Изучение взаимодействий белков с ДНК в клетках иммунной системы с помощью иммунопреципитации и иммунорасщепления хроматина

Резюме

Клетки иммунной системы отвечают на инфекции и другие неблагоприятные воздействия изменениями экспрессии сотен генов, обеспечивающих иммунную защиту. В основе регуляции экспрессии генов лежат взаимодействия геномной ДНК с белками - гистонами, факторами транскрипции, РНК-полимеразами, кофакторными белками. В настоящем обзоре рассмотрены методы, позволяющие исследовать взаимодействия ДНК с белками непосредственно в клетке: иммунопреципитация хроматина (chromatin immunoprecipitation, ChIP) и иммунорасщепление хроматина (chromatin immunocleavage, ChIC). Рассмотрены основные технические характеристики и модификации, достоинства и недостатки обоих методов. В заключительной части обзора приведены примеры, иллюстрирующие возможности иммунопреципитации и иммунорасщепления хроматина в фундаментальных и клинико-ориентированных иммунологических исследованиях.

Ключевые слова:хроматин; иммунопреципитация хроматина; иммунорасщепление хроматина; иммунная система; эпигенетика; гистоны; факторы транскрипции

Для цитирования: Масютина А.М., Муругина Н.Е., Пащенков М.В. Изучение взаимодействий белков с ДНК в клетках иммунной системы с помощью иммунопреципитации и иммунорасщепления хроматина. Иммуно-

логия. 2022; 43 (6): 722-736. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-722-736

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00211.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Анализ литературы, написание статьи - Масютина А.М.; анализ литературы, написание

статьи - Муругина Н.Е.; анализ литературы, редактирование и утверждение окончательного текста статьи - Пащенков М.В.

Введение

Большинство клеток нашего организма содержит одинаковую последовательность ДНК, однако многообразие типов и функций клеток поражает воображение. Основной функцией ДНК является хранение информации о белках, необходимых для развития, выживания и размножения организма. В клетках эукариот ДНК компактно упакована и образует хроматин - комплекс ДНК и ассоциированных с ней белков, причем большую часть составляют гистоны. Структурной единицей хроматина является нуклеосома - последовательность из 146-147 пар нуклеотидов, "намотанная" на гистоновый октамер, включающий по две молекулы гистонов каждой из четырех разновидностей: H2A, H2B, H3 и H4.

Молекулы гистонов, содержащие большое количество остатков лизина и аргинина, при физиологическом pH заряжены положительно, что обеспечивает их сильное электростатическое взаимодействие с отрицательно заряженной молекулой ДНК. В зависимости от "наднуклеосомной" организации, выделяют рыхло упакованный эухроматин и плотно упакованный гетерохроматин. В эухроматине идет транскрипция различной степени интенсивности, тогда как гетерохроматин транскрипционно неактивен, поскольку ДНК в нем малодоступна для РНК-полимераз и белков, регулирующих транскрипцию.

Залог успешного выживания клетки или организма - адаптация к изменяющимся условиям внешней среды, что на молекулярном уровне отражается в изменениях экспрессии генов, которые в первую очередь зависят от изменений транскрипции мРНК. Переключения транскрипционных программ лежат в основе дифференцировки различных видов клеток в ходе онтогенеза, деления клеток, их ответа на внешние раздражители и т. д. Изменения транскрипции обеспечиваются взаимодействием большого количества вспомогательных белков непосредственно с ДНК или с белками хроматина. Ключевую роль в подстройке экспрессии генов под новые задачи играют модификации белков хроматина, так как данный механизм быстрый, точный и обратимый [1].

Стимулы, происходящие извне или изнутри клетки, вызывают активацию сигнальных путей, их конечным этапом является поступление в ядро факторов транскрипции, связывающихся с промоторами и энхансерами определенных генов. Промотор - это регуляторный участок ДНК, непосредственно предшествующий кодирующей последовательности гена, тогда как энхансер может быть отделен от кодирующей последовательности многими тысячами пар нуклеотидов. В пределах промоторов и энхансеров факторы транскрипции взаимодействуют с уникальными короткими последовательностями ДНК - сайтами связывания или мотивами. Нужно учитывать, что последовательности, схожие с сайтами связывания факторов транскрипции, могут встречаться в геноме очень часто, однако лишь небольшая их часть доступна для связывания, что обусловлено упаковкой ДНК [2].

Факторы транскрипции, способные связываться с плотно упакованной ДНК, называются пионерскими [3]. Как правило, они обеспечивают дифференцировку различных видов клеток. Пионерские факторы транскрипции подготавливают клетки к выполнению определенных эффекторных транскрипционных программ, однако сами эти программы, запускаемые в ответ на те или иные стимулы, контролируются другими факторами транскрипции, так называемыми активационными или стимул-зависимыми [3]. Факторы транскрипции привлекают к регуляторным участкам ДНК ферменты, отвечающие за пострансляционные модификации гистонов. Ведущая роль в активации транскрипции отводится ацетилированию гистонов H3 и H4, которое осуществляется гистонацетилтрансферазами. Ацетилирование по свободным ε-аминогруппам остатков лизина локально влияет на заряд (нейтрализует положительный заряд лизина) и на структуру гистонов, что ослабляет электростатические взаимодействия гистонов и ДНК, "распаковывает" молекулы ДНК, открывает доступ к ДНК для других белков, в том числе для активационных факторов транскрипции и для РНК-полимераз, а также создает сайты связывания для дополнительных регуляторных белков [4]. В целом, ацетилирование гистонов способствует активации транскрипции.

Помимо ацетилирования, к основным посттрансляционным модификациям гистонов относят метилирование, фосфорилирование, убиквитинилирование и сумоилирование [5]. Метилирование гистонов по остаткам лизина и аргинина может как усиливать, так и ингибировать транскрипцию, в зависимости от того, какой именно остаток метилирован и какое количество метильных групп добавлено. Как правило, неактивный гетерохроматин обогащен гистоном Н3, ди- и триметилированным по лизину 9 (H3K9me2/3) и монометилированным по лизину 27 (Н3К27me), а также гистоном Н4, триметилированным по лизину 20 (H4K20me3), в то время как активный эухроматин содержит гистоны с ацетильными группами (H3K9ac, H3K27ac и др.) или моно-/триметилированные гистоны (H3K4me1/3) [6].

Ковалентные модификации гистонов, приобретенные клеткой, могут сохраняться в течение длительного времени и передаваться дочерним клеткам. Наряду с метилированием ДНК и РНК-интерференцией стойкие модификации гистонов являются важнейшим механизмом эпигенетической регуляции экспрессии генов. Применительно к иммунной системе эпигенетические механизмы лежат в основе дифференцировки различных типов клеток, участвующих в иммунном ответе [7], обеспечивают формирование адаптивной [8] и врожденной [9] иммунологической памяти, влияют на фенотипические проявления заболеваний, имеющих наследственную предрасположенность [10].

Описанная выше система контроля экспрессии генов позволяет быстро и точно регулировать клеточный ответ, что представляется особенно важным в случае иммунной системы, так как нарушения регуляции экспрессии генов в клетках иммунной системы могут приводить к повреждению тканей и органов, например при таких заболеваниях и состояниях, как сепсис, аутоиммунные и аутовоспалительные заболевания, реакции гиперчувствительности, первичные иммунодефициты и т. д. Таким образом, информация о взаимодействии белков с ДНК важна как для расшифровки фундаментальных механизмов функционирования иммунной системы, так и для понимания патогенеза конкретных заболеваний, связанных с нарушением этих механизмов, а следовательно, и для разработки новых методов лечения [11]. Хотя методы исследования взаимодействий белков с ДНК довольно трудоемки, они с успехом применяются во многих научных лабораториях.

