Транскрипционный ответ макрофагов на сочетанную стимуляцию NOD- и Toll-подобного рецептора

Резюме

Введение. Активация клеток врожденного иммунитета агонистами двух и более паттерн-распознающих рецепторов может приводить к взаимному ослаблению или усилению активационных сигналов. На основании анализа экспрессии отдельных генов считается, что при сочетанной стимуляции NOD- и Toll-подобных рецепторов происходит синергическое увеличение клеточного ответа (эффект сочетания агонистов больше, чем сумма эффектов отдельно взятых агонистов). Однако данное положение до сих пор не было проверено путем полнотранскриптомного анализа.

Цель исследования - провести полнотранскриптомный анализ макрофагов человека, активированных сочетанием агонистов рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro.

Материал и методы. Макрофаги получали путем культивирования моноцитов крови здоровых доноров с гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором, после чего стимулировали агонистами NOD1 и TLR4 раздельно и в сочетании в течение 1 и 4 ч. Транскриптомы анализировали с помощью высокопроизводительного секвенирования РНК (RNA-seq) и ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Для выявления синергически индуцируемых генов рассчитывали индексы потенцирования (отношение ответа на сочетание агонистов к сумме ответов на отдельные агонисты).

Результаты. Синергически индуцируемые гены составили не более 10 % от числа всех генов, индуцируемых агонистами NOD1 и/или TLR4 раздельно и в сочетании. Отличительными особенностями синергически индуцируемых генов являются низкая базальная экспрессия и высокий ответ на стимуляцию сочетанием агонистов. Несмотря на относительную малочисленность, данная группа генов имеет большое функциональное значение, так как включает в себя гены основных провоспалительных цитокинов. Результаты биоинформатического анализа указывают на роль факторов транскрипции семейств NFB и AP-1 в регуляции экспрессии синергически индуцируемых генов.

Заключение. Знания о характеристиках и механизмах синергических эффектов позволят выбрать правильные мишени для подавления гиперпродукции цитокинов при "цитокиновом шторме", а также подобрать наиболее подходящие комбинации агонистов для их терапевтического использования в клинических ситуациях, требующих усиления врожденного иммунного ответа.

Ключевые слова:макрофаги; транскриптом; секвенирование РНК; NOD1; TLR4; синергизм

Для цитирования: Масютина А.М., Пащенков М.В. Транскрипционный ответ макрофагов на сочетанную стимуляцию NOD- и Toll-подобного рецептора. Иммунология. 2023; 44 (4): 408-418. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-4-408-418

Финансирование. Работа выполнена при поддержке гранта Российского научного фонда № 21-15-00211.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Постановка экспериментов и анализ результатов - Масютина А.М.; планирование экспериментов, анализ результатов и написание статьи - Пащенков М.В.

Введение

Типовые молекулярные структуры микробов выступают в роли активационных лигандов паттерн-распознающих рецепторов (ПРР) клеток врожденного иммунитета. Однако при инфекционных заболеваниях происходит активация не одного ПРР, а их сочетаний, зависящих от типа патогена. Параметры врожденного иммунного ответа на патогены определяются взаимодействиями сигналов от различных рецепторов. Однако механизмы кооперации ПРР изучены значительно хуже, чем механизмы функционирования отдельно взятых рецепторов.

Стимуляция ПРР из семейства Toll-подобных рецепторов (TLR), а также NOD1 и NOD2 из семейства NOD-подобных рецепторов (NLR) активирует экспрессию многочисленных генов врожденного иммунного ответа. Многими авторами, в том числе нами, отмечено, что при сочетанной активации пар рецепторов NOD1 + TLR и NOD2 + TLR происходит синергическое увеличение экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов [1-8].

Под синергизмом понимают такое взаимодействие сигналов, при котором эффект одновременной активации двух рецепторов больше, чем сумма эффектов активации каждого рецептора по отдельности. Так, при активации макрофагов сочетанием агонистов TLR4 и NOD1 происходит синергическое увеличение экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов, кодируемых генами IL1B, IL6, IL12B, IL23A, TNF [1]. Подобные синергические эффекты могут играть пагубную роль при инфекционных заболеваниях, приводя к развитию "цитокинового шторма" [9, 10]. Однако мы обнаружили, что многие другие активационные процессы в макрофагах, в частности активация NF-κB-зависимого сигнального пути, усиление гликолиза, увеличение экспрессии ряда индуцибельных генов, увеличение противоопухолевой активности, при сочетанной стимуляции NOD1 и TLR4 регулируются несинергическим образом [1]. Эти данные позволили предположить, что эффект синергизма при одновременной стимуляции TLR4 и NOD1 ограничен сравнительно небольшой подгруппой индуцибельных генов.

