Сравнительная характеристика транскриптомов макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4

Резюме

Введение. Агонисты паттерн-распознающих рецепторов используются для создания иммуностимуляторов и иммунологических адъювантов, позволяющих активировать врожденный иммунитет для получения требуемых защитных эффектов. Выбор агонистов, наиболее подходящих в конкретных клинических ситуациях, должен быть основан на понимании механизмов их действия, а для этого необходима детальная информация о биологических эффектах, оказываемых агонистами на клетки иммунной системы.

Цель исследования - сопоставить транскриптомы макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro.

Материал и методы. Макрофаги человека, полученные путем культивирования моноцитов крови здоровых доноров с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором, стимулировали агонистами NOD1 и TLR4 в течение 1, 4 и 9 ч. Транскриптомы анализировали с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-seq) и полимеразной цепной реакции в реальном времени. В качестве дополнительных методов использовали анализ обогащения генов по функциональной принадлежности и анализ сайтов связывания факторов транскрипции.

Результаты. Главным различием транскриптомов макрофагов, активированных агонистами NOD1 и TLR4, стала индукция более мощного интерферонового ответа при активации агонистом TLR4. Среди защитных механизмов, запускаемых в макрофагах при стимуляции агонистом NOD1, необходимо отметить повышение экспрессии генов, кодирующих белки с антимикробными свойствами (аконитатдекарбоксилазу-1, антимикробные хемокины), медиаторы воспаления и белки, необходимые для индукции дифференцировки Th17-клеток.

Заключение. Полученные данные позволяют рекомендовать агонисты NOD1 для профилактики и лечения инфекций, вызванных внеклеточными формами бактерий и грибов.

Ключевые слова:макрофаги; транскриптом; секвенирование РНК; NOD1; TLR4; иммуностимуляторы

Для цитирования: Масютина А.М., Муругина Н.Е., Пащенкова Ю.Г., Пащенков М.В. Сравнительная характеристика транскрипционных профилей макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4. Иммунология. 2023; 44 (1): 16-27. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-1-16-27

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00211.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Постановка экспериментов и анализ результатов - Масютина А.М., Муругина Н.Е., Пащенкова Ю.Г.; планирование и постановка экспериментов, анализ результатов, написание статьи - Пащенков М.В.

Введение

Распознавание веществ микробного происхождения паттерн-распознающими рецепторами врожденного иммунитета приводит к изменениям экспрессии сотен генов, обеспечивающих адекватный иммунный ответ на тот или иной вид патогена. Эти же вещества, выделенные в чистом виде или синтезированные искусственно, используются для создания иммуностимуляторов и иммунологических адъювантов, позволяющих активировать иммунную систему для получения требуемых защитных эффектов [1-3]. Поскольку число известных паттерн-распознающих рецепторов и их агонистов довольно велико, встает вопрос выбора агонистов, наиболее подходящих в тех или иных клинических ситуациях. Этот выбор должен быть основан на понимании механизмов действия конкретных агонистов, а для этого необходима подробная информация о биологических эффектах, оказываемых ими на клетки иммунной системы.

Агонисты NOD-подобных рецепторов (NOD1, NOD2) применяются для профилактики и лечения инфекционно-воспалительных заболеваний человека [4]. Тем не менее в литературе отсутствует подробное описание влияния этих веществ на экспрессию генов в клетках иммунной системы человека. В данной работе мы впервые изучили влияние одного из основных агонистов рецептора NOD1 - N-ацетил-D-мурамил-L-аланил-D-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновой кислоты (М-триДАП) - на экспрессию генов в макрофагах человека in vitro. Макрофаги были выбраны в качестве модели как один из основных типов клеток врожденной иммунной системы. В качестве препарата сравнения использовали липополисахарид (ЛПС), агонист Toll-подобного рецептора 4 (TLR4), влияние которого на транскриптом клеток иммунной системы достаточно хорошо изучено [5-7]. В настоящей работе охарактеризованы относительно кратковременные эффекты агонистов, развивающиеся в сроки до 9 ч после их добавления к клеткам. В качестве основного метода исследования использовали высокопроизводительное секвенирование РНК (RNA-seq), позволяющее глобально оценить клеточный транскриптом.

Материал и методы

Реактивы. Синтетический М-триДАП и ультрачистый ЛПС, полученный из E. coli O111:B4, были закуплены у фирмы InvivoGen (США), рекомбинантный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) - у Miltenyi Biotec (ФРГ). Полная культуральная среда (ПКС) представляла собой RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10 % фетальной телячьей сыворотки (все Thermo Fisher Scientific, США).

