β (1→6)-D-глюкан из плодового тела гриба Lentinus edodes: структура и иммунобиологические свойства

• Степаненко Р.Н.
• Львов В.Л.
• Андреев И.В.
• Новикова Е.М.
• Козырева О.В.
• Разваляева Н.А.
• Мартынов Александр Игоревич

Резюме

Многие, если не все, базидиальные грибы, содержат биологически активные полисахариды (β-глюканы) обладающие иммуномодулирующими свойствами. Большинство исследований биологической активности глюканов было сфокусировано на изучении β-(1→3)-D-глюканов. В то же время у высших грибов обнаружен широкий спектр глюканов с различным соотношением и композицией (1→3)- и (1→6)-β-гликозидных связей. В этой работе грубый водорастворимый полисахарид, выделенный из плодового тела гриба Lentinus edodes экстракцией горячей водой и преципитацией этанолом, фракционировали на колонке с Sepharose 6B. Была выделена полисахаридная фракции с молекулярной массой 500-2000 кДа. ¹H- и ¹³C-ЯМР-спектры показали, что очищенный полисахарид является разветвленным β-глюканом, построенный из β-(1→6) связанных остатков D-глюкозы, с боковыми ответвлениями, представленными одним β-(1→3)-связанным остатком D-глюкозы. Выделенный β-(1→6) увеличивал in vitro продукцию фактора некроза опухоли (ФНО)α, интерферона-γ (ИФН-γ) и интерлейкинов (ИЛ) -1β и не стимулировал синтез ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-5 клетками селезенки мышей. Кроме того, β-(1→6)-глюкан in vitro усиливал созревание дендритных клеток. Он увеличивал экспрессию CD83, CD86 и MHC (major histocompatibility complex - главный комплекс гистосовместимости) II-антигенов на конечных этапах дифференцировки этих клеток. Наши данные свидетельствуют о том, что не только β-(1→3)-глюканы, но и другие глюканы, включая β-(1→6)-, могут быть перспективными для дальнейших исследований, в частности как иммуномодулирующие агенты.

Ключевые слова:иммуностимулирующие полисахариды; β-(1→6)-D-глюканы высших грибов; ФНОα; дендритные клетки

Одним из источников биологически активных соединений природного происхождения являются высшие базидиальные грибы. Выделенные из клеточных мембран этих грибов полисахариды - β-D-глюканы - оказывают иммуностимулирующее, противоопухолевое, противоинфекционное, антидиабетическое, гепатопротекторное, гиполипидемическое и антиаллергическое действие [1-5]. При попадании в организм млекопитающих они, взаимодействуя с рецепторами на макрофагах, нейтрофилах, естественных клетках-киллерах и дендритных клетках (ДК), индуцируют развитие реакций врожденного иммунитета [6-8]. Связывание с рецепторами приводит к активации фагоцитоза, образованию активных форм кислорода, усилению микробиологического киллинга и продукции провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (ФНО)α, интерлейкинов (ИЛ-1β, ИЛ-6, ИЛ-12), интерферона-γ (ИФН-γ), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и ряда других [7, 8]. В настоящее время накоплено много экспериментальных и клинических данных, свидетельствующих о том, что каскад метаболических реакций, вызванных взаимодействием полисахаридов базидиальных грибов с клетками врожденного иммунитета, может оказывать влияние на функционирование различных органов и тканей [1].

Особый интерес к глюканам связан с их способностью оказывать положительный клинический эффект при лечении различных онкологических заболеваний. Установлено, что большинство из них не проявляют прямого цитотоксического воздействия на опухолевые клетки, а их положительное терапевтическое действие обусловлено стимуляцией противоопухолевой активности клеток иммунной системы больного [4, 5, 9, 10].

Молекулы β-D-глюканов, выделенные из высших грибов, - это длинные цепи, образованные остатками D-глюкозы, связанными β-(1→3)- или β-(1→6)-гликозидными связями. При этом основная цепь может содержать боковые ответвления различной длины, также образованные остатками D-глюкозы, связанными β-(1→3)- или β-(1→6) связями. β-D-глюканы различаются длиной цепи, количеством и строением боковых ответвлений, пространственной структурой, растворимостью в воде и физиологическом растворе и т. д. Установлено, что эти факторы в различной степени влияют на иммуностимулирующую активность β-D-глюканов. Так, наиболее выраженный ответ моноцитарных клеток наблюдали при связывании β-D-глюкана с большим молекулярным весом (400-2000 кДа) и сложной пространственной структурой, так как в этом случае в реакцию включается одновременно большое количество рецепторов. В то же время инкубация клеток с короткими фрагментами молекулы этого же глюкана, содержащими менее 10 остатков глюкозы, не приводит к активации клеток. Установлено, что способность моноцитарных клеток связывать β-D-глюканы зависит от пространственной структуры, молекулярного веса, наличия боковых цепей и заряда полисахарида [8, 11-13].

