Интенсивность противоопухолевых иммунных реакций на иммунизацию вакцинами Multivac против карциномы 4T1 у мышей BALB/c и меланомы B16 у мышей C57BL/6J не зависит от генотипа "хозяина" и тканевой природы опухоли

Резюме

Введение. Ранее мы сообщали о новой методической платформе Multivac для создания персонализированных противоопухолевых вакцин. Сила иммунного ответа зависит от генов главного комплекса гистосовместимости и их продуктов, представленных на поверхности антиген-презентирующих клеток. Природа антигенов и их разнообразие в составе вакцины тоже могут сильно влиять на интенсивность иммунного ответа при вакцинации. Противоопухолевые вакцины серии Multivac, полученные из ткани опухоли или из злокачественных клеток опухоли, содержат большую коллекцию опухолевых антигенов. Это позволяет предположить, что такие вакцины будут вызывать интенсивные иммунные реакции и формировать иммунную память, независимо от генотипа индивидуума и тканевой природы опухоли.

Цель. В данной работе мы сравнивали иммуногенность вакцин серии Multivac против двух значительно различающихся опухолей (карцинома молочной железы и меланома) у двух инбредных линий мышей, существенно различающихся генетической основой и генами главного комплекса гистосовместимости, от которых критически зависит интенсивность адаптивных иммунных реакций.

Материал и методы. Мультиантигенные вакцины Multivac-1 были получены из ткани солидной карциномы 4Т1 молочной железы мышей BALB/c (генотип H-2d) или ткани меланомы B16F10 мышей C57BL/6J (генотип H-2b). Вакцины Multivac-4 создавали на основе лизатов злокачественных клеток 4T1-карциномы или меланомы B16F10, выращенных в условиях культуры клеток in vitro. Мультиантигенные лизаты ткани опухоли или злокачественных клеток дополняли молекулярными иммуноадъювантами из класса PRR-агонистов. Системные иммунные реакции против антигенов карциномы 4T1 и меланомы B16F10 определяли по содержанию противоопухолевых Т-клеток в селезенке и антител в сыворотке крови мышей. Антиген-реактивные CD4+- и CD8+-Т-клетки памяти и Т-клетки-эффекторы, секретирующие ИФН-γ, анализировали методом ELISpot. Антитела к внутриклеточным антигенам карциномы 4T1 и меланомы B16F10 исследовали методом иммуноферментного анализа.

Результаты. Обе линии мышей, BALB/c и C57BL/6J, эффективно отвечали на иммунизацию вакциной Multivac-1, полученной, соответственно, из тканей опухолей 4T1 и B16F10. В селезенках мышей накапливалось > 1000 CD4+-Т-клеток-эффекторов, CD4+- и CD8+-Т-клеток памяти (в расчете на 1 млн соответствующих Т-клеток). Еще более интенсивные иммунные реакции развивались в селезенках мышей BALB/c и C57BL/6J, иммунизированных вакциной Multivac-4. У мышей обеих линий вакцинация Multivac-4 вызывала интенсивное накопление антиген-реактивных Т-клеток памяти. Иммунизация мышей BALB/c и C57BL/6J вакцинами серии Multivac, соответственно, против карциномы 4T1 и меланомы B16F10, индуцировала накопление в сыворотке крови животных большого количества противоопухолевых антител, связывающихся с антигенами клеток карциномы 4T1 и меланомы B16F10.

Заключение. Вакцины Multivac, созданные на основе мультиантигенных лизатов опухолевой ткани или злокачественных клеток карциномы 4T1 или меланомы B16F10, продемонстрировали одинаково высокую иммуногенность. Интенсивность иммунных реакций в ответ на иммунизацию вакцинами серии Multivac не зависела от генотипа реципиентов вакцины. У мышей BALB/c и C57BL/6J наблюдались одинаково высокие уровни Т-клеточной и антительной реакций на опухолевые антигены, использованные в соответствующих вакцинах.

Ключевые слова:противоопухолевая терапевтическая вакцина; Т-клеточные реакции; антитела к антигенам опухоли; генотип вакцинируемого; тканевая природа опухоли

Для цитирования: Ушакова Е.И., Пичугин А.В., Федорова А.А., Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И. Интенсивность противоопухолевых иммунных реакций на иммунизацию вакцинами Multivac против карциномы 4T1 у мышей BALB/c и меланомы B16 у мышей C57BL/6J не зависит от генотипа "хозяина" и тканевой природы опухоли. Иммунология. 2022; 43 (6): 691-701. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-691-701

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 20-15-00391.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Постановка экспериментов, статистическая обработка, редактирование статьи - Ушакова Е.И.; планирование и постановка экспериментов, анализ данных - Пичугин А.В.; постановка экспериментов - Федорова А.А.; дизайн вакцины, анализ данных - Лебедева Е.С.; концепция, дизайн экспериментов, анализ данных, написание статьи - Атауллаханов Р.И.

