Трансдукция В-лимфоцитов человека с помощью аденоассоциированных вирусов различных серотипов

• Бязрова Мария Георгиевна
• Михайлов Артем Андреевич
• Сухова Мария Михайловна
• Бардина Марьяна Владимировна
• Шмидт Анна Андреевна
• Прилипов Алексей Геннадьевич
• Филатов Александр Васильевич

Резюме

Введение. Векторы на основе аденоассоциированного вируса (AAV) являются ведущей платформой для генной терапии при лечении различных заболеваний человека. Доставка генов в В-лимфоциты человека с использованием AAV-векторов представляет значительные сложности, так как В-клетки устойчивы к инфекции AAV. Проводятся исследования с целью поиска эффективных методов для преодоления этой проблемы.

Цель исследования - разработка метода доставки генов с помощью AAV-векторов в В-лимфоциты человека in vitro.

Материал и методы. В-лимфоциты выделяли из периферической крови здоровых доноров путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина с дальнейшим обогащением методом отрицательной селекции с использованием магнитных микросфер. В-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью смеси лимфокинов, в состав которой входили ИЛ-2, ИЛ-4, BAFF, ИЛ-21 и мультимеризованный CD40L (mCD40L). Через 24 ч стимулированные В-лимфоциты инфицировали рекомбинантным AAV, несущим репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Были протестированы 3 серотипа: AAV2, AAV6 и AAV-DJ. Через 48 ч после инфекции определяли долю трансдуцированных В-лимфоцитов. Через 7 дней методом проточной цитометрии определяли количество и фенотип стимулированных В-лимфоцитов, а с помощью иммуноферментного анализа оценивали секрецию Ig в супернатант культивируемых клеток. В качестве контроля трансдукции использовали клетки HEK293T.

Результаты. Серотипы AAV2, AAV6 и AAV-DJ эффективно и в равной степени трансдуцировали клетки HEK293T. Нестимулированные В-лимфоциты были резистентными к действию AAV и не обнаруживали заметной флуоресценции репортерного белка GFP. В-лимфоциты, стимулированные смесью, содержащей ИЛ-2, ИЛ-4, BAFF, ИЛ-21 и mCD40L, были эффективно трансдуцированы с помощью AAV2, AAV6 и AAV-DJ. Наиболее высокую экспрессию трансгена обеспечивал серотип AAV6. Трансдуцированные В-лимфоциты продолжали активно пролиферировать, приобретали фенотип плазмабластов и секретировали Ig в супернатант. По своим функциональным свойствам трансдуцированные В-лимфоциты не отличались от контрольных клеток, которые не подвергались инфекции. Таким образом, в умеренных дозах AAV-инфекция не оказывала токсического действия на В-лимфоциты и не влияла на физиологические параметры В-клеток. Эффективная трансдукция наблюдалась в обеих субпопуляциях В-клеток памяти - как с переключенным (IgG⁺CD27⁺), так и непереключенным (IgM⁺CD27⁺) синтезом Ig.

Ключевые слова:аденоассоциированный вирус (rAAV); серотипы AAV; перенос генов; В-лимфоциты; трансдукция; GFP; стимуляция В-лимфоцитов

Введение

Последние годы были отмечены значительными успехами в области генной терапии, которая стала использоваться для лечения как генетических, так и приобретенных заболеваний. Примером успешного применения генной терапии при лечении иммунодефицитных состояний является препарат "Стримвелис" (Strimvelis, GlaxoSmithKline, Великобритания), который показал хорошие результаты при лечении врожденной недостаточности аденозиндезаминазы [1].

Дальнейшее развитие генной терапии в значительной степени сдерживается проблемами в эффективной доставке трансгенов. Для клеток человека с этой целью наиболее часто используются вирусные векторы, среди которых наибольшее распространение получили конструкции на основе ретровирусов, лентивирусов, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов. Эти вирусы способны эффективно заражать клетки-мишени и доставлять в них целевые гены. Каждая из отмеченных платформ имеет свои преимущества, но не лишена недостатков.

В последние годы значительную популярность получили векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) [2]. AAV стали ведущей платформой для доставки генов при лечении некоторых заболеваний человека. Наиболее известным примером является использование AAV для лечения наследственного заболевания спинальной мышечной атрофии с помощью препарата "Золгенсма" [3], который эффективно переносит в нейроны функциональную копию гена SMN1. К настоящему времени более 200 препаратов на основе AAV проходят клинические испытания и вскоре они могут пополнить рынок биотехнологических лекарственных препаратов. К преимуществам AAV относится то, что они биологически безопасны и обеспечивают высокую экспрессию трансгена. К недостаткам AAV можно отнести их невысокую емкость в отношении трансгена.

