Морфин-специфические антигенные и функциональные свойства поли- и моноклональных антиидиотипических антител

• Трофимов А.В.
• Горбунов Н.П.
• Ищенко А.М.
• Рак А.Я.
• Симбирцев А.С.
• Гамалея Н.Б.
• Ульянова Л.И.
• Берзина А.Г.
• Климова Т.А.

Резюме

Антиидиотипические антитела, имитирующие образ антигена, могут быть использованы в качестве вакцин для профилактики и лечения различных болезней, в том числе наркотической зависимости. Их использование особенно актуально в тех случаях, когда применение в качестве антигенов препаратов, обладающих психотропным действием, ограничено законом. В настоящей работе исследованы антигенные и функциональные свойства нескольких типов антиидиотипических моно-и поликлональных антител (Ab2) к производным морфина. Для получения АЬ2 были использованы два типа первичных моноклональных антител (МкАт) (АЬ1): 3К11 и 6G1, обладающие различной специфичностью, которые в свою очередь были получены в ответ на иммунизацию конъюгатами производных морфина с бычьим сывороточным альбумином. Иммунизация кроликов всеми полученными типами АЬ2 стимулировала продукцию антител III поколения (АЬ3), которые, подобно первичным антителам АЬ1, взаимодействовали с исходными антигенами - производными морфина. Наблюдалось различие в специфичности Ab1 и АЬ3, выявленное с использованием дифференциального иммуноферментного анализа. МкАт АЬ1 типов 3К11 и 6G1 обладали более узкой специфичностью и распознавали только свои иммуногены, обозначенные как конъюгаты КММ-БСА, ФАМ-БСА и ГСМ-БСА. При этом АЬ1 К11 взаимодействовали с первыми двумя конъюгатами, а 6G1 - c ГСМ-БСА. В отличие от них АЬ3, полученные при иммунизации типами АЬ2 К11 и G1, взаимодействовали со всеми конъюгатами производных морфина, которыми проводилась первичная иммунизация. Концентрация АЬ3 в ответ на иммунизацию МкАт многократно превышала титр антител, полученных при введении поликлональных антител, что свидетельствует о принадлежности МкАт АЬ2 к β-типу. Изучение функциональной активности АЬ2 показало, что все типы данных антител при концентрациях 37,5-75 нМ, подобно морфину, стимулировали пролиферацию клеток глиобластомы линии T98G, на мембране которых присутствует значительное количество опиоидных рецепторов преимущественно μ- и κ-типов. В то же время морфин оказывал максимальный пролиферативный эффект при концентрации 20 мкМ. Антагонист опиатных рецепторов налоксон полностью блокировал пролиферативные эффекты АЬ2 и морфина, что подтверждает специфичность действия полученных антиидиотипических антител.

Ключевые слова:антиидиотипические антитела; антитела; глиобластома человека линии T98G; синтез ДНК; иммуноферментный анализ; моноклональные антитела; поликлональные антитела; производные морфина

Активная иммунизация (вакцинация) в настоящее время широко применяется в мире для защиты организма от инфекционных заболеваний и при лечении опухолей. Однако не менее актуальной является разработка вакцин для иммунопрофилактики наркомании [1-4]. При разработке вакцин против действия наркотиков возникает ряд проблем, затрудняющих использование традиционных подходов к их получению. В частности, использование самих психотропных молекул в качестве антигенов для вакцинации людей затруднено, а в ряде стран, включая Россию, невозможно из-за законодательных запретов. Помимо этого, психотропные молекулы, такие как морфин, героин и другие, относятся к низкомолекулярным веществам и, следовательно, являются слабыми иммуногенами. В этих случаях для стимуляции Т- и В-зависимого иммунного ответа исследователи идут по пути создания комплексов, представляющих собой конъюгаты целевого психоактивного вещества с молекулами-носителями, в качестве которых используются высокомолекулярные белки и гликопротеины. Однако в этом случае возможен риск возникновения побочных эффектов, включающих анафилактические реакции, аутоиммунный ответ и др.