Введение

Ранее мы сообщали [1] об успешной индукции Т-клеточных и антительных реакций против опухолевых антигенов с помощью мультиантигенной вакцины, созданной из лизата ткани опухоли (Multivac-1) или злокачественных клеток опухоли (Multivac-4). Для успешного применения любой вакцины, в том числе противоопухолевой вакцины серии Multivac, необходимо обеспечить ее эффективность у максимально широкой популяции людей, что является нетривиальной задачей в силу значительных индивидуальных различий по способности к развитию иммунных реакций. Иммунизация большой популяции одним и тем же антигеном, в том числе вакциной, демонстрирует порядковые различия в способности индивидуумов к иммунному ответу на иммунизацию. В ответ на иммунизацию одним и тем же антигеном одни люди реагируют выработкой сильных иммунных реакций, другие отвечают значительно более слабыми реакциями, а третьи вообще не реагируют. И такие различия не связаны с принципиальной неспособностью иммунной системы к адекватным ответам на иммунизацию. Индивидуумы, не реагирующие или слабо реагирующие на один антиген, вполне эффективно реагируют на сотни других антигенов, т. е. их иммунная система вполне здорова и функциональна, но на какие-то конкретные антигены реагировать не может.

Молекулярные и клеточные механизмы, определяющие уровни иммунного ответа на антигены, хорошо изучены. Они ассоциированы с генами главного комплекса гистосовместимости (MHC) и их продуктами, представленными на поверхности антиген-презентирующих клеток [2, 3]. Если небольшие фрагменты антигена в виде пептидов размером 8-10 аминокислотных остатков прочно удерживаются в белках MHC класса I, то такой комплекс MHC с антигенным пептидом распознается CD8+-Т-клетками [4]. Аналогично небольшие фрагменты антигена в виде пептидов размером от 13 до 25 аминокислотных остатков могут прочно удерживаться в комплексе с MHC класса II, и такие комплексы распознаются CD4+-Т-клетками [5, 6].

Индивидуумы различаются аллельными вариантами MHC, и далеко не все аллельные варианты MHC способны прочно удерживать любой антигенный пептид. При процессинге конкретного антигена в антиген-презентирующих клетках образуется набор антигенных пептидов. Если ни один из этих пептидов не может прочно удерживаться в аллельных вариантах MHC данного человека, то Т-клетки данного индивидуума не смогут развить иммунные реакции на этот конкретный антиген. Это и приведет к слабым иммунным реакциям или к полному отсутствию иммунных реакций на данный антиген. Тот же индивид может отлично реагировать на сотни других антигенов, поскольку пептидные фрагменты этих антигенов прочно ассоциируются с аллельными вариантами MHC на его антиген-презентирующих клетках. Иными словами, интенсивность иммунных реакций на антигены и вакцины может сильно различаться в зависимости от генотипа иммунизируемого человека [7-9].

Вероятность интенсивных иммунных реакций зависит не только от генома иммунизируемого человека. Природа антигенов и их разнообразие в составе вакцины тоже могут сильно влиять на интенсивность иммунного ответа при вакцинации. Чем крупнее белковые антигены, тем разнообразнее и многочисленнее набор антигенных пептидов, получающихся при их протеолитическом расщеплении. Чем больше разнообразие антигенных пептидов, являющихся фрагментами конкретного антигена, тем выше вероятность высокоаффинного взаимодействия хотя бы некоторых антигенных пептидов с конкретными аллельными вариантами MHC данного индивида и, как следствие, выше вероятность интенсивных иммунных реакций на эпитопы данного антигена. Аналогично с увеличением разнообразия белковых антигенов в составе вакцины увеличивается разнообразие антигенных пептидов и, следовательно, возрастает вероятность интенсивных иммунных реакций в ответ на вакцину [8, 10, 11].

Противоопухолевые вакцины из серии Multivac содержат большой набор антигенов, экспрессированных в злокачественных клетках опухоли - неоантигены, являющиеся продуктами соматических мутаций в злокачественных клетках опухоли, онкоэмбриональные, раковотестикулярные, а также антигены с повышенным уровнем экспрессии [12]. Большое разнообразие антигенов в составе вакцин серии Multivac позволяет предположить, что такие вакцины будут вызывать интенсивные иммунные реакции независимо от генотипа вакцинируемого [13-17].

Это предположение мы проверили в экспериментальных моделях. Результаты представлены в данном сообщении. Кроме того, мы проанализировали, зависит ли интенсивность иммунных реакций на вакцинацию Multivac от тканевой природы опухоли, из которой создается такая мультиантигенная вакцина.

Материал и методы

Экспериментальные животные. Мыши линий BALB/c и C57BL/6J 8-10-недельного возраста были получены из питомника "Столбовая", содержались на стандартной диете в стандартных условиях вивария ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными локальным комитетом по этике (Резолюция 4/17 от 13.07.2017).