В настоящее время наиболее изучены иммунобиологические свойства β-(1→3)-D-глюканов с боковыми ответвлениями в положении 6, являющиеся компонентом клеточной стенки съедобных грибов: Pleurotus ostreatus, Lentinus edodes, Flammulina velutipes, Hericium erinaceus, Grifola frondosa, Saccharomyces cerevisiae и ряда других [14, 15]. Специфическая структура β-(1→3)-глюканов позволяет им связываться с рецепторами на клетках миелоидного ряда, такими как Dectin-1 и CR3. С рецептором Dectin-1 связываются плохорастворимые в воде β-D-глюканы, которые затем фагоцитируются. Параллельно с фагоцитозом индуцируется синтез провоспалительных цитокинов посредством активации тирозинкиназы Syk и транскрипционного фактора. Поглощение β-D-глюканов приводит к преимущественной активации Th1- и Th17-клеток и индуцирует активацию антигенспецифических CD8⁺-цитотоксичных Т-лимфоцитов. Хорошо растворимые в воде β-D-глюканы связываются CR3-рецепторами на нейтрофилах и естественных клетках-киллерах, таким образом, становится возможна реакция CD3-зависимой клеточной цитотоксичности в отношении iC3b-опсонизированных опухолевых клеток [15-18].

Наряду с β-(1→3)-D-глюканами из плодовых тел высших грибов (Pleurotus cornucopiae, Amillariella mellea, Hericium erinaceus и Lentinus edodes) выделены глюканы, в которых основная цепь образована β-(1→6)-связанными остатками D-глюкозы [18, 19]. Выделенные β-(1-6)-D-глюканы различаются по молекулярной массе, пространственной организации и структуре боковых цепей. При этом они, как и β-(1→3)-D-глюканы, оказывают влияние на активность клеток врожденного иммунитета. При добавлении в культуру макрофагов они индуцируют респираторный взрыв и синтез ФНО, ИЛ-1β и ИЛ-10. β-(1→6)-D-глюкан с боковыми цепями β-(1→3) стимулирует созревание ДК клеток человека и активирует синтез хемокинов СС-типа: CCL2 (MCP-1), CCL3 (MIP-1α) и CCL8 (MCP-2) этими клетками. Эти и ряд других данных свидетельствуют о том, что β-(1→6)-D-глюканы наряду с другими полисахаридами, выделенными из базидиальных грибов, обладают способностью стимулировать реакции врожденного иммунитета, оказывающие положительное влияние при различных патологических процессах в организме человека (инфекции, диабет, онкологические заболевания и т. д.).

Нами выделен β-(1→6)-D-глюкан (ВГЛ) с молекулярной массой 500-2000 кДа из плодового тела гриба Lentinus edodes. Выделенный глюкан - это гомополимер, построенный из β-(1→6)-связанных остатков D-глюкозы, с боковыми ответвлениями, представленными одним β-(1→3)-связанным остатком D-глюкозы. Добавление выделенного глюкана в культуру клеток селезенки мышей приводит к стимуляции синтеза ФНОα, ИЛ-1β и ИФН-γ, но не ИЛ-2, -4, -5 (табл. 1). Наибольший стимулирующий эффект ВГЛ оказывает на синтез ФНО клетками, прилипающими к пластиковой поверхности. Кроме того, выделенный полисахарид увеличивает продукцию ГМ-КСФ при культивировании с клетками перитонеального экссудата, а при индукции образования ДК костномозгового происхождения в культуре in vitro стимулирует созревание этих клеток на конечных этапах дифференцировки.

Материал и методы

Животные

Для экспериментов использовали мышей линии C57BL/6J и гибридов первого поколения (CBA/J × C57BL/6)F1 массой 18-20 г, полученных из питомника "Столбовая". Содержание животных соответствовало санитарно-эпидемиологическим правилам СП 2.2.1.3218-14 "Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)". Животных без ограничений кормили комбикормом ПК-120 по ГОСТу Р 50258-92 и поили водой по ГОСТу 2874-82. Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя.

Выделение полисахаридов

Высушенные плодовые тела гриба L. edodes измельчали в лабораторном гомогенизаторе и перемешивали c тройным объемом (по отношению к объему сухих грибов) деионизированной воды в течение 2 ч при 80 °С, затем раствор центрифугировали при 12 000 об./мин в течение 20 мин и супернатант упаривали на роторном испарителе при температуре 60 ^оС до 1/10 первоначального объема. Сконцентрированный раствор повторно центрифугировали при 12 000 об/мин в течение 20 мин и осаждали из него полисахариды, добавляя 96% этиловый спирт до выпадения осадка. Осадок осаждали центрифугированием при 12 000 об./мин 10 мин, супернатант сливали, а осадок растворяли в деионизированной воде до первоначального объема и центрифугировали при 12 000 об./мин 10 мин и лиофилизировали.

В 30 мл деионизированной воды растворяли 500 мг высушенного препарата, диализовали в мешках для диализа с размером пор 12-14 кДа в течение суток и лиофилизировали (выход 255 мг); 100 мг глюкана перемешивали 24 ч при 37 °С в 10 мл в буферного раствора (0,2 М NaCl, 0,01 TRIS, 0,001M CaCl₂, 0,001M MgCl₂, 0,01% NaN₃), содержащего 1-2 мг протеазы (Protease K, AppliChem). После диализа и лиофилизации получено 67 мг продукта, содержащего 93% углеводов, <1% белков и 6% неидентифицированных компонентов по весу. Содержание углеводов определяли фенол-сернокислотным методом [20], используя D-глюкозу в качестве стандарта. Белки определяли по методу, предложенному Бредфорд [21].