Доноры крови. Для проведения полнотранскриптомного анализа (RNA-seq) была получена венозная гепаринизированная кровь от трех здоровых доноров из числа сотрудников лаборатории. Для подтверждающих экспериментов [полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ), вестерн-блоттинг] была получена кровь еще от 5 здоровых доноров. Исследование было одобрено локальным Комитетом по этике ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России" (протокол 10/2017). Все доноры дали информированное согласие на участие в исследовании.

Культивирование и стимуляция макрофагов для RNA-seq. Мононуклеарные клетки выделяли на градиенте плотности фиколла, отмывали, подсчитывали и ресуспендировали в концентрации 10 млн/мл в среде RPMI-1640 с добавлением 1 % пуловой человеческой сыворотки IV группы. Вносили по 5 мл клеточной суспензии в чашки Петри диаметром 60 мм (SPL Life Sciences, Республика Корея) и инкубировали в течение 1 ч при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. После этого неадгезированные клетки удаляли путем двукратной промывки теплой RPMI-1640, а адгезированные клетки (моноциты) культивировали в ПКС с добавлением 40 нг/мл ГМ-КСФ в течение 6 сут. На 3-и сутки культуральную среду полностью меняли на свежую ПКС с добавлением ГМ-КСФ в той же концентрации. Через 6 сут дифференцированные макрофаги отделяли от пластика трипсинизацией, отмывали, подсчитывали и высевали в 24-луночный планшет по 2 - 105 клеток в 400 мкл ПКС на лунку. На следующие сутки к клеткам добавляли М-триДАП (10 мкг/мл) или ЛПС (10 нг/мл) либо оставляли без агонистов для оценки базальной экспрессии. Через 1, 4 и 9 ч после начала стимуляции клетки лизировали для выделения РНК. По техническим причинам образцы после 9 ч стимуляции были получены только от 2 доноров.

Исследование транскриптомов макрофагов с помощью RNA-seq. Тотальную клеточную РНК выделяли с помощью набора фирмы Jena Bioscience (ФРГ, кат. № PP-210) и обрабатывали ДНКазой I (NEB, США, кат. № M0303). Полиаденилированную мРНК выделяли из фракции тотальной РНК с помощью суперпарамагнитных частиц, покрытых олигодезокситимидинфосфатом (олиго-dT, NEB, США, кат. № E7490). Образцы мРНК преобразовывали в баркодированные библиотеки кДНК с помощью набора NEBNext® UltraII Directional RNA Library Prep with Sample Purification Beads (NEB, США, кат. № E7765) и наборов баркодирующих праймеров NEBNext® Multiplex Oligos for Illumina® (NEB, США, кат. № E7335 и E7500) в соответствии с инструкциями производителя. Качество библиотек анализировали на приборе 2100 Bioanalyzer system (Agilent Technologies, США). Пулы библиотек кДНК секвенировали на приборе Illumina NovaSeq 6000 (Евроген, Москва, Россия) в формате односторонних прочтений длиной 100 пар оснований. Среднее количество прочтений (reads) на библиотеку составило 41,02 ± 3,97 - 106, 41,71 ± 5,06 - 106 и 23,73 ± 7,08 - 106 у доноров 1-3 соответственно. Выравнивание прочтений на транскриптом человека (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/cdna/Homo_sapiens.GRCh38.cdna.abinitio.fa.gz), а также подсчет числа прочтений на ген (counts) выполняли с помощью программного пакета Salmon [8]. Доля успешно выравненных прочтений составила 92,9 ± 0,2, 93,2 ± 0,3 и 91,0 ± 1,5 % у доноров 1-3 соответственно. Прочтения, относящиеся к различным вариантам мРНК одного и того же гена, суммировали.

Анализ данных RNA-seq. Мы отобрали 11 839 наиболее представленных белок-кодирующих генов (не менее 50 "сырых" прочтений на ген хотя бы в одном образце у каждого из трех доноров). Чтобы избежать деления на 0 при расчете индексов стимуляции (см. ниже), нулевые значения числа прочтений заменяли на 1. Нормализованную экспрессию генов выражали в виде количества прочтений на 1 000 000 всех прочтений в образце (reads-per-million, RPM).

Для каждого гена рассчитывали индекс стимуляции (отношение RPM у данного донора в данной точке при данном виде стимуляции к RPM в нестимулированных клетках того же донора в той же точке). Повышение экспрессии гена в данной точке при данном виде стимуляции считали биологически значимым, если индекс стимуляции составлял ≥ 2 у всех исследованных доноров. Понижение экспрессии считали значимым при индексе стимуляции ≤ 0,5 у всех доноров.