Культуры клеток in vitro. Линия клеток 4T1 карциномы молочной железы (ATCC, США, Cat. No. CRL-2539) была получена от профессора М.Г. Агаджаняна (Institute for Molecular Medicine, Huntington Beach, CA). Линия клеток меланомы B16F10 была получена от профессора Д.М. Чудакова (ФГБУН Институт биоорганической химии РАН, Москва). Суспензии клеток селезенки и костного мозга мыши получали в асептических условиях стандартными методами, описанными ниже. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) с 25 мМ HEPES, дополненной смесью заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы "ПанЭко", Россия), при 37 оС, в увлажненной атмосфере с содержанием 5 % СО2.

Мышей выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков. В асептических условиях выделяли селезенку. Клеточную суспензию готовили в фосфатном буфере с 0,5 % бычьего альбумина (ФБ-БСА). Фракцию мононуклеарных клеток получали методом центрифугирования в градиенте фиколла ("ПанЭко", Россия). Клетки отмывали ФБ-БСА. Для сортировки CD4+- и CD8+-Т-клеток суспензию окрашивали антителами CD4-PE и CD8-APC. Лейкоциты подсчитывали с окрашиванием CD45-BV510. Жизнеспособность суспензий определяли при окрашивании DAPI. Сортировку клеток проводили с помощью проточного цитометрасортировщика BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США). Чистота полученных популяций CD4+- и CD8+-Т-клеток составляла 98 %.

Получение антиген-презентирующих дендритных клеток in vitro. Дифференцировку дендритных клеток и макрофагов костного мозга мышей осуществляли in vitro в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (Sigma, США). В асептических условиях выделяли бедренные и большие берцовые кости мышей. Костный мозг вымывали шприцом (игла 25G) в чашку Петри с раствором ФБ-БСА и тщательно суспендировали. Клетки отмывали ФБ-БСА. Эритроциты удаляли осмотическим лизисом. Ядросодержащие клетки культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл ГМ-КСФ и 50 мкМ β-меркаптоэтанола при 37 оС и 5 % CO2. Через 3-4 дня в культуры вносили равный объем ПС с теми же добавками. На 7-й день дендритные клетки активировали ЛПС из E. coli в конечной концентрации 0,1 мкг/мл и нагружали антигеном. В качестве антигена использовали лизат опухолевых клеток 4T1 или B16F10 в конечной концентрации 10 мкг/мл (по белку). Концентрацию белка в лизате определяли методом Pierce™ BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, США). Для презентации антигенов в комплексе с MHC-II активированные дендритные клетки нагружали лизатом опухолевых клеток 4T1 или B16F10. Для презентации антигенов в комплексе с MHC-I активированные дендритные клетки культивировали совместно с клетками карциномы 4T1 или B16F10.

Иммунизация мультиантигенными вакцинами против карциномы 4T1 или меланомы B16F10. Вакцинные антигены получали из ткани опухоли 4T1 или B16F10, а также из злокачественных клеток линии 4T1 или B16F10, выращенных в культуре in vitro. Для создания солидной опухоли мышам BALB/c подкожно вводили клетки карциномы 4T1 в количестве 15 тыс. клеток на мышь, а мышам C57BL/6J - клетки меланомы B16F10 в количестве 200 тыс. клеток на мышь. При достижении размеров опухолей 5-10 мм мышей выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков. Ткань опухоли получали в асептических условиях, измельчали и лизировали с помощью замораживания-оттаивания. Лизат замораживали до использования. Линии клеток 4T1 карциномы и B16F10 меланомы поддерживали регулярными пересевами в ПС. Клетки карциномы 4T1 и меланомы B16F10 получали из культуры in vitro, лизировали с помощью замораживания-оттаивания. Лизат замораживали до использования. В лизат гомогената опухолевой ткани или лизат клеток 4T1 (или B16F10) добавляли молекулярные адъюванты, агонисты PRR, действие которых детально исследовано и описано нами ранее [18-24]. Одна доза вакцины Multivac для иммунизации мышей массой 20-25 г содержала лизат из 50 мг ткани опухоли 4T1 (или B16F10) или лизат из 5 млн клеток 4T1 (или B16F10), дополненные 10 мкг кислого пептидогликана из растений (агонист TLR4), 4 мкг сополимера полиинозиновой и полицитидиловой кислот (агонист TLR3) и 1,6 мкг неметилированного CpG-олигонуклеотида (агонист TLR9).

Вакцина Multivac-1 была приготовлена на основе лизата ткани опухоли 4T1 (или опухоли B16F10), а вакцина Multivac-4 - на основе лизата клеток 4T1 (или B16F10). Иммунизацию мышей вакцинами серии Multivac проводили внутрибрюшинно, 4-кратно, с интервалом 2 нед между иммунизациями. Через 2 нед после последней иммунизации у мышей брали кровь для анализа антител и выводили из эксперимента дислокацией шейных позвонков, выделяли селезенки, в которых методом ELISpot исследовали количество CD4+- и CD8+-Т-клеток, секретирующих интерферон (ИФН)-γ.