В настоящем обзоре мы рассмотрим два метода, позволяющие изучить взаимодействия белок-ДНК непосредственно в клетке: иммунопреципитацию хроматина (Chromatin immunoprecipitation, ChIP) и иммунорасщепление хроматина (Chromatin immunocleavage, ChIC). В заключительной части обзора будут приведены примеры практического применения рассмотренных методик в фундаментальной и клинической иммунологии.

Иммунопреципитация хроматина (Chromatin immunoprecipitation, ChIP)

С технической точки зрения ChIP представляет собой вариант метода иммунопреципитации, в котором антитела к интересующему белку используются для осаждения (выделения) комплексов данного белка с геномной ДНК. Основными задачами ChIP являются: 1) определение участков генома, содержащих модифицированные гистоны ("эпигенетические метки"); 2) определение участков генома, с которыми связаны факультативные компоненты хроматина (факторы транскрипции, РНК-полимеразы и т.д.). В зависимости от выбранного метода анализа иммунопреципитированной ДНК можно либо оценить изменения белкового состава хроматина в заранее заданных участках генома, либо проанализировать распределение этих изменений глобально в геноме.

Метод ChIP был впервые применен D.S. Gilmour и J.T. Lis для исследования ассоциации РНК-полимеразы II с активно транскрибируемыми и с неактивными генами у кишечной палочки (Escherichia coli) [12]. Белки фиксировали к ДНК при помощи ультрафиолетового излучения, позже M.J. Solomon и A. Varshavsky предложили использовать формальдегид для сшивания белков и ДНК [13]. Долгое время методом идентификации иммунопреципитированных фрагментов ДНК служила полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако в 2004 г. был предложен метод ChIP-сhip [14], а затем в 2007 г. G. Robertson и соавт. впервые использовали метод ChIP в сочетании с секвенированием (ChIP-seq) для изучения последовательностей ДНК, связывающих транскрипционные факторы, в клетках млекопитающих HeLa S3 [15]. В настоящее время ChIP широко применяется в различных областях биологии.

Общая схема метода приведена на рис. 1. Материалом для ChIP могут служить как клетки, так и образцы тканей [16]. В классических вариантах для постановки одной реакции ChIP требуется довольно большое количество исходного материала: 5 - 107 культивированных клеток или эквивалент одной четверти печени взрослой мыши [17]. Однако существуют модификации метода, позволяющие работать с гораздо меньшим количеством клеток - тысячами и даже сотнями [18, 19].

Пробоподготовка для ChIP включает формирование ковалентных сшивок между белками и ДНК (опционально), лизис клеток и фрагментирование хроматина. Если целевой белок относительно непрочно связан с ДНК (например, фактор транскрипции), для образования ковалентных сшивок ДНК-белок применяют фиксацию клеток 1 % раствором формальдегида (ChIP с поперечным связыванием или X-ChIP). Если количество целевого белка в образце невелико или если он связан с ДНК не напрямую, а через другой белок, перед фиксацией формальдегидом проводят дополнительную процедуру сшивания белков с белками с использованием дисукцинимидилглутарата [17, 20].

Метод химической фиксации имеет ряд недостатков: 1) фиксация может нарушать конформацию эпитопов, к которым направлены преципитирующие антитела; 2) фиксация может создавать артефакты вследствие "пришивания" к ДНК тех белков, которые в живой клетке не были связаны либо вообще с ДНК, либо с ее конкретными участками; 3) фиксация делает цитоплазматическую мембрану устойчивой к действию детергентов, что затрудняет последующий лизис клеток [21]. В качестве альтернативы формальдегиду для создания сшивок белок-ДНК может использоваться обработка ультрафиолетом [22], что позволяет избежать некоторых из перечисленных выше проблем. Если же целевые белки естественным образом прочно связаны с ДНК (например, гистоны), этап фиксации можно опустить. В этом случае говорят о "нативном ChIP" (native ChIP, N-ChIP).

Далее цитоплазматическую мембрану лизируют в присутствии ингибиторов протеаз для удаления неядерного материала, оставляя только содержимое ядра для ChIP. Поскольку ДНК является протяженной молекулой, для точного определения места связывания целевого белка с молекулой ДНК необходима фрагментация хроматина. Эти фрагменты должны быть достаточно малы, чтобы обеспечить приемлемую разрешающую способность метода, но достаточно велики, чтобы не нарушить связи целевого белка с ДНК.

Фрагментацию хроматина проводят с помощью воздействия ультразвука или микрококковой нуклеазы [23, 24]. Настройки ультразвуковой обработки хроматина должны быть определены заранее в зависимости от используемого оборудования и материала. Следует стремиться к тому, чтобы большинство фрагментов хроматина, возникающих в результате обработки ультразвуком, имели размер от 200 до 400 пар нуклеотидов [17]. Микрококковая нуклеаза при определенных условиях приводит к расщеплению хроматина между нуклеосомами до дискретных фрагментов постоянной длины ~ 200 п.н. [23]. Высокомолекулярный нефрагментированный хроматин и клеточный дебрис осаждают центрифугированием, тогда как фрагментированный хроматин остается в растворе. После этого часть фрагментированного хроматина отбирают и выделяют из нее ДНК. Эта проба служит "входящим" образцом (input), а также используется для верификации размера фрагментов ДНК с помощью электрофореза [17].

Как и во всех экспериментах по иммунопреципитации, для успешного проведения ChIP требуются подходящие антитела. Многие коммерческие производители выпускают антитела, уже валидированные для ChIP, либо исследователи проводят валидацию самостоятельно. Пригодность конкретного антитела для ChIP предугадать нельзя. Теоретически эти антитела должны распознавать нативные эпитопы целевого белка, причем такие, которые при нахождении этого белка в составе хроматина не замаскированы взаимодействиями с ДНК или с другими белками. После связывания антител с целевым белком образец инкубируют с суперпарамагнитными частицами или частицами агарозы, покрытыми белком A/G (генно-инженерный аналог белков A и G стафилококкового происхождения). Последний образует высокоаффинные связи с Fc-фрагментами большинства изотипов антител, используемых для ChIP. Комплексы "белок-ДНК", связанные с частицами, осаждают с помощью сильного магнита или центрифугирования, разрывают ковалентные связи между белками и ДНК путем гидролиза при слабощелочном pH, белки разрушают обработкой протеиназой K, после чего из образцов выделяют ДНК любым приемлемым способом [17].

В эксперимент включают также положительный контроль: ChIP с антителом к высокопредставленному белку или эпитопу, например к гистону H3, триметилированному по остатку лизина-4 (H3K4me3) или лизина-27 (H3K27me3) [25]; а также отрицательный изотипический контроль (ChIP с антителом того же изотипа, что и специфическое антитело, но не имеющим мишеней у данного биологического вида).

Существуют разные варианты ChIP, адаптированные под задачи конкретных экспериментов (табл. 1). По способу анализа иммунопреципитированных фрагментов ДНК выделяют ChIP-qPCR, ChIP-chip и ChIP-seq (см. табл. 1, рис. 1). Если геномные сайты связывания исследуемых белков заранее известны, можно разработать праймеры для количественной ПЦР в реальном времени (Quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR), таргетирующие именно данный участок геномной ДНК. Также подбирают праймеры к контрольной последовательности ДНК из той же области генома, но заведомо не связанной с данным белком. Выделенные с помощью ChIP фрагменты ДНК амплифицируют с подобранными праймерами.