Клетки различных тканей отличаются по восприимчивости к инфекции AAV. Тропизм AAV в отношении определенных клеток-мишеней в основном определяется серотипом вируса. К настоящему времени открыто 12 основных серотипов AAV, которые отличаются по тропизму к клеткам различных тканей. Определены серотипы, которые наилучшим образом подходят для трансдукции клеток мышц, почек, нейронов, пигментного эпителия сетчатки и некоторых других типов клеток.

Значительно меньше известно о трансгенезе с помощью AAV в В-клетки человека. В ранних работах утверждалось, что В-лимфоциты резистентны к AAV-инфекции, однако недавно было показано, что В-клетки, активированные вирусом Эпштейна-Барр, приобретают восприимчивость к инфекции AAV некоторых серотипов [4]. Имеются также другие сообщения, которые показывают, что восприимчивость к AAV-инфекции повышается при активации В-лимфоцитов [5].

В настоящей работе было проведено сравнение эффективности инфекции В-лимфоцитов с помощью AAV различных серотипов. Для тестирования нами были выбраны 3 серотипа: 2 природных варианта (AAV2 и AAV6) и один генно-инженерный вариант (AAV-DJ). AAV2 можно охарактеризовать как вирус с медленной и низкой экспрессией трансгена, в то время как AAV6 относится к группе вирусов с быстрой по кинетике и средней по интенсивности экспрессии трансгена [6]. Выбранные серотипы отличаются также по тропизму к различным тканям [7]. Мы подобрали условия AAV-опосредованной доставки модельного трансгена GFP в В-лимфоциты человека in vitro. Мы показали, что трансдукции подвержены только активированные, но не покоящиеся В-лимфоциты.

Материал и методы

Доноры. В исследуемую группу были включены 5 здоровых добровольцев (2 женщины и 3 мужчин, средний возраст - 25 лет, в диапазоне от 21 до 27 лет). Исследование было выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого". Письменное информированное согласие было получено от каждого участника исследования перед выполнением каких-либо процедур исследования. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Этическим комитетом ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России (№ 3-1, 11 марта 2020 г.).

Выделение лимфоцитов. Образцы цельной крови собирали в гепаринизированные вакуумные пробирки (Sarstedt, Cat. No. 04.1927, Германия). Мононуклеарные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (ρ = 1,077 г/см³). B-лимфоциты обогащали методом отрицательной иммуномагнитной сепарации с использованием набора Dynabeads Untouched human B cell kit (Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 11351D, США). Чистота выделенных В-лимфоцитов составляла ≥ 98 %. Субпопуляции В-клеток памяти с переключенным (IgG⁺CD27⁺) и непереключенным (IgM⁺CD27⁺) синтезом Ig выделяли с помощью проточного сортировщика клеток SH800S (Sony Biotechnology, США) как описано ранее [8].

Стимуляция лимфоцитов in vitro. Выделенные В-лимфоциты культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (все "ПанЭко", Россия). Клетки стимулировали смесью лимфокинов, состоявшей из 10 нг/мл ИЛ-21, 10 нг/мл ИЛ-4, 50 нг/мл ИЛ-2, 10 нг/мл BAFF и 10 нг/мл mCD40L (Peprotech, США) при 37 °C в 5 % CO₂ [9].

Наработка и очистка вирусов AAV. Конструкция вектора AAV-eGFP подробно была описана ранее [10]. Векторная конструкция spAAV/eGFP, содержавшая ген, кодирующий улучшенный зеленый флуоресцентный белок GFP под контролем промотора цитомегаловируса, и ген устойчивости к ампициллину, была получена из AddGene (#49055, США).

Рекомбинантные AAV получали с помощью системы AAV Helper-Free System (Agilent, США) в культуре клеток HEK293T. Вирусы различных серотипов нарабатывали с использованием плазмидных конструкций, кодирующих белки Rep и Cap, - pAAV-RC2 (Agilent, США), pAAV-RC6 и pAAV-DJ (Cell Biolabs, США). Вирусные частицы очищали с помощью центрифугирования в градиенте плотности йодиксанола. Титр вирусных частиц на всех стадиях продукции, очистки и конечного концентрированного препарата контролировали методом количественной полимеразной цепной реакции. Отсутствие белковых примесей подтверждали электрофорезом в полиакриламидном геле с последующим окрашиванием Кумасси (Coomassie Brilliant blue, G250, Helicon, Россия). Титр AAV-eGFP составлял от 1 до 5 - 10¹⁰ копий/мл.

Вирусная трансдукция. Клетки-мишени HEK293T или выделенные стимулированные В-лимфоциты высевали в 96-луночные планшеты по 15 000 и 2 500 клеток на лунку соответственно. После 24 ч культивирования при 37 °C в 5 % CO₂ к клеткам добавляли очищенный препарат вируса из расчета 1 - 10⁵ геномных копий на клетку. После инфекции клетки инкубировали при 37 °C в 5 % CO₂ в течение 48 ч, после чего анализировали экспрессию GFP или культивировали 7 дней и анализировали пролиферацию и фенотип клеток, а также секрецию Ig.