Перспективным подходом к созданию вакцин против опиатов является использование для иммунизации в качестве антигенов вторичных антиидиотипических (АИ) антител (Ab2) [5-7]. Как известно, по своим свойствам они подразделяются на три типа: Ab2α, Ab2β и Ab2γ. Ab2α взаимодействуют с Ab1, но не блокируют взаимодействие Ab1 с антигеном. Антитела Ab2γ способны к взаимодействию с активным центром Ab1 и блокируют связывание Ab1 с антигеном, но при иммунизации не вызывают образования антител, специфичных к антигену (Ab3). Антитела Ab2, относящиеся к β-типу, воссоздают паратопом молекулярную мимикрию отдельных участков исходного антигена, к которым были получены первичные антитела Ab1 [8]. Таким образом, главной задачей при создании эффективной вакцины для профилактики и лечения опиатной зависимости является получение Ab2, стимулирующих продукцию высокоспецифических антител к опиатам.

В связи с этим ранее в ответ на иммунизацию 3-О-карбоксиметильным и 6-гемисукцинильным производными морфина были получены два типа Ab1 моноклональных антител (МкАт) - 3К11 и 6G1, обладающих различной специфичностью по отношению к молекуле морфина [9], которые были использованы в качестве антигенов для получения поли- и моноклональных антител II поколения Ab2. Было показано, что полученные антитела являются АИ. При этом антитела НАМ-К11 и АИ-К11B распознают идиотип МкАт 3К11, а НАМ-G1 и АИ-G1 - идиотип МкАт 6G1. В настоящей работе были исследованы иммуноспецифические свойства полученных антител и их способность стимулировать продукцию антител Ab3 к исходным опиатам. Была также изучена способность Ab2-антител связываться с опиатными рецепторами, присутствующими на клетках глиобластомы человека линии T98G.

Материал и методы

МкАт АИ-K11B и АИ-G1 были получены иммунизацией мышей линии Balb/c конъюгатами гемоцианина лимфы улитки с моноклональными антителами 3K11 и 6G1 в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) в дозе 10 мкг на мышь. На 30-й день после иммунизации животным вводили внутривенно 5 мкг МкАт 3K11 или 6G1 в физиологическом растворе. На 4-й день после инъекции животных забивали цервикальной дислокацией и выделяли спленоциты и лимфоциты паховых и брюшных лимфоузлов. Полученные клетки смешивали с клетками миеломы мыши линии SP 2/0 в соотношении 2 : 1. Гибридизацию клеток проводили 50% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) по стандартной технологии [9].

МкАт мыши Ab1 и Ab2 были наработаны в перитонеальной полости сингенных мышей линии BALB/c (ФГУП "Питомник лабораторных животных Рапполово") введением клеток-продуцентов и выделены из асцитной жидкости методом аффинной хроматографии на сорбенте MabSelect-сефароза (GE, США) согласно инструкции, предложенной производителем.

Поликлональные АИ-антитела Ab2 были получены иммунизацией лошади первичными антителами Ab1: 3К11 и 6G1. Поликлональные антитела НАМ-К11 и НАМ-G1 на первом этапе истощали из гипериммунной сыворотки крови лошади с использованием сорбента с иммобилизованными общими иммуноглобулинами мыши с целью удаления антител против видоспецифических детерминант иммуноглобулина (Ig) мыши. Далее с использованием иммуносорбентов 3К11-сефарозы и 6G1-сефарозы, синтезированных путем иммобилизации первичных антител Ab1 на сефарозу-6CL (GE, США), получали препарат очищенных поликлональных АИ-антител.

Определение АИ-специфичности поли- и моноклональных Ab2 антител проводили посредством иммуноферментного анализа (ИФА). При этом в лунки планшетов с сорбированными первичными МкАт 3K11 или 6G1 вносили растворы Ab2, а затем после инкубации и отмывки в лунки добавляли конъюгаты соответствующих первичных антител с пероксидазой хрена. Реакцию, подтверждающую специфичность АИ-антител, проявляли добавлением субстрата.

Для получения антител III поколения Ab3 использовали МкАт мыши АИ-К11B и АИ-G1, а также поликлональные антитела лошади НАМ-К11 и НАМ-G1. Антитела вводили кроликам-самцам породы советская шиншилла в возрасте 5-6 мес и массой 1,5-2,0 кг (ФГБНУ "Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии", пос. Вольгинский, Петушинский район, Владимирская обл.).

Для изучения иммуноспецифичности были использованы производные морфина КММ, ФАМ и ГСМ, конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином с помощью бифункционального реагента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида, которые далее обозначены как КММ-БСА, ФАМ-БСА и ГСМ-БСА конъюгаты [10]. Строение этих конъюгатов схематически показано на рис. 1.

