Аддитивный эффект синтетических малых интерферирующих РНК в отношении респираторно-синцитиального вируса

• Шиловский Игорь Петрович
• Тимотиевич Екатерина Драгановна
• Юмашев Кирилл Валерьевич
• Русак Татьяна Евгеньевна
• Вишнякова Людмила Ивановна
• Никонова Александра Александровна
• Смирнов Валерий Валерьевич
• Кофиади Илья Андреевич
• Брылина Вера Евгеньевна
• Сергеев Илья Викторович
• Маерле Артем Владимирович
• Кудлай Дмитрий Анатольевич
• Хаитов Муса Рахимович

Резюме

Введение. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) - один из самых распространенных патогенов в мире. Он вызывает тяжелые заболевания верхних и нижних дыхательных путей. Ежегодно от РСВ-инфекции в мире умирает несколько миллионов детей младше 5 лет. Эффективных, безопасных и при этом доступных методов лечения пациентов с РСВ-инфекцией до сих пор не создано. С открытием явления интерференции РНК - механизма негативной регуляции активности генов молекулами малых интерферирующих РНК (миРНК) - появились новые возможности для создания эффективных специфических лекарственных средств, в том числе противовирусных.

Цель данной работы - создание молекул миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ и исследование их антивирусной активности in vitro.

Материал и методы. Проектирование молекул миРНК осуществляли in silico с использованием биоинформационного программного обеспечения. Антивирусную активность изучали в экспериментах in vitro на культуре клеток HEp-2. Клетки трансфецировали молекулами миРНК, после чего оценивали вирусную нагрузку с помощью количественного ПЦР-анализа и титрования на монослое чувствительных клеток МА-104.

Результаты. В отдельных экспериментах мы показали, что из трех чувствительных к вирусу клеточных линий клетки НЕр-2 более пригодны для тестирования антивирусной активности миРНК, поскольку они легче трансфецируются. В результате тестирования 4 вариантов миРНК против жизненно важных генов вируса (генов n и p) было установлено, что 2 варианта (siN-745 - против гена n и siP4 - против гена p) обладают наиболее выраженным антивирусным эффектом, снижая титр вируса более чем в 10 раз. При этом одновременное использование двух вариантов миРНК обеспечивает более выраженный (аддитивный) противовирусный эффект, снижая репликацию вируса почти в 100 раз. Данный эффект, возможно, связан с тем, что гены p и n играют различную роль в жизненном цикле вируса. Ген p кодирует фермент репликации, ген n - нуклеопротеин, защищающий геном вируса от деградации.

Заключение. Показано, что одновременное применение двух вариантов миРНК, направленных против консервативных генов n и p РСВ, позволяет добиться более выраженного противовирусного эффекта в сравнении с использованием индивидуальных миРНК против отдельных генов. Созданная композиция молекул миРНК может быть использована в составе противовирусных препаратов, направленных против РСВ.

Ключевые слова:миРНК; РНК-интерференция; вирус; респираторно-синцитиальный вирус

Введение

Заболевания, вызываемые вирусными инфекциями дыхательных путей, занимают 1-е место по распространенности среди всех вирусных патологий. Наиболее значимыми патогенами являются респираторно-синцитиальный вирус (РСВ), риновирус (РВ), вирус гриппа и коронавирусы. На эти патогены приходиться до 90 % всех случаев инфекционных заболеваний [1]. Один из самых распространенных вирусных патогенов - РСВ. Он поражает нижние дыхательные пути, что в ~ 40 % случаев сопровождается тяжелым бронхиолитом и пневмонией. Ежегодно в мире госпитализируется до 3 млн детей, инфицированных РСВ, при этом смертность от этой инфекции составляет 66-199 тыс. в год [2]. К особенностям этого вируса также можно отнести то, что перенесенная инфекция не вызывает стойкого иммунитета, что приводит к реинфекциям [3]. Помимо непосредственного участия в развитии инфекции дыхательных путей, РСВ является значимым триггером в осложнениях других заболеваний, в частности бронхиальной астмы (БА), что в некоторых случаях может приводить к летальному исходу. Таким образом, РСВ-инфекция опасна не только своим прямым негативным действием на организм человека, но и тем, что является триггером других патологий дыхательных путей [4].