Анализ обогащения генов по функциональной принадлежности (Gene set enrichment analysis, GSEA). Использовали программный пакет GSEA 4.0.3 (UC San Diego and Broad Institute, США). GSEA сравнивает экспрессию генов в образцах двух фенотипов (например, в клетках, активированных агонистами двух различных рецепторов) и позволяет оценить связь между фенотипом и повышением либо понижением экспрессии наборов генов (gene sets), сформированных заранее по какому-либо функциональному признаку [9]. Входными данными для GSEA служили log2-преобразованные значения индексов стимуляции.

Мерой дифференциальной экспрессии гена в клетках с фенотипами 1 и 2 считали отношение сигнала к шуму:

ОСШ = (M1 - M2)/(σ1 + σ2),

где M1 и M2 - средние значения, а σ1 и σ2 - стандартные отклонения экспрессии данного гена в фенотипах 1 и 2 [9].

Использовали аннотированные функциональные наборы генов, опубликованные на сайте GSEA (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp), из коллекций Hallmark (50 наборов генов, участвующих в основных биологических процессах), C3.TFT (1134 набора генов, являющихся мишенями определенных факторов транскрипции - transcription factor targets), C3.MIR (2598 наборов генов, являющихся мишенями определенных мкРНК - mcRNA), С5 (14 998 наборов генов, характеризующих различные биологические процессы). Связь экспрессии данного набора генов с одним из двух фенотипов считали достоверной, если значение частоты ложных открытий Q для данного набора не превышало 0,05.

Для качественной оценки транскриптомов анализировали представленность генов из тех же функциональных наборов GSEA в множествах генов, сформированных в данном исследовании. Из наборов GSEA исключали гены, не входящие в список 11 839 генов, экспрессируемых в макрофагах. Обогащение или обеднение представителей данного функционального набора в данном множестве генов по сравнению с другим множеством оценивали с помощью теста χ2. Множественность сравнений учитывали по процедуре Беньямини-Хохберга [10] с пороговым уровнем достоверности q = 0,05.

Тепловые карты строили с помощью онлайн-программы Morpheus (https://software.broadinstitute.org/morpheus).

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Данные по экспрессии мРНК отдельных генов были валидированы с помощью ПЦР-РВ в независимых экспериментах, поставленных по вышеописанной схеме. Условия ПЦР-РВ были описаны ранее в [11]. Определение экспрессии мРНК EGR1, MX1, IL1B, IL12B, IL23A выполнено у 5 доноров, EGR1, IFNB1, IL6 - у 4 доноров.

Вестерн-блоттинг. Выделение цитоплазматической и ядерной фракций и их анализ с помощью вестерн-блоттинга проводили, как описано в [11]. EGR1 детектировали с помощью поликлональных кроличьих антител производства Cloud-Clone (КНР).

Анализ сайтов связывания факторов транскрипции. Для собственного анализа сайтов связывания факторов транскрипции в промоторах генов применяли программу CiiiDER, которая использует алгоритм MATCH, позиционно-частотные матрицы JASPAR и сборку генома человека GRCh38 [12]. Промоторами считали области ДНК от -1500 до +500 пар оснований от сайтов старта транскрипции. Минимальный индекс соответствия между последовательностями предполагаемого и идеального сайта составлял 0,85 (индекс 1 обозначает полное соответствие, индекс 0 - полное несоответствие последовательностей).

Индекс обогащения (ИО) генов, содержащих данный сайт, рассчитывали по формуле:

ИО = log2[(n1 + 0,5)/(N1+0,5)] - log2[(n2+0,5)/(N2+0,5)],

где n1 и n2 - число генов, содержащих данный сайт, в множествах генов 1 и 2, N1 and N2 - общее число генов в множествах 1 и 2 [12].

Представленность данного сайта в множествах генов 1 и 2 сравнивали с помощью теста χ2. Программа CiiiDER автоматически выбирала индекс соответствия для каждого сайта (в пределах от 0,85 до 1), при котором различие между двумя множествами генов было наиболее достоверным. Учитывали сайты связывания только тех факторов транскрипции, которые экспрессировались в макрофагах (354 разновидности). Множественность сравнений учитывали по процедуре Беньямини - Хохберга с q = 0,05.

Анализ корреляций. Для анализа корреляций вычисляли коэффициент корреляции Пирсона (r), который считали значимым при p < 0,05.

