Влияние капсульного полисахарида и детоксифицированного липополисахарида Shigella sonnei на рост опухолевого узла и синтез цитокинов у мышей линии С57Bl/6 после инокуляции меланомы В16

• Новикова Елена Михайловна
• Козырева Ольга Валентиновна
• Разваляева Надежда Алексеевна
• Чухина Елена Станиславовна
• Головина Марина Эдуардовна
• Львов Вячеслав Леонидович
• Апарин Петр Геннадьевич
• Степаненко Родион Николаевич

Резюме

Введение. Злокачественная меланома представляет собой иммуногенную опухоль, клетки которой распознаются иммунной системой. При определенных условиях иммунная система может подавить развитие злокачественного новообразования. Об этом свидетельствуют клинические наблюдения спонтанной регрессии и полной элиминации опухоли у отдельных больных.

Одним из возможных подходов к индукции регрессии злокачественных опухолей является стимуляция клеток иммунной системы продуктами бактериального происхождения. При этом ключевую роль играют Толл-подобные рецепторы, распознающие консервативные структуры микроорганизмов и активирующие врожденный и адаптивный иммунный ответ.

Цель работы - изучение способности двух соединений бактериальной природы: детоксифицированного липополисахарида (Ас3-S-ЛПС) и капсульного полисахарида (КПС), полученных из микроорганизмов Shigella sonnei фаза 1, стимулировать противоопухолевый иммунный ответ у экспериментальных животных с привитой злокачественной меланомой.

Материал и методы. В качестве модели для проведения исследования использовали перевиваемую клеточную линию меланомы В16 (предоставлена лабораторией клеточного иммунитета НИИ ЭДиТО ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России). О противоопухолевой активности препаратов судили по влиянию препаратов на рост первичных опухолевых узлов (ПОУ) у мышей С57Bl/6J после введения опухолевых клеток. При изучении механизмов противоопухолевой активности оценивали влияние препаратов на образование оксида азота (NO) и синтез цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО и ГМ-КСФ).

Результаты. Показано, что введение мышам Ас3-S-ЛПС и КПС приводит к замедлению роста ПОУ, которое не связано с непосредственным цитотоксическим действием соединений на опухолевые клетки. Ас3-S-ЛПС и КПС, как и нативный ЛПС Shigella sonnei, не способны индуцировать синтез NO клетками меланомы В16. При этом Ас3-S-ЛПС и нативный ЛПС индуцируют его в культуре клеток ПОУ. Показано, что клетки меланомы В16 при культивировании in vitro спонтанно продуцируют 3 из 5 исследованных цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10) и не синтезируют ФНО и ГМ-КСФ. Добавление к клеткам ЛПС Shigella sonnei или Ас3-S-ЛПС стимулировало синтез ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10 и не влияло на синтез двух других цитокинов.

В супернатантах культур ПОУ были обнаружены цитокины ФНО, ГМ-КСФ и ИЛ-4, концентрация которых увеличивалась при добавлении в культуры Ас3-S-ЛПС. Введение Ас3-S-ЛПС непосредственно в ПОУ приводило к стимуляции синтеза ИЛ-10 и не влияло на синтез других цитокинов.

Заключение. На модели перевиваемой меланомы исследована противоопухолевая активность двух соединений бактериальной природы: Ас3-S-ЛПС и КПС микроорганизмов Shigella sonnei фаза 1, ранее не изучавшихся в этом аспекте. Полученные результаты позволяют отнести их к агонистам TLRs, подавляющим рост злокачественной меланомы В16 после инокуляции экспериментальным животным в результате стимуляции реакций врожденного иммунитета. Исследование влияния цитокинов, индуцированных взаимодействием лигандов бактериального происхождения с TLRs на клетках иммунной системы и опухоли, ведет к более глубокому пониманию патофизиологии канцерогенеза и может способствовать разработке приемов таргетной терапии для ингибирования опухолевого роста.

Ключевые слова:противоопухолевая активность; меланома В16; лиганды; Toll-подобный рецептор; липополисахарид; цитокины

Введение

До настоящего времени злокачественная меланома относится к заболеваниям с неблагоприятным прогнозом, которые с трудом поддаются лечению. При этом меланома является иммуногенной опухолью, клетки которой распознаются иммунной системой, а следовательно, при определенных условиях иммунная система может подавить развитие злокачественного новообразования, о чем свидетельствуют клинические наблюдения спонтанной регрессии и полной элиминации опухоли у отдельных больных [1, 2]. На сегодняшний день в качестве одного из возможных подходов к индукции регрессии злокачественных опухолей активно изучается стимуляция клеток иммунной системы продуктами бактериального происхождения [3, 4].

Установлено, что продукты бактериального происхождения способны влиять на иммунную систему через различные типы рецепторов распознавания образов (PAMPs), в частности TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7 и TLR9 [5]. Одним из эффективных стимуляторов клеток иммунной системы, участвующих в противоопухолевом ответе, является липополисахарид (ЛПС) грам-отрицательных бактерий, являющийся лигандом для TLR4. В результате взаимодействия агонистов с TLR4 в антиген-представляющих клетках запускаются программы высвобождения провоспалительных цитокинов, хемокинов и интерферонов типа I с сопутствующим созреванием дендритных клеток (ДК) и миграцией их в лимфатические узлы, где они активируют дифференцировку нативных Т-клеток в опухоль-специфические Т-лимфоциты [6-9].