Эффективной вакцины против РСВ в настоящее время не существует. Созданная в 1960-х гг. вакцина сенсибилизировала детей к РСВ и в 80 % случаев вызывала развитие тяжелых осложнений, таких как пневмония и бронхиолит, приведших к госпитализации и даже гибели двух детей из вакцинированной группы.

Вакцины, созданные спустя 30 лет, также не были эффективны по различным причинам: одни вызывали острую РСВ-инфекцию, другие оказывали отсроченное вирулентное действие либо не вызывали адекватного иммунного ответа [5].

Существует опыт применения средств против РСВ на основе нейтрализующих моноклональных антител IGIV (Respigam), паливизумаб (Synagis), MEDI-524 (Numab), мотавизимаб [6-8]. Клинические исследования этих препаратов продолжаются, однако их применение будет ограничено высокой стоимостью.

Кроме того, недавно фармацевтическая компания Regeneron Pharmaceuticals (США) сообщила о приостановке клинического исследования препарата суптавизимаб против РСВ ввиду того, что не была достигнута основная конечная точка исследования: предотвращение инфицирования младенцев РСВ [9].

За последние 15 лет разработан ряд низкомолекулярных органических соединений, которые были способны ингибировать проникновение РСВ в клетки за счет связывания их с F-белком РСВ (блокирование слияния вируса с клеткой). Однако в результате мутаций F-белка возникали варианты РСВ, устойчивые к ингибиторам [10].

В настоящее время для лечения РСВ-инфекции применяется только виразол (рибавирин) [11], однако он вызывает многочисленные побочные эффекты [12]. Ведутся работы над созданием новых терапевтических средств, например пептидных ингибиторов [13, 14], наночастиц [15] и различных малых молекул [16].

Таким образом, эффективных, безопасных и при этом доступных методов лечения РСВ-инфекции до сих пор не разработано. Это определяет актуальность разработки новых противовирусных препаратов.

Открытие в 1998 г. явления интерференции РНК как способа регуляции генной экспрессии на посттраскрипционном уровне дало новые возможности для разработки лекарственных средств, которые могут применяться в том числе для лечения вирусных инфекций. Синтезируя молекулы малых интерферирующих РНК (миРНК) с заданной нуклеотидной последовательностью, можно подавлять экспрессию любого гена с известной нуклеотидной последовательностью [17, 18], в том числе генов патогенных вирусов [19, 20].

К настоящему времени секвенированы геномы многих вирусов, в том числе геном РСВ. Он представлен несегментированной одноцепочечной молекулой РНК негативной полярности, длина которой составляет 15 200 нуклеотидных оснований, и содержит 10 генов, кодирующих 11 белков [21, 22].

РСВ имеет 3 поверхностных гликопротеина: малый гидрофобный протеин SH (small hydrophobic), белок слияния F (fusion protein) и гликопротеин прикрепления G (attachment glycoprotein).

Характерная особенность РСВ - индукция образования массы слившихся, утративших свою нормальную структуру инфицированных клеток, называемой синцитием, от которого РСВ и получил свое название. Белок слияния F играет основную роль в процессе образования синцитиев. Противовирусная активность антител in vitro и in vivo определяется именно связыванием с белками G и F [8]. Функция белка SH не известна. Белки нуклеокапсида включают нуклеопротеин N, фосфопротеин P, матриксные протеины М1, М2-1, M2-2 и протеин L.

Белок M2-1 (также называемый 22К или матриксный протеин) - фактор элонгации транскрипции. Ген M2 содержит вторую открытую рамку считывания, которая кодирует белок М2-2, участвующий в регуляции транскрипции. Матриксный протеин М1 участвует в процессе упаковки вируса [21, 22].

Закодированные в геноме РСВ два неструктурных белка, NS1 и NS2, по некоторым данным, могут угнетать интерфероновый антивирусный ответ [23]. Особо важную роль в репликации РСВ играют три белка: белок нуклеокапсида N, окружающий негативную геномную цепь РНК и комплементарную ей позитивную антигеномную РНК в цитоплазме клетки, предотвращая их гидролиз нуклеазами; белок L, являющийся главной субъединицей РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp), и фосфопротеин Р, являющийся малой субъединицей RdRp и необходимым транскрипционным фактором [21, 22, 24].

