Gillison M.L. Nivolumab for recurrent squamous-cell carcinoma of the head and neck. N. Engl. J. Med. 2016; 375 (19): 1856-67. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMoa1602252 PMID: 27718784.

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Редакционная коллегия журнала «Иммунология» и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России с прискорбием сообщают, что 11.03.2022 г. скончался Президент журнала «Иммунология», научный руководитель Института академик РАН Хаитов Рахим Мусаевич
Медицина сегодня
Приглашаем специалистов Сибирского федерального округа 9-10 февраля посетить Школу РОАГ!

Приглашаем специалистов Сибирского федерального округа 9-10 февраля посетить Школу РОАГ! Успешно продолжается образовательная работа общероссийского проекта "Школы РОАГ". Очередная встреча пройдет 9-10 февраля в онлайн-формате и объединит врачей Иркутска, Кемерово, а также...

Конференция "Бронхоэктазы: муковисцидоз и не только-"

Уважаемые коллеги, приглашаем принять участие в конференции "Бронхоэктазы: муковисцидоз и не только-", которая состоится с 3 по 4 февраля в Ижевске! Организаторы: · Общероссийская общественная организация "Российское общество медицинских генетиков" · НМИЦ...

Образовательный форум специалистов регионов Российской Федерации "Открытая и эндоваскулярная хирургия в лечении патологии сердца и сосудов"

HandsHeart-2023 Образовательный форум специалистов регионов Российской Федерации "Открытая и эндоваскулярная хирургия в лечении патологии сердца и сосудов" 2-3 марта 2023 года, г. Казань Выбор метода лечения патологий аортального клапана, коронарных артерий и острого...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»