Для проверки этого предположения мы провели полнотранскриптомный анализ макрофагов при сочетанной активации рецепторов TLR4 и NOD1 in vitro. Выбор сочетания TLR4 + NOD1 обусловлен тем, что эти рецепторы играют ключевую роль во врожденном иммунном ответе против грам-отрицательных бактерий: TLR4 распознает липополисахарид (ЛПС), а NOD1 - фрагменты пептидогликана грам-отрицательных бактерий [11, 12]. В качестве агониста NOD1 использовали синтетический фрагмент пептидогликана - N-ацетил-D-мурамил-L-аланил-D-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновую кислоту (М-триДАП), в качестве агониста TLR4 - ЛПС E. coli O111:B4. Поскольку синергическое нарастание экспрессии мРНК цитокинов происходит в период между 1 и 4 ч после начала стимуляции NOD1 + TLR4 [1], эти две точки были выбраны для исследования транскриптомов в настоящей работе.

Материал и методы

Реактивы. Синтетический М-триДАП и ультрачистый ЛПС E. coli O111:B4 были закуплены у фирмы InvivoGen (США), рекомбинантный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) - у Miltenyi Biotec (ФРГ). Полная культуральная среда (ПКС) представляла собой RPMI-1640 с добавлением 2 мМ L-глутамина и 10 % фетальной телячьей сыворотки (все Thermo Fisher Scientific, США).

Доноры крови. Для проведения полнотранскриптомного анализа (RNA-seq) была получена венозная гепаринизированная кровь от 3 здоровых доноров из числа сотрудников лаборатории. Для подтверждающих экспериментов (ПЦР-РВ) была получена кровь еще от 40 здоровых доноров. Исследование было одобрено Локальным комитетом по этике ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России" (протокол 10/2017). Все доноры дали информированное согласие на участие в исследовании.

Культивирование и стимуляция макрофагов. Макрофаги получали, как описано ранее [13], и высевали в 24-луночный планшет по 2·105 клеток в 400 мкл ПКС на лунку. На следующие сутки к клеткам добавляли М-триДАП (10 мкг/мл) и ЛПС (10 нг/мл) раздельно и в сочетании либо оставляли без агонистов для оценки базальной экспрессии. Через 1 и 4 ч после начала стимуляции клетки лизировали для выделения мРНК.

Исследование транскриптомов макрофагов с помощью RNA-seq. Процедура получения библиотек кДНК для RNA-seq описана ранее [13]. Библиотеки секвенировали на приборе Illumina NovaSeq 6000 (Евроген, Москва, Россия) в формате односторонних прочтений длиной 100 пар оснований. Выравнивание прочтений на транскриптом человека (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-98/fasta/homo_sapiens/cdna/Homo_sapiens.GRCh38.cdna.abinitio.fa.gz), а также подсчет числа прочтений на ген (counts) выполняли с помощью программного пакета Salmon [14]. Доля успешно выравненных прочтений во всех библиотеках составила > 90 %. Прочтения, относящиеся к различным вариантам мРНК одного и того же гена, суммировали.

Анализ данных RNA-seq. Для анализа были отобраны 11 839 наиболее представленных белок-кодирующих генов (не менее 50 "сырых" прочтений на ген хотя бы в одном образце у каждого из трех доноров). Чтобы избежать деления на 0 при расчете индексов стимуляции, нулевые значения числа прочтений заменяли на 1. Нормализованную экспрессию генов выражали в виде числа прочтений, деленного на миллион всех прочтений в данной библиотеке и на длину гена в килобазах (reads per kilobase per million, RPKM). Длины генов определяли с помощью программного пакета GTFtools (https://www.genemine.org/gtftools.php) как средние значения длин сплайс-вариантов мРНК.

В каждом эксперименте для каждого гена, точки и агониста вычисляли индексы стимуляции (ИС) по формуле:

ИС = RPKMагонист / RPKM0,

где RPKMагонист - экспрессия гена после стимуляции агонистом или их сочетанием, RKPM0 - базальная экспрессия данного гена у того же донора в той же временной точке. Увеличение экспрессии гена, вызванное данным агонистом в данной точке, считали биологически значимым при ИС ≥ 2 у всех трех доноров.