Цель данной работы - проектирование миРНК, направленных против жизненно важных генов РСВ, и изучение их противовирусных свойств in vitro.

Материал и методы

Культура клеток и вирусный штамм. В работе использовали РСВ штамм А2, предоставленный ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова Минобрнауки России. Использовали клетки карциномы гортани человека HEp-2, карциномы легкого человека А549 и эмбриональной почки зеленой мартышки МА-104 (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, подразделение ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России).

Проектирование миРНК к генам РСВ. Проектирование последовательностей миРНК осуществлялось с помощью программы OligoWalk [http://rna.urmc.rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_form.cgi]. Синтез молекул миРНК, их очистка, а также подтверждение чистоты и подлинности осуществлялся компанией ООО "ДНК-Технология" (Россия).

Оценка активности люциферазы. В 24-луночный планшет засевали клетки линий HEp-2, А549 и МА-104 в количестве 200 тыс./лунку в 0,6 мл полной питательной среды ДМЕМ (ПанЭко, Россия). Инкубировали в течение ночи до образования монослоя, после чего осуществляли трансфекцию 0,5 мкг плазмиды pGL3 (Promega, США) и 1 мкл Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific, США). Через сутки после трансляции клетки лизировали и оценивали активность люциферазы при помощи набора Bright-Glo™ Luciferase Assay System (Promega, США). Данные представляли в виде RLU/200 000 клеток, где RLU - количество относительных световых единиц (RLU - relative light unit).

Оценка противовирусного эффекта молекул миРНК. Для оценки противовирусных свойств молекул миРНК клетки НЕр-2 трансфецировали спроектированными миРНК с использованием коммерческого реагента Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) (0,5 мкг миРНК/200 тыс. кл.). В качестве отрицательного контроля клетки трансфецировали таким же количеством неспецифических молекул миРНК против гена gfp (siGFP). Через 4 ч после трансфекции клетки инфицировали вирусом РСВ штамм А2 при MOI = 0,1 в течение 2 ч, после чего повторяли трансфекцию и инкубировали в течение 3 сут. Затем собирали супернатант и хранили его при -20 °С до анализа с помощью титрования, а монослой клеток лизировали в буфере RLT (Qiagen, США) и хранили его при -20 °С до анализа с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Оценка вирусной нагрузки. Вирусную нагрузку оценивали с помощью количественной ПЦР. Для этого из клеточных лизатов выделяли общую РНК. 1-2 мкг РНК использовали в реакции обратной транскрипции с использованием случайного гексамерного праймера и набора реагентов ОТ-1 (Синтол, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. Далее 3 мкл кДНК использовали в реакции количественной ПЦР с применением набора реагентов ОТ-1 производства компании "Синтол", специфических праймеров и зонда: F GAAGCATTAATGACCAATGA, R CATCTGATGTGTCTTTTGC, Z (ROX) GCTATGGCAAGACTCAGGAATGAG (RTQ2). Синтез праймеров и зонда осуществляли в компании "Синтол" (Россия). ПЦР осуществляли с использованием амплификатора IQ5 (BioRad, США).

Также вирусную нагрузку определяли с помощью титрования на монослое чувствительных клеток МА-104. Для этого в 96-луночный планшет засевали клетки в количестве 20 тыс./лунку в объеме 100 мкл/лунку полной среды DМЕМ (Gibco, США), содержащей 300 мг/л L-глутамина (ПанЭко, Россия), 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), 25 мМ HEPES (ПанЭко, Россия) и инкубировали в течение ночи при 37 ° в атмосфере 5 % СО₂ до образования монослоя. После чего клетки промывали физиологическим раствором (ПанЭко, Россия) (200 мкл/лунку), вносили в них безсывороточную среду DМЕМ, содержащую 600 мг/л L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 25 мМ HEPES, и титровали супернатанты с шагом разведения 10 раз. Затем клетки инкубировали 3-5 сут и оценивали титр вируса с помощью световой микроскопии по образовавшимся на монослое синцитиям (бляшкам). Титр вируса рассчитывали по формуле Спирмена-Кербера.