Анализ Т-клеточных реакций, специфичных к антигенам карциномы 4T1 или меланомы B16F10. Антиген-специфический ответ Т-клеток оценивали по секреции ИФН-γ. Специфический Т-клеточный ответ индуцировали в совместной культуре Т-клеток с антиген-презентирующими дендритными клетками, предварительно нагруженными лизатом клеток 4Т1 (или B16F10), как описано выше, или совместно с клетками карциномы 4T1 (или B16F10). В лунки планшета для ELISpot (BD TM ELISPOT Mouse IFN-γ, кат. 551083, BD Biosciences, США) помещали 30 тыс. CD4+- или CD8+-Т-клеток, очищенных с помощью проточного сортировщика FACS Aria II, культивировали совместно с 50 тыс. дендритных клеток. Для активации CD8+-Т-клеток в совместную культуру Т-клеток и дендритных клеток вносили 10 тыс. клеток карциномы 4Т1 или меланомы B16F10. Совместные культуры инкубировали в течение 36 ч при 37 °C и 5 % CO2, после чего выявляли клетки, секретирующие ИФН-γ, в соответствии с инструкцией производителя. Фотографии каждой лунки делали с помощью микроскопа Levenhuk DTX 700 LCD, количество спотов считали с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Количество ИФН-γ-секретирующих антиген-реактивных Т-клеток представляли в расчете на 1 млн CD4+- или CD8+-Т-клеток.

Анализ антител, специфично связывающихся с антигенами карциномы 4T1 или меланомы B16F10. Сывороточные антитела, связывающиеся с внутриклеточными антигенами клеток карциномы 4T1 или меланомы B16F10, исследовали методом иммуноферментного анализа (ИФА). Использовали планшеты MaxiSorp (NUNC). В лунках планшета адсорбировали лизат клеточной линии 4T1 или меланомы B16F10. Для этого в каждую лунку вносили 100 мкл лизата с концентрацией 50 мкг/мл, инкубировали в течение 12 ч при 4 °С. После блокировали 4 % БСА в лунки планшета вносили разведения исследуемых сывороток, инкубировали в течение 2 ч. Отмывали фосфатным буфером с 0,05 % Tween-20, затем инкубировали с козьими антителами к тяжелым и легким цепям IgG мыши, конъюгированными с биотином (Сat. No. 103008, Bio-Rad, США). Вновь отмывали фосфатным буфером с 0,05 % Tween-20 и инкубировали со стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена (Сat. No. 710005, Bio-Rad, США). Добавляли субстрат пероксидазы хрена - ТМБ. Реакцию останавливали раствором серной кислоты. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм.

Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения Graph-Pad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., США). Результаты экспериментов представляли в виде медианы и процентилей (25-й и 75-й процентили). Статистический анализ данных проводили с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни (различия считались значимыми при p < 0,05).

Результаты

Сравнение интенсивности Т-клеточных реакций на вакцину Multivac у мышей BALB/c и C57BL/6J

Мы сравнили иммуногенность вакцин серии Multivac у мышей, различающихся своей генетической основой и имеющих значительные различиями по генам гистосовместимости. Использовали две экспериментальные модели сингенных опухолей - карциному молочной железы 4T1 у мышей BALB/c и меланому B16F10 у мышей C57BL/6J.

Мыши BALB/c гомозиготны по генам MHC, имеют 3 гена MHC класса I, представленных аллельными вариантами H-2Kd, H-2Dd и H-2Ld, а также 2 гена MHC класса II, представленных аллельными вариантами H-2Ad и H-2Ed. Мыши C57BL/6J тоже гомозиготны по генам MHC, имеют 2 гена MHC класса I в виде аллельных вариантов H-2Kb и H-2Db, а также 1 ген MHC класса II в виде аллельного варианта H-2Ab.

Ткань первичной опухоли, полученную при хирургической резекции, либо чистую популяцию злокачественных клеток опухоли, выращенную в культуре клеток in vitro, использовали для приготовления вариантов мультиантигенной вакцины Multivac-1 и Multivac-4, как это было описано ранее [1]. Мышей иммунизировали 4-кратно с интервалами в 2 нед между иммунизациями. Интенсивность иммунных реакций анализировали через 2 нед после последней иммунизации. Иммуногенность вакцин Multivac-1 и Multivac-4 у двух генетически различающихся линий мышей сравнивали по накоплению в селезенке CD4+- и CD8+-Т-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-γ, а также CD4+- и CD8+-Т-клеток памяти, специфически отвечающих на реактивацию антигенами соответствующей опухоли.

Интенсивность Т-клеточных реакций у мышей BALB/c и C57BL/6J в ответ на два варианта Multivac-1, приготовленных, соответственно, из тканей опухолей 4T1 и B16F10, представлена на рис. 1. Обе линии мышей эффективно отвечали на иммунизацию вакцинами Multivac-1, однако наблюдались некоторые различия в детальных характеристиках иммунного ответа. В селезенках мышей BALB/c накапливалось 3070 ± 2277 CD4+-Т-клеток-эффекторов и 2560 ± 1301 CD8+-T-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-γ (в расчете на 1 млн соответствующих Т-клеток). В селезенках мышей C57BL/6J тоже накапливалось 2044 ± 568 CD4+-T-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-γ. Однако содержание CD8+-Т-клеток-эффекторов не отличалось от такового в селезенках контрольных, неиммунизированных, мышей.