Следует подчеркнуть, что термин ЛПС означает класс структурно связанных молекул, которые построены в соответствии с общим архитектурным принципом, и препараты ЛПС, выделенные из различных микроорганизмов, могут заметно различаться по своей структуре и биологическим свойствам. Установлено, что ЛПС содержат липидный компонент - липид А, который определяет токсичность грам-отрицательных бактерий и играет ключевую роль в индукции иммунных реакций врожденного иммунитета. При этом самые незначительные структурные различия между очень похожими видами липида А влияют на активацию иммунного ответа, что может позволить использовать их как способ тонкой настройки последнего и даст новое понимание иммуномодулирующих процессов [10].

В настоящее время установлено, что цитокины, синтез которых индуцируется в результате взаимодействия бактериальных лигандов с TLRs, как в клетках иммунной системы, так и в малигнизированных меланоцитах, играют существенную роль в патогенезе злокачественной меланомы [11]. Анализ экспрессии генов цитокинов клеточными линиями меланомы показал, что клетки меланомы конститутивно продуцируют как аутостимулирующие, так и ингибирующие цитокины. С помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией была обнаружена одновременная экспрессия клетками меланомы нескольких цитокинов, включая ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-8, фактор некроза опухоли (ФНОα) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) [12, 13].

В данной работе мы изучали способность двух соединений бактериальной природы, выделенных из штамма Shigella sonnei фаза 1, подавлять рост первичного опухолевого узла (ПОУ) после инокуляции клеток меланомы линии В16 и влиять на продукцию цитокинов как клетками самой меланомы, так и клетками ПОУ. Первое соединение представляет собой ЛПС с длинной цепью О-специфического полисахарида, ковалентно связанного с триацилированным липидом А (Ac3-S-ЛПС), содержащим 3, а не 6 остатков высших жирных кислот, как в липидах А, выделенных из ЛПС различных микроорганизмов. Удаление 3 жирных кислот позволило значительно снизить токсичность, характерную для нативных ЛПС. Второе соединение - капсульный полисахарид, по структуре аналогичный О-специфическому полисахариду штамма Shigella sonnei фаза 1 и содержащий вместо липида А диацилглицерофосфат (КПС) (рис. 1).

Материал и методы

Животные. Мыши линии С57Вl/6J, самки массой 18-20 г, получены из питомника СМК "Стезар". Мыши содержались в виварии отдела лабораторных животных НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России на стандартном пищевом рационе брикетированных экструзированных кормов со свободным доступом к корму и питьевой воде. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными Локальным комитетом по этике (резолюция 4/17 от 13.07.2017). Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя.

Культивирование клеток. Культуру клеток меланомы мыши В16 инкубировали в полной культуральной среде (ПКС), состоящей из RPMI-1640 с 25 мМ HEPES, 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина и 40 мкг/мл гентамицина (все реактивы "ПанЭко", Россия), при 37 °С в увлажненной атмосфере 5 % СО₂. На 4-е сутки клетки снимали раствором трипсин-ЭДТА ("ПанЭко", Россия), отмывали центрифугированием в фосфатном буферном физиологическом растворе (ФБ), ресуспендировали и подсчитывали количество клеток с трипановым синим в камере Горяева.

Культура прилипающих клеток костного мозга. Клетки костного мозга мышей вымывали из трубчатых костей (бедренных и большеберцовых). Клеточную суспензию тщательно ресуспендировали и помещали на 24 ч во флаконе с ПКС в СО₂-инкубатор Galaxy 14S (New Brunswich Scientific, UK). После культивирования клетки, прилипшие ко дну, снимали скребком ("ПанЭко", Россия) и центрифугировали 5 мин при 250 g.

Культура клеток ПОУ. Клетки меланомы В16 вводили мышам линии С57Вl/6J внутримышечно в дозе 100 тыс. опухолевых клеток в 50 мкл ФБ. На 14-е сутки ПОУ выделяли, измельчали, фильтровали через клеточное сито, центрифугировали при 250 g 5 мин. Эритроциты удаляли лизирующим буфером (10 × RBC Lysis Buffer eBioscience, США). Дважды отмывали клетки в ПКС и подсчитывали с трипановым синим в камере Горяева.

Индукция образования ПОУ. Размораживали клетки линии меланомы В16, хранившиеся при температуре -70 °С. Размороженные клетки дважды отмывали средой RPMI-1640 с добавлением 25 мМ HEPES-буфера с помощью центрифугирования при 1000 об/мин в течение 5 мин. Отмытые клетки помещали в пластиковые культуральные флаконы в ПКС и культивировали в течение 4 сут при 37 °С в СО₂-инкубаторе. После образования монослоя, на 4-е сутки, ПКС сливали и ополаскивали флакон средой RPMI-1640 с добавлением 25 мМ HEPES-буфера. В культуральный флакон добавляли раствор для снятия клеток (трипсин-ЭДТА) и инкубировали в течение 5 мин при 37 °С. Полученную клеточную суспензию дважды отмывали с помощью центрифугирования в среде RPMI-1640 с добавлением 25 мМ HEPES-буфера при 1000 об/мин в течение 5 мин. Подсчитывали количество живых клеток в камере Горяева с трипановым синим. Полученные опухолевые клетки вводили мышам С57Вl/6J в количестве 100 тыс. опухолевых клеток в 50 мкл стерильного физиологического раствора внутримышечно в бедро правой задней лапы.

МТТ-тест. Раствор МТТ ("ПанЭко", кат. №: О105/D298931.0005, Россия) в концентрации 5 мг/мл в ФБ был добавлен по 20 мкл в лунки 96-луночного планшета за 4 ч до окончания инкубации клеток В16. Затем среда в каждой лунке была заменена на 200 мкл раствора ДМСО ("ПанЭко", кат. № Ф135, Россия) и планшет помещен на 30 мин на шейкер для растворения кристаллов формазана. Оптическую плотность в каждой лунке определяли с помощью прибора Multiscan ММС/430 (Labsystems, Финляндия) при 540 нм.