Результаты

Проектирование молекул миРНК

Молекулы миРНК против гена р были спроектированы и изучены в экспериментах in vitro и in vivo в предшествующих работах [25, 26]. Ген p кодирует фосфопротеин Р, который является субъединицей RdRp и участвует в транскрипции мРНК генов РСВ и в репликации генома вируса. Было продемонстрировано, что наибольшей антивирусной активностью обладают два варианта - siP2 и siP4 [25, 26] (см. таблицу).

С использованием программного обеспечения OligoWalk было спроектировано 43 варианта молекул миРНК против другого жизненно важного гена РСВ - n, который кодирует нуклеопротеин N - белок, связывающийся с геномной РНК вируса в клетке и защищающий ее от клеточных нуклеаз. Из 43 вариантов были выбраны для синтеза и изучения в экспериментах in vitro 2 варианта миРНК (см. таблицу). При выборе миРНК мы руководствовались результатами прогнозирования биологической активности молекул миРНК и рассматривали варианты миРНК с высокой теоретической активностью. Помимо этого, осуществлялся поиск последовательностей спроектированных молекул миРНК среди последовательностей генома человека. Из исследования исключались те варианты миРНК, которые имели высокое сходство с последовательностями в геноме человека, чтобы избежать off-target-эффектов. В исследование включали миРНК, имеющие не более 84 % идентичности с последовательностями в геноме человека.

Подбор модельной клеточной линии

В мировых научных публикациях описано по меньшей мере 3 культуры клеток, чувствительных к РСВ: МА-104 - клетки эмбриональной почки зеленой мартышки, HEp-2 - клетки эпидермоидной карциномы гортани человека, А549 - клеточная линия бронхиальной карциномы человека [8, 27]. Мы оценили способность указанных клеточных линий быть трасфецированными. Для этого с помощью коммерческого реагента Lipofectamine 2000 вводили в них плазмидную ДНК pGL3, несущую репортерный ген люциферазы, с последующим определением активности данного фермента в клеточных лизатах.

Мы показали, что клеточная линия HEp-2 является оптимальной для трансфекции спроектированных молекул миРНК. Активность люциферазы в лизатах этих клеток достигала 5 000 000 RLU/200 тыс. кл., в то время как в лизатах клеток А549 и МА-104 активность люциферазы была меньше в 5 и 70 раз соответственно (рис. 1). Дальнейшее изучение противовирусных свойств миРНК мы проводили на культуре HEp-2.

Оценка противовирусных свойств молекул миРНК in vitro

Для изучения противовирусной активности спроектированных миРНК клетки HEp-2 трансфецировали индивидуальными молекулами миРНК, после чего осуществляли инфекцию клеток вирусом и повторяли трансфекцию (как описано выше). Спустя 3 сут супернатант собирали и анализировали с помощью титрования, а клетки лизировали, выделяли РНК и определяли количество копий геномной РНК. Обнаружено, что наибольший противовирусный эффект обеспечивали варианты миРНК siN-745 и siP4, которые подавляли репликацию РСВ до 10 раз в сравнении с использованием контрольной миРНК - siGFP, что свидетельствует о сиквенс-специфическом подавлении репликации РСВ в клетке (рис. 2).

Поскольку гены n и p играют различную роль в репликации вируса, мы предположили, что одновременное подавление указанных генов может оказывать аддитивный противовирусный эффект. В серии экспериментов мы оценили аддитивный эффект миРНК siN-745 и siP4. Для этого использовали ту же модель инфекции in vitro (HEp-2/РСВ) с незначительными изменениями - трансфекцию клеток молекулами миРНК осуществляли однократно. Одновременное применение молекул миРНК siN-745 и siP4 приводило к почти 100-кратному подавлению вирусной нагрузки в инфицированных клетках. Таким образом, наблюдается аддитивный эффект исследованных миРНК (рис. 3).