Определение уровня цитокинов в культурах клеток селезенки мышей

Для изучения влияния выделенного глюкана на синтез цитокинов клетками мышей C57BL/6 забивали цервикальным смещением, удаляли селезенки, гомогенезировали их в стеклянном гомогенезаторе в культуральной среде RРМI-1640 с добавлением 25 мМ Hepes-бефера. Клеточную суспензию фильтровали через капроновый фильтр и лизировали в ней эритроциты с помощью лизирующего раствора 10Х RBC (Lysis Buffer multi-species cat. N 00-4300, eBioscience) в объеме 3 мл в течение 5 мин при комнатной температуре. После обработки лизирующим раствором клеточную суспензию дважды отмывали в культуральной среде, затем разводили ее до концентрации 5 - 10⁶/мл полной культуральной средой - культуральная среда RPMI-1640 с добавлением 25 мМ Hepes-буфера ("ПанЭко", кат. № С350), 10% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки (ЭТС) (HyClon UK Ltd, SH 40007-13), 2 мМ L-глутамина ("ПанЭко", кат. № Ф032), 40 мкг/мл гентамицина (ОАО "Биохимик") (протеинкиназа С - ПКС).

Для фракционирования выделенных клеток селезенки на прилипающие и неприлипающие к пластиковой поверхности по 1 мл клеточной суспензии помещали в лунки 24 луночного пластикового планшета, предварительно обработанные ЭТС при 37 °С в течение 1 ч. Клетки культивировали в течение 2 ч (37 °С; 5% СО₂), по окончанию культивирования из лунок отбирали пипеткой культуральную жидкость, содержащую неприлипшие клетки. Неприлипшие клетки осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 250g, разводили в 500 мкл ПКС и помещали в свободные лунки планшета. В лунки с прилипшими клетками также добавляли по 500 мкл ПКС.

В лунки, содержащие прилипающие, неприлипающие и нефракционированные клетки, добавляли 500 мкл ПКС, содержащий ВГЛ в концентрации 0,1 мг/мл, в контрольные - аналогичный объем ПКС без глюкана. Клетки культивировали 24 ч (37 °С; 5% СО₂), а затем определяли в супернатантах культур уровень ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИФН-γ и ФНО с помощью наборов реактивов BD™ CBA Mouse Th1/Th2 Cyokine Kit (Catalog No. 551287), согласно инструкции к наборам.

Определение синтеза гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора клетками перитонеального экссудата мышей

В работе использовали макрофаги от гибридов первого поколения CBA/J × C57BL/6)F1 мышей после дислокации шейных позвонков. Резидентные макрофаги получали путем перитонеального лаважа по 5 мл на мышь среды RPMI-1640 с добавлением 10% ЭТС и 40 мкг/мл гентамицина (Mapichem AG, Швейцария). Клетки пулировали, отмывали центрифугированием и полученную клеточную суспензию разливали в чашки Петри, предварительно обработанные в течение 1 ч ЭТС. Через 2 ч инкубации при 37 °С и 5% СО₂ культуральную среду вместе с неприлипшими клетками сливали, адгезировавшие клетки снимали с помощью шпателя и помещали в ПКС. Доводили клеточной средой до концентрации 1 - 10⁶ клеток/мл и разливали по 1 мл в лунки 24-луночного планшета. В опытные лунки добавляли ВГЛ в концентрации 0,1 мг/мл. Клетки инкубировали 24 ч в СО₂-инкубаторе при 37 °С и 5% СО₂. После окончания инкубации планшет замораживали и хранили при -20 °С в течение нескольких дней.

Затем планшет размораживали, центрифугировали и в супернатантах опытных и контрольных лунок определяли концентрацию ГМ-КСФ с помощью набора реактивов для количественного определения ГМ-КСФ иммуноферментным методом (Mouse GM-CSF Platinum ELISE, eBioscience).

Получение дендритных клеток

Для получения дендритных клеток (ДК) из трубчатых костей (бедренных и большеберцовых) мышей линии С57ВL/6 с помощью шприца вымывали культуральной средой клетки костного мозга.

Клеточную суспензию тщательно ресуспендировали и помещали в объеме 15 мл ПКС во флакон 75 см² (SPL Lifesciences кат. № 70075) в СО₂-инкубатор на 24 ч (37 °С; 5% СО₂). После культивирования культуральную жидкость сливали, клетки, прилипшие ко дну флакона, снимали скребком ("Пан Эко" № 90030) и центрифугировали 5 мин при 250g. Полученную клеточную суспензию (25-28 - 10⁶ в мл) разводили в 15 мл в ПКС с добавлением мышиных ростовых факторов: рекомбинантного интерлейкина-4 (ИЛ-4) 10 нг/мл (Invitrogen Gibco PMC0045) и ГМ-КСФ 20 нг/мл (Invitrogen Gibco PMC2015) и разливали во флаконы 75 см², которые помещали в СО₂-инкубатор (37 °С; 5% СО₂) на 72 ч. Через 72 ч во флаконы добавляли 15 мл свежей ПКС с тем же количеством ростовых факторов - ИЛ-4 и ГМ-КСФ.