Определение оксида азота. Для оценки индукции синтеза оксида азота (NO) клетки культур меланомы В16, прилипающих клеток костного мозга и ПОУ помещали в лунки 24-луночного планшета в количестве 0,5 - 10⁶ клеток в 500 мкл ПКС на 24 ч с добавлением нативного ЛПС, Ас3-S-ЛПС и КПС в количестве 10 мкг/мл в СО₂-инкубатор при 37 °С. После окончания инкубации культуральная среда из отдельных лунок была собрана, центрифугирована 5 мин при 250 g. Супернатанты в объеме 100 мкл были перенесены в 96-луночный планшет, каждая проба в трех повторах. Параллельно был раститрован стандарт (нитрит NO₂) от концентрации 100 мкМ до концентрации 1,56 мкМ, и каждая концентрация внесена в планшет в трех повторах. Еще в 3 лунки была добавлена ПКС. Во все лунки было внесено эквивалентное количество раствора Griess-реагента (Sigma-Aldrich, США), после чего планшет был оставлен в темном месте на 15 мин. Абсорбцию измеряли при длине волны 540 нм на микробиологическом анализаторе Multiscan MCC/340 (Labsystems, Finland).

Определение цитокинов. Клетки меланомы В16 в 96-луночном планшете в количестве 20 тыс. клеток в лунку в объеме 200 мкл ПКС помещали в СО₂-инкубатор (37 °С, 5 % СО₂). Через 24 ч производили полную замену среды с добавлением ЛПС и Ас3-S-ЛПС в количестве 10 мкг/мл и культивировали в течение 48 ч. Планшеты хранили в холодильнике при -70 °С для последующего определения содержания цитокинов в супернатантах.

ПОУ выделяли, получали суспензию клеток, ферментировали согласно инструкции производителя в СО₂-инкубаторе в течение 2 ч на горизонтальном шейкере с помощью ферментов коллагеназы/гиалуронидазы и ДНКазы (Stemcell Technology, Канада). После инкубации клетки фильтровали через клеточное сито с диаметром пор 40 мкм и обрабатывали 2 мМ раствором ЭДТА в ФБ с 5 % эмбриональной телячьей сывороткой в течение 10 мин. 5 мл клеточной суспензии (5 - 10⁷-10 - 10⁷ в 1 мл) осторожно наслаивали на 5 мл среды для разделения клеток Lymholyte-M плотностью 1,0875 (Cedarlane, США) и фракционировали при 1250 g в течение 25 мин. Клетки из интерфазы были отобраны и помещены в лунки 96-луночного планшета по 20 тыс. клеток в объеме 200 мкл ПКС. Последующее культивирование клеток ПОУ проводили аналогично культивированию клеток меланомы В16.

Введение непосредственно в ПОУ раствора Ас3-S-ЛПС в концентрации 2 мкг/мл в объеме 50 мкл проводили дважды с интервалом 24 ч, контрольным животным вводили стерильный ФБ. Через сутки мышей выводили из эксперимента с помощью цервикальной дислокации, выделяли ПОУ и обрабатывали аналогично ПОУ из предыдущего эксперимента, но без добавления в культуру Ас3-S-ЛПС.

Все полученные культуры клеток хранили в холодильнике при -70 °С.

Содержание цитокинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10, ФНО и ГМ-КСФ) в супернатантах определяли с помощью наборов BD Cytometric Bead Array (BD Becton Dickinson and Company, США) согласно протоколу фирмы-производителя.

Проточная цитометрия. Использовали меченые флуорохромами моноклональные антитела фирмы eBioscience (США): CD3 APC, CD8a APC, CD NK1.1PE, CD206PE, CD F4/80 APC, CD86 FITC, CD45R APC. Пробы анализировали на проточном цитометре Gallios 6 Color (Beckman Coulter, США) согласно протоколу фирмы-производителя моноклональных антител.

Статистический анализ данных. Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку (m) по результатам трех независимых экспериментов с использованием программы Excel 13. Для оценки значимости различий между группами использовали t-критерий Стьюдента, различия считали достоверными при уровне значимости р < 0,05.

Результаты

Влияние Ac3-S-ЛПС и КПС на динамику роста ПОУ, индуцированных введением экспериментальным животным клеток меланомы В16

Для изучения влияния Ac3-S-ЛПС и КПС на динамику роста ПОУ трем группам мышей линии С57Вl/6J вводили по 100 тыс. живых клеток меланомы В16. Одновременно с введением клеток опухоли одной группе мышей вводили Ac3-S-ЛПС в дозе 5 мг/кг, другой - КПС в той же дозе, 3-я группа была контрольной. В дальнейшем исследуемые препараты вводили в той же дозе, внутрибрюшинно на 3-и, 8, 13, 23-и и 28-е сутки после инокуляции клеток. На 13-е сутки после начала эксперимента при пальпации в контрольной группе животных в месте введения клеток были обнаружены ПОУ. Начиная с этого момента, каждые 3 дня проводили измерение опухолевых узлов во всех трех группах. Объем образовавшихся узлов (в мм³) определяли по формуле V = (малый диаметр)² × (большой диаметр) × 0,5 [14]. Динамика роста ПОУ представлена на рис. 2.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что введение мышам Ac3-S-ЛПС и КПС приводит к замедлению роста ПОУ, индуцированных введением клеток меланомы В16. При этом эффект от введения препарата с модифицированным липидом А был больше, чем от препарата, в котором вместо липида А к О-специфическому полисахариду был присоединен ацилглицерофосфат.