Для изучения антигенных свойств полученных АИ-антител Ab2 проводили иммунизацию кроликов очищенными поликлональными антителами НАМ-К11 и НАМ-G1, а также МкАт АИ-К11B и АИ-G1 способами, схематично представленными в табл. 1.

Определение специфичности Ab3 в сыворотке крови кроликов проводили методом ИФА. В качестве захватывающих антигенов использовали КММ-БСА, ФАМ-БСА и ГСМ-БСА, которые иммобилизовали на дне лунок планшетов для ИФА путем инкубации раствора конъюгата 10 мкг/мл в 20 мМ боратном буфере (рН 8,0), содержащем 0,15 М NaCl (посадочный буфер), 20 ч при комнатной температуре. По окончании сорбции планшеты отмывали промывочным буфером (посадочный буфер, содержащий 0,05% Tween-20) и в лунки вносили по 100 мкл тестируемых антител: Ab3 кролика, МкАт Ab1 3К11 и 6G1. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при перемешивании при 37 °С. Затем в трижды промытый планшет вносили растворы антивидового пероксидазного конъюгата антител козы против иммуноглобулинов кролика или мыши (Sigma, США) в концентрации 0,5 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при перемешивании при 37 °С, после чего тщательно отмывали и проводили окрашивание с помощью раствора субстрата тетраметилбензидина (XEMA, Россия).

Для определения временной динамики образования антител кровь из ушной вены кроликов отбирали на 16, 28, 31, 37 и 50-й дни после последней иммунизации. Уровень антител Ab3 в сыворотке крови кроликов определяли методом ИФА. В этом варианте анализа на дно лунок планшетов для ИФА смесь конъюгатов КММ-БСА и ГСМ-БСА иммобилизовали путем инкубации раствора, содержащего в посадочном буфере по 5 мкг/мл каждого конъюгата в течение 20 ч. По окончании сорбции антигена планшеты отмывали промывочным буфером и в лунки вносили по 100 мкл тестируемых Ab3, которые предварительно готовили в виде 10-кратных серийных разбавлений. В качестве стандарта для определения концентрации специфических антител в сыворотках иммунных животных использовали выделенные с помощью иммуноаффинной хроматографии антитела Ab1 кролика, иммунизированного конъюгатами КММ-БСА и ГСМ-БСА. Все дальнейшие стадии анализа совпадали с завершающими стадиями при определении специфичности антител. По калибровочной кривой зависимости интенсивности OD₄₅₀ от концентрации антител с учетом разбавления определяли содержание Ab3 в сыворотке.

Оценку биологической активности поли- и моноклональных Ab2 по сравнению с морфином проводили in vitro на перевиваемой клеточной линии глиобластомы человека T98G с двойным набором хромосом (2n = 46, модальное число хромосом - 128-132), которая экспрессирует на своей поверхности опиоидные рецепторы [11]. Культивирование клеточной линии проводили на культуральной среде (КС) DMEM (Sigma, США), которая содержала 2 мМ L-глутамина, 1% пирувата натрия, 10% фетальной телячьей сыворотки (Sigma, США) и 1% набор аминокислот (NEAA, Sigma, США). Для постановки анализа определения функциональной активности АИ-антител предварительно готовили в КС серии двукратных разбавлений исследуемых препаратов в диапазоне 5-300 нМ. В 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты (Sigma, США) вносили по 100 мкл на ячейку приготовленных проб и КС, содержащую клетки линии T98G с концентрацией 5 - 10⁵ клеток в 1 мл КС. Контролем служила КС, не содержащая испытуемых веществ. Планшеты помещали на 48 ч в термостат с влажностью 80%, содержанием 5% СО₂ и температурой 37 °С. За 16 ч до окончания инкубации в лунки вносили метил-³Н₁-тимидин. Интенсивность биологического эффекта психоактивного вещества оценивали по активности синтеза ДНК клеточных культур, которую измеряли по скорости включения метил-³Н₁-тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Для этого из культуральных планшетов удаляли КС и вносили в каждую лунку по 0,2 мл 0,25% раствора Трипсин/ЭДТА. Планшеты помещали в термостат при 37 °С на 15 мин. После отделения клеток от пластика проводили осаждение полученной суспензии клеток T98G на стекловолокнистом фильтре с помощью полуавтоматического сборщика клеток Cell Harvester (Flow Lab, США). Фильтры помещали в стеклянные флаконы со сцинтилляционной жидкостью, содержащей 0,35% РРО и 0,005% РОРОР в толуоле. Интенсивность реакции образцов измеряли на β-счетчике TRI−CARB 2100TR (Perkin Elmer, США). Результаты измерения выражали в имп/мин и рассчитывали для каждой культуры. Каждая экспериментальная группа состояла из 2 идентичных культур.