На 8-е сутки после начала культивирования из флаконов сливали культуральную среду, содержащиеся в ней клетки осаждали центрифугированием 5 мин при 250g, осадок тщательно ресуспендировали в ПКС и переносили в опытный и контрольный флаконы. В опытный флакон добавляли ВГЛ в ПКС до конечной концентрации 0,1 мг/мл, в контрольный - такой же объем ПКС. Флаконы помещали в СО₂-инкубатор на 24 ч (37 °С; 5% СО₂).

На следующие сутки культуральную жидкость из каждого флакона, содержащую снятые скребком клетки, центрифугировали 5 мин при 250g. Клеточный осадок ресуспендировали в разводящем буферном растворе (фосфатно-солевой буфер кат. № 6020 "Эко Сервис" с добавлением 0,1% ЭТС и 0,1% NaN₃) и готовили образцы для проточной цитометрии.

Проточная цитометрия

Клетки окрашивали FITC-, PE- и APC-конъюгированными моноклональными антителами (МКАт). Были использованы следующие флюросцеин-меченые МКАт фирмы eBioscience: CD11c-FITC (кат. № 11-0114), cd80-FITC (кат. № 12-0801-82), CD83-FITC (кат. № 11-0831), cd86-РЕ (кат. № 11-0862) и CD MHC II PE (кат. № 12-5321). Пробы анализировали на проточном цитометре Gallios 6 Color/2 (Bekman).

Результаты

Выделение высокомолекулярной фракции полисахарида из плодового тела грибов Lentinus edodes хроматографией на колонке с сефарозой 6В

Полученные из плодовых тел гриба L. edodes 20 мг экстракта растворяли в 5 мл 0,15 М NaCl и наносили на колонку с сефарозой 6В (2,6 × 75 см), уравновешенную 0,15 M NaCl. Препарат элюировали 0,15 М NaCl при скорости потока 0,5 мл/мин, собирая фракции по 10 мл. После хроматографии определяли содержание глюкана в пробах фенол-сернокислотным методом. Профиль элюции препарата представлен на рис. 1.

По оси абсцисс - номера фракций; по оси ординат - ОД (490 нм). А - профиль элюции экстракта из плодовых тел гриба L. edodes; Б - профиль элюции высокомолекулярной фракции (рехроматография); I, II, III, IV - области выхода декстранов с молекулярными массами 2000, 500, 150 и 70 кДа.

Получены 3 глюкан-содержащие фракции - мажорная в области выхода декстранов с молекулярной массой от 2000 (Blue Dextran 2000) до 500 кДа (декстран, Т500) и 2 минорные - с меньшими молекулярными массами. Повторная хроматография 20 мг мажорной фракции при тех же условиях подтвердила ее гомогенность (см. рис. 1). Эта фракция была собрана, повторно диализована в мешках для диализа с размером пор 12-14 кДа в течение суток, лиофилизирована и использована для дальнейших исследований.

ЯМР-спетроскопия β-(1→6)-D-глюкан

¹³С- и ¹Н-спектры ЯМР (ядерный магнитный резонанс) С¹³ и Н¹ выделенного высокомолекулярного глюкана были сняты на спектрометрах Avance II 600 b DRX-500 (Bruker) с рабочей частотой для протонов 600 МГц и атомов углерода 150 МГц соответственно. Собирали и обрабатывали данные с помощью программы TopSpin 2/1 (Bruker) с использованием стандартного программного обеспечения. Сигналы ¹³С- и ¹Н-ЯМР-спектров были интерпретированы, согласно литературным данным [22-24]. Отнесение сигналов и анализ корреляций в спектрах ЯМР с использованием двумерных экспериментов с применением методов коррелирующих химические сдвиги протонов между собой (¹Н, ¹H COSY, ¹Н, ¹H TOCSY, ¹Н, ¹H ROESY) и протонов с атомами углерода (¹Н, ¹³С HMBC и ¹Н, ¹³С HMQC) свидетельствует о том, что выделенный полисахарид (далее - ВГЛ) - это β-(1→6)-D-Glcp -цепь, содержащая 10-20% боковых ответвлений, представленных одним β-(1→3)-связанным остатком D-глюкозы (рис. 2-4).

Иммунобиологические свойства выделенного высокомолекулярного глюкана

Исследование иммунобиологических свойств ВГЛ мы начали с изучения его способности влиять на клетки иммунной системы при непосредственном контакте, т. е. в культуре in vitro. В предварительных экспериментах было установлено, что ВГЛ нетоксичен в диапазоне концентраций 1-0,01 мг/мл (не оказывает цитотоксического эффекта на клетки селезенки при культивировании в течение 24-48 ч).