В следующей серии экспериментов оценивали цитотоксическое действие Ac3-S-ЛПС и КПС на клетки меланомы В16 в культуре in vitro. Для этого клетки меланомы культивировали с данными соединениями в течение 48 ч и затем оценивали с помощью МТТ-теста активность НАДФ-H-зависимых клеточных оксидоредуктаз, которые отражают количество жизнеспособных клеток в культуре [15]. Ни одно из соединений не оказывало существенного влияния на жизнеспособность опухолевых клеток в культуре in vitro (табл. 1).

Таким образом, замедление развития ПОУ после введения Ac3-S-ЛПС и КПС, по-видимому, не связано с непосредственным цитотоксическим действием на опухолевые клетки.

Известно, что одним из первых проявлений взаимодействия агонистов бактериальной природы с клетками, несущими TLRs, является активация индуцибельной NO-синтазы (iNOS) посредством MyD-88-зависимого сигнального пути, что приводит к продукции NO [16, 17]. Поэтому в следующей серии экспериментов мы оценивали влияние Ac3-S-ЛПС и КПС на образование NO клетками меланомы В16 и ПОУ, образующегося после введения клеток меланомы мышам C57Bl/6J.

Добавление Ac3-S-ЛПС и КПС или нативного ЛПС Shigella sonnei в культуры клеток меланомы В16 не приводило к индукции синтеза NO (табл. 2). Средняя оптическая плотность проб после постановки Griess-реакции была < 0,06. Согласно калибровочной кривой это соответствует полному отсутствию NO в супернатантах культур клеток.

Культивирование клеток ПОУ с Ac3-S-ЛПС или с ЛПС Shigella sonnei приводило к появлению NO в супернатантах клеток. При этом способность Ac3-S-ЛПС, содержащего модифицированный липид А, индуцировать синтез NO была значительно ниже, чем у нативного ЛПС. В то же время КПС и в этом случае не индуцировал синтез NO (табл. 3).

В отличие от этого добавление КПС, как и ЛПС и Ac3-S-ЛПС в культуры прилипающих клеток костного мозга индуцировало образование NO (табл. 4).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что неспособность КПС индуцировать образование NO в культуре клеток ПОУ, образующихся после инокуляции клеток меланомы В16, обусловлена не свойствами самого капсульного полисахарида, а, скорее всего, связана с отсутствием или низкой концентрацией в ПОУ клеток, способных на него реагировать.

Таким образом, Ac3-S-ЛПС и КПС, как и нативный ЛПС Shigella sonnei, неспособны индуцировать синтез NO клетками меланомы В16, но при этом Ac3-S-ЛПС и нативный ЛПС индуцируют его при культивировании с клетками ПОУ. По-видимому, это связано с миграцией клеток моноцитарно-макрофагального ряда в опухолевые узлы.

Одним из наиболее значимых для развития противоопухолевого иммунного ответа результатом взаимодействия продуктов микробного происхождения с TLRs является индукция синтеза различных цитокинов.

Поэтому в следующей серии экспериментов мы изучали влияние ЛПС Shigella sonnei и Ac3-S-ЛПС на синтез цитокинов клетками меланомы В16, хранившимися при -70°С, и клетками, выделенными из ПОУ, образовавшихся после введения клеток меланомы В16 экспериментальным животным. Существующие в настоящее время данные свидетельствуют о том, что меланоциты, в том числе малигнизированные, могут спонтанно продуцировать ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-10, ГМ-КСФ и некоторые другие цитокины [18, 19]. При этом клетки различных линий злокачественной меланомы могут продуцировать разные цитокины [18]. Кроме того, на малигнизированных миелоцитах присутствуют TLRs, а следовательно, агонисты TLRs также могут стимулировать в этих клетках синтез цитокинов [11, 20]. Таким образом, эффект применения агонистов будет зависеть, с одной стороны, от их действия на клетки опухоли, а с другой - от способности стимулировать клетки иммунной системы.

Для изучения влияния ЛПС Shigella sonnei и Ac3-S-ЛПС непосредственно на культуру клеток меланомы В16 клетки размораживали, культивировали во флаконах в течение 4 сут, затем в лунках 96-луночных планшетов культивировали с Ac3-S-ЛПС или ЛПС в течение 48 ч и определяли концентрацию цитокинов в супернатантах с помощью наборов BD Cytometric Bead Array.

Из 5 исследованных цитокинов клетки перевиваемой культуры меланомы В16, которую мы использовали в экспериментах, спонтанно продуцируют 3 из них: ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 (рис. 3). Добавление в культуры ЛПС или Ac3-S-ЛПС приводило к стимуляции синтеза этих интерлейкинов. В то же время клетки данной линии ни спонтанно, ни в присутствии ЛПС Shigella sonnei или его производного с модифицированным липидом А не синтезировали ФНО и ГМ-КСФ.

Многочисленными исследованиями установлено, что образование ПОУ сопровождается активной инфильтрацией лимфоцитами, стимуляция которых агонистами TLRs может оказывать существенное влияние на рост опухоли [21-23]. В связи с этим в одной и той же субпопуляции лимфоцитов ПОУ мы параллельно оценивали влияние ЛПС и Ac3-S-ЛПС на синтез цитокинов и содержание клеток. Для изучения субпопуляционного состава клеток, инфильтрирующих ПОУ, выделяли опухолевые узлы, образовавшиеся после инокуляции клеток меланомы В16 мышам линии C57Bl/6J, получали суспензии, которые очищали путем центрифугирования в среде для фракционирования клеток мыши (Lympholyte-М) и собирали клетки, локализовавшиеся в интерфазе.