Содержание целевого и контрольного фрагментов ДНК в иммунопреципитате и во входящей фракции оценивают по числу пороговых циклов (Ct), рассчитывают отношение содержания фрагментов в иммунопреципитате и во входящей фракции (в процентах). Степень связанности целевого белка с целевым фрагментом ДНК оценивают по обогащению (увеличению относительного содержания) целевого фрагмента по сравнению с контрольным в иммунопреципитате. Метод qPCR можно использовать и в тех случаях, когда сайты связывания заранее не известны, но имеются кандидатные гены-мишени: в этом случае можно создавать праймеры для количественной ПЦР, равномерно покрывающие предполагаемые регуляторные области, такие как промоторы и консервативные некодирующие последовательности. Преимущества ПЦР в реальном времени - сравнительная доступность и низкая стоимость эксперимента [26].

Если кандидатные гены-мишени или потенциальные сайты связывания недоступны, вместо ChIP-qPCR следует рассмотреть ChIP on сhip (ChIP-chip) или ChIP-sequencing (ChIP-seq). Суть метода ChIP-chip состоит в гибридизации выделенных методом ChIP образцов ДНК с микрочипами (chips), на поверхность которых нанесены олигодезоксинуклеотидные зонды, комплементарные геномным последовательностям. Длина зондов варьирует от 25 до > 200 нуклеотидов, в зависимости от типа микрочипа. Для увеличения количества ДНК, выделенной в результате ChIP, ее предварительно амплифицируют с праймерами, содержащими случайную пентануклеотидную последовательность [14].

Амплифицированную ДНК метят флуоресцентной меткой [27] и гибридизируют с зондами на чипе. Чтобы обеспечить всесторонний и непредвзятый обзор взаимодействий белок-ДНК, микрочипы для ChIP должны содержать зонды, которые представляют весь геном, причем для каждого исследуемого организма требуются видоспецифичные конструкции микрочипов [27]. Информативность ChIP при данном виде анализа результатов будет ограничена информативностью микрочипов. Наиболее информативны микрочипы, в которых олигонуклеотидные зонды равномерно покрывают весь геном, в идеале - с частичным перекрытием между зондами ("черепичные" микрочипы, или tiling arrays).

ChIP-seq - это сочетание ChIP с высокопроизводительным секвенированием, или секвенированием следующего поколения (next generation sequencing, NGS). Из-за своего размера геномы высших эукариот представляют собой проблему для проектирования микрочипов, которые охватывали бы весь геном. Метод NGS теоретически позволяет выявить все участки геномной ДНК, взаимодействующие с данным белком, и зависит только от выравнивания обнаруженных в образце фрагментов ДНК на интересующий эталонный геном (т. е. от правильного определения геномных координат фрагментов). Для проведения ChIP-seq фрагменты ДНК, выделенные с помощью ChIP, преобразуют в библиотеку, пригодную для высокопроизводительного секвенирования [17, 28]. Предпочтительнее двустороннее секвенирование, позволяющее определить геномные координаты обоих концов фрагментов. При анализе крупных геномов, таких как геном человека, для получения репрезентативных результатов необходимо секвенировать не менее 30 млн уникальных фрагментов на образец [29]. Результаты ChIP-seq обычно представляют в виде гистограмм, на которых по оси абсцисс откладывают порядковый номер нуклеотида на хромосоме, а по оси ординат - число выявлений данного нуклеотида (в составе фрагментов ДНК) в данном образце. На таких гистограммах образуются "пики", соответствующие сайтам накопления данного белка или белковой модификации (см. рис. 1). Разработаны многочисленные компьютерные программы, позволяющие отфильтровать "шум" (неспецифическую преципитацию фрагментов хроматина), идентифицировать пики в соответствии с заданными критериями, определить их геномные координаты и другие характеристики. ChIP-seq обеспечивает более высокое разрешение, чувствительность и специфичность по сравнению с ChIP-chip, преодолевает некоторые ограничения, присущие анализу на микрочипах. Так, ChIP-seq позволяет выявить события, расположенные в повторяющихся областях генома млекопитающих [30], а также в областях генома, не покрываемых микрочипами. ChIP-seq в меньшей степени страдает от ложных или неточных сигналов, возникающих при проведении анализа на микрочипах в результате кросс-гибридизации, что позволяет достичь более точных количественных результатов [28].

Иммунорасщепление хроматина (Chromatin ImmunoCleavage, ChIC)

Метод ChIC и его более новая версия Cut-and-Run (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease) являются элегантной альтернативой ChIP, позволяющей решать те же задачи и обладающей рядом преимуществ. Метод ChIC был впервые предложен в 2004 г. [35]. Принципиальное отличие ChIC от ChIP состоит в том, что антитела, специфичные к целевому белку, служат "якорями" для связывания белка слияния, образованного путем объединения белка A/G и микрококковой нуклеазы. В этой системе белок A/G направляет нуклеазу в участки генома, связанные с антителами, где нуклеаза вырезает из нерастворимого хроматина сравнительно короткие растворимые фрагменты, содержащие целевой белок и связанные с ним участки геномной ДНК (рис. 2). Метод Cut-and-Run предложен сравнительно недавно и представляет собой вариант метода ChIC в комплексе с NGS [36]. Таким образом, ChIC и Cut-and-Run соотносятся так же, как ChIP и ChIP-seq.

Исходным материалом для ChIC/Cut-and-Run могут служить как цельные клетки, так и выделенные ядра. Данные методы дают возможность избежать фиксации материала, что позволяет избавиться от артефактов, сопровождающих фиксацию [37]. В некоторых модификациях метода клетки или ядра прикрепляют к магнитным частицам, покрытым конканавалином А [36], для облегчения отмывок и уменьшения потерь клеток при их малом исходном количестве. Однако этот шаг, способный вызвать активацию клеток, можно опустить и использовать для отмывок центрифугирование. Далее, если используются цельные клетки, их обрабатывают дигитонином, который пермеабилизирует цитоплазматическую мембрану путем вымывания холестерина. Поскольку ядерная мембрана содержит значительно меньшее количество холестерина, она остается интактной [38]. В отличие от ChIP, ультразвуковая фрагментация хроматина не проводится. Затем клетки или ядра инкубируют с антителами к целевому белку, причем антитела проникают в ядра через естественные ядерные поры. Специфичность последующего разрезания ДНК в областях нахождения целевого белка и связавшихся с ним антител обеспечивается за счет слитой конструкции белка A/G с микрококковой нуклеазой. За узнавание мест связывания антител, как отмечено ранее, в данной конструкции отвечает белок А/G, тогда как микрококковая нуклеаза вносит двуцепочечные разрывы ДНК по обе стороны от сайта связывания антител (см. рис. 2). Активация микрококковой нуклеазы происходит при добавлении хлорида кальция; реакцию проводят при 0 °С для предотвращения деградации фрагментов ДНК и неспецифического разрезания ДНК в участках, не связанных с антителами. Нуклеазную реакцию останавливают путем хелатирования ионов Ca2+. Высвобожденные фрагменты хроматина диффундируют через ядерные поры в буферный раствор. Их очищают и секвенируют с помощью NGS. Представление результатов - такое же, как при ChIP-seq.

Одним из главных преимуществ ChIC/Cut-and-Run по сравнению с ChIP является отсутствие необходимости в фиксации клеток и ультразвуковой обработке хроматина - этапов, дающих наибольшее число артефактов. Существенной проблемой ChIP является неспецифическая преципитация фрагментов хроматина ("шум"), от чего не удается избавиться даже путем строгой оптимизации протоколов и большого числа отмывок. Высокий уровень "шума" заставляет увеличивать глубину секвенирования: для получения информативных результатов в ChIP-seq необходимо не менее 30 млн прочтений на образец [29]. ChIC/Cut-and-Run не требует полной фрагментации хроматина. Благодаря целенаправленному разрезанию ДНК вблизи сайтов связывания интересующих белков, продукт реакции ChIC/Cut-and-Run гораздо сильнее обогащен "нужными" фрагментами ДНК, чем продукт ChIP. Уменьшение уровня "шума" повышает специфичность, чувствительность и разрешение метода по сравнению с ChIP, а также делает возможным уменьшение глубины секвенирования до 3-8 млн прочтений на образец [39], что снижает стоимость анализа. Высокая чувствительность ChIC/Cut-and-Run позволяет исследовать малочисленные клеточные популяции: от 100 клеток для изучения модификаций гистонов, от 1000 - для исследования транскрипционных факторов.