Было обнаружено 637 генов, удовлетворявших данному условию хотя бы в одной точке при стимуляции хотя бы одним агонистом либо их сочетанием. Эти гены сформировали подмножество индуцибельных генов.

Чтобы оценить взаимодействие сигналов от NOD1 и TLR4, рассчитывали индексы потенцирования (ИП), известные также как индексы синергизма, по формуле:

ИП = ОтветМ-триДАП+ЛПС / (ОтветМ-триДАП + ОтветЛПС),

где Ответагонист = (RPKMагонист - RPKM0) / RPKM0 = ИСагонист - 1.

ИП для данного гена/точки рассчитывали только при наличии биологически значимой индукции хотя бы одним агонистом или их сочетанием. Чтобы избежать отрицательных значений ИП, отрицательные значения ответов приравнивали к нулю. Если ответы на оба отдельно взятых агониста были нулевыми, а ответ на сочетание агонистов - ненулевым, во избежание деления на 0 значением ИП считали значение ответа на сочетание агонистов (ИП = ИСМ-триДАП+ЛПС - 1). Достоверность отличия ИП от 1 для данного гена в данной точке оценивали с помощью парного t-теста по трем экспериментам. Использовали два определения синергически индуцируемых генов: 1) средний ИП > 1 (по трем экспериментам) при p < 0,05; 2) ИП ≥ 1,2 в каждом из трех опытов независимо от значения p.

Анализ функциональной принадлежности генов. Использовали аннотированные функциональные наборы генов, опубликованные на сайте Gene set enrichment analysis (https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/genesets.jsp), из коллекций Hallmark (50 наборов генов, участвующих в основных биологических процессах) и C3.TFT (1134 набора генов, являющихся мишенями определенных факторов транскрипции). Из наборов исключали гены, не входящие в список 11 839 генов, экспрессируемых в макрофагах. Обогащение или обеднение представителей данного функционального набора в данном множестве генов по сравнению другим множеством оценивали с помощью теста χ2. Множественность сравнений учитывали по процедуре Беньямини-Хохберга [15] с пороговым уровнем достоверности q = 0,05.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Данные по экспрессии мРНК отдельных генов были валидированы с помощью ПЦР-РВ в независимых экспериментах, поставленных по вышеописанной схеме. Условия ПЦР-РВ описаны ранее [1]. Определение экспрессии мРНК IL6 и TNF было выполнено у 40 доноров, IL12B и IL23A - у 21 донора.

Анализ сайтов связывания факторов транскрипции. Использовали программу CiiiDER [16], как описано ранее [13]. Численность генов, содержащих в промоторе хотя бы один данный сайт связывания, в множествах генов 1 и 2 сравнивали тестом χ2. Учитывали сайты связывания только тех факторов транскрипции, которые экспрессировались в макрофагах (354 разновидности). Множественность сравнений учитывали по процедуре Беньямини-Хохберга с q = 0,05.

Прочие методы статистического анализа и визуализации данных. Значения случайных величин в независимых выборках сравнивали с помощью t-теста Стьюдента. Распределения случайных величин сравнивали с помощью теста Колмогорова-Смирнова. Различия считали значимыми при p < 0,05. Диаграммы Венна строили с помощью онлайн-программы http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/.

Результаты

Численность индуцибельных генов в макрофагах, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4

Анализ кооперации NOD1 и TLR4 проводили на подмножестве 637 индуцибельных генов, сформированном по критериям, описанным в разделе "Материал и методы". Сочетание М-триДАП + ЛПС вызывало биологически значимое повышение экспрессии большего числа генов, чем любой из двух агонистов по отдельности (рис. 1А, Б). Существенная доля генов, отвечающих на М-триДАП + ЛПС, не отвечала на отдельно взятые агонисты (54 из 182 в точке 1 ч, 112 из 536 в точке 4 ч). Однако большинство генов, характеризующихся значимым ответом на М-триДАП + ЛПС, отвечало на стимуляцию одним из агонистов или обоими агонистами по отдельности. Самой малочисленной группой оказались гены, индуцируемые отдельно взятыми агонистами, но не отвечающие на сочетание агонистов (рис. 1А, Б).