При анализе клеток из интерфазы методом проточной цитометрии в координатах прямого и бокового рассевания был выявлен гейт, в котором преимущественно содержались лимфоидные клетки, в частности CD3⁺- и CD8⁺-клетки (рис. 4). При аналогичном анализе популяции клеток культуры в данной области цитограммы лимфоцитов не обнаружено. Кроме CD3⁺- и CD8⁺-клеток, в популяции клеток ПОУ были обнаружены клетки, экспрессирующие и другие маркеры (табл. 5).

Присутствие в популяции клеток, инфильтрирующих ПОУ, привело к изменению спектра интерлейкинов, накапливающихся в супернатантах при культивировании клеток in vitro. Так, в этих супернатантах были обнаружены ФНО, ГМ-КСФ и ИЛ-4, которые отсутствовали в супернатантах культур клеток меланомы, при этом увеличилась концентрация всех исследованных цитокинов (рис. 5). Добавление в культуры ЛПС привело к увеличению в супернатантах концентрации ИЛ-1β и ИЛ-10. Ac3-S-ЛПС с модифицированным липидом А также стимулировал продукцию ИЛ-1β, ИЛ-10.

Способность Ac3-S-ЛПС влиять на синтез цитокинов клетками ПОУ и его низкая токсичность позволили оценить эффект от его введения непосредственно в ПОУ в следующей серии экспериментов. Для этого мышам С57Вl/6J после инокуляции клеток меланомы в образовавшиеся ПОУ вводили Ac3-S-ЛПС в концентрации 2 мкг/мл в объеме 50 мкл двукратно с интервалом 24 ч. Контрольным животным в образовавшиеся ПОУ вводили стерильный физиологический раствор. На следующие сутки после введения мышей выводили из эксперимента, выделяли ПОУ, готовили клеточные суспензии, культивировали клетки в течение 48 ч, а затем определяли концентрацию цитокинов в супернатантах клеточных культур (рис. 6).

Введение Ac3-S-ЛПС непосредственно в ПОУ приводило к стимуляции синтеза ИЛ-10 и не влияло на синтез других исследованных цитокинов.

Обсуждение

На модели перевиваемой меланомы В16 была исследована противоопухолевая активность двух соединений бактериальной природы, выделенных из клеток штамма Shigella sonnei фаза 1 (Ac3-S-ЛПС и КПС), ранее не изучавшихся в этом аспекте. Одно из них - Ac3-S-ЛПС - представляет собой длинную цепь О-специфического полисахарида, ковалентно связанного с триацилированным липидом А, содержащим 3, а не 6 остатков высших жирных кислот, как в нативном ЛПС. Второе соединение - КПС - образован аналогичной цепью О-специфического полисахарида Shigella sonnei и содержит вместо липида А диацилглицерофосфат (см. рис. 1).

Введение обоих соединений мышам линии C57Bl/6 с привитой меланомой В16 привело к замедлению роста ПОУ, при этом более активным был ЛПС с модифицированным липидом А (см. рис. 2). Результаты экспериментов по изучению цитотоксического действия Ac3-S-ЛПС и КПС на клетки меланомы В16 в культуре, которое оценивали с помощью МТТ-теста, показали, что ни один из них не оказывает существенного влияния на выживаемость опухолевых клеток в культуре in vitro (см. табл. 1), что свидетельствует об отсутствии прямого цитотоксического действия данных соединений на клетки меланомы.

Таким образом, с достаточно высокой степенью вероятности можно утверждать, что способность полисахаридов Shigella sonnei подавлять рост ПОУ обусловлена стимуляцией реакций иммунной системы. Очевидно, противоопухолевая активность одного из исследованных соединений, а именно Ac3-S-ЛПС, обусловлена наличием в его составе детоксифицированного липида А. Известно, что липид А ЛПС грам-отрицательных микроорганизмов является очень сильным стимулятором реакций врожденного иммунитета, проявляющихся в значительной степени массивным скоординированным высвобождением цитокинов, таких как ИЛ-1β, ИЛ-10, ИЛ-12 и ФНОα и ряда других, а также NO из антиген-представляющих клеток через трехмолекулярный комплекс (CD14-MD2-TLR4).

Удаление 3 жирных кислот из молекулы липида А привело к уменьшению эндотоксических свойств Ac3-S-ЛПС и оказало определенное влияние на его биологическую активность. Так, значительно снизилась способность активировать синтез NO у клеток ПОУ (см. табл. 3). Это можно отнести к положительным свойствам данного соединения, так как установлено, что образование NO стимулирует размножение опухолевых клеток, подавляя активности клеток иммунной системы и ингибируя апоптоз. Также NO стимулирует синтез протуморогенных цитокинов, активирует опухоль-ассоциированные макрофаги и влияет на процессы ангиогенеза в опухоли [17].

Сами клетки меланомы В16 при культивировании с ЛПС или Ac3-S-ЛПС NO не синтезировали (см. табл. 2), что подтверждает ранее опубликованные результаты о неспособности клеток различных линий меланомы В16 после активации ЛПС и ИФН-γ продуцировать обнаруживаемые уровни NO [24].

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что клетки меланомы В16, которую мы использовали для экспериментов, при культивировании in vitro из 5 исследованных цитокинов спонтанно продуцируют ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 и не синтезируют ФНО и ГМ-КСФ. Добавление в культуры ЛПС Shigella sonnei или Ac3-S-ЛПС стимулировало синтез ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 и не влияло на синтез 2 других цитокинов. На основании полученных результатов можно предположить, что, во-первых, стимуляция синтеза цитокинов малигнизированными меланоцитами возможна только в случае, если эти цитокины синтезируются спонтанно и, во-вторых, удаление 3 жирных кислот из липида А не оказывает существенного влияния на способность Ac3-S-ЛПС стимулировать синтез цитокинов клетками меланомы В16 (см. рис. 3).