Одним из недостатков методов ChIC/Cut-and-Run является возможность неспецифического разрезания ДНК микрококковой нуклеазой. Эту проблему решают путем использования минимальных количеств белка слияния A/G-нуклеазы, минимизацией и строгим контролем времени инкубации с активным ферментом (для быстрого управления активностью нуклеазы используют внесение/хелатирование ионов Ca2+), оптимизацией температурных условий. Ассортимент валидированных антител для ChIC/Cut-and-Run, предлагаемых коммерческими производителями, на сегодня довольно невелик и в основном представлен антителами к модифицированным гистонам, однако постоянно расширяется. Более фундаментальным недостатком ChIC/Cut-and-Run может быть зависимость эффективности нуклеазной реакции от степени упаковки хроматина вблизи сайтов связывания целевого белка; эта проблема детально не исследована.

Интеграция методов ChIP и ChIC с другими методами анализа генома и транскриптома

Интеграция результатов различных методов позволяет лучше понять природу исследуемых процессов. В идеале результаты ChIP и ChIC должны быть дополнены результатами других методов, позволяющих оценить в том числе функциональную значимость выявленных изменений белкового состава хроматина. Так, несколько методов позволяют непосредственно оценить транскрипционную активность генов [40]. Одним из них является анализ "нарождающихся" транскриптов, связанных с хроматином и представляющих собой пре-мРНК на различных этапах элонгации и сплайсинга. Важную функциональную информацию несет и анализ транскриптома, который представлен зрелыми цитоплазматическими мРНК, хотя их уровни, в отличие от уровней хроматин-ассоциированной пре-мРНК, зависят не только от собственно транскрипции, но также от показателей сплайсинга и стабильности мРНК. Для исследования хроматин-ассоциированной пре-мРНК и зрелой мРНК в масштабе всего генома применяют технологию RNA-seq [41].

В качестве примера интеграции результатов ChIP-seq и RNA-seq приведем работу M. Krosel и соавт., в которой исследовали связь между привлечением гистоновой ацетилтрансферазы p300 в регуляторные участки генов и активацией транскрипции генов воспалительного ответа в синовиальных фибробластах человека [42]. p300 ацетилирует гистон H3 по остатку лизина-27 (H3K27ac), что приводит к активации транскрипции. Участки генома, содержащие данную модификацию гистона H3, определяли с помощью ChIP-seq. Чтобы идентифицировать гены, для экспрессии которых требуется именно p300 (у человека имеется более 10 других гистоновых ацетилтрансфераз), экспрессию p300 подавляли с помощью миРНК, после чего с помощью полнотранскриптомного анализа (RNA-seq) определяли гены, экспрессия которых понизилась. При сопоставлении результатов двух методов было обнаружено, что в регуляторных участках почти всех генов-мишеней p300, выявленных с помощью RNA-seq, имеются пики H3K27ac, выявленные с помощью ChIP-seq. Однако эти пики находились преимущественно на расстоянии > 50 000 пар нуклеотидов от сайтов старта транскрипции генов. Эти данные показывают, что гистоновая ацетилтрансфераза p300 регулирует транскрипцию генов путем взаимодействия с удаленными энхансерами [42]. К сожалению, p300 активирует экспрессию как про-, так и противовоспалительных генов, в связи с чем ингибиторы этого фермента не являются хорошими кандидатами на роль противовоспалительных препаратов [42].

Интегративные геномные данные по различным типам клеток, полученные в том числе с помощью ChIP, представлены на интернет-ресурсах, например в геномном браузере Калифорнийского университета (Санта-Круз) (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway).

Роль методов ChIP и ChIC в фундаментальных иммунологических исследованиях

Фундаментальные иммунологические исследования, выполненные с применением ChIP (и гораздо реже с применением ChIC/Cut-and-Run), можно условно разделить на две группы: 1) исследования дифференцировки клеток иммунной системы; 2) исследования активации клеток иммунной системы и формирования иммунологической памяти. Ниже мы приведем несколько примеров таких исследований.

Исследование дифференцировки клеток иммунной системы. Метод ChIP позволил определить геномные мишени факторов транскрипции, контролирующих дифференцировку различных типов клеток иммунной системы. Такие факторы транскрипции обычно связываются с энхансерами генов, экспрессируемых в данном типе клеток. Так, в работе J.M. Felton и соавт. методом ChIP-seq было исследовано связывание транскрипционных факторов PU.1 (Spi1), а также членов семейств AP-1, KLF, STAT, SMAD и GATA с энхансерами генов в зрелых эозинофилах мыши [7]. Сами энхансеры определяли с помощью ChIP-seq как участки генома, обогащенные эпигенетической меткой H3K27ac, находящиеся на расстоянии 1-20 000 пар нуклеотидов от активно транскрибируемых генов (эти гены, в свою очередь, выявляли с помощью RNA-seq). Обнаружено связывание транскрипционного фактора PU.1 с энхансерами генов, характеризующихся высокой экспрессией в эозинофилах. Эти гены участвуют в миграции, пролиферации, дегрануляции и выживании эозинофилов. Гомологи некоторых из этих генов у человека ассоциированы с риском эозинофилии и аллергических заболеваний [7]. Полученные данные иллюстрируют ключевую роль и механизм действия PU.1 в дифференцировке эозинофилов.

Одним из негативных регуляторов дифференцировки миелоидных клеток является длинная некодирующая РНК HOTAIRM1. Анализ с помощью ChIP-seq показал, что при дифференцировке моноцитов человека в дендритные клетки происходит накопление ингибиторной модификации гистона H3 (триметилирование по лизину-27, или H3K27me3) в промоторе гена HOTAIRM1. Это приводит к подавлению экспрессии РНК HOTAIRM1, что устраняет препятствие на пути дифференцировки моноцитов в дендритные клетки [43].

Ключевым регулятором дифференцировки регуляторных Т-клеток (Treg) является фактор транскрипции FoxP3. С помощью метода ChIP-on-chip были идентифицированы мишени FoxP3 в регуляторных Т-клетках мыши при их поликлональной активации форбол-12-миристат-13-ацетатом [44]. Обнаружено, что FoxP3 связывается с промоторами генов, кодирующих хорошо охарактеризованные регуляторы активации Т-клеток, а также генов, вовлеченных в патогенез аутоиммунных заболеваний, таких как PTPN22 (ассоциирован с диабетом 1 типа, ревматоидным артритом, системной красной волчанкой, болезнью Грейвса) [44]. При этом было показано, что один из основных механизмов действия FoxP3 состоит в подавлении экспрессии генов-мишеней, необходимых для активации Т-клеток [44].

Путем интеграции данных RNA-seq, секвенирования хроматин-ассоциированной РНК и ChIP-seq была создана карта промоторов и энхансеров, контролирующих экспрессию мкРНК в 63 типах клеток иммунной системы мыши [45]. Как упоминалось выше, мкРНК играют важнейшую роль в эпигенетической регуляции дифференцировки и активации клеток.