Обсуждение

В данной работе показано, что спроектированные молекулы миРНК способны подавлять репликацию РСВ в экспериментах in vitro. Для проектирования молекул миРНК были выбраны два гена-мишени: n и p. Первый кодирует нуклеопротеин N, необходимый для предотвращения деградации геномной вирусной РНК в цитоплазме инфицированной клетки. Второй кодирует фосфопротеин Р, являющийся субъединицей РНК-полимеразы, необходимой для репликации вируса [21, 22]. Эти гены являются самыми консервативными в геноме РСВ [28, 29] Значимость этих генов для жизненного цикла вируса и высокая консервативность делают их привлекательными в качестве мишеней противовирусного воздействия с помощью целевых молекул миРНК.

РНК-интерференция - это высокоспецифичный процесс. Несовпадение спроектированных миРНК с последовательностью мишени на один нуклеотид существенно снижает эффект генного сайленсинга, несовпадение на два нуклеотида и более полностью отменяет эффект РНК-интерференции.

Гены n и p ранее уже рассматривались различными коллективами исследователей в качестве мишеней. Так, в работе V. Bitko и соавт. в 2001 г. были разработаны молекулы миРНК против гена р вируса [29]. В работе R. Alvarez и соавт. в качестве мишени выступал ген n как наиболее консервативный в геноме РСВ [28]. Также в качестве мишени для миРНК рассматривался ген f, кодирующий белок слияния F, необходимый для проникновения вируса в клетку и способствующий образованию синцитиев (конгломерата слившихся инфицированных клеток). Однако, хотя подавление экспрессии гена f ингибировало образование синцития, цитопатический эффект вируса на клетки оставался [29]. В наших предыдущих исследованиях [25, 26, 30] мы создали молекулы миРНК против гена p с уникальными последовательностями, отличающимися от используемых в работе V. Bitko и соавт. [29], а также дополнительно спроектировали миРНК против уникальных последовательностей гена n.

В данном исследовании мы попытались оценить аддитивный эффект применения молекул миРНК против обоих генов (n и p) одновременно. Показано, что трансфекция клеток HEp-2 обоими вариантами миРНК (siP4 и siN-745) усиливала противовирусный эффект в 2-3 раза по сравнению с использованием индивидуальных миРНК.

Возможно, данный эффект связан с тем, что гены p и n играют различную роль в жизненном цикле вируса. Ген p кодирует фермент репликации, ген n - нуклеопротеин, защищающий геном вируса от деградации. Кроме того, N-белок косвенно способен участвовать в репликации генома РСВ. Большие количества этого белка в клетке переводят полимеразу RdRp в репликативный режим, в котором она реплицирует геном вируса, а не осуществляет транскрипцию отдельных его генов [31]. Таким образом, подавляя молекулами миРНК две различные стадии жизненного цикла вируса (стадию репликации генома и процесс его упаковки), мы наблюдали усиленный (аддитивный) противовирусный эффект молекул миРНК.

Известен лекарственный препарат ALN-RSV01 производства Alnylam Pharmaceuticals (США), который прошел основные стадии клинических испытаний [32-34]. Действующим веществом этого препарата является модифицированная молекула миРНК против гена n РСВ. Проведенные R. Alvarez и соавт. исследования показали, что, несмотря на высокую консервативность гена n, в 9 % случаев участок гена, к которому направлен препарат ALN-RSV01, несет мутации, которые нивелируют его противовирусный эффект [28]. Таким образом, применение двух молекул миРНК, направленных к двум различным генам РСВ, будет оправдано не только с точки зрения большей противовирусной активности, но и с точки зрения уменьшения вероятности ухода вируса от действия препарата за счет мутаций.

Заключение

Осуществлен дизайн и синтез молекул миРНК против генов p и n, жизненно важных для репликации РСВ, и показан аддитивный противовирусный эффект при их совместном использовании in vitro. Созданная композиция молекул миРНК может быть использована в составе противовирусных препаратов, направленных против РСВ.

Литература

1. Fernandes-Matano L., Monroy-Munoz I., Angeles-Martinez J., Sarquiz-Martinez B. et al. Prevalence of non-influenza respiratory viruses in acute respiratory infection cases in Mexico. PLoS One. 2017; 12 (5): e0176298. DOI: https://10.1371/journal.pone.0176298.