Результаты исследований выражали выборочным средним χ ± s (выборочное стандартное отклонение). Нормальность распределения определяли по критериям Лиллиефорса и Шапиро-Уилка. Для переменных с нормальным распределением применяли дисперсионный анализ (ANOVA) повторных измерений. Множественные сравнения проведены по критериям Ньюмена-Кейлса и Даннета. Для сравнения трех зависимых групп и более по одному признаку (стимулирующей пролиферацию активности при одной и той же концентрации препарата) был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) повторных измерений, так как эксперименты по оценке влияния различных препаратов были выполнены на одних и тех же культурах клеток [12].

Результаты

В табл. 2 представлены результаты изучения иммунологической специфичности Ab1-антител 3К11 и 6G1, а также антител Ab3 кроликов, иммунизированных Ab2-антителами - поликлональными НАМ-К11 и НАМ-G1 или моноклональными АИ-К11B и АИ-G1. В наименованиях антител Ab3 указан тип иммуногена.

Как видно из табл. 2, все типы Ab2-антител стимулируют продукцию поликлональных антител Ab3, которые распознают различающиеся по структуре три типа производных морфина (см. рис. 1). В то же время следует отметить, что Ab1 3K11 и 6G1, к идиотипу которых получены исследуемые Ab2, не распознают ГСМ-БСА или КММ-БСА и ФАМ-БСА соответственно.

В табл. 3 представлены данные по зависимой от времени динамике продукции Ab3 при иммунизации кролика МкАт АИ-К11B и АИ-G1. Дни отбора крови отсчитывали после последней иммунизации.

Как видно из табл. 3, концентрация антител в крови кролика, иммунизированного МкАт Ab2, возрастала от 4,8 до 33,5 мкг/мл. Концентрация Ab3 при иммунизации поликлональными Ab2 не достигала 0,2 мкг/мл, находясь на уровне предела чувствительности используемой тест-системы, что не позволило изучить кинетику иммунного ответа НАМ-К11 и НАМ-G1.

Влияние поли- и моноклональных Ab2 к морфину на интенсивность синтеза ДНК изучали на клеточной линии глиобластомы человека Т98G. Первоначально было протестировано воздействие налоксона и нормальных Ig мыши и лошади на этот процесс. Полученные данные представлены в табл. 4, они отражают воспроизводимость измерений и фоновое значение измеряемых величин.

На рис. 2 представлены результаты оценки влияния морфина на интенсивность пролиферативной активности клеток глиобластомы линии Т98G по включению метил-³Н₁-тимидина во вновь синтезируемую ДНК.

Как видно из рис. 2, максимальный уровень интенсивности синтеза ДНК достигался при концентрации морфина 20 000 нМ, что значимо отличало эту величину от контроля (критерий Ньюмена-Кейлса q = 183,740, критерий Даннета q’ = 129,924), а также от значений при всех других концентрациях.

На рис. 3 представлены данные, отражающие усиление пролиферативного ответа клеток глиобластомы линии Т98G при инкубации с поликлональными Ab2-антителами лошади НАМ-К11 или НАМ-G1.

Как видно из рис. 3, пик стимулирующей пролиферацию активности антител HAM-K11 соответствовал концентрации 75 нМ, что значимо отличало ее от контроля (критерий Ньюмена-Кейлса q = 362,457, критерий Даннета q’ = 256,296), а также от значений при всех других концентрациях. Пик стимулирующей активности антител HAM-G1 достигался при концентрации 37,5 нМ, что также значимо отличало эту величину от контроля (критерий Ньюмена-Кейлса q составил 97,810, а критерий Даннета q’ = 69,162) и от всех других исследованных концентраций.

Влияние МкАт Ab2 АИ-К11B или АИ-G1 на интенсивность синтеза ДНК в клетках культуры линии T98G в диапазоне концентраций от 5 до 300 нМ представлено на рис. 4.