Известно, что одним из основных характерных свойств глюканов, выделенных из плодовых тел базидиальных грибов, является способность при контакте с клетками иммунной системы индуцировать синтез различных цитокинов. Поэтому на первом этапе исследования иммунобиологических свойств ВГЛ изучали его способность индуцировать в клетках селезенки мышей синтез различных цитокинов. Для этого 3 - 10⁵ клеток селезенки интактных мышей линии C57BL/6J (после лизиса эритроцитов) культивировали в СО₂-инкубаторе при 37 °С и 5% СО₂ в течение 24 ч в присутствии 0,1 мг/мл препарата. Жизнеспособность клеток после выделения и перед началом культивирования составляла 95% (по окрашиванию трипановым синим). Клетки культивировали на 96-луночном планшете по 0,3 мл ПКС в лунке. После окончания культивирования определяли в супернатантах культур клеток концентрацию ИЛ-1β, ИЛ2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИФН-γ и ФНО, используя коммерческие наборы BD Cytometric Bead Array (CBA) фирмы BD Biosciences. В основе использованного метода лежит цитофотометрическое определение уровня цитокинов в супернатантах клеточных культур и сыворотках с помощью МКАт к ним, иммобилизованных на микрогранулах. Вышеуказанный метод позволяет определять концентрацию цитокинов в диапозоне от 20 до 2500 пк/мл. Концентрации цитокинов (пг/мд) в супернатантах культур клеток селезенки, в которые был добавлен ВГЛ, и в контрольных представлены в табл. 1.

Из табл. 1 следует, что ВГЛ при добавлении в культуру спленоцитов интактных мышей, т. е. при непосредственном контакте с клетками, стимулирует продукцию ИЛ-1β, ФНО и ИФН-γ и в то же время он не оказывает влияния на синтез ИЛ-2, -4 и -5.

Известно, что цитокины ИЛ-1β, ФНО и ИФН-γ синтезируются преимущественно клетками моноцит/макрофагальной системы иммунитета и, по-видимому, выделенный 1,6-β-глюкан оказывает стимулирующее действие именно на эти клетки. Для подтверждения этого предположения клетки селезенки интактных мышей разделили на прилипающие к пластиковой поверхности (клетки моноцит/макрофагального ряда) и неприлипающие. После фракционирования прилипающие и неприлипающие клетки и клетки цельной популяции, в течение 24 ч культивировали в присутствии 0,1 мг/мл ВГЛ, после окончания культивирования определяли концентрацию ИЛ-1β, ФНО и ИФН-γ (рис. 5).

По оси ординат - концентрация цитокинов, пг/мл.

Эксперименты по культивированию различных субпопуляций клеток селезенки интактных мышей с ВГЛ показали, что наибольший стимулирующий эффект на синтез цитокинов глюкан оказывает при взаимодействии с прилипающими клетками. Культивирование клеток этой субпопуляции с глюканом увеличило концентрации ФНО в супернатанте культур почти в 4 раза: с 302 до 1184 пг/мл. Кроме того, увеличилась концентрация ИЛ-1β (с 136 до 248 пк/мл) и ИФН-γ (с 88 до 258 пк/мл). В то же время эффект от добавления глюкана к субпопуляции клеток, не прилипающих к пластику, был значительно слабее. Так, концентрация ФНО в супернатанте культур возросла всего со 113 до 247 пк/мл. Индукция синтеза ИЛ-1β практически отсутствовала (44 пк/мл - в контроле и 52 пк/мл - в контроле), так же как ИФН-γ - 42 пк/мл в контроле и 38 пк/мл в опыте. Таким образом, с большой долей вероятности можно утверждать, что мишенями, с которыми взаимодействует ВГЛ, являются клетки моноцит-макрофагального ряда. Данное заключение подтверждается результатами, полученными в экспериментах по культивированию с ВГЛ резидентных макрофагов, выделенных из перитонеальной полости интактных мышей линии C57BL/6. Культивирование этих клеток в течение 24 ч с 0,1 мг/мл полисахарида приводило к накоплению в супернатанте культур ГМ-КСФ. Его концентрация в культурах, в которые добавляли глюкан, была в 2,65 раза выше, чем в контрольных (39,0 и 14,7 пг/мл соответственно).

Установлено, что некоторые β-глюканы грибного происхождения стимулируют созревание ДК [25-27], поэтому в следующей серии экспериментов мы решили выяснить, обладает ли аналогичными свойствами выделенный нами β-(1→6)-глюкан. Для этого полисахарид в концентрации 0,1 мг/мл добавляли в культуру предшественников ДК на 8-е сутки после начала культивирования прилипающих клеток костного мозга с ИЛ-4 и ГМ-КСФ. Клетки культивировали в СО₂-инкубаторе 24 ч (37 °С; 5% СО₂), после окончания культивирования окрашивали МКАт, мечеными флюорохромами к cd11c, MHC II, cd80, cd83 cd86 и cd205 АГ, и определяли относительное количество меченых клеток в опыте и в контроле (табл. 2).

Добавление ВГЛ в культуру предшественников ДК увеличило относительное количество клеток, экспрессирующих поверхностные антигены, характерные для зрелых клеток. В присутствии глюкана значительно возросла экспрессия маркера созревания CD83, а также было обнаружено повышение плотности на поверхности ДК костимулирующей молекулы CD86 (рис. 6), но при этом глюкан не оказывал влияния на экспрессию другой костимулирующей молекулы - cd80.

На следующем этапе исследования влияния ВГЛ на созревание ДК в культуре сравнили концентрацию 3 цитокинов: ИЛ-1β, ФНО и ИФН-γ, синтез которых стимулирует глюкан в культуре клеток селезенки, в культурах ДК. Концентрацию цитокинов определяли методом Cytometric Bead Array (табл. 3).