2. Shi T., McAllister D., O’Brien K., Simoes E. et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 2017; 390 (10098): 946-58. DOI: https://10.1016/S0140-6736(17)30938-8

3. Hall C.B., Weinberg G.A., Iwane M.K., Blumkin A.K. et al. The burden of respiratory syncytial virus infection in young children. N. Engl. J. Med. 2009; 360 (6): 588-98. DOI: https://10.1056/NEJMoa0804877

4. Busse W.W., Lemanske R.F., Gern J.E. Role of viral respiratory infections in asthma and asthma exacerbations. Lancet. 2010; 376 (9743): 826-34. DOI: https://10.1016/S0140-6736(10)61380-3

5. Castilow E.M., Olson M.R., Varga S.M. Understanding respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease. Immunologic Research. 2007; 39 (1-3): 225-39. DOI: https://10.1007/s12026-007-0071-6

6. Paton J.Y. To Palivizumab or not to Palivizumab - that is the question. Paediatric Respiratory Reviews. 2013; 14 (2): 126-7. DOI: https://10.1016/j.prrv.2012.12.004

7. Yang C., Wang C., Malkin E., Schickli J. et al. Implication of respiratory syncytial virus (RSV) F transgene sequence heterogeneity observed in Phase 1 evaluation of MEDI-534, a live attenuated parainfluenza type 3 vectored RSV vaccine. Vaccine. 2013; 31 (26): 2822-7. DOI: https://10.1016/j.vaccine.2013.04.006

8. Huang K., Incognito L., Cheng X., Ulbrandt N. et al. Respiratory syncytial virus-neutralizing monoclonal antibodies motavizumab and palivizumab inhibit fusion. J. Virol. 2010; 84 (16): 8132-40. DOI: https://10.1128/JVI.02699-09

9. Simоes E., Forleo-Neto E., Geba G., Kamal M. et al. Suptavumab for the prevention of medically attended respiratory syncytial virus infection in preterm infants. Clin. Infect. Dis. 2021; 73 (11): e4400-8. DOI: https://10.1093/cid/ciaa951

10. Battles M., Langedijk J., Furmanova-Hollenstein P., Chaiwatpongsakorn S. et al. Molecular mechanism of respiratory syncytial virus fusion inhibitors. Nat Chem Biol. 2016; 12 (2): 87-93. DOI: https://10.1038/nchembio.1982

11. Tejada S., Martinez-Reviejo R., Karakoc H., Pena-Lopez Y. Ribavirin for treatment of subjects with respiratory syncytial virus-related infection: a systematic review and meta-analysis. Advances in Therapy. 2022; 39 (9): 4037-51. DOI: https://10.1007/s12325-022-02256-5

12. Janai H., Marks M., Zaleska M., Stutman H. Ribavirin: adverse drug reactions, 1986 to 1988. Pediatr. Infect. Dis. J. 1990; 9 (3): 209-11. PMID: 2139930.

13. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Nikolskii A.A. et al. Prospects for the use of peptides against respiratory syncytial virus. Mol. Biol. 2019; 53 (4): 484-500. DOI: https://10.1134/S002689841904013X

14. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Barvinskaia E.D. et al. Dendrimeric peptide LTP exhibits potent antiviral properties against respiratory syncytial virus. Allergy. 2019; 74 (S106): 1544. https://doi.org/10.1111/all.13999

15. Osminkina L.А., Timoshenko V.Yu., Shilovsky I.P., Kornilaeva G.V. et al. Porous silicon nanoparticles as scavengers of hazardous viruses. Journal of Nanoparticle Research. 2014; 16 (6). DOI: https://10.1007/s11051-014-2430-2

16. Heylen E., Neyts J., Jochmans D. Drug candidates and model systems in respiratory syncytial virus antiviral drug discovery. Biochemical Pharmacology. 2017; 127: 1-12. DOI: https://10.1016/j.bcp.2016.09.014

17. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A. et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998; 391 (6669): 806-11. DOI: https://10.1038/35888

18. Meister G., Tuschl T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA. Nature. 2004; 431 (7006): 343-9. DOI: https://10.1038/nature02873

19. Хаитов М.Р., Литвин Л.С., Шиловский И.П., Башкатова Ю.Н. и др. Интерференция РНК. Новые подходы к разработке противовирусных препаратов. Иммунология. 2010; 31 (2): 69-76.