Количество антиген-реактивных Т-клеток памяти, вырабатывающих ИФН-γ при реактивации антигенами опухоли 4T1, в селезенках мышей BALB/c, иммунизированных Multivac-1, составило 1495 ± 611 в популяции CD4+-Т-клеток и 2550 ± 909 в популяции CD8+-Т-клеток. Еще более мощным был ответ мышей C57BL/6J на вакцинацию Multivac-1 против меланомы B16F10, в их селезенках накапливалось 3467 ± 1024 CD4+-T-клеток памяти и 4163 ± 618 CD8+-Т-клеток памяти (рис. 1).

Подобно вакцинам Multivac-1, иммунизация Multivac-4 индуцировала интенсивные иммунные реакции против антигенов соответствующих опухолей. Так, у мышей BALB/c, иммунизированных Multivac-4 против карциномы 4T1, в селезенках накапливалось 3250 ± 1114 CD4+-Т-клеток-эффекторов и 2848 ± 1266 CD8+-Т-клеток-эффекторов (рис. 2). У мышей C57BL/6J, вакцинированных Multivac-4 против меланомы B16F10, в селезенках накапливалось 4700 ± 1998 CD4+-Т-клеток-эффекторов, однако, как и при иммунизации Multivac-1, не происходило накопления CD8+-Т-клетокэффекторов.

У мышей обоих генотипов вакцинация Multivac-4 вызывала интенсивное накопление антиген-реактивных Т-клеток памяти. После иммунизации вакциной Multivac-4 против карциномы 4T1 в селезенках мышей BALB/c накапливалось 6155 ± 1633 CD4+-T-клеток памяти и 3507 ± 1008 CD8+-T-клеток памяти. У мышей C57BL/6J вакцинация Multivac-4 индуцировала образование 1855 ± 840 CD4+-T-клеток памяти и 3522 ± 678 CD8+-Т-клеток памяти (рис. 2).

Сравнение интенсивности антительных реакций на вакцину Multivac у мышей BALB/c и C57BL/6J

Независимо от генотипа мыши BALB/c и C57BL/6J в ответ на иммунизацию вакцинами серии Multivac интенсивно продуцировали сывороточные антитела, специфически связывающиеся с антигенами опухоли, использованной для приготовления вакцины. На рис. 3 представлены результаты измерения концентрации противоопухолевых антител в сыворотках крови мышей. Иммунизация вакциной Multivac-4 индуцировала накопление в сыворотке крови мышей BALB/c антител, связывающихся с антигенами клеток карциномы 4T1, в титрах выше 1 : 10 000. Аналогично, в сыворотках крови мышей C57BL/6J, иммунизированных вакциной Multivac-4 против меланомы B16F10, накапливались специфические к меланоме антитела в титрах более 1 : 10 000.

Обсуждение

Представленные в данной работе результаты исследования свидетельствуют о том, что вакцины серии Multivac в одинаковой степени эффективны при иммунизации инбредных мышей, имеющих разные генотипы и существенно различающихся аллельными вариантами генов MHC классов I и II. Высокая иммуногенность вакцины, не зависящая от генотипа иммунизируемого индивида, - это желанное свойство для любой вакцины, в том числе для Multivac. Результаты успешной иммунизации мышей двух разных генотипов позволяют надеяться, что и у пациентов, генотип которых всегда уникален, вакцины серии Multivac будут эффективными.

Различия между мышами BALB/c и C57BL/6J по накоплению CD8+-Т-клеток-эффекторов после иммунизации вакцинами Multivac (рис. 1 и 2) могут объясняться различиями в динамике иммунных реакций у этих двух генотипов мышей. Через 2 нед после 4-й иммунизации мы не видели накопления CD8+-T-клеток-эффекторов, секретирующих ИФН-γ, у мышей C57BL/6J. В то же время у этих же мышей в селезенках мы регистрировали большое количество антиген-реактивных CD8+-Т-клеток памяти. Маловероятно, если вообще возможно, чтобы в популяции CD8+-Т-клеток шла мощная адаптивная реакция в ответ на вакцину с образованием большого числа CD8+-T-клеток памяти без генерации значительного пула CD8+-T-клеток-эффекторов.

Т-клетки-эффекторы и Т-клетки памяти являются стадиями одного и того же процесса - экспоненциального размножения и дифференцировки антиген-специфических Т-клеток [25]. Стадия клеток-эффекторов предшествует формированию клеток памяти. Полученный нами результат может указывать на то, что у мышей C57BL/6J эффекторная фаза Т-клеточной реакции происходит и завершается быстрее, чем у мышей BALB/c. По этой причине через 2 нед после последней иммунизации мы уже не выявляем короткоживущие CD8+-Т-клетки-эффекторы, но обнаруживаем долгоживущую популяцию CD8+-T-клеток памяти. Это предположение требует проверки путем экспериментального сравнения динамики эффекторной фазы реакции Т-клеток в ответ на иммунизацию вакциной Multivac у мышей C57BL/6J и BALB/c.