Результаты

Общая характеристика транскриптомов макрофагов, активированных агонистами NOD1 и TLR4

Увеличение экспрессии генов, вызванное данным агонистом в данной точке, считали биологически значимым, если экспрессия возрастала в ≥ 2 раза по сравнению с нестимулированными клетками у всех исследованных доноров. С помощью RNA-seq были выявлены 589 генов, удовлетворявших данному критерию хотя бы в одной из точек (1, 4 или 9 ч) при стимуляции хотя бы одним агонистом. Только эти гены считали индуцибельными. Число генов с биологически значимым повышением экспрессии было наименьшим через 1 ч, наибольшим - через 4 ч после начала стимуляции (рис. 1А). Во всех трех точках отмечалось частичное пересечение множеств М-триДАП- и ЛПС-индуцибельных генов, наибольшее - в точке 1 ч (см. рис. 1А).

Еще 544 гена характеризовались значимым понижением экспрессии хотя бы в одной точке. Интересно, что после 1 ч стимуляции такие гены практически отсутствовали, тогда как в точках 4 и 9 ч их число при стимуляции М-триДАП составило несколько сотен, при стимуляции ЛПС - несколько десятков (см. рис. 1А). Большинство генов, отвечавших понижением экспрессии при стимуляции ЛПС, вели себя схожим образом и при стимуляции М-триДАП (см. рис. 1А).

Множества индуцибельных и репрессибельных генов не пересекались, за двумя исключениями: экспрессия гена ADRB2, кодирующего β2-адренорецептор, была повышена при стимуляции М-триДАП или ЛПС в течение 1 ч, но снижена после 4 и 9 ч стимуляции; экспрессия гена SECTM1, кодирующего костимуляторную молекулу, была понижена и повышена после стимуляции соответственно М-триДАП и ЛПС в течение 9 ч. Таким образом, множество регулируемых генов в данном исследовании составило 589 + 544 - 2 = 1131 ген, или ~ 9,6 % от всех анализируемых генов.

Сравнение индуцибельных генов при активации агонистами NOD1 и TLR4

Через 1 ч после начала стимуляции наблюдалась сильная корреляция экспрессии 589 индуцибельных генов в М-триДАП- и ЛПС-стимулированных макрофагах (рис. 1Б), что согласуется со значительным пересечением множеств М-триДАП- и ЛПС-индуцибельных генов в этой точке (см. рис. 1А). Через 4 и 9 ч после начала стимуляции корреляция экспрессии генов в М-триДАП и ЛПС-стимулированных макрофагах уменьшалась (см. рис. 1Б), что говорит о нарастании различий транскриптомов.

Качественный анализ функциональной принадлежности М-триДАП- и ЛПС-индуцибельных генов ожидаемо показал, что и среди первых, и среди вторых достоверно повышена представленность генов, кодирующих медиаторы воспаления (функциональные наборы Hallmark_tnfa_signaling_via_nfkb, Hallmark_inflammatory_response, Hallmark_interferon_gamma_response; табл. 1). Среди ЛПС-индуцибельных генов через 4 и 9 ч после начала стимуляции была избирательно повышена представленность генов из набора Hallmark_interferon_alpha_response, включающего гены, участвующие в индукции интерферонов (ИФН) I типа и в ответе на ИФН I типа (см. табл. 1).

Далее мы провели прямое сопоставление экспрессии регулируемых генов в М-триДАП- и ЛПС-стимулированных макрофагах с помощью GSEA. При активации ЛПС в течение 4-9 ч наблюдалось более выраженное повышение экспрессии генных наборов, характеризующих ответ на вирусы, нуклеиновые кислоты и ИФН I типа (табл. 2). При активации М-триДАП не выявлено генных наборов из коллекций Hallmark и C5, экспрессия которых возрастала бы сильнее, чем при стимуляции ЛПС (см. табл. 2).

Нас интересовало, в какой степени различия транскриптомов М-триДАП- и ЛПС-стимулированных макрофагов могут быть обусловлены различиями сигнальных путей и факторов транскрипции, активируемых при стимуляции рецепторов NOD1 и TLR4. Для этого с помощью GSEA сопоставили экспрессию наборов генов, являющихся мишенями факторов транскрипции (коллекция C3.TFT). Как видно из табл. 3, в ЛПС-стимулированных макрофагах через 4-9 ч после начала стимуляции повышена экспрессия генов, содержащих сайт ISRE (interferon-stimulated response element; набор ISRE_01), а также генов-мишеней факторов транскрипции семейства IRF (interferon response factor), участвующих в индукции экспрессии ИФН I типа. Эти результаты согласуются с представленными в табл. 1 и 2 данными о повышенной экспрессии генных наборов, относящихся к интерфероновому ответу, в тех же точках при стимуляции ЛПС.