Идентификация синергически индуцируемых генов (СИГ)

Взаимодействия сигналов от NOD1 и TLR4 на уровне отдельно взятых генов оценивали по значениям ИП. Распределение средних значений ИП было асимметричным (рис. 1В, Г). В обеих точках гены со средним ИП < 1 (log2 ИП < 0) преобладали над генами с ИП > 1. В точке 1 ч был выявлен лишь 1 ген с ИП > 1 и p < 0,05 (C11ORF96), что соответствует нашим более ранним наблюдениям, свидетельствующим об отсутствии синергических эффектов через 1 ч стимуляции [1]. В точке 4 ч было обнаружено 29 генов с ИП > 1 и p < 0,05, что составило ≈ 4,6 % от числа индуцибельных генов или ≈ 0,24 % всех экспрессирующихся генов.

Интересно, что при данном способе идентификации СИГ в их число не вошли TNF, IL6, IL1B (p > 0,05 в парном t-тесте), хотя значения ИП для них в точке 4 ч были существенно выше 1 во всех трех экспериментах. Вероятная причина - большие разбросы значений ИП при малом числе экспериментов. Мы оценили экспрессию мРНК TNF, IL6, а также IL12B и IL23A с помощью ПЦР-РВ в большем числе опытов и подтвердили наличие достоверных синергических эффектов для всех 4 генов после 4 ч сочетанной стимуляции (ИПTNF = 4,23 ± 1,66, p = 5,01 · 10-15 для отличия ИП от 1, n = 40; ИПIL6 = 7,35 ± 6,85, p = 8,02 · 10-7, n = 40; ИПIL12B = 4,19 ± 1,84, p = 1,29 · 10-7, n = 21; ИПIL23A = 4,59 ± 1,89, p = 3,14 · 10-8, n = 21), что соответствует результатам нашей предыдущей работы [1].

Поскольку статистические методы недостаточно надежны при малом числе наблюдений, мы применили другой подход для идентификации СИГ: таковыми считали гены, имеющие ИП ≥ 1,2 во всех трех экспериментах независимо от значения p. Пороговое значение ИП было сдвинуто на 0,2 единицы вверх, чтобы исключить гены, у которых синергическое усиление экспрессии слабо выражено. В точке 1 ч данному определению СИГ удовлетворяли 6 генов (ACOD1, ARC, C11ORF96, GFPT2, IL36G, MCOLN2), или ≈ 0,94 % всех индуцибельных генов (рис. 1В). В точке 4 ч таких генов выявлено 64 (рис. 1Г), что составило ≈ 10 % всех индуцибельных генов или ≈ 0,54 % всех экспрессирующихся генов. 32 из этих 64 генов (50 %) значимо индуцировались каждым из двух агонистов по отдельности; остальные 50 % составили гены, значимо индуцируемые только одним агонистом, но потенцируемые при действии сочетания агонистов, а также гены, значимо индуцируемые только сочетанием агонистов (табл. 1). Для генов ACOD1, C11ORF96 и IL36G синергическое усиление экспрессии наблюдалось в обеих точках.

В целом, независимо от метода идентификации, СИГ составляют лишь небольшую часть индуцибельных генов. Среди СИГ преобладают гены с провоспалительной активностью, однако присутствуют также гены, кодирующие противовоспалительные белки (ACOD1, IL10) (см. табл. 1).

Сопоставление синергически и несинергически индуцируемых генов

В первую очередь нас интересовали 32 СИГ, индуцируемые каждым из двух агонистов по отдельности, так как это подмножество включало в себя гены основных провоспалительных цитокинов и других ключевых медиаторов воспаления (см. табл. 1).

Чтобы оценить особенности этого подмножества СИГ (далее - 32-СИГ), мы сформировали подмножество сравнения: 87 генов, также отвечающих на каждый агонист по отдельности, но имеющих ИП ≤ 1 в точке 4 ч во всех 3 экспериментах (несинергически индуцируемые гены - НИГ). 32-СИГ характеризовались достоверно более низкой абсолютной базальной экспрессией, чем НИГ (рис. 2А). Напротив, при стимуляции М-триДАП + ЛПС в течение 4 ч абсолютная экспрессия 32-СИГ была достоверно выше, чем экспрессия НИГ (см. рис. 2А). Соответственно, в присутствии М-триДАП + ЛПС индексы стимуляции у 32-СИГ были существенно выше, чем у НИГ (рис. 2Б). В списке 11839 экспрессируемых генов, ранжированных по базальной экспрессии, 32-СИГ находились преимущественно среди генов с низкой экспрессией, тогда как НИГ были распределены более равномерно (рис. 2В). При сочетанной стимуляции 32-СИГ и в меньшей степени НИГ смещались в область высокоэкспрессируемых генов (рис. 2В): например ген IL1B (один из 32-СИГ) по уровню мРНК оказался на 4-м месте среди всех мРНК ядерного происхождения.