Динамика синтеза ДНК в тестируемой культуре клеток, как следует из рис. 4, при стимуляции МкАт АИ Ab2 не отличалась от таковой при использовании поликлональных антител. Пик стимулирующей активности антител АИ-К11B соответствовал, как и в случае НАМ-К11, концентрации препарата 75 нМ, что значимо отличало ее от контроля (критерий Ньюмена-Кейлса q = 85,201, критерий Даннета q’ = 60,246), а также от значений при всех других концентрациях антител. Максимум стимулирующей активности АИ-G1 достигался при концентрации 37,5 нМ. Значимость отличий пиковой концентрации от контроля и всех других исследованных концентраций антител подтверждалась соответствующими критериями (q = 94,218; q’ = 66,622).

Изучение действия налоксона на стимуляцию синтеза ДНК проводили в пробах, в которых содержание морфина и АИ-антител соответствовало концентрации препарата с максимальной пролиферативной активностью (см. рис. 3, 4). Концентрация налоксона составляла 6,25 мкг/мл. Во всех вариантах анализа налоксон эффективно подавлял до контрольных значений синтез ДНК, стимулированный морфином и АИ-антителами. На рис. 5 представлены результаты влияния налоксона на стимуляцию пролиферативной активности клеток культуры линии T98G, вызванную Ab2 и морфином.

Обсуждение

Как видно из полученных результатов, поли- и моноклональные Ab2 индуцировали выработку третичных поликлональных Ab3-антител к производным морфина у иммунизированных кроликов. Ab3 по иммунологическим свойствам отличались от моноклональных Ab1 3К11 и 6G1, к которым были получены АИ-антитела Ab2. В противоположность тому, что МкАт 3К11 не взаимодействовали с конъюгатом ГСМ-БСА, а МкАт 6G1 - с конъюгатами КММ-ВСА и ФАМ-БСА, все Ab3 проявляли кросс-реактивность по отношению к трем вышеописанным конъюгатам производных морфина (см. рис. 1). Поскольку МкАт 3К11 и 6G1 распознавали разные участки морфина, АИ-антитела, полученные к Ab1, должны имитировать конформацию этих участков. Иммунизация животных разными по специфичности Ab2 привела к генерации Ab3 одинаковой специфичности. Как правило, к молекулам малого размера, к которым относится морфин с молекулярной массой 324 Да, трудно получить антитела к двум независимым участкам. Мы полагаем, что полученные Ab1 3К11 и 6G1 обладают перекрестной специфичностью к определенному участку молекулы морфина. Возможно, этот участок конформационно представлен в паратопах двух типах Ab2, что привело к синтезу антител более широкой специфичности.

Концентрация Ab3 при иммунизации животных поликлональными АИ-антителами НАМ-К11 и НАМ-G1 не превышала 200 нг/мл, в то время как концентрация Ab3 в ответ на иммунизацию моноклональными АИ-К11B и АИ-G1 достигала 30 мкг/мл. Низкий титр антител Ab3, вызванный поликональными АИ НАМ-К11 и НАМ-G1, вероятно, является следствием их гетерогенной специфичности, так как они представлены тремя типами АИ (α, β и γ), причем антитела β-типа наиболее полно могут имитировать конформацию антигена и способны индуцировать выработку антител, подобных Ab1. Кроме того, сами Ab2 β-типа являются поликлональными, что определяет их антигенную поливалентность. В то же время высокий титр антител к морфину, полученный при иммунизации МкАт Ab2, является следствием того, что иммунный ответ происходит узконаправленно и с большей продуктивностью, чем при иммунизации поликлональными Ab2.

При анализе временной динамики продукции поликлональных Ab3-антител к производным морфина у кролика, иммунизированного антителами АИ-К11B и АИ-G1, пик продукции Ab3 приходился на 30-35-й дни после последней иммунизации. Как правило, максимальный уровень концентрации антител наблюдается на 12-14-й дни после иммунизации животных. Вероятной причиной сдвига пика являются свойства АИ Ab2 связываться с опиоидными рецепторами лимфоцитов, циркулирующими в кровотоке, и, как следствие, к более позднему иммунному ответу.

Для определения морфин-имитирующих функциональных свойств АИ-антител были использованные клетки глиобластомы человека линии Т98G, которые несут на своей поверхности большое число μ- и κ-опиоидных рецепторов и незначительное количество δ-опиоидных рецепторов [13]. Результаты по изучению биологической активности агониста опиоидных рецепторов морфина, а также поли- и моноклональных Ab2-антител на пролиферативные процессы клеток линии T98G представлены на рис. 2-4. В то время как максимальная интенсивность пролиферативного эффекта наблюдалась при концентрации морфина 20 мкМ, поли- и моноклональные Ab2-антитела вызывали аналогичный эффект при концентрациях 37,5-75 нМ.