Собственный анализ сайтов связывания факторов транскрипции в промоторах М-триДАП- и ЛПС-индуцибельных генов

Хотя многие гены отвечали достоверным повышением экспрессии избирательно на стимуляцию М-триДАП, но не ЛПС, с помощью GSEA не удалось выявить ни их общие функциональные характеристики, ни общие механизмы их регуляции. Поэтому мы провели собственный анализ сайтов связывания факторов транскрипции в промоторных областях М-триДАП-индуцибельных генов в сравнении с ЛПС-индуцибельными.

Вначале для подтверждения валидности метода сопоставили представленность сайтов связывания в промоторах индуцибельных генов и конститутивных генов (таких, у которых экспрессия ни в одной точке и ни у одного донора не менялась более чем в 1,5 раза по сравнению с базальной, n = 3432). Как и ожидалось, промоторы генов, индуцируемых как М-триДАП, так и ЛПС, были достоверно обогащены сайтами связывания активационных факторов транскрипции NFB, AP-1, IRF, STAT1:STAT2, что говорит об общности механизмов активации клетки обоими агонистами (рис. 2А).

Чтобы выявить факторы транскрипции, избирательно участвующие в активации макрофагов под действием отдельных агонистов, из множеств М-триДАП- и ЛПС-индуцибельных генов выделили так называемые селективные гены - такие, экспрессия которых при стимуляции одним агонистом у всех доноров возрастала в ≥ 2 раза по сравнению с базальной экспрессией в данной точке, а при стимуляции другим агонистом - не менялась ни у одного донора в этой же точке.

Через 1 ч после начала стимуляции селективные гены практически отсутствовали (0 при стимуляции ЛПС, 4 при стимуляции М-триДАП), тогда как в точках 4 и 9 ч было выявлено несколько десятков М-триДАП- и ЛПС-селективных генов (табл. 4). Данные по их относительной экспрессии приведены на рис. 2Б и 2В (4 ч) и рис. 2Д и 2Е (9 ч). Число провоспалительных генов среди них было невелико. ЛПС-селективные гены преимущественно относились к интерфероновому ответу (см. табл. 4). Среди М-триДАП-селективных генов была несколько повышена представленность генов-мишеней гистоновой деметилазы KDM7A и репрессора транскрипции MORC2, однако эти различия не были достоверными (табл. 4).

Анализ промоторов показал, что промоторы ЛПС-селективных генов обогащены сайтами связывания факторов транскрипции семейства IRF и STAT1:2, что согласуется с участием этих генов в интерфероновом ответе (рис. 2Г, 2Ж). Промоторы М-триДАП-селективных генов оказались обогащены сайтами связывания факторов транскрипции семейств EGR (early growth response), SP (specificity protein), KLF (Krueppel-like factor) и ряда других (рис. 2Г, Ж). Общее свойство этих сайтов - высокое содержание гуанина и цитозина.

По данным RNA-seq, большинство факторов транскрипции, ассоциированных с М-триДАП-селективными генами, экспрессируется макрофагами конститутивно (данные не представлены), тогда как ген EGR1 является индуцибельным: экспрессия его мРНК повышается через 1 ч стимуляции обоими агонистами, однако гораздо существеннее при стимуляции М-триДАП, чем при стимуляции ЛПС (рис. 3А). Присутствие белка EGR1 в цитоплазматической и ядерной фракциях макрофагов подтверждено с помощью вестерн-блоттинга (рис. 3Б). Полученные данные указывают на возможное участие факторов транскрипции семейств EGR, SP и KLF в индукции экспрессии генов при активации рецептора NOD1.

Оценка функционального потенциала макрофагов, активированных агонистом NOD1, по транскриптомным данным

Макрофаги могут реализовывать свое защитное действие как за счет собственных механизмов, так и через активацию адаптивного иммунитета. Одним из главных собственных защитных механизмов является фагоцитоз. Макрофаги конститутивно экспрессировали гены, необходимые для реализации фагоцитоза (набор GOBP_phagocytosis), а также гены, кодирующие бактерицидные белки лизоцим (LYZ), белок, повышающий проницаемость (BPI), микробицидные хемокины (CCL18, CCL22, CXCL16) и ряд других; экспрессия этих генов при стимуляции не менялась. М-триДАП и ЛПС индуцировали экспрессию ряда микробицидных хемокинов, активных в отношении ряда бактерий и грибов [13], а также аконитатдекарбоксилазы-1 (ACOD1), продукт которой - итаконат - активен в отношении M. tuberculosis и S. enterica (рис. 3В) [14].

Вторым важнейшим защитным механизмом, в активации которого участвуют макрофаги, является воспаление. Как можно видеть на рис. 3Г, оба агониста индуцировали экспрессию десятков провоспалительных генов, при этом кинетика их экспрессии при активации М-триДАП и ЛПС была схожей за отдельными исключениями.