Полученные нами данные доказывают, что высокая иммуногенность вакцин серии Multivac не зависит от генотипа вакцинируемого "хозяина". Причины такой независимости от генотипа вакцинируемого, скорее всего, кроются в разнообразии опухолевых антигенов в составе таких вакцин. Интенсивность ответа на индивидуальный антигенный эпитоп прямо зависит от аффинности его взаимодействия с молекулами MHC, экспонированными на поверхности антиген-презентирующих клеток.

Вакцины серии Multivac содержат множество антигенов опухоли, поскольку в их составе используется лизат ткани опухоли или лизат злокачественных клеток, полученных из опухоли методом культивирования in vitro. При процессинге вакцины в антиген-презентирующих клетках, большое количество различных по природе антигенов превращается в еще большее количество антигенных пептидов. Из каждого белкового антигена образуются многие десятки или даже сотни пептидных фрагментов, потенциально способных экспонироваться в комплексе с молекулами MHC. Чем больше множество антигенных пептидов, тем выше вероятность того, что какие-то антигенные пептиды из этого множества будут взаимодействовать с высокой аффинностью с аллельными вариантами MHC данного пациента. Иными словами, обогащенность различными опухолевыми антигенами является большим достоинством вакцин серии Multivac, поскольку создает материальную основу для высокой вероятности хорошего иммунного ответа, несмотря на уникальность аллельных вариантов генов MHC пациента.

В исследовании, описанном в этой работе, сравнивалась эффективность иммунизации вакцинами Multivac не только у генетически различающихся линий мышей. Мы также сравнивали эффективность вакцин серии Multivac, созданных на основе лизатов двух совершенно различных по своей природе опухолей - карциномы молочной железы и меланомы.

Огромные различия между этими опухолями доказаны на уровне геномных аберраций [26]. В карциноме 4T1 доказано наличие 505 однонуклеотидных замен (SNV), 20 небольших нуклеотидных вставок (indel) и 12 событий слияния последовательностей различных генов (fusion) [27]. В меланоме B16F10 доказана экспрессия 1392 мутаций на уровне мРНК, из них 962 мутации несинонимические, создающие основу для существенных изменений в структуре и антигенных свойствах мутантного белка [28]. Из 50 генов, чаще всего мутирующих в раковых клетках, в карциноме 4T1 мутировано 12 генов, а в меланоме B16F10 - 26 генов. Причем совпадений между двумя опухолями по мутированным генам всего 7, т. е. на уровне геномных аббераций и, как следствие, по мутационным антигенам меланома B16F10 и карцинома 4T1 драматически различаются [26].

В экспериментах, описанных в этом сообщении (рис. 1-3), вакцины Multivac, в составе которых содержались лизаты клеток карциномы 4T1 или клеток меланомы B16F10, продемонстрировали одинаково высокую иммуногенность, несмотря на значительные различия по антигенному составу между карциномой 4T1 и меланомой B16F10. Иначе говоря, технологическая платформа Multivac позволяет создавать высокоиммуногенные вакцины из злокачественных клеток опухолей, различных по тканевой природе и антигенному составу, а интенсивные иммунные реакции в ответ на иммунизацию вакцинами серии Multivac не зависят от генотипа иммунизируемого индивида.

Литература

1. Ушакова Е.И., Федорова А.А., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Иммуногенность мультиантигенной вакцины, приготовленной из лизата злокачественных клеток опухоли. Иммунология. 2022; 43 (4): 389-400. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-4-389-400

2. Rammensee H.G., Friede T., Stevanoviíc S. MHC ligands and peptide motifs: first listing. Immunogenetics. 1995; 41 (4): 178-228. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00172063 PMID: 7890324.

3. Castro C.D., Luoma A.M., Adams E.J. Coevolution of T-cell receptors with MHC and non-MHC ligands. Immunol. Rev. 2015; 267 (1): 30-55. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12327 PMID: 26284470.

4. Szeto C., Lobos C.A., Nguyen A.T., Gras S. TCR recognition of peptide-MHC-I: rule makers and breakers. Int. J. Mol. Sci. 2020; 22 (1): 68. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22010068 PMID: 33374673.

5. Wieczorek M., Abualrous E.T., Sticht J., Álvaro-Benito M., Stolzenberg S., Noé F., Freund C. Major histocompatibility complex (MHC) class I and MHC class II proteins: conformational plasticity in antigen presentation. Front. Immunol. 2017; 8: 292. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2017.00292 PMID: 28367149.

6. ten Broeke T., Wubbolts R., Stoorvogel W. MHC class II antigen presentation by dendritic cells regulated through endosomal sorting. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2013; 5 (12): a016873. DOI: https://doi.org/10.1101/cshperspect.a016873 PMID: 24296169.

7. Calis J.J., Maybeno M., Greenbaum J.A., Weiskopf D., De Silva A.D., Sette A., Keşmir C., Peters B. Properties of MHC class I presented peptides that enhance immunogenicity. PLoS Comput. Biol. 2013; 9 (10): e1003266. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1003266.