Данный эффект, как и в случае обработки клеток морфином гидрохлоридом, нейтрализовался действием антагониста опиоидных рецепторов налоксоном. Эти результаты служат доказательством взаимодействия Ab2 c опиодными рецепторами, которое приводит к проявлению функциональной активности.

Наряду с этим было выявлено, что поли- и моноклональные Ab2, полученные к идиотипу МкАт 3К11, обладают меньшей стимулирующей активностью, чем Ab2 к 6G1 антителам, что может быть связано с различиями в константах связывания антител и/или со способностью взаимодействовать с опиоидными рецепторами разных типов. Получение трехмерных моделей антиген-связывающих центров Ab1 антител 3К11 и 6G1 и Ab2-антител АИ-К11В и АИ-G1, а также проведение сравнительного анализа взаимодействия АИ-антител с μ-, κ- и δ- опиоидными рецепторами позволит объяснить причину их различия.

Заключение

Таким образом, представленные результаты доказывают, что впервые полученные лошадиные поликлональные и мышиные моноклональные АИ Ab2-антитела НАМ-К11, НАМ-G1 и АИ-К11В, АИ-G1 обладают морфин-специфическими антигенными свойствами и могут быть в дальнейшем использованы для создания вакцины на их основе.

Литература

1. Гамалея Н.Б., Берзина А.Г. Вакцины от наркотиков - новое перспективное направление профилактики злоупотребления ПАВ. Наркология. 2011; 10: 70-83.

2. Basak S., Eck S., Gutzmer R., Smith A.J. et al. Colorectal cancer vaccines: antiidiotypic antibody, recombinant protein, and viral vector. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000; 910 (1): 237-52.

3. Bellati F., Napoletano C., Ruscito I., Antonilli M. et al. Past, present and future strategies of immunotherapy in gynecological malignancies. Curr. Mol. Med. 2013; 13 (4): 648-69.

4. Moreno A.Y., Janda K.D. Immunopharmacotherapy: vaccination strategies as a treatment for drug abuse and dependence. Pharmacol. Biochem. Behav. 2009; 92 (2): 199-205.

5. Гамалея Н.Б., Берзина А.Г., Шестаков К.А., Капанадзе Г.Д. и др. Иммуноген для лечения и профилактики зависимости от опиатов. Пат. РФ № 2548802; 2015.

6. Bonese K.F., Wainer B.H., Fitch F.W., Rothberg R.M. et al. Changes in heroin self-administration by a rhesus monkey after morphine immunization. Nature. 1974; 252 (5485): 708-10.

7. Schabacker D.S., Kirschbaum K.S., Segre M. Exploring the feasibility of an anti-idiotypic cocaine vaccine: analysis of the specificity of anticocaine antibodies (Ab1) capable of inducing Ab2b anti-idiotypic antibodies. Immunology. 2000; 100: 48-56.

8. Huang J.Y., Ward R.E., Kohler H. Biological mimicry of antigenic stimulation: analysis of the in vitro antibody responses induced by monoclonal antiidiotypic antibodies. Immunology. 1988; 63: 1-8.

9. Берзина А.Г., Гамалея Н.Б., Сергеева В.Е., Трофимов А.В. и др. Получение поликлональных и моноклональных антител к двум производным морфина. Вопр. наркологии. 2016; 11-12: 39-54.

10. Берзина А.Г., Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И, Шестаков К.А. и др. Методологические подходы к разработке вакцины для лечения зависимости от опиатов. Наркология. 2015; 11 (167): 25-31.

11. Гамалея Н.Б., Ульянова М.А., Кротов Г.И., Берзина А.Г., Ульянова Л.И. Оценка биологической активности морфина, лоперамида и налоксона на культуре перевиваемой клеточной линии глиобластомы человека T98G. Наркология. 2017; 1: 39-44.

12. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М. : Медиа Сфера, 2003.

13. Lazarczyk M., Matyja E., Lipkowski A.W. A comparative study of morphine stimulation and biphalin inhibition of human glioblastoma T98G cell proliferation in vitro. Peptides. 2010; 31: 1606-12.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)