Анализ функциональной принадлежности показал, что 32-СИГ и НИГ примерно в равной степени обогащены генами из наборов Hallmark_tnfa_signaling_via_nfkb и Hallmark_inflammatory_response, включающих гены основных провоспалительных медиаторов (табл. 2). 32-СИГ были обогащены также генами из набора Hallmark_IL6_JAK_STAT3_signaling, а НИГ - Hallmark_interferon_gamma_response. Гены из набора Hallmark_interferon_alpha_response, включающего интерферониндуцибельные гены, среди 32-СИГ и НИГ практически отсутствовали.

Низкая базальная экспрессия 32-СИГ может быть связана с активной репрессией этих генов в покоящихся клетках, в то время как их высокая индуцибельность при стимуляции М-триДАП + ЛПС может быть обусловлена наличием определенных сайтов связывания активационных факторов транскрипции. Для проверки этой гипотезы применили два подхода. Во-первых, проанализировали представленность генов из наборов C3.TFT (гены-мишени факторов транскрипции) среди 32-СИГ и НИГ (табл. 3). 32-СИГ по сравнению с НИГ были обогащены генами-мишенями NF-κB, PU.1 и AP-1 (наборы ALL_NFKB_TARGETS, RGAGGAARY_PU1_Q6, TGANTCA_AP1_C; см. табл. 3). Во-вторых, провели собственный анализ сайтов связывания факторов транскрипции в промоторах 32-СИГ и НИГ. Среди 32-СИГ достоверно чаще встречались гены, содержащие в своих промоторах сайты связывания факторов транскрипции семейства AP-1 (JUN, JUNB, JUND, FOS, FOSL1, FOSL2), а также BHLHE41, CUX1, HIF1α и ZEB1 (рис. 3А). Полученные данные указывают на возможную роль NF-κB и AP-1 в синергическом усилении экспрессии 32-СИГ. Однако необходимо отметить, что значения p для сравнений 32-СИГ и НИГ во всех случаях были выше пороговых при проверке на множественность сравнений.

Экспрессия ИФН-индуцибельных генов при сочетанной стимуляции

Секреция ИФН-β и вызванное этим повышение экспрессии ИФН-индуцибельных генов является неотъемлемой частью ответа макрофагов на стимуляцию TLR4. Напротив, при стимуляции NOD1 возрастает экспрессия лишь нескольких представителей этой группы генов [13]. В промоторах 32-СИГ и НИГ не выявлено обогащения сайтов связывания факторов транскрипции, участвующих в интерфероновом ответе (STAT1, STAT2, семейство IRF). В то же время среди 637 индуцибельных генов, анализируемых в настоящей работе, присутствовали 45 представителей набора Hallmark_interferon_alpha_response, включающего ИФН-индуцибельные гены. Как видно из рис. 3Б и 3В, экспрессия генов этого набора при стимуляции ЛПС и М-триДАП + ЛПС различалась незначительно. Лишь 1 из 45 генов (ISG20) соответствовал одному из определений СИГ (ИП ≥ 1,2 в 3 экспериментах). Таким образом, интерфероновый ответ макрофагов при стимуляции сочетанием М-триДАП + ЛПС определяется преимущественно действием ЛПС, синергические эффекты отсутствуют.

Обсуждение

В настоящей работе впервые охарактеризован транскрипционный ответ макрофагов человека на сочетанную стимуляцию NOD- и Toll-подобного рецепторов. Хотя взаимодействие представителей этих семейств ПРР принято считать синергическим [2, 3, 7, 8], мы наблюдали синергическое усиление экспрессии менее чем для 10 % всех индуцибельных генов. В частности, эффект синергизма отсутствовал для ИФН-индуцибельных генов (рис. 3Б, В). Кроме того, мы подтвердили, что синергические эффекты отсутствуют на раннем этапе активации макрофагов (1 ч) и формируются после 4 ч сочетанной стимуляции (рис. 1В, Г).