Исследование активации клеток иммунной системы и формирования иммунологической памяти. Метод ChIP дает возможность оценить связывание факторов транскрипции и динамику эпигенетических модификаций гистонов в процессе активации клеток врожденного и адаптивного иммунитета, выявлять новые механизмы регуляции экспрессии генов. Так, ChIP позволил ответить на вопрос, почему экспрессия ряда генов в макрофагах, стимулированных липополисахаридом (ЛПС), возрастает уже в течение нескольких минут после воздействия активационного сигнала на клетку. К числу таких генов, называемых первичными, относится, например, TNF. Используя ChIP-qPCR с антителами к РНК-полимеразе II и ее фосфоформам, D.C. Hargreaves и соавт. показали, что в первичных генах РНК-полимеразный комплекс находится в собранном виде уже в нестимулированных клетках, причем РНК-полимераза синтезирует короткий 5′-фрагмент мРНК, после чего "замирает". При активации клетки РНК-полимераза, связанная с первичными генами, реактивируется в течение нескольких минут в результате фосфорилирования остатков серина в регуляторном домене [46].

Метод ChIP-seq сыграл ключевую роль в раскрытии механизмов праймирующего действия интерферона-γ (ИФН-γ) на экспрессию провоспалительных генов в макрофагах человека при последующей стимуляции ЛПС [47]. Было показано, что факторы транскрипции STAT1 и IRF1, опосредующие биологические эффекты ИФН-γ, имеют ранее не известные сайты связывания в промоторах и энхансерах провоспалительных генов. STAT1 и IRF1 сами по себе не индуцируют экспрессию этих генов, но вызывают гиперацетилирование гистонов в промоторах и энхансерах, что увеличивает доступность ДНК в этих регуляторных элементах и значительно облегчает связывание тех факторов транскрипции, которые приходят в ядро после стимуляции ЛПС. В свою очередь, это приводит к значительному усилению образования комплексов инициации транскрипции, содержащих РНК-полимеразу II, и к увеличению транскрипции ключевых провоспалительных генов, таких как TNF, IL6 и IL12B, при стимуляции ЛПС [47].

В течение нескольких часов после стимуляции ЛПС и агонистами других паттерн-распознающих рецепторов макрофаги входят в состояние толерантности, которое заключается в отсутствии экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов в ответ на повторное воздействие того же агониста, что сопровождается утратой активационных модификаций гистонов в промоторах и энхансерах соответствующих генов [48]. S. Foster и соавт. показали, что не все гены ведут себя подобным образом: некоторые из них, названные "нетолеризуемыми", отвечают на повторную стимуляцию так же или сильнее, чем на первичную [49]. При исследовании ЛПС-толеризованных макрофагов с помощью ChIP-qPCR было показано, что промоторы нетолеризуемых генов сохраняют активированное состояние (содержат ацетилированные гистоны), благодаря чему эти гены сохраняют способность отвечать на повторную стимуляцию, тогда как в промоторах толеризуемых генов активационные модификации гистонов утрачиваются. Таким образом, ЛПС-толерантность представляет собой не отсутствие реактивности, а состояние измененной реактивности макрофагов.

Клетки врожденного иммунитета способны к формированию особого вида иммунологической памяти, которая основана на длительно сохраняющихся эпигенетических изменениях (эпигенетическом репрограммировании) клеток после воздействия микроорганизмов или агонистов паттерн-распознающих рецепторов. В отличие толерантности, оцениваемой обычно через 24 ч после первичной стимуляции, в случае врожденной иммунологической памяти речь идет об эффектах, сохраняющихся в течение дней и месяцев. Так, после иммунизации SCID-мышей вакциной БЦЖ формируется довольно длительная антиген-неспецифическая защита против неродственного грибкового патогена [9]. Этот эффект получил название "тренированного иммунитета" (trained immunity) [9]. При исследовании моноцитов здоровых доноров, вакцинированных БЦЖ, с помощью ChIP-qPCR были выявлены длительно сохраняющиеся активационные модификации гистонов (H3K4me3, H3K27ac) в промоторах генов провоспалительных цитокинов (TNF, IL1B, IFNG). Моноциты этих доноров в течение нескольких месяцев после вакцинации БЦЖ характеризуются повышенной (по сравнению со значениями до вакцинации) выработкой ФНО и ИЛ-1β в ответ на стимуляцию ЛПС [9]. Предполагается, что "тренированный иммунитет" может лежать в основе неспецифического иммуностимулирующего действия живых вакцин, а также вносить вклад в патогенез различных острых и хронических воспалительных заболеваний [9].

Эпигенетические механизмы обеспечивают дифференцировку Т-хелперов после их активации антигеном. В пионерской работе M. Messi и соавт. [8], выполненной с помощью ChIP-PCR с детекцией результатов ПЦР по конечной точке, было показано, что в ходе дифференцировки наивных CD4+-Т-клеток в Th1-клетки in vitro происходит гиперацетилирование гистонов в промоторе гена IFNG и деацетилирование гистонов в промоторе гена IL4, тогда как в дифференцирующихся Th2-клетках наблюдается обратная картина. Аналогичные изменения имеют место в Th1- и Th2-клетках памяти in vivo. В центральных Т-клетках памяти, которые не вырабатывают ни ИФН-γ, ни ИЛ-4, деацетилированы гистоны в промоторах обоих генов. В дальнейшем схожие эпигенетические закономерности были выявлены и в других разновидностях Т-хелперов [50]. Важно, что эпигенетические изменения, приобретаемые Т-хелперами в ходе дифференцировки, относительно нестойки и могут быть перепрограммированы [8], что открывает возможности для лечения иммунопатологий, связанных с избыточной активацией той или иной субпопуляции Т-хелперов [50].

Переключение классов иммуноглобулинов - важный этап антиген-зависимой дифференцировки B-клеток. В частности, основную роль в переключении на продукцию IgE играет фактор транскрипции STAT6, который связывается с интронным промотором гена ε-цепи (Iε) и инициирует транскрипцию этого гена. Методом ChIP-qPCR было показано, что белок SWAP-70, участвующий в регуляции перестройки актина, играет также роль кофактора в переключении на продукцию IgE. SWAP-70 связывается с Iε и способствует связыванию STAT6 с этим промотором, а также препятствует связыванию Bcl6, являющегося антагонистом STAT6 [51].

Непрямым негативным регулятором переключения на IgE является фактор транскрипции STAT3. Известно, что мутации в гене STAT3 связаны с возникновением аутосомно-доминантного гипер-IgE-синдрома, характеризующегося повышенным уровнем IgE в сыворотке. P. Dascani и соавт., используя ChIP-seq с антителами к STAT3, показали, что STAT3 контролирует переключение продукции иммуноглобулинов на IgE путем связывания с промотором и активации экспрессии гена BCL6 [52].

Примером использования метода Cut-and-Run в иммунологических исследованиях является работа B.R. Ford и соавт. [53], в которой профилировали ландшафт модификаций гистонов в CD8+-Т-клетках, инфильтрирующих опухоль, чтобы выявить причину нарушения активации этих клеток. Было обнаружено, что в терминально истощенных опухоль-инфильтрирующих Т-клетках наличие активных энхансеров не коррелирует с низкой экспрессией соответствующих генов. Многие энхансеры содержали так называемые бивалентно модифицированные гистоны: сочетание активационных (H3K4me3) и ингибиторных (H3K27me3) модификаций, что способствовало снижению транскрипционного потенциала. Экспрессия генов и функциональные свойства истощенных Т-клеток восстанавливались при воздействии костимуляторных сигналов, а также в результате трансгенной экспрессии гистоновой деметилазы Kdm6b [53].

Использование ChIP и ChIC в клинико-ориентированных исследованиях

Успехи использования ChIP и ChIC в фундаментальных иммунологических исследованиях способствовали внедрению этих методов в клинико-ориентированные исследования. Целями таких работ являются, в частности: 1) изучение роли модификаций гистонов и факторов транскрипции в патогенезе конкретных заболеваний, связанных с дисфункцией иммунной системы, таких как бронхиальная астма [52, 54], инфекционные заболевания [55], аутоиммунные заболевания [56]; 2) поиск эпигенетических маркеров предрасположенности к таким заболеваниям [57]; 3) поиск новых способов лечения, основанных на управлении активностью сигнальных путей, промоторов и энхансеров генов в клетках иммунной системы.