ИФН I типа необходимы для защиты от вирусов и некоторых видов бактерий, паразитирующих в цитозоле. Хорошо известно, что при активации рецептора TLR4 через TRIF-зависимый сигнальный путь запускается продукция ИФН-β (ген IFNB1) [15]. В свою очередь, ИФН-β вторично индуцирует экспрессию ИФН-зависимых генов [16]. Вопрос об индукции экспрессии IFNB1 и ИФН-индуцибельных генов агонистами NOD-подобных рецепторов (NOD1 и родственного рецептора NOD2) является спорным: есть работы, как подтверждающие [17-19], так и не подтверждающие [20-22] такую возможность. В нашей работе биологически значимое (> 2 раз) повышение экспрессии гена IFNB1 было зафиксировано у 5 из 7 доноров при стимуляции ЛПС и ни у одного при стимуляции М-триДАП (рис. 3А). Экспрессия изоформ ИФН-α в макрофагах отсутствовала независимо от вида и срока стимуляции. Экспрессия MX1 - классического ИФН-индуцибельного гена - значимо возрастала у всех доноров после 4-9 ч стимуляции ЛПС, ни у одного - после 4 ч стимуляции М-триДАП и незначительно повышалась у 2 из 8 доноров после 9 ч стимуляции М-триДАП (рис. 3А). На тепловой карте (рис. 3Д) видно, что М-триДАП, в отличие от ЛПС, вызывает повышение экспрессии лишь единичных ИФН-индуцибельных генов, что может быть обусловлено ИФН-независимыми механизмами [21]. Таким образом, полученные данные свидетельствуют об отсутствии значимой экспрессии ИФН I типа при активации макрофагов агонистом NOD1.

Еще одним защитным механизмом, в котором участвуют макрофаги, является индукция активации и дифференцировки Т-хелперов. Макрофаги конститутивно экспрессируют гены, кодирующие HLA класса II и костимуляторную молекулу CD86 (данные не представлены). Поскольку при активации М-триДАП отсутствует значимая экспрессия ИФН I типа (рис. 3) и не экспрессируется ген IL12A, кодирующий p35-субъединицу ИЛ-12 (данные не представлены), можно предполагать низкую способность М-триДАП-активированных макрофагов поддерживать дифференцировку Т-хелперов 1-го типа.

Вместе с тем при активации через NOD1 макрофаги экспрессируют гены инструктивных цитокинов, необходимых для дифференцировки Th17-клеток: гены инструктивных цитокинов [TGFB1 - конститутивно (данные не представлены), IL6, IL1B, IL12B и IL23A - индуцибельно (см. рис. 3А)], а также гены компонентов инфламмасомы, необходимых для процессинга и секреции ИЛ-1β [ASC/PYCARD и CASP1 - конститутивно (данные не представлены), NLRP3 - индуцибельно (рис. 3А)]. Эти результаты позволяют предположить, что макрофаги, активированные агонистом NOD1, могут индуцировать дифференцировку Т-хелперов по Th17-пути.

Обсуждение

В данной работе предпринята попытка выявить отличительные особенности транскриптома макрофагов, активированных агонистом рецептора NOD1. В качестве препарата сравнения использовали ЛПС E. coli O111:B4 - хорошо изученный агонист TLR4.

Оба агониста индуцировали экспрессию нескольких сотен генов, регулируемых факторами транскрипции семейств NFB и AP-1. Главное системное различие эффектов ЛПС и М-триДАП состояло в индукции более мощного интерферонового ответа под действием ЛПС. М-триДАП проявил себя как весьма слабый индуктор ИФН I типа, что согласуется с данными литературы [20-22]. Интересно, что в ряде работ показана защитная роль NOD1- и NOD2-зависимой продукции ИФН-β при вирусных инфекциях [19, 22-24]. Наши данные не противоречат этим работам, поскольку защитные эффекты NOD1 и NOD2 могут проявляться в условиях уже развившейся вирусной инфекции: 1) агонисты NOD1 и NOD2 могут потенцировать вирус-индуцированную продукцию ИФН I типа [19, 22]; 2) агонисты NOD2 могут усиливать миграцию интерферон-продуцирующих клеток в очаг инфекции [23]; 3) описано агонист-независимое участие NOD1 и NOD2 в ответе клеток на стресс [24], который может быть вызван в том числе вирусной инфекцией.