Наши данные принципиально схожи с результатами G. Napolitani и соавт., изучавшими активацию дендритных клеток человека сочетанием агонистов TLR4 + TLR8 [17]. В этой работе синергические эффекты агонистов также отсутствовали на раннем этапе сочетанной стимуляции (2 ч), но были ярко выражены через 8 ч. Многие гены, синергически индуцируемые сочетанием агонистов NOD1 + TLR4 в макрофагах в нашей работе, также индуцировались синергически сочетанием TLR4 + TLR8 в дендритных клетках, в частности гены CSF2 (GMCSF), CSF3 (GCSF), IL6, IL10, IL12B, IL23A, IL36G, MMP10, PTGS2 (COX2), TNF, TSLP [17].Эти результаты показывают, что возможность синергической индукции экспрессии тех или иных генов зависит не столько от конкретного сочетания агонистов и типа клеток, сколько от особенностей самих генов. К особенностям СИГ, выявленным в настоящей работе, можно отнести низкую базальную экспрессию и высокий ответ на стимуляцию (см. рис. 2). Кроме того, среди СИГ чаще встречаются гены-мишени NF-κB и AP-1 (см. табл. 3), а промоторы СИГ достоверно чаще содержат сайты связывания факторов транскрипции семейства AP-1 (см. рис. 3А). Эти результаты хорошо согласуются с работой А.И. Тухватулина и соавт., где показано, что для синергического усиления экспрессии репортерного гена в клетках THP-1, активированных сочетаниями агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов, достаточно присутствия в промоторе сайтов связывания NF-κB и AP-1 [4].

Несмотря на свою относительную малочисленность, СИГ имеют большое функциональное значение, поскольку включают гены основных провоспалительных цитокинов (см. табл. 1). Мы полагаем, что синергические эффекты могут играть как положительную, так и отрицательную роль. Неконтролируемая синергическая индукция выработки цитокинов сочетаниями агонистов NOD- и Toll-подобных рецепторов может иметь отрицательные последствия при инфекционных заболеваниях, приводя к развитию "цитокинового шторма" с неблагоприятным исходом [9, 10]. С другой стороны, контролируемые синергические эффекты могут быть использованы в терапевтических целях для профилактики инфекционных заболеваний и для лечения злокачественных опухолей [18-20]. В частности, только сочетание агонистов NOD1 + TLR4, но не отдельно взятые агонисты, позволяет эффективно перепрограммировать свойства макрофагов с проопухолевых на противоопухолевые, причем одним из медиаторов противоопухолевой активности макрофагов, активированных сочетанием агонистов, является ФНО, кодируемый одним из 32-СИГ [20]. Знания о характеристиках и механизмах синергических эффектов позволят выбрать правильные мишени для подавления гиперпродукции цитокинов при "цитокиновом шторме", а также подобрать наиболее подходящие комбинации агонистов для терапевтического использования в клинических ситуациях, требующих усиления врожденного иммунного ответа.

Выводы

1. Впервые охарактеризован транскрипционный ответ макрофагов человека на сочетание агонистов рецепторов NOD1 и TLR4, играющих ключевую роль в распознавании грам-отрицательных бактерий.

2. Гены, синергически индуцируемые при сочетанной стимуляции двух рецепторов, составляют не более 10 % всех индуцибельных генов.

3. Группа синергически индуцируемых генов имеет большое функциональное значение, так как включает гены основных провоспалительных цитокинов.

4. Синергически индуцируемые гены отличаются от несинергически индуцируемых низкой базальной экспрессией и высоким ответом на сочетание агонистов. Получены косвенные данные о возможном участии факторов транскрипции семейств NF-κB и AP-1 в синергическом усилении экспрессии генов.

Литература

1. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P.V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S. et al. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflammatory gene expression. J. Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https://www.doi.org/10.4049/JIMMUNOL.2000692

2. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M. et al. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2- activating agonists. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70. DOI: https://www.doi.org/10.1002/eji.200526286

3. Tada H., Aiba S., Shibata K.I., Ohteki T., Takada H. Synergistic effect of Nod1 and Nod2 agonists with toll-like receptor agonists on human dendritic cells to generate interleukin-12 and T helper type 1 cells. Infect. Immun. 2005; 73 (12): 7967-76. DOI: https://www.doi.org/10.1128/IAI.73.12.7967-7976.2005

4. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheblyakov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova I.V. et al. Powerful complex immunoadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive immune responses. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155650. DOI: https://www.doi.org/10.1371/journal.pone.0155650