Исследование патогенетических механизмов заболеваний. Бронхиальная астма - это социально значимое заболевание, от которого страдает 5-15 % населения в различных странах, поэтому предпринимаются интенсивные усилия по модулированию молекулярных путей, лежащих в основе патогенеза астмы. Одним из примеров использования ChIP для изучения патогенеза бронхиальной астмы является работа [58], где исследовали механизм действия твердых частиц размером ≤ 2,5 мкм (PM2,5), доказанного провоцирующего фактора обострений астмы. PM2,5 активируют рецептор ароматических углеводородов (AhR), который, как рецепторы к стероидным гормонам или витамину D, непосредственно связывается с ДНК и выступает в роли фактора транскрипции. С помощью ChIP-qPCR было показано, что AhR в Т-клетках мыши связывается с последовательностями XRE-2 и XRE-3 (xenobiotic response elements) в промоторе гена глутамат-оксалоацетат-трансаминазы 1 (Got1). AhR-индуцированное повышение экспрессии Got1 вызывает ряд событий, которые приводят к гиперметилированию ДНК в промоторе гена Foxp3, что способствует ингибированию дифференцировки Treg и сдвигу дифференцировки в сторону Th17. Эти изменения объясняют утяжеление экспериментальной аллерген-индуцированной астмы, наблюдаемое при ингаляции PM2,5. Ингибитор GOT1, разрывая данный патогенетический путь, отменяет негативный эффект PM2,5 на течение экспериментальной астмы [58].

Как было отмечено выше, STAT3 может действовать как негативный регулятор выработки IgE [52]. Однако роль STAT3 в формировании аллергического воспаления не сводится только к контролю продукции IgE. При аллергическом воспалении в легких происходит транслокация STAT3 в митохондрии, где он способствует генерации S-аденозилметионина - мощного донора метильных групп для метилирования ДНК и гистонов. ChIP-qPCR показал, что S-аденозилметионин поддерживает экспрессию ИЛ-5 и ИЛ-13 врожденными лимфоидными клетками 2-го типа за счет увеличения триметилирования гистонов H3K4 в промоторах генов IL5 и IL13. Дефицит STAT3, ингибирование митохондриальной транслокации STAT3 или блокада метаболизма метионина снижали продукцию цитокинов 2-го типа, что приводило к заметному уменьшению аллергического воспаления в легких [54].

Сепсис - опасное для жизни состояние, возникающее вследствие чрезмерной активации клеток врожденного иммунитета в ответ на инфекцию. Первая стадия сепсиса характеризуется системным воспалением, приводящим к повреждению органов и полиорганной недостаточности. Эта стадия сменяется стадией иммунного паралича, для которой характерно ингибирование функций клеток иммунной системы и вследствие этого - снижение резистентности к оппортунистическим инфекциям. J. Niu и соавт. проанализировали транскриптомы (RNA-seq) клеток крови пациентов с сепсисом и здоровых доноров [55]. Были выделены 3 ключевых гена (TLR8, KRAS и PPP3CA), увеличение экспрессии которых коррелировало с тяжестью течения сепсиса. Путем анализа данных ChIP-seq был определен фактор транскрипции VEZF1 (Vascular endothelial zinc finger 1), который может повышать экспрессию всех трех перечисленных генов [55].

Стадия иммунного паралича при сепсисе схожа с состоянием толерантности, наблюдаемым in vitro, о чем свидетельствует накопление репрессивных эпигенетических меток в промоторах генов иммунного ответа, выявляемое путем анализа метилирования ДНК (бисульфитное секвенирование) и модификаций гистонов (ChIP) как в экспериментальных моделях сепсиса, так и у пациентов с сепсисом [59]. Преодолеть состояние иммунного паралича in vitro и in vivo позволяет ИФН-γ: данные ChIP показывают, что ИФН-γ препятствует переходу промоторов в неактивное состояние, способствует привлечению факторов транскрипции и РНК-полимеразы в промоторы [60].

Поиск эпигенетических маркеров заболеваний. Большое количество работ посвящено поиску эпигенетических маркеров предрасположенности к различным иммуноопосредованным заболеваниям. Набирают популярность полноэпигеномные ассоциативные исследования [57, 61]. Среди эпигенетических маркеров в полноэпигеномных исследованиях изучают прежде всего метилирование ДНК, что обусловлено более простой пробоподготовкой и меньшей стоимостью анализа. Однако в перспективе метод ChIP-seq способен сыграть здесь не менее важную роль, позволяя исследовать один из основных типов эпигенетических маркеров - посттрансляционные модификации гистонов.

Поиск новых лекарственных препаратов. Поскольку ChIP позволяет оценить конечную стадию активации сигнальных путей - связывание факторов транскрипции с ДНК, этот метод применяется для подтверждения эффективности кандидатных лекарственных препаратов - активаторов или ингибиторов сигнальных путей в клетках иммунной системы [62]. Большое внимание в качестве модуляторов иммунного ответа привлекают специфические ингибиторы факторов транскрипции [63] и ферментов - модификаторов хроматина [64]. ChIP является одним из методов изучения механизмов действия этих препаратов [64].

Заключение

Таким образом, ChIP и в меньшей степени ChIC, несмотря на определенную техническую сложность, занимают важное место среди методов исследования в иммунологии. Технологические достижения последних лет, в первую очередь появление NGS, резко повысило информативность этих методов. Различные модификации ChIP и ChIC позволяют решать широкий круг задач, включая исследование механизмов дифференцировки и активации клеток иммунной системы, поиск новых патогенетических механизмов, разработку новых способов лечения иммуноопосредованных заболеваний.

Литература/References

1. Morrison A.J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Mol. Metab. 2020; 38 100973. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molmet.2020.100973 PMID: 32251664

2. Wang J., Zhuang J., Iyer S., et al. Sequence features and chromatin structure around the genomic regions bound by 119 human transcription factors. Genome Res. 2012; 22 (9): 1798-1812. DOI: https://doi.org/10.1101/gr.139105.112 PMID: 22955990

3. Glass C.K., Natoli G. Molecular control of activation and priming in macrophages. Nat. Immunol. 2016; 17 (1): 26-33. DOI: https://doi.org/10.1038/ni.3306 PMID: 26681459

4. Fenley A.T., Anandakrishnan R., Kidane Y.H., et al. Modulation of nucleosomal DNA accessibility via charge-altering post-translational modifications in histone core. Epigenetics and Chromatin. 2018; 11 (1): 11. DOI: https://doi.org/10.1186/s13072-018-0181-5 PMID: 29548294

5. Kouzarides T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 2007; 128 (4): 693-705. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2007.02.005 PMID: 17320507

6. Devenish L.P., Mhlanga M.M., Negishi Y. Immune Regulation in Time and Space: The Role of Local- and Long-Range Genomic Interactions in Regulating Immune Responses. Front. Immunol. 2021; 12 DOI: https://doi.org/10.3389/FIMMU.2021.662565 PMID: 34046034

7. Felton J.M., Vallabh S., Parameswaran S., et al. Epigenetic Analysis of the Chromatin Landscape Identifies a Repertoire of Murine Eosinophil-Specific PU.1-Bound Enhancers. J. Immunol. 2021; 207 (4): 1044-1054. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.2000207 PMID: 34330753

8. Messi M., Giacchetto I., Nagata K., et al. Memory and flexibility of cytokine gene expression as separable properties of human T(H)1 and T(H)2 lymphocytes. Nat. Immunol. 2003; 4 (1): 78-86. DOI: https://doi.org/10.1038/ni872 PMID: 12447360