20. Khaitov M.R., Nikonova A.A., Shilovskiy I.P., Kozhikhova K.V. et al. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://10.1111/all.14850

21. Hacking D., Hull J. Respiratory syncytial virus - Viral biology and the host response. Journal of Infection. 2002; 45: 18-24. DOI: https://10.1053/jinf.2002.1015

22. Van Drunen Littel-Van Den Hurk S., Watkiss E.R. Pathogenesis of respiratory syncytial virus. Current Opinion in Virology. 2012; 2: 300-5. DOI: https://10.1016/j.coviro.2012.01.008

23. Schlender J., Bossert B., Buchholz U., Conzelmann K. Bovine respiratory syncytial virus nonstructural proteins NS1 and NS2 cooperatively antagonize alpha/beta interferon-induced antiviral response. J. Virol. 2000; 74 (18): 8234-42. DOI: https://10.1128/JVI.74.18.8234-8242.2000

24. Shilovskiy I.P., Yumashev K.V., Nikolsky A.A., Vishnyakova L.I. et al. Molecular and cellular mechanisms of respiratory syncytial viral infection: using murine models to understand human pathology. Biochemistry (Moscow). 2021; 86 (3): 290-306. DOI: https://10.1134/S0006297921030068

25. Шиловский И.П., Мазуров Д.В., Файзулоев Е.Б., Хаитов М.Р. shRNA опосредованное ингибирование репликации РСВ. Сообщение № 1: создание векторных конструкций для сайленсинга гена Р. Физиология и патология иммунной системы. 2011; 14 (7): 7-13.

26. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Shershakova N.N. et al. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syncytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum. Gene. Ther. 2014; 25 (7): 642-50. DOI: https://10.1089/hum.2013.142

27. Mehedi M., Collins P., Buchholz U. A novel host factor for human respiratory syncytial virus. Commun. Integr. Biol. 2017; 10 (3): e1319025. DOI: https://10.1080/19420889.2017.1319025

28. Alvarez R., Elbashir S., Borland T., Toudjarska I. et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrob Agents Chemother. 2009; 53 (9): 3952-62. DOI: https://10.1128/AAC.00014-09

29. Bitko V., Barik S. Phenotypic silencing of cytoplasmic genes using sequence-specific double-stranded short interfering RNA and its application in the reverse genetics of wild type negative-strand RNA viruses. BMC Microbiol. 2001; 1: 1-11. DOI: https://10.1186/1471-2180-1-34

30. Шиловский И.П., Башкатова Ю.Н., Мазуров Д.В., Файзулоев Е.Б. и др. Лентивирусная система доставки shRNA обеспечивает подавление репликации РСВ in vitro посредством активации механизма интерференции РНК. Иммунология. 2011; 32 (1): 6-11.

31. Wertz G., Howard M., Davis N., Patton J. The switch from transcription to replication of a negative-strand RNA virus. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1987; 52: 367-71. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.77.10.5740-5748.2003

32. DeVincenzo J., Cehelsky J., Alvarez R., Elbashir S. et al. Evaluation of the safety, tolerability and pharmacokinetics of ALN-RSV01, a novel RNAi antiviral therapeutic directed against respiratory syncytial virus (RSV). Antiviral Res. 2008; 77 (3): 225-31. DOI: https://10.1016/j.antiviral.2007.11.009

33. DeVincenzo J., Lambkin-Williams R., Wilkinson T., Cehelsky J. et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107 (19): 8800-5. DOI: https://10.1073/pnas.0912186107

34. Simon A., Glanville A., Zamora M., Hodges T. et al. Results of a phase 2b multi-center, randomized, double-blind, placebo-controlled study of an RNAi therapeutic, ALN-RSV01, in respiratory syncytial virus (RSV)-infected lung transplant patients. European respiratory journal. 2012; 40: 1-17.

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)