8. Kotturi M.F., Scott I., Wolfe T., Peters B., Sidney J., Cheroutre H., von Herrath M.G., Buchmeier M.J., Grey H., Sette A. Naive precursor frequencies and MHC binding rather than the degree of epitope diversity shape CD8+ T cell immunodominance. J. Immunol. 2008; 181 (3): 2124-33. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.181.3.2124 PMID: 18641351.

9. Tynan F.E., Borg N.A., Miles J.J., Beddoe T., El-Hassen D., Silins S.L., van Zuylen W.J., Purcell A.W., Kjer-Nielsen L., McCluskey J., Burrows S.R., Rossjohn J. High resolution structures of highly bulged viral epitopes bound to major histocompatibility complex class I. Implications for T-cell receptor engagement and T-cell immunodominance. J. Biol. Chem. 2005; 280 (25): 23 900-9. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M503060200 PMID: 15849183.

10. Kreiter S., Vormehr M., van de Roemer N., Diken M., Löwer M., Diekmann J., Boegel S., Schrörs B., Vascotto F., Castle J.C., Tadmor A.D., Schoenberger S.P., Huber C., Türeci Ö., Sahin U. Mutant MHC class II epitopes drive therapeutic immune responses to cancer. Nature. 2015; 520 (7549): 692-6. DOI: https://doi.org/10.1038/nature14426.

11. Chan T.A., Wolchok J.D., Snyder A. Genetic Basis for Clinical Response to CTLA-4 Blockade in melanoma. N. Engl. J. Med. 2015; 373 (20): 1984. DOI: https://doi.org/10.1056/NEJMc1508163.

12. Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М. Вакцины для лечения злокачественных новообразований. Иммунология. 2019; 40 (4): 64-76. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-140

13. Sahin U., Derhovanessian E., Miller M., Kloke B.P., Simon P., Löwer M., Bukur V., Tadmor A.D., Luxemburger U., Schrörs B., Omokoko T., Vormehr M., Albrecht C., Paruzynski A., Kuhn A.N., Buck J., Heesch S., Schreeb K.H., Müller F., Ortseifer I., Vogler I., Godehardt E., Attig S., Rae R., Breitkreuz A., Tolliver C., Suchan M., Martic G., Hohberger A., Sorn P., Diekmann J., Ciesla J., Waksmann O., Brück A.K., Witt M., Zillgen M., Rothermel A., Kasemann B., Langer D., Bolte S., Diken M., Kreiter S., Nemecek R., Gebhardt C., Grabbe S., Höller C., Utikal J., Huber C., Loquai C., Türeci Ö. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly-specific therapeutic immunity against cancer. Nature. 2017; 547 (7662): 222-6. DOI: https://doi.org/10.1038/nature23003.

14. Ott P.A., Hu Z., Keskin D.B., Shukla S.A., Sun J., Bozym D.J., Zhang W., Luoma A., Giobbie-Hurder A., Peter L., Chen C., Olive O., Carter T.A., Li S., Lieb D.J., Eisenhaure T., Gjini E., Stevens J., Lane W.J., Javeri I., Nellaiappan K., Salazar A.M., Daley H., Seaman M., Buchbinder E.I., Yoon C.H., Harden M., Lennon N., Gabriel S., Rodig S.J., Barouch D.H., Aster J.C., Getz G., Wucherpfennig K., Neuberg D., Ritz J., Lander E.S., Fritsch E.F., Hacohen N., Wu C.J. An immunogenic personal neoantigen vaccine for patients with melanoma. Nature. 2017; 547 (7662): 217-21. DOI: https://doi.org/10.1038/nature22991 PMID: 28678778.

15. Yamamoto T.N., Kishton R.J., Restifo N.P. Developing neoantigen-targeted T cell-based treatments for solid tumors. Nat. Med. 2019; 25 (10): 1488-99. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-019-0596-y PMID: 31591590.

16. Hu Z., Ott P.A., Wu C.J. Towards personalized, tumour-specific, therapeutic vaccines for cancer. Nat. Rev. Immunol. 2018; 18 (3): 168-82. DOI: https://doi.org/10.1038/nri.2017.131 PMID: 29226910.

17. Sahin U., Oehm P., Derhovanessian E., Jabulowsky R.A., Vormehr M., Gold M., Maurus D., Schwarck-Kokarakis D., Kuhn A.N., Omokoko T., Kranz L.M., Diken M., Kreiter S., Haas H., Attig S., Rae R., Cuk K., Kemmer-Brück A., Breitkreuz A., Tolliver C., Caspar J., Quinkhardt J., Hebich L., Stein M., Hohberger A., Vogler I., Liebig I., Renken S., Sikorski J., Leierer M., Müller V., Mitzel-Rink H., Miederer M., Huber C., Grabbe S., Utikal J., Pinter A., Kaufmann R., Hassel J.C., Loquai C., Türeci Ö. An RNA vaccine drives immunity in checkpoint-inhibitor-treated melanoma. Nature. 2020; 585 (7823): 107-12. DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-020-2537-9 PMID: 32728218.

18. Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Багаев А.В., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Комбинированная иммунотерапия метастатической карциномы у лабораторных мышей путем резекции первичного опухолевого узла и последующего перепрограммирования макрофагов и дендритных клеток с помощью агониста TLR4. Иммунология. 2021; 42 (5): 490-501. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-5-490-501

19. Багаев А.В., Рыбинец А.С., Федорова А.А., Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Синергизм агонистов TLR3 и TLR4 при перепрограммировании макрофагов в противоопухолевое состояние. Иммунология. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630

20. Лебедева Е.С., Багаев А.В., Гараева А.Я., Чулкина М.М., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Кооперативное взаимодействие сигнальных путей рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 в макрофагах мыши. Иммунология. 2018; 39 (1): 4-11. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-1-4-11

21. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М.М., Атауллаханов Р.И. Комбинированное применение трех агонистов рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергически увеличивает выработку белков-цитокинов макрофагами мыши. Иммунология. 2018; 39 (4): 172-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-172-177

22. Чулкина М.М., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Гараева А.Я., Пичугин А.В., Атауллаханов Р.И. Cинергическая активация транскрипции генов INOS, IFN-β, IL12p40, IL6, TNF-α при одновременном воздействии на макрофаги агонистами рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2. Иммунология. 2018; 39 (4): 178-85. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-4-178-185

23. Лебедева Е.С., Джаруллаева А.Ш., Багаев А.В., Ерохова А.С., Чулкина М.М., Тухватулин А.И., Пичугин А.В., Логунов Д.Ю., Атауллаханов Р.И. Сочетанная стимуляция рецепторов TLR4, TLR9 и NOD2 синергически повышает защиту лабораторных мышей в модели летальной инфекции Salmonella enterica. Иммунология. 2018; 39 (5-6): 252-7. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-252-257

24. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Ataullakhanov R., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x

25. Cui W., Kaech S.M. Generation of effector CD8+ T cells and their conversion to memory T cells. Immunol. Rev. 2010; 236: 151-66. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-065X.2010.00926.x PMID: 20636815.

26. Mosely S.I., Prime J.E., Sainson R.C., Koopmann J.O., Wang D.Y., Greenawalt D.M., Ahdesmaki M.J., Leyland R., Mullins S., Pacelli L., Marcus D., Anderton J., Watkins A., Coates Ulrichsen J., Brohawn P., Higgs B.W., McCourt M., Jones H., Harper J.A., Morrow M., Valge-Archer V., Stewart R., Dovedi S.J., Wilkinson R.W. Rational selection of syngeneic preclinical tumor models for immunotherapeutic drug discovery. Cancer Immunol. Res. 2017; 5 (1): 29-41. DOI: https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-16-0114 PMID: 27923825.

27. Schrörs B., Boegel S., Albrecht C., Bukur T., Bukur V., Holtsträter C., Ritzel C., Manninen K., Tadmor A.D., Vormehr M., Sahin U., Löwer M. Multi-omics characterization of the 4T1 murine mammary gland tumor model. Front. Oncol. 2020; 10: 1195. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2020.01195 PMID: 32793490.

28. Castle J.C., Kreiter S., Diekmann J., Löwer M., van de Roemer N., de Graaf J., Selmi A., Diken M., Boegel S., Paret C., Koslowski M., Kuhn A.N., Britten C.M., Huber C., Türeci O., Sahin U. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer Res. 2012; 72 (5): 1081-91. DOI: https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-11-3722 PMID: 22237626.

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Редакционная коллегия журнала «Иммунология» и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России с прискорбием сообщают, что 11.03.2022 г. скончался Президент журнала «Иммунология», научный руководитель Института академик РАН Хаитов Рахим Мусаевич
Медицина сегодня
Приглашаем специалистов Сибирского федерального округа 9-10 февраля посетить Школу РОАГ!

Приглашаем специалистов Сибирского федерального округа 9-10 февраля посетить Школу РОАГ! Успешно продолжается образовательная работа общероссийского проекта "Школы РОАГ". Очередная встреча пройдет 9-10 февраля в онлайн-формате и объединит врачей Иркутска, Кемерово, а также...

Конференция "Бронхоэктазы: муковисцидоз и не только-"

Уважаемые коллеги, приглашаем принять участие в конференции "Бронхоэктазы: муковисцидоз и не только-", которая состоится с 3 по 4 февраля в Ижевске! Организаторы: · Общероссийская общественная организация "Российское общество медицинских генетиков" · НМИЦ...

Образовательный форум специалистов регионов Российской Федерации "Открытая и эндоваскулярная хирургия в лечении патологии сердца и сосудов"

HandsHeart-2023 Образовательный форум специалистов регионов Российской Федерации "Открытая и эндоваскулярная хирургия в лечении патологии сердца и сосудов" 2-3 марта 2023 года, г. Казань Выбор метода лечения патологий аортального клапана, коронарных артерий и острого...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»