Хотя мы обнаружили гены, селективно отвечающие на стимуляцию NOD1, но не TLR4, общие функциональные характеристики этих генов установить не удалось. Анализ сайтов связывания факторов транскрипции показал, что значимую роль в регуляции экспрессии этих генов могут играть представители семейств EGR, KLF и SP (что, однако, не исключает роль этих факторов и в активации клетки под действием ЛПС).

Наряду с индуцибельными генами мы обнаружили сопоставимое число генов со снижением экспрессии мРНК (см. рис. 1А). Отсутствие таких генов через 1 ч и их появление через 4 ч после начала стимуляции указывает на возможную роль мкРНК в данном процессе, поскольку на синтез мкРНК de novo требуется время. По данным анализа генных наборов коллекции C3.MIR, каждая из 2598 мкРНК, входящих в коллекцию, таргетирует не более 5 % от общего числа генов с понижением экспрессии. Тем не менее 40 мкРНК с наибольшим количеством мишеней таргетировали ~ 56 % из 348 мРНК, для которых наблюдалось понижение экспрессии при стимуляции макрофагов М-триДАП в течение 4 ч. Поскольку экспрессию самих мкРНК не измеряли, делать какие-либо выводы об участии конкретных мкРНК в формировании транскриптома М-триДАП-стимулированных макрофагов на основании данной работы не представляется возможным. Альтернативным механизмом понижения уровней мРНК может быть подавление транскрипции.

Среди защитных механизмов, запускаемых в макрофагах при стимуляции агонистом NOD1 и выявляемых путем анализа транскриптома, необходимо отметить: 1) повышение экспрессии генов, кодирующих белки с антимикробными свойствами (ACOD1, гены хемокинов); 2) повышение экспрессии генов, кодирующих медиаторы воспаления; 3) повышение экспрессии генов, необходимых для индукции дифференцировки Th17-клеток.

Этот комплекс механизмов позволяет рекомендовать агонисты NOD1 для профилактики и лечения инфекций, вызванных внеклеточными формами бактерий и грибов. Поскольку ИФН I типа не участвуют в борьбе с данными классами патогенов, отсутствие их индукции можно рассматривать как преимущество, поскольку избыточная выработка этих цитокинов может приводить к развитию и/или обострению ряда аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка и псориаз [25-27]. Вместе с тем агонисты NOD1 не являются оптимальными для профилактики инфекций, вызванных внутриклеточными паразитами.

Литература / References

1. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheblyakov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova I.V., et al. Powerful complex immunoadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive immune responses. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155650. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155650

2. Tukhvatulin A.I., Gitlin I.I., Shcheblyakov D.V., Artemicheva N.M., Burdely L.G., Shmarov M.M., et al. Combined stimulation of Toll-like receptor 5 and Nod1 strongly potentiates activity of NF-κB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar typhimurium infection. Infect. Immun. 2013; 81 (10): 3855-64. DOI: https://doi.org/10.1128/IAI.00525-13

3. Pashenkov M., Goëss G., Wagner C., Hörmann M., Jandl T., Moser A., et al. Phase II trial of a toll-like receptor 9-activating oligonucleotide in patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 2006; 24 (36): 5716-24. DOI: https://doi.org/10.1200/JCO.2006.07.9129

4. Pashenkov M.V., Dagil Y.A., Pinegin B.V. NOD1 and NOD2: Molecular targets in prevention and treatment of infectious diseases. Int. Immunopharmacol. 2018; 54: 385-400. DOI: https://doi.org/10.1016/j.intimp.2017.11.036

5. Napolitani G., Rinaldi A., Bertoni F., Sallusto F., Lanzavecchia A. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1 -polarizing program in dendritic cells. Nat. Immunol. 2005; 6 (8): 769-76. DOI: https://doi.org/10.1038/ni1223

6. Ramirez-Carrozzi V.R., Braas D., Bhatt D.M., Cheng C.S., Hong C., Doty K.R., et al. A unifying model for the selective regulation of inducible transcription by CpG islands and nucleosome remodeling. Cell. 2009; 138 (1): 114-28. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2009.04.020

7. Bhatt D.M., Pandya-Jones A., Tong A.J., Barozzi I., Lissner M.M., Natoli G., et al. Transcript dynamics of proinflammatory genes revealed by sequence analysis of subcellular RNA fractions. Cell. 2012; 150 (2): 279-90. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2012.05.043

8. Patro R., Duggal G., Love M.I., Irizarry R.A., Kingsford C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat. Methods. 2017; 14 (4): 417-9. DOI: https://doi.org/10.1038/nmeth.4197

9. Subramanian A., Tamayo P., Mootha V.K., Mukherjee S., Ebert B.L., Gillette M.A., et al. Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102 (43): 15 545-50. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0506580102

10. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Stat. Soc. Ser. B. 1995; 57 (1): 289-300. DOI: https://doi.org/10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x

11. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P.V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S., et al. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflammatory gene expression. J. Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.2000692

12. Gearing L.J., Cumming H.E., Chapman R., Finkel A.M., Woodhouse I.B., Luu K., et al. CiIIder: A tool for predicting and analysing transcription factor binding sites. PLoS One. 2019; 14 (9): e0215495. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0215495

13. Yung S.C., Murphy P.M. Antimicrobial chemokines. Front. Immunol. 2012; 3: 276. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2012.00276

14. Michelucci A., Cordes T., Ghelfi J., Pailot A., Reiling N., Goldmann O., et al. Immune-responsive gene 1 protein links metabolism to immunity by catalyzing itaconic acid production. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2013; 110 (19): 7820-5. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1218599110

15. Yamamoto M., Sato S., Hemmi H., Hoshino K., Kaisho T., Sanjo H., et al. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent toll-like receptor signaling pathway. Science. 2003; 301 (5633): 640-3. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1087262

16. Sheikh F., Dickensheets H., Gamero A.M., Vogel S.N., Donnelly R.P. An essential role for IFN-β in the induction of IFN-stimulated gene expression by LPS in macrophages. J. Leukoc. Biol. 2014; 96 (4): 591-600. DOI: https://doi.org/10.1189/jlb.2A0414-191R

17. Watanabe T., Asano N., Fichtner-Feigl S., Gorelick P.L., Tsuji Y., Matsumoto Y., et al. NOD1 contributes to mouse host defense against Helicobacter pylori via induction of type I IFN and activation of the ISGF3 signaling pathway. J. Clin. Invest. 2010; 120 (5): 1645-62. DOI: https://doi.org/10.1172/jci39481

18. Pandey A.K., Yang Y., Jiang Z., Fortune S.M., Coulombe F., Behr M.A., et al. NOD2, RIP2 and IRF5 play a critical role in the type I interferon response to Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathog. 2009; 5 (7): e1000500. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1000500

19. Fan Y.H., Roy S., Mukhopadhyay R., Kapoor A., Duggal P., Wojcik G.L., et al. Role of nucleotide-binding oligomerization domain 1 (NOD1) and its variants in human cytomegalovirus control in vitro and in vivo. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2016; 113 (48): E7818-27. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.1611711113

20. Stockinger S., Reutterer B., Schaljo B., Schellack C., Brunner S., Materna T., et al. IFN regulatory factor 3-dependent induction of type I IFNs by intracellular bacteria is mediated by a TLR- and Nod2-independent mechanism. J. Immunol. 2004; 173 (12): 7416-25. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.173.12.7416

21. Werts C., le Bourhis L., Liu J., Magalhaes J.G., Carneiro L.A., Fritz J.H., et al. Nod1 and Nod2 induce CCL5/RANTES through the NF-kappaB pathway. Eur. J. Immunol. 2007; 37 (9): 2499-508. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200737069

22. Kapoor A., Fan Y.H., Arav-Boger R. Bacterial Muramyl Dipeptide (MDP) restricts human cytomegalovirus replication via an IFN-β-dependent pathway. Sci. Rep. 2016; 6: 20295. DOI: https://doi.org/10.1038/srep20295

23. Coulombe F., Fiola S., Akira S., Cormier Y., Gosselin J. Muramyl dipeptide induces NOD2-dependent Ly6C(high) monocyte recruitment to the lungs and protects against influenza virus infection. PLoS One. 2012; 7 (5): e36734. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0036734

24. Pei G., Zyla J., He L., Moura-Alves P., Steinle H., Saikali P., et al. Cellular stress promotes NOD1/2-dependent inflammation via the endogenous metabolite sphingosine-1-phosphate. EMBO J. 2021; 40 (13): e106272. DOI: https://doi.org/10.15252/embj.2020106272

25. Crow M.K. Type I interferon in the pathogenesis of lupus. J. Immunol. 2014; 192 (12): 5459. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1002795

26. Afshar M., Martinez A.D., Gallo R.L., Hata T.R. Induction and exacerbation of psoriasis with Interferon-alpha therapy for hepatitis C: A review and analysis of 36 cases. J. Eur. Acad. Dermatol. Venereol. 2013; 27 (6): 771. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1468-3083.2012.04582.x

27. Nestle F.O., Conrad C., Tun-Kyi A., Homey B., Gombert M., Boyman O., et al. Plasmacytoid predendritic cells initiate psoriasis through interferon-α production. J. Exp. Med. 2005; 202 (1): 135-143. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.20050500

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»