9. Kleinnijenhuis J., Quintin J., Preijers F., et al. Bacille Calmette-Guérin induces NOD2-dependent nonspecific protection from reinfection via epigenetic reprogramming of monocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012; 109 (43): 17537-17542. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1202870109 PMID: 22988082

10. Javierre B.M., Fernandez A.F., Richter J., et al. Changes in the pattern of DNA methylation associate with twin discordance in systemic lupus erythematosus. Genome Res. 2010; 20 (2): 170-179. DOI: https://doi.org/10.1101/gr.100289.109 PMID: 20028698

11. Lisi S., Trovato M., Vitaloni O., et al. Acetylation-Specific Interference by Anti-Histone H3K9ac Intrabody Results in Precise Modulation of Gene Expression. Int. J. Mol. Sci. 2022; 23 (16): 8892. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms23168892 PMID: 36012156

12. Gilmour D.S., Lis J.T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc. Natl. Acad. Sci. 1984; 81 (14): 4275-4279. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.81.14.4275 PMID: 6379641

13. Solomon M.J., Larsen P.L., Varshavsky A. Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene. Cell. 1988; 53 (6): 937-947. DOI: https://doi.org/10.1016/s0092-8674(88)90469-2 PMID: 2454748

14. Buck M.J., Lieb J.D. ChIP-chip: considerations for the design, analysis, and application of genome-wide chromatin immunoprecipitation experiments. Genomics. 2004; 83 (3): 349-360. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2003.11.004 PMID: 14986705

15. Robertson G., Hirst M., Bainbridge M., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nat. Methods. 2007; 4 (8): 651-657. DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth1068

16. Pedre X., Mastronardi F., Bruck W., et al. Changed histone acetylation patterns in normal-appearing white matter and early multiple sclerosis lesions. J. Neurosci. 2011; 31 (9): 3435-3445. DOI: https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.4507-10.2011 PMID: 21368055

17. Schmidt D., Wilson M.D., Spyrou C., et al. ChIP-seq: using high-throughput sequencing to discover protein-DNA interactions. Methods. 2009; 48 (3): 240-248. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2009.03.001 PMID: 19275939

18. Acevedo L.G., Iniguez A.L., Holster H.L., et al. Genome-scale ChIP-chip analysis using 10,000 human cells. Biotechniques. 2007; 43 (6): 791-797. DOI: https://doi.org/10.2144/000112625 PMID: 18251256

19. Dahl J.A., Collas P. Q2ChIP, a Quick and Quantitative Chromatin Immunoprecipitation Assay, Unravels Epigenetic Dynamics of Developmentally Regulated Genes in Human Carcinoma Cells. Stem Cells. 2007; 25 (4): 1037-1046. DOI: https://doi.org/10.1634/stemcells.2006-0430 PMID: 17272500

20. DeCaprio J., Kohl T.O. Chromatin immunoprecipitation. Cold Spring Harb. Protoc. 2020; 2020 (8): 354-364. DOI: https://doi.org/10.1101/pdb.prot098665 PMID: 32747583

21. Schoppee Bortz P.D., Wamhoff B.R. Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR. PLoS One. 2011; 6 (10): e26015. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026015 PMID: 22046253

22. Gilmour D.S., Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol. Cell. Biol. 1985; 5 (8): 2009-2018. DOI: https://doi.org/10.1128/mcb.5.8.2009-2018.1985

23. Duband-Goulet I. Lamin ChIP from Chromatin Prepared by Micrococcal Nuclease Digestion. Methods in Molecular Biology. 2016; 325-339

24. Alonso A., Bernstein E., Hasson D. Histone Native Chromatin Immunoprecipitation. Methods Mol. Biol. 2018; 1832 77-104. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-4939-8663-7_5 PMID: 30073523

25. Nelson J.D., Denisenko O., Bomsztyk K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat. Protoc. 2006; 1 (1): 179-85. DOI: https://doi.org/10.1038/nprot.2006.27 PMID: 17406230

26. Kim T.H., Dekker J. ChIP-quantitative polymerase chain reaction (ChIP-qPCR). Cold Spring Harb. Protoc. 2018; 2018 (5): 354-355. DOI: https://doi.org/10.1101/pdb.prot082628 PMID: 29717044

27. Liu X.S. Getting started in tiling microarray analysis. PLoS Comput. Biol. 2007; 3 (10): 1842-1844. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.0030183 PMID: 17967045

28. Nakato R., Sakata T. Methods for ChIP-seq analysis: A practical workflow and advanced applications. Methods. 2021; 187 44-53. DOI: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2020.03.005 PMID: 32240773

29. Nakato R., Shirahige K. Recent advances in ChIP-seq analysis: from quality management to whole-genome annotation. Brief. Bioinform. 2017; 18 (2): 279-290. DOI: https://doi.org/10.1093/bib/bbw023 PMID: 26979602

30. Ng P., Wei C.-L., Sung W.-K., et al. Gene identification signature (GIS) analysis for transcriptome characterization and genome annotation. Nat. Methods. 2005; 2 (2): 105-11. DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth733 PMID: 15782207

31. Székvölgyi L., Bálint B.L., Imre L., et al. Chip-on-beads: flow-cytometric evaluation of chromatin immunoprecipitation. Cytometry. A. 2006; 69 (10): 1086-91. DOI: https://doi.org/10.1002/cyto.a.20325 PMID: 16998871

32. Ilsley M.D., Gillinder K.R., Magor G.W., et al. Krüppel-like factors compete for promoters and enhancers to fine-tune transcription. Nucleic Acids Res. 2017; 45 (11): 6572-6588. DOI: https://doi.org/10.1093/NAR/GKX441 PMID: 28541545

33. Métivier R., Penot G., Hübner M.R., et al. Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter. Cell. 2003; 115 (6): 751-63. DOI: https://doi.org/10.1016/s0092-8674(03)00934-6 PMID: 14675539

34. Grosselin K., Durand A., Marsolier J., et al. High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer. Nat. Genet. 2019; 51 (6): 1060-1066. DOI: https://doi.org/10.1038/s41588-019-0424-9 PMID: 31152164

35. Schmid M., Durussel T., Laemmli U.K. ChIC and ChEC. Mol. Cell. 2004; 16 (1): 147-157. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molcel.2004.09.007

36. Skene P.J., Henikoff J.G., Henikoff S. Targeted in situ genome-wide profiling with high efficiency for low cell numbers. Nat. Protoc. 2018; 13 (5): 1006-1019. DOI: https://doi.org/10.1038/nprot.2018.015 PMID: 29651053

37. Baranello L., Kouzine F., Sanford S., et al. ChIP bias as a function of cross-linking time. Chromosom. Res. 2016; 24 (2): 175-181. DOI: https://doi.org/10.1007/s10577-015-9509-1 PMID: 26685864

38. Ogawa Y., Imamoto N. Methods to separate nuclear soluble fractions reflecting localizations in living cells. iScience. 2021; 24 (12): 103503. DOI: https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.103503

39. Skene P.J., Henikoff S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. Elife. 2017; 6 1-35. DOI: https://doi.org/10.7554/eLife.21856 PMID: 28079019

40. Wissink E.M., Vihervaara A., Tippens N.D., et al. Nascent RNA analyses: tracking transcription and its regulation. Nat. Rev. Genet. 2019; 20 (12): 705-723. DOI: https://doi.org/10.1038/s41576-019-0159-6 PMID: 31399713

41. Круглова Н. А., Филатов А. В. Метод секвенирования РНК (RNA-seq) в иммунологических исследованиях. Иммунология. 2017; 38 (2): 112-117. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-112-117

42. Krošel M., Gabathuler M., Maciukiewicz M., et al. Individual functions of the histone acetyl transferases CBP and p300 in regulating the inflammatory response of synovial fibroblasts. J. Autoimmun. 2021; 123 102709. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaut.2021.102709 PMID: 34304080