В отличие от клеток в культуре, клетки ПОУ наряду с цитокинами ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10 спонтанно продуцировали ФНО, ГМ-КСФ и ИЛ-4. По-видимому, это связано с инфильтрацией опухолевых узлов лимфоцитами и макрофагами. Известно, что эти клетки активно мигрируют в опухолевые узлы, особенно на начальных этапах развития опухоли [25].

В ПОУ, развивавшихся после введения животным клеток меланомы В16, присутствовали клетки, экспрессирующие маркеры CD3, CD8, NK1.1, СD206, CDF4/80, CD86, CD45R, что не могло не сказаться на спектре цитокинов, продуцируемых этими клетками. При этом добавление в культуры ЛПС Shigella sonnei или Ac3-S-ЛПС, содержащего детоксифицированный липид А, приводило к статистически достоверной стимуляции синтеза только ИЛ-1β и ИЛ-10. На синтез других исследованных цитокинов оба соединения существенного влияния не оказывали (см. рис. 5).

ИЛ-1β является важным цитокином, который опосредует воспаление, индуцируя каскад провоспалительных молекул [26]. Этот цитокин синтезируется малигнизированными меланоцитами и активно стимулирует рост опухолевых клеток, способствует усилению ангиогенеза в опухолевой ткани и быстрой инвазии опухолевых клеток через стенки сосудов и гематогенному распространению опухоли. С другой стороны, при определенных условиях ИЛ-1β в процессе инициации и роста меланомы может иметь противоположную функцию - способствовать замедлению ее роста. В частности, ИЛ-1β может усиливать противоопухолевую активность натуральных киллеров и макрофагов - клеток, осуществляющих противоопухолевый надзор, стимулировать продукцию Т-лимфоцитами ИЛ-2, ИЛ-4, ИФН-γ и колониестимулирующих факторов, которые потенциально обладают способностью к противоопухолевым эффектам [27-29].

ИЛ-10, как и ИЛ-1β, синтезируется малигнизированными меланоцитами, но в отличие от него является противовоспалительным цитокином, ингибирующим синтез провоспалительных цитокинов. Так, рекомбинантный ИЛ-10 и супернатант культуры клеток меланомы подавляли синтез ФНОα, ИФН-γ и ИЛ-2 клетками периферической крови человека, стимулированными ФГА [17]. При развитии противоопухолевого иммунного ответа ИЛ-10 преимущественно продуцируется активированными Т-клетками и антиген-представляющими клетками [30]. Предполагается, что функция ИЛ-10 состоит в подавлении воспалительной реакции, при этом высокие дозы этого цитокина стимулируют цитотоксическую активность и пролиферацию CD8⁺-Т-клеток [31]. Показано, что ИЛ-10 стимулирует размножение и активацию инфильтрирующих опухоль CD8⁺-Т-клеток [32].

Таким образом, ЛПС Shigella sonnei и его производное Ac3-S-ЛПС, содержащее детоксифицированный липид А, при добавлении в культуры клеток ПОУ стимулировали продукцию цитокинов, оказывающих, согласно данным литературы, оппозитное влияние на развитие противоопухолевого иммунного ответа [19, 28].

Детоксикация Ac3-S-ЛПС путем удаления остатков 3 жирных кислот из липида А сделала возможным введение его непосредственно в ПОУ. Оценка синтеза интерлейкинов после его введения in vivo показала, что в этом случае он стимулировал синтез только ИЛ-10 (см. рис. 6), а это позволяет предположить, что противоопухолевая активность Ac3-S-ЛПС в определенной степени обусловлена способностью увеличивать продукцию этого интерлейкина, оказывающего стимулирующее влияние на активность цитотоксических лимфоцитов, инфильтрирующих опухолевый узел.

В то же время КПС, в котором нет липида А, также замедлял рост ПОУ, хотя и в гораздо меньшей степени, чем Ac3-S-ЛПС (см. рис. 2). Можно предположить, что противоопухолевая активность КПС связана с наличием в его молекуле цвиттерионных структур, которые, являясь агонистами TLR2, могут активировать антиген-представляющие клетки и Т-лимфоциты [33]. Данное предположение требует дальнейших исследований.

Таким образом, результаты, полученные после изучения двух соединений бактериальной природы - Ac3-S-ЛПС и КПС, позволяют отнести их к агонистам TLRs, оказывающим противоопухолевый эффект при введении экспериментальным животным с привитой меланомой. Один из них, а именно Ac3-S-ЛПС, перспективен для дальнейшего изучения с целью использования в клинической практике при злокачественной меланоме.

Заключение

На модели перевиваемой меланомы была исследована противоопухолевая активность двух соединений бактериальной природы: Ac3-S-ЛПС и КПС Shigella sonnei, ранее не изучавшихся в этом аспекте.

Введение обоих соединений мышам линии С57Bl/6J с привитой меланомой привело к замедлению роста ПОУ, что не связано с прямым цитотоксическим действием препаратов на клетки меланомы.

Детоксикация ЛПС посредством удаления 3 жирных кислот из молекулы липида А привела к уменьшению эндотоксических свойств Ас3-S-ЛПС, снижению способности активировать синтез NO у клеток ПОУ, но не оказала существенного влияния на стимуляцию продукции цитокинов. Введение Ас3-S-ЛПС непосредственно в ПОУ приводит к усилению синтеза ИЛ-10. Вероятно, с этим и связана его противоопухолевая активность. Возможно, противоопухолевая активность КПС, в котором нет липида А - агониста TLR4, связана с наличием в его молекуле цвиттерионных структур, которые являются агонистами TLR2.