Обсуждение

Из плодовых тел гриба Lentinus edodes экстракцией при 80 °С деионизированной водой, преципитацией этанолом и фракционированием на хроматографической колонке с Sepharose CL-6B выделен ВГЛ с молекулярной массой 500-2000 кДа. Выделенный глюкан представляет собой гомополимер, построенный из (1→6)-связанных остатков β-D-глюкозы с короткими боковыми ответвлениями, представленным одним (1→3)-связанным остатком β-D-глюкозы.

К настоящему времени из базидиальных грибов выделен ряд ВГЛ, различающихся по молекулярной массе и строению боковых цепей. Так, Lee Jong Seok и соавт. [28] из плодового тела гриба Hericium erinaceus выдели ВГЛ с боковыми β-(1→3)-цепями с молекулярной массой 13 кДа, который индуцировал у макрофагов респираторный взрыв и стимулировал синтез ИЛ-1β и ФНО. ВГЛ с боковыми цепями, представленными или замещенными в положении О-3 остатком β-D-глюкозы или цепями α-D-(1→6)-галактозы, был выделен из грибов Amillariella mellea [29]. При добавлении в культуру макрофагов клеточной линии RAW264.7 он стимулировал продукцию H₂O₂, супероксида O₂- и гидроксильного радикала OH-, а также ФНОα, ИЛ-6 и ИЛ-1β. Из грибов Pleurotus citrinopileatus был выделен ВГЛ с β-(1→3)-боковыми цепями и молекулярной массой 450 кДа, который при добавлении в культуру предшественников ДК человека стимулировал появление их на поверхности маркеров созревания, таких как cd80, cd86 и HLA-DR. Кроме этого, данный глюкан обладал способностью стимулировать синтез провоспалительных цитокинов ФНО, ИЛ-1β, ИЛ-6 и противовоспалительного цитокина ИЛ-10, а также ряда хемокинов [30]. Из плодового тела грибов Lentinuse edodes был выделен β-(1→6)-D-глюкан с молекулярной массой 577 кДа с боковыми цепями, представленными соединенными в β-(1→3)-остатками D-глюкозы [31]. Авторы показали, что данный глюкан регулирует экспрессию MHC II и F4/80 на супрессорных клетках миелоидного происхождения и дозозависимо подавляет их ингибирующее действие на CD4⁺-Т-клетки. Под воздействием этого глюкана супрессорные клетки дифференцировались в многоядерные макрофаги посредством MyD88-зависимого NF-κB-сигнального пути. Результаты, полученные при изучении иммунобиологических свойств глюканов, в которых основная цепь образована остатками молекул β-D-глюкозы, соединенными гликозидной связью между 1-м и 6-м атомами углерода, свидетельствуют о том, что они так же, как и β-(1→3)-D-глюканы, активируют реакции врожденного иммунитета посредством структур, получивших название "патоген-ассоциированных молекулярных паттернов" (pathogen-associated molecular patterns (PAMP), которые распознаются образ-распознающим рецептором (pattern-recognition receptors (PRR) на клетках врожденного иммунитета. По-видимому, к этому же типу патогенов природного происхождения относится выделенный нами высокомолекулярный ВГЛ.

При изучении иммунологических свойств ВГЛ установлено, что при совместном культивировании с прилипающими клетками селезенки он стимулирует синтез ФНО, ИЛ-1β и ИФН-γ. Аналогичный эффект, хотя и гораздо менее выраженный, он оказывал и на нефракционированные клетки селезенки (рис. 5). В то же время он не стимулировал синтез ИЛ-2, ИЛ-4 и ИЛ-5 как прилипающими клетками, так и нефракционированными (см. табл. 1). Полученные результаты позволяют утверждать, что при добавлении в культуру клеток селезенки глюкана, его распознают клетки моноцит/макрофагального ряда, что подтверждается его способностью стимулировать продукцию ГМ-КСФ резидентными макрофагами, выделенными из перитонеальной полости интактных мышей.

Характер иммунобиологических свойств ВГЛ позволяет предположить, что он может взаимодействовать с одним из представленных на лимфоцитах рецепторов, распознающих PAMP - PRR. К этим рецепторам относятся RIG-I-подобные рецепторы, Nod-подобные рецепторы, лектины C-типа, Toлл-подобные рецепторы (TLR) и др., расположенные на поверхности и/или внутри клеток врожденной иммунной системы [32]. И, если в отношении β-(1→3)-D-глюканов, выделенных из плодового тела базидиальных грибов, точно установлено, что они взаимодействуют с рецептором Дектин-1, представленным на макрофагах и ДК, и с рецептором CR3 на нейтрофилах, то в отношении ВГЛ такой ясности нет. E.L. Adams и соавт. [33] и A.S. Palma и соавт. [34] представили результаты, свидетельствующие о том, что Дектин-1 не распознает ВГЛ. Также β-(1→6)-глюканы не связываются и другим PPR - лактозилцерамидом, входящим в состав клеточных мембран различных видов лейкоцитов, и взаимодействующим с β-(1→3)-глюканами [35]. Результаты, полученные в последние годы, свидетельствуют о существовании на макрофагах специфического рецептора, распознающего ВГЛ, и это может быть TLR2 [19], с которым не взаимодействуют β-(1→3)-глюканы. [36]. Эти результаты свидетельствуют о различных механизмах распознавания β-(1→6)- и β-(1→3)-глюканов. Различие в механизмах распознавания структурно различающихся глюканов, естественно, приводит к различию в иммунобиологических эффектах, которые оказывают эти патогены при попадании в организм млекопитающих, что делает целесообразным дальнейшее их изучение при различных патологических процессах, в том числе при онкологических заболеваниях. В пользу перспективности таких исследований говорят данные о большей иммуногенности ВГЛ, чем β-(1→3)-глюканов, что приводит к подавлению роста злокачественных опухолей у экспериментальных животных. Так, показано наличие обратной корреляции между титрами АТ, индуцированными ВГЛ, и продолжительностью жизни мышей с привитой солидной опухолью EL-4 [37].