43. Xin J., Li J., Feng Y., et al. Downregulation of long noncoding RNA HOTAIRM1 promotes monocyte/dendritic cell differentiation through competitively binding to endogenous miR-3960. Onco. Targets. Ther. 2017; Volume 10 1307-1315. DOI: https://doi.org/10.2147/OTT.S124201

44. Marson A., Kretschmer K., Frampton G.M., et al. Foxp3 occupancy and regulation of key target genes during T-cell stimulation. Nature. 2007; 445 (7130): 931-935. DOI: https://doi.org/10.1038/nature05478 PMID: 17237765

45. Rose S.A., Wroblewska A., Dhainaut M., et al. A microRNA expression and regulatory element activity atlas of the mouse immune system. Nat. Immunol. 2021; 22 (7): 914-927. DOI: https://doi.org/10.1038/s41590-021-00944-y PMID: 34099919

46. Hargreaves D.C., Horng T., Medzhitov R. Control of Inducible Gene Expression by Signal-Dependent Transcriptional Elongation. Cell. 2009; 138 (1): 129-145. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.05.047 PMID: 19596240

47. Qiao Y., Giannopoulou E.G., Chan C.H., et al. Synergistic activation of inflammatory cytokine genes by interferon-γ-induced chromatin remodeling and toll-like receptor signaling. Immunity. 2013; 39 (3): 454-469. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2013.08.009 PMID: 24012417

48. Novakovic B., Habibi E., Wang S.Y., et al. β-Glucan Reverses the Epigenetic State of LPS-Induced Immunological Tolerance. Cell. 2016; 167 (5): 1354-1368.e14. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2016.09.034 PMID: 27863248

49. Foster S.L., Hargreaves D.C., Medzhitov R. Gene-specific control of inflammation by TLR-induced chromatin modifications. Nature. 2007; 447 (7147): 972-978. DOI: https://doi.org/10.1038/nature05836 PMID: 17538624

50. Kanno Y., Vahedi G., Hirahara K., et al. Transcriptional and epigenetic control of T helper cell specification: molecular mechanisms underlying commitment and plasticity. Annu. Rev. Immunol. 2012; 30 (1): 707-31. DOI: https://doi.org/10.1146/annurev-immunol-020711-075058 PMID: 22224760

51. Audzevich T., Pearce G., Breucha M., et al. Control of the STAT6-BCL6 Antagonism by SWAP-70 Determines IgE Production. J. Immunol. 2013; 190 (10): 4946-4955. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1203014 PMID: 23589612

52. Dascani P., Ding C., Kong X., et al. Transcription Factor STAT3 Serves as a Negative Regulator Controlling IgE Class Switching in Mice. ImmunoHorizons. 2018; 2 (11): 349-362. DOI: https://doi.org/10.4049/immunohorizons.1800069

53. Ford B.R., Vignali P.D.A., Rittenhouse N.L., et al. Tumor microenvironmental signals reshape chromatin landscapes to limit the functional potential of exhausted T cells. Sci. Immunol. 2022; 7 (74): eabj9123. DOI: https://doi.org/10.1126/SCIIMMUNOL.ABJ9123 PMID: 35930654

54. Fu L., Zhao J., Huang J., et al. A mitochondrial STAT3-methionine metabolism axis promotes ILC2-driven allergic lung inflammation. J. Allergy Clin. Immunol. 2022; 149 (6): 2091-2104. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2021.12.783 PMID: 34974065

55. Niu J., Qin B., Wang C., et al. Identification of Key Immune-Related Genes in the Progression of Septic Shock. Front. Genet. 2021; 12 668527. DOI: https://doi.org/10.3389/fgene.2021.668527 PMID: 34804111

56. Masalha M., Ben-Dov I.Z., Ram O., et al. H3K27Ac modification and gene expression in psoriasis. J. Dermatol. Sci. 2021; 103 (2): 93-100. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jdermsci.2021.07.003 PMID: 34281744

57. García-Sánchez A., Marqués-García F. Chromatin immunoprecipitation: Application to the study of asthma. Methods in Molecular Biology. 2016; 121-137

58. Sun L., Fu J., Lin S.-H., et al. Particulate matter of 2.5 μm or less in diameter disturbs the balance of TH17/regulatory T cells by targeting glutamate oxaloacetate transaminase 1 and hypoxia-inducible factor 1α in an asthma model. J. Allergy Clin. Immunol. 2020; 145 (1): 402-414. DOI: https://doi.org/10.1016/j.jaci.2019.10.008 PMID: 31647966

59. Weiterer S., Uhle F., Lichtenstern C., et al. Sepsis induces specific changes in histone modification patterns in human monocytes. PLoS One. 2015; 10 (3): e0121748. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0121748 PMID: 25793379

60. Leentjens J., Kox M., Koch R.M., et al. Reversal of immunoparalysis in humans in vivo: a double-blind, placebo-controlled, randomized pilot study. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2012; 186 (9): 838-845. DOI: https://doi.org/10.1164/RCCM.201204-0645OC PMID: 22822024

61. Masalha M., Ben-Dov I.Z., Ram O., et al. H3K27Ac modification and gene expression in psoriasis. J. Dermatol. Sci. 2021; 103 (2): 93-100. DOI: https://doi.org/10.1016/J.JDERMSCI.2021.07.003 PMID: 34281744

62. Kang D., Sp N., Jo E., et al. Non-toxic sulfur inhibits LPS-induced inflammation by regulating TLR-4 and JAK2/STAT3 through IL-6 signaling. Mol. Med. Rep. 2021; 24 (1): 485. DOI: https://doi.org/10.3892/mmr.2021.12124 PMID: 33907855

63. Ishida M., Ueki M., Morishita J., et al. T-5224, a selective inhibitor of c-Fos/activator protein-1, improves survival by inhibiting serum high mobility group box-1 in lethal lipopolysaccharide-induced acute kidney injury model. J. Intensive Care. 2015; 3 (1): 49. DOI: https://doi.org/10.1186/s40560-015-0115-2 PMID: 26579229

64. Halili M.A., Andrews M.R., Labzin L.I., et al. Differential effects of selective HDAC inhibitors on macrophage inflammatory responses to the Toll-like receptor 4 agonist LPS. J. Leukoc. Biol. 2010; 87 (6): 1103-1114. DOI: https://doi.org/10.1189/JLB.0509363 PMID: 20200406

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Редакционная коллегия журнала «Иммунология» и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России с прискорбием сообщают, что 11.03.2022 г. скончался Президент журнала «Иммунология», научный руководитель Института академик РАН Хаитов Рахим Мусаевич
Медицина сегодня
Приглашаем специалистов Сибирского федерального округа 9-10 февраля посетить Школу РОАГ!

Приглашаем специалистов Сибирского федерального округа 9-10 февраля посетить Школу РОАГ! Успешно продолжается образовательная работа общероссийского проекта "Школы РОАГ". Очередная встреча пройдет 9-10 февраля в онлайн-формате и объединит врачей Иркутска, Кемерово, а также...

Конференция "Бронхоэктазы: муковисцидоз и не только-"

Уважаемые коллеги, приглашаем принять участие в конференции "Бронхоэктазы: муковисцидоз и не только-", которая состоится с 3 по 4 февраля в Ижевске! Организаторы: · Общероссийская общественная организация "Российское общество медицинских генетиков" · НМИЦ...

Образовательный форум специалистов регионов Российской Федерации "Открытая и эндоваскулярная хирургия в лечении патологии сердца и сосудов"

HandsHeart-2023 Образовательный форум специалистов регионов Российской Федерации "Открытая и эндоваскулярная хирургия в лечении патологии сердца и сосудов" 2-3 марта 2023 года, г. Казань Выбор метода лечения патологий аортального клапана, коронарных артерий и острого...


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»