Результаты, полученные в результате изучения Ac3-S-ЛПС и КПС, позволяют отнести их к агонистам TLRs, способным ингибировать рост ПОУ, образующегося после инокуляции экспериментальным животным клеток меланомы, и влиять на продукцию цитокинов клетками как самой меланомы, так и ПОУ. Исследование влияния цитокинов, индуцированных взаимодействием лигандов бактериального происхождения с TLRs на клетках иммунной системы и опухоли, ведет к более глубокому пониманию патофизиологии канцерогенеза и может способствовать разработке приемов таргетной терапии для ингибирования опухолевого роста.

Литература

1. Kucerova P., Cervinkova M. Spontaneous regression of tumour and the role of microbial infection - possibilities for cancer treatment. Anticancer Drugs. 2016; 27: 269-77. DOI: https://www.doi.org/10.1097/CAD.0000000000000337

2. Cervinkova M., Kucerova P., Cizkova J. Spontaneous regression of malignant melanoma - is it based on the interplay between host immune system and melanoma antigens? Anticancer Drugs. 2017; 28 (8): 819-30. DOI: https://www.doi.org/10.1097/CAD.0000000000000526

3. Yamada S., Nawata A., Yoshioka M., Hiraki T., Higashi M., Hatanaka K., Tanimoto A. Complete regression of primary cutaneous malignant melanoma associated with distant lymph node metastasis: a teaching case mimicking blue nevus. BMC Res Notes. 2016; 9: 366. DOI: https://www.doi.org/10.1097/CAD.0000000000000526

4. Blenman K.R.M., Wang J., Cowper S., Bosenberg M. Pathology of spontaneous and immunotherapy-induced tumor regression in a murine model of melanoma pigment Cell. Melanoma Res. 2019; 32 (3): 448-57. DOI: https://www.doi.org/10.1111/pcmr.12769

5. Mortaz E., Adcock I.M., Tabarsi P., Masjedi M.R., Mansouri D., Velayati A.A., Casanova J.-L. Barnes P.J. Interaction of Pattern Recognition Receptors with Mycobacterium Tuberculosis. J. Clin. Immunol. 2015; 35 (1): 1-10. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s10875-014-0103-7

6. Wculek S.K., Cueto F.J., Mujal A.M., Melero I., Matthew F., Krummel M.F., Sancho D. Dendritic cells in cancer immunology and immunotherapy. Nat. Rev. Immunol. 2020; 20 (1): 7-24. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41577-019-0210-z

7. Ghochikan A., Pichugin A., Bagaev A., Davtyan A., Hovakimyan A., Tukhvatulin A., Davtyan H., Shcheblyakov D., Logunov D., Chulkina M., Savilova A., Trofimov D., Nelson E.L., Agadjanyan M.G., Ataullakhanov R.I. Targeting TLR-4 with a novel pharmaceutical grade plant derived agonist, Immunomax^®, as a therapeutic strategy for metastatic breast cancer. Journal of translational medicine. 2014; 12: 322-3. DOI: https://www.doi.org/10.1186/s12967-014-0322-y

8. Пичугин А.В., Подсвирова С.А., Ушакова Е.И., Спирин Д.М., Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения повышает эффективность блокады рецепторов CTLA-4 и PD-1 при иммунотерапии злокачественной меланомы в эксперименте. Иммунология. 2022; 43 (6): 673-90. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-673-690

9. Ушакова Е.И., Пичугин А.В., Федорова А.А., Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И. Интенсивность противоопухолевых иммунных реакций на иммунизацию вакцинами Multivac против карциномы 4T1 у мышей BALB/c и меланомы B16 у мышей C57BL/6J не зависит от генотипа "хозяина" и тканевой природы опухоли. Иммунология. 2022; 43 (6): 691-701. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-691-701

10. Zamyatina A., Heine H. Lipopolysaccharide recognition in the crossroads of TLR4 and Caspase-4/11 mediated inflammatory pathways. Front. Immunol. 2020; 11: 585146. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2020.585146

11. Coati I., Miotto S., Zanetti I., Alaibac M. Toll-like receptors and cutaneous melanoma. Oncol Lett. 2016; 12 (5): 3655-61. DOI: https://www.doi.org/10.3892/ol.2016.5166

12. Krüger-Krasagakes S., Krasagakis K., Garbe C., Diamantstein T. Production of cytokines by human melanoma cells and melanocytes. Recent. Results Cancer Res. 1995; 139: 155-68. DOI: https://www.doi.org/10.1007/978-3-642-78771-3_11

13. Xu X., Dai W., Li C. Interleukins in the treatment of melanoma. Chin. Med. J. 2022; 135 (4): 393-9. DOI: https://www.doi.org/10.1097/CM9.0000000000001929

14. Quidville V., Segond N., Pidoux E., Cohen R., Jullienne A., Lausson S. Tumor growth inhibition by indomethacin in a mouse model of human medullary thyroid cancer: Implication of cyclooxygenases and 15-hydroxyprostaglandin dehydrogenase. Endocrinology. 2004; 145: 2561-71. DOI: https://www.doi.org/10.1210/en.2003-0915

15. Аникина Л.В., Пухов С.А., Дубровская Е.С., Афанасьева С.В., Клочков С.Г. Сравнительное определение жизнеспособности клеток с помощью МТТ и ресазурина. Фундаментальные исследования. 2014; 12 (7): 1423-7.