Выводы

1. Из плодовых тел гриба Lentinus edodes выделен β-(1→6)-D-глюкан с молекулярной массой 500-2000 кДа, построенный из β-(1→6)-связанных остатков D-глюкозы с короткими боковыми ответвлениями, представленными одним β-(1→3)-связанным остатком D-глюкозы. Сходный по структуре β-(1→6)-D-глюкан с боковым ответвлением в виде одного остатка D-глюкозы, соединенной с основной цепью β-(1→3)-гликозидной связью, но с гораздо меньшей молекулярной массой (5,6 кДа), был выделен J. Yan и соавт. [18] из плодового тела грибов Amillariella mellea.

2. При совместном культивировании с прилипающими клетками селезенки выделенный высокомолекулярный β-(1→6)-D-глюкан стимулирует синтез ФНО, ИЛ-1β и ИФН-γ. Он также увеличивает продукцию ГМ-КСФ резидентными макрофагами, выделенными из перитонеальной полости интактных мышей, и количество ДК миелоидного происхождения при добавлении в культуру на конечных этапах дифференцировки этих клеток.

3. Можно предположить, что выделенный нами глюкан, как и сходный с ним по структуре низкомолекулярный глюкан, выделенный J. Yan и соавт. [18], взаимодействует с TLR2 на клетках моноцит-макрофагальной системы, а следовательно, по всем своим характеристикам они являются типичными РАМР.

4. Выделение и изучение иммунобиологических свойств новых β-глюканов природного происхождения позволяет расширить спектр известных иммуностимулирующих средств; наиболее эффективные из них могут найти применение в клинической практике.

Литература

1. Герасименя В.П., Гумаргалиева К.З., Захаров С.В., Милевич Т.И. и др. Экстракты базидиальных грибов и их полифункциональная медико-биологическая активность. М. : Ин-т химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, ООО "Инбиофарм"; 2014.

2. Brown G.D., Gordon S. Fungal b-glucans and mammalian immunity. Immunity. 2003; 19: 311-315.

3. Friedman M. Mushroom polysaccharides: chemistry and antiobesity, antidiabetes, anticancer, and antibiotic properties in cells, rodents, and humans. Foods. 2016; 5: 80.

4. Meng X., Liang H., Luo L. Antitumor polysaccharides from mushrooms: a review on the structural characteristics, antitumor mechanisms and immunomodulating activities. Carbohydr. Res. 2016; 424: 30-41.

5. Wasser S.P. Medicinal mushrooms in human clinical studies. Part I. Anticancer, oncoimmunological, and immunomodulatory activities: a review. Int. J. Med. Mushrooms. 2017; 19 (4): 279-317.

6. Gordon D.B., Gordon S. Fungal b-glucans and mammalian immunity. Immunity. 2003; 19: 311-5.

7. Barreto-Bergter E., Figueiredo R.T. Fungal glycans and the innate immune recognition. Front. Cell. Infect. Microbiol. 2014; 4: 145.

8. Camilli G.,Tabouret G., Quintin J. The Complexity of fungal β-glucan in health and disease: effects on the mononuclear phagocyte system. Front. Immunol. 2018; 9: 673.

9. Vannucci L., Krizan J., Sima P., Stakheev D. et al. Immunostimulatory properties and antitumor activities of glucans (review). Int. J. Oncol. 2013; 43: 357-64.

10. Cioanca O., Trifan A., Mircea C., Dragos S. et al. Natural macromolecules with protective and antitumor activity. Anticancer Agents. Med. Chem. 2018: 18 (5): 675-83. doi: 10.2174/1871520618666180425115029.

11. Mueller A., Raptis J., Rice P.J., Kalbfleisch J.H. et al. The influence of glucan polymer structure and solution conformation on binding to (1→3)-β-D-glucan receptors in human monocyte-like cell line. Glicobiology. 2000; 10 (4): 339-46.

12. Lowe E., Rice P., Ha T., Li C. et al. A (1→3)-β-D-linked heptasaccharide is the unit ligand for glucan pattern recognition receptors on human monocytes. Microbes Infect. 2001; 3 (10): 789-97.

13. Adams E.L., Rice P.J., Graves B., Ensley H.E. et al. Differential high-affinity interaction of Dectin-1 with natural or synthetic glucans is dependent upon primary structure and is influenced by polymer chain length and side-chain branchin. J. Pharm. Exp. Ther. 2008; l (325): 115-23.