5. van Beelen A.J., Zelinkova Z., Taanman-Kueter E.W., Muller F.J., Hommes D.W., Zaat S.A.J. et al. Stimulation of the intracellular bacterial sensor NOD2 programs dendritic cells to promote interleukin-17 production in human memory T cells. Immunity. 2007; 27 (4): 660-9. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.immuni.2007.08.013

6. Van Heel D.A., Ghosh S., Hunt K.A., Mathew C.G., Forbes A., Jewell D.P. et al. Synergy between TLR9 and NOD2 innate immune responses is lost in genetic Crohn’s disease. Gut. 2005; 54 (11): 1553-7. DOI: https://www.doi.org/10.1136/gut.2005.065888

7. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D. et al. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur J Immunol. 2005; 35 (8): 2471-26. DOI: https://www.doi.org/10.1002/eji.200526296

8. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева Е.С., Чулкина М., Атауллаханов Р.И. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов различных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38 (2): 118-23. DOI: https://www.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-118-123

9. Takada H., Galanos C. Enhancement of endotoxin lethality and generation of anaphylactoid reactions by lipopolysaccharides in muramyl-dipeptide-treated mice. Infect Immun. 1987; 55 (2): 409-13. DOI: https://www.doi.org/10.1128/iai.55.2.409-413.1987

10. Murch O., Abdelrahman M., Kapoor A., Thiemermann C. Muramyl dipeptide enhances the response to endotoxin to cause multiple organ injury in the anesthetized rat. Shock. 2008; 29 (3): 388-94. DOI: https://www.doi.org/10.1097/SHK.0b013e3181453e59

11. Poltorak A., He X., Smirnova I., Liu M.Y., Van Huffel C., Du X. et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: Mutations in Tlr4 gene. Science. 1998; 282 (5396): 2085-8. DOI: https://www.doi.org/10.1126/science.282.5396.2085

12. Girardin S.E., Travassos L.H., Hervé M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J. et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41702-8. DOI: https://www.doi.org/10.1074/jbc.M307198200

13. Масютина А.М., Муругина Н.Е., Пащенкова Ю.Г., Пащенков М.В. Сравнительная характеристика транскриптомов макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4. Иммунология. 2023; 44 (1): 16-27. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-1-16-27

14. Patro R., Duggal G., Love M.I., Irizarry R.A., Kingsford C. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 2017; 14 (4): 417-9. DOI: https://www.doi.org/10.1038/nmeth.4197

15. Benjamini Y., Hochberg Y. Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. J. R. Stat. Soc. Ser. B. 1995; 57 (1): 289-300. DOI: https://www.doi.org/10.1111/j.2517-6161.1995.tb02031.x

16. Gearing L.J., Cumming H.E., Chapman R., Finkel A.M., Woodhouse I.B., Luu K. et al. CiIIder: A tool for predicting and analysing transcription factor binding sites. PLoS One. 2019; 14 (9): e0215495. DOI: https://www.doi.org/10.1371/journal.pone.0215495

17. Napolitani G., Rinaldi A., Bertoni F., Sallusto F., Lanzavecchia A. Selected Toll-like receptor agonist combinations synergistically trigger a T helper type 1 -polarizing program in dendritic cells. Nat. Immunol. 2005; 6 (8): 769-76. DOI: https://www.doi.org/10.1038/ni1223

18. Tukhvatulin A.I., Gitlin I.I., Shcheblyakov D.V., Artemicheva N.M., Burdely L.G., Shmarov M.M. et al. Combined stimulation of Toll-like receptor 5 and Nod1 strongly potentiates activity of NF-κB, resulting in enhanced innate immune reactions and resistance to Salmonella enterica serovar typhimurium infection. Infect. Immun. 2013; 81 (10): 3855-64. DOI: https://www.doi.org/10.1128/IAI.00525-13

19. Багаев А.В., Рыбинец А.С., Федорова А.А., Ушакова Е.И., Лебедева Е.С., Пичугин А.В. и др. Синергизм агонистов TLR3 и TLR4 при перепрограммировании макрофагов в противоопухолевое состояние. Иммунология. 2021; 42 (6): 615-30. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-615-630

20. Муругина Н.Е., Муругин В.В., Пащенков М.В. Противоопухолевая активность макрофагов человека, активированных агонистами рецепторов NOD1 и TLR4 in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 548-57. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-548-557

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»