16. Abdul-Cader M.S., Amarasinghe A., Abdul-Careem M.F. Activation of toll-like receptor signaling pathways leading to nitric oxide-mediated antiviral responses. Arch. Virol. 2016; 161: 2075-86. DOI: https://www.doi.org/10.1007/s00705-016-2904-x

17. Yarlagadda K., Hassani J., Foote I.P., Markowitz J. The role of nitric oxide in melanoma. Biochim. Biophys. Acta. Rev. Cancer. 2017; 1868 (2): 500-9. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.bbcan.2017.09.005

18. Armstrong C.A., Tara D.C., Hart C.E., Kock A., Luger T.A., Ansel J.C. Heterogeneity of cytokine production by human malignant melanoma cells. Exp. Dermatol. 1992; 1 (1): 37-45. DOI: https://www.doi.org/10.1111/j.1600-0625.1992.tb00070.x

19. Chen Q., Daniel V., Maher D.W., Hersey P. Production of IL-10 by melanoma cells: examination of its role in immunosuppression mediated by melanoma. Int. J. Cancer. 1994; 56 (5): 755-60. DOI: https://www.doi.org/10.1002/ijc.2910560524

20. Huang B., Zhao J., Li H., He K.-L., Chen Y., Mayer L. Jay C., Unkeless M.C., Xiong H. Toll-Like Receptors on Tumor Cells Facilitate Evasion of Immune Surveillance. Cancer Res. 2005; 65 (12): 5005-14. DOI: https://www.doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-05-0784

21. Lund A.W., Medler T.R., Leachman S.A., Coussens L.M. Lymphatic Vessels, Inflammation, and Immunity in Skin Cancer. Cancer Discov. 2016; 6 (1): 22-35. DOI: https://www.doi.org/10.1158/2159-8290.CD-15-0023

22. Yusubalieva G.M., Petrichuk S.V., Krivoshapkin A.L., Kedrova A.G., Ivanov Yu.V., Vinokurov A.G., Kalinkin A.A., Sandjarov A.E., Kim S.V., Ponomarev A.V., Kuptsova D.G., Ischenko R.V., Troitsky A.V., Baklaushev V.P. Tumor inflating lymphocytes. Purification, expanding and cytotoxicity analysis on primary tumor cultures. Journal of Clinical Practice. 2020; 11 (1): 49-58. DOI: https://www.doi.org/10.17816/clinpract33974

23. Maibach F., Sadozai H.S., Jafari S.M.S., Robert E., Hunger R.E., Schenk M. Tumor-infiltrating lymphocytes and their prognostic value in cutaneous melanoma. Front. Immunol. 2020; 11: 2105. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fimmu.2020.02105

24. Wang B., Xiong Q., Shi Q., Tan D., Le X., Xie K. Genetic disruption of host nitric oxide synthase II gene impars melanoma-induced angiogenesis and suppresses pleural effusion. Int. J. Cancer. 2001; 91: 607-61. PMID: 11267968

25. Gata V.A., Lisencu C.I., Vlad C.I., Piciu D., Irimie A., Achimas-Cadariu P. Tumor infiltrating lymphocytes as a prognostic factor in malignant melanoma. Review of the literature. J. BUON 2017; 22 (3): 592-8. PMID: 28730761

26. Apte R.N., Voronov E. Is interleukin-1 a good or bad ‘guy’ in tumor immunobiology and immunotherapy? Immunol. Rev. 2008; 222: 222-41. DOI: https://www.doi.org/10.1111/j.1600-065X.2008.00615.x

27. Okamoto M., Liu W., Luo Y., Tanaka A., Cai X., Norris D.A., Dinarello C.A., Fujita M. Constitutively active inflammasome in human melanoma cells mediating autoinflammation via caspase-1 processing and secretion of interleukin-1beta. J. Biol. Chem. 2010; 285: 6477-88. DOI: https://www.doi.org/10.1074/jbc.M109.064907

28. Voronov E., Shouval D.S., Krelin Y., Cagnano E., Benharroch D., Iwakura Y., Dinarello C.A., Apte R.N. IL-1 is required for tumor invasiveness and angiogenesis. PNAS. 2003; 100: 2645-50. DOI: https://www.doi.org/10.1073/pnas.0437939100

29. Qin Y., Ekmekcioglu S., Liu P., Duncan L.M., Lizée G., Poindexter N., Grimm E.A. Constitutive aberrant endogenous interleukin-1 facilitates inflammation and growth in human melanoma. Mol. Cancer Res. 2011; 9: 1537-50. DOI: https://www.doi.org/10.1158/1541-7786.MCR-11-0279

30. Asadullah K., Sterry W., Volk H.D. Interleukin-10 therapy - review of a new approach. Pharmacol. Rev. 2003; 55: 241-69. DOI: https://www.doi.org/10.1124/pr.55.2.4

31. Moore K.W., de Waal Malefyt R., Coffman R.L., O’Garra A. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Ann Rev Immunol. 2001; 19: 683-765. DOI: https://www.doi.org/10.1146/annurev.immunol.19.1.683

32. Naing A., Papadopoulos K.P., Autio K.A., Ott P.A., Patel M.R., Wong D.J., Falchook G.S., Pant S., Whiteside M., Rasco D.R., Mumm J.B., Chan I.H., Bendell J.C., Bauer T.M., Colen R.R., Hong D.S., Van Vlasselaer P., Tannir N.M., Oft M., Infante J.R. Safety, antitumor activity, and immune activation of pegylated recombinant human interleukin-10 (AM0010) in patients with advanced solid tumors. J. Clin. Oncol. 2016; 34: 3562-9. DOI: https://www.doi.org/10.1200/JCO.2016.68.1106

33. Gallorini S., Berti F., Parente P., Baronio R., Aprea S., D’Oro U., Pizza M., Telford J.L., Wack A. Introduction of Zwitterionic Motifs into Bacterial Polysaccharides Generates TLR2 Agonists Able to Activate APCs. J. Immunol. 2007; 179: 8208-15. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.179.12.8208