14. Dalonso N., Goldman G.H., Gern R.M.M. β-(1-3),(1-6)-Glucans: medicinal activities, characterization, biosynthesis and new horizons. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2015; 99 (19): 7893-906. doi: 10.1007/s00253-015-6849-x.

15. Nakashima A., Yamada K., Iwata O., Sugimoto R. et al. β-Glucan in foods and its physiological functions. J. Nutr. Sci. Vitaminol. (Tokyo). 2018; 64 (1): 8-17.

16. Chan G.C., Chan W.K., Sze D.M. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. J. Hematol. Oncol. 2009; 2: 25-35.

17. Albeituni S.H., Yan J. The effects of β-glucans on dendritic cells and implications for cancer therapy. Anticancer Agents Med. Chem. 2013; 13 (5): 689-98.

18. Yan J., Han Z., Qu Y., Yao C. et al. Structure elucidation and immunomodulatory activity of a β-glucan derived from the fruiting bodies of Amillariella mellea. Food Chem. 2018; 240: 534-43.

19. Jeff I.B., Yuan X., Sun L., Kassim R.M. et al. Purification and in vitro anti-proliferative effect of novel neutral polysaccharides from Lentinus edodes. Int. J. Biol. Macromol. 2013; 52: 99-106. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2012.10.007. Epub 2012 Oct 13.

20. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J., Robers P.A. et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 1956; 28: 350-6.

21. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-54.

22. Luo X., Xu X.Y., Yu M.Y., Yang Z.R. et al. Characterization and immunostimulatory activity of an α-(1→6)-d-glucan from the cultured Armillariella tabescens mycelia. Food Chem. 2008; 111: 357-63.

23. Aguire M.J., Isaacs M., Matsuhiro B., Mendoza L. et al. Characterization of a neutral polysaccharide with antioxidant capacity from red wine. Carbohydr. Res. 2009; 344: 1095-101.

24. Mei-Kuang L., Jing-Ly C., Cha-Yui L., Chia-Chuan. FoodChem. 2010; 118: 349-56.

25. Huang H., Ostroff G.R., Lee C.K., Wang J.P. et al. Distinct patterns of dendritic cell cytokine release stimulated by fungal β-glucans and toll-like receptor agonists. Infect. Immun. 2009; 77 (5): 1774-81.

26. Masuda Y., Inoue H., Ohta H., Miyake A. et al. Oral administration of soluble β-glucans extracted from Grifolafrondosa induces systemic antitumor immune response and decreases immunosuppression in tumor-bearing mice. Int. J. Cancer. 2013; 133: 108-20.

27. Minato K.I., Laan L.C., Ohara A., van Die I. Pleurotus citrinopileatus polysaccharide induces activation of human dendritic cells through multiple pathways. Int. Immunopharmacol. 2016; 40: 156-63.

28. Lee J.S., Kyoung M.M., Jae Y.C., Eock K.H. Study of macrophage activation and structural characteristics of purified polysaccharides from the fruiting body of Hericium erinaceus. J. Microbiol. Biotechnol. 2009; 19 (9): 951-9.

29. Jingmin Yan, Zhen Han, Yunhe Qu, Ci Yao et al. Structure elucidation and immunomodulatory activity of aβ-glucan derived from the fruiting bodies of Amillariella mellea. Food Chem. 2018; 240: 534-43.

30. Minato K.I., Laan L.C., Ohara A., van Die I. Pleurotus citrinopileatus polysaccharide induces activation of human dendritic cells through multiple pathways. Int. Immunopharmacol. 2016; 40: 156-63.

31. Wu H., Tao N., Liu X., Li X. et al. Polysaccharide from Lentinus edodes inhibits the immunosuppressive function of myeloid-derived suppressor cells. PLoS One. 2012; 7 (12): e51751.

32. Lee M.S., Kim Y.J. Signaling pathways downstream of pattern recognition receptors and their cross talk. Annu. Rev. Biochem. 2007; 76: 447-80.

33. Adams E.L., Rice P.J., Graves B. et al. Differential high affinity interaction of Dectin-1 with natural or synthetic glucans is dependent upon primary structure and is influenced by polymer chain length and side chain branching. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2008; 325: 115-23.

34. Palma A.S., Feizi T., Zhang Y. et al. Ligands for the beta-glucan receptor, Dectin-1, assigned using "designer" microarrays of oligosaccharide probes (neoglycolipids) generated from glucan polysaccharides. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5771-9.

35. Zimmerman J.W., Lindermuth J., Fish P.A. et al. A novel carbohydrate-glycosphingolipid interaction between a β-(1→3)-glucan immunomodulator, PGG-glucan, and lactosylceramide of human leukocytes. J. Biol. Chem. 1998; 273: 22 014-20.

36. Noss I., Ozment T.R., Graves B.M., Kruppa M.D. et al. Cellular and molecular mechanisms of fungal β-(l→6)-glucan in macrophages. Innate Immun. 2015; 21 (7): 759-69.

37. Dong H., Dai H., Hu X., Xiong S.D. et al. The (1→6)-β-glucan moiety represents a cross-reactive epitope of infection-induced malignancy surveillance. J. Immunol. 2014; 192 (3): 1302-12.