Проточная цитометрия. Для окрашивания лимфоцитов использовали следующие конъюгаты антител с флуорохромами: CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), против человеческого IgG-FITC (клон CH1) и IgM-FITC (клон MA2). Указанные антитела ранее были получены в нашей лаборатории [11]. Окрашивание производили в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки 2 раза отмывали в физиологическом растворе, забуференном фосфатами. Перед измерением клеточную суспензию пропускали через сито с диаметром пор 40 мкм. Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного двумя диодными лазерами 488 и 561 нм. Обработку цитофлуориметрических данных проводили при помощи программы FlowJo (Becton Dickinson, США).

Определение Ig методом иммуноферментного анализа (ИФА). Антитела против человеческого IgG (клон G4A5) и IgM (клон CH2) в концентрации 10 мкг/мл сорбировали в лунках 96-луночных планшетов (Greiner, Германия), внося в лунку по 100 мкл раствора антител в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ). Планшеты инкубировали ночь при 4 °С, после чего трижды отмывали буфером ФСБ)/Tween-20. Лунки блокировали добавлением ФСБ, содержавшего 1 % бычьего сывороточного альбумина, инкубировали в течение часа и 3 раза отмывали c помощью ФСБ)/Tween-20. Образцы культуральных супернатантов серийно разводили от 1 : 2 до 1 : 200 раз в буфере для образцов. Планшеты инкубировали с образцами в течение 1 ч при комнатной температуре. После отмывки планшеты дополнительно инкубировали в течение 1 ч со вторичными антителами против IgG или IgM человека, конъюгированными с пероксидазой хрена. Далее планшеты промывали 7 раз и проявляли в течение 10 мин с помощью 100 мкл раствора хромогена TMB (Хема, Россия). Реакцию останавливали добавлением 50 мкл 1 M H₂SO₄ и оптическую плотность при 450 нм измеряли с помощью фотометра BioRad iMark Microplate Absorbance Reader (BioRad, США). Данные анализировали с помощью программы Zemfira 4.0 (BioRad, США).

Статистическая обработка. Статистическая обработка данных проведена с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версия 8.4.3 (GraphPad, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью критерия Вилкоксона. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p ≤ 0,05. Данные на гистограммах показывают медиану.

Результаты

Трансдукция клеток HEK293T с помощью различных серотипов AAV

Для того чтобы оценить качество полученных препаратов AAV для начала мы проверили их способность трансдуцировать клетки HEK293T. Эти клетки легко поддаются как трансфекции, так и трансдукции, поэтому они являются удобным объектом для оценки инфекционной активности препаратов AAV.

Клетки HEK293T инфицировали вирусами в дозе 50 - 10¹⁰ частиц/мл и наблюдалась интенсивная зеленая флуоресценция клеток (при множественности инфекции 10⁶ геномных копий на клетку). Эффективность инфекции оценивали по уровню экспрессии репортерного гена GFP. Флуоресценция GFP хорошо детектировалась на 2-й день после инфекции (рис. 1А). Практически все клетки приобретали зеленую флуоресценцию (рис. 1Б). При увеличении дозы вируса в диапазоне от 0,2 до 108 - 10¹⁰ частиц/мл наблюдалось дозозависимое увеличение экспрессии белка GFP. Все 3 серотипа (AAV2, AAV6 и AAV-DJ) обладали примерно равными уровнями трансдукции (рис. 1В).

Проведенные эксперименты продемонстрировали, что полученные препараты AAV-GFP на контрольных клетках HEK293T обладают хорошей инфицирующей активностью, трансдуцируют основную часть клеток и обеспечивают высокий уровень экспрессии гена GFP. Таким образом, полученные препараты AAV-GFP можно использовать для изучения трансдукции целевых клеток, которыми в нашем исследовании являлись В-лимфоциты крови.

Трансдукция В-лимфоцитов с помощью различных серотипов AAV

Из периферической крови здоровых доноров выделяли мононуклеарные клетки, далее методом магнитной сепарации обогащали фракцию мононуклеарных клеток В-лимфоцитами. Свежевыделенные В-лимфоциты, полученные от 5 разных здоровых доноров, были стимулированы в бесфидерной системе и на 2-й день были инфицированы векторами rAAV, полученными из трех различных серотипов (AAV2, AAV6 и AAV-DJ).

При дозе вирусов 30 - 10¹⁰ частиц/мл у большей части В-лимфоцитов наблюдалась интенсивная зеленая флуоресценция. Флуоресценция появлялась на 2-й день и достигала максимума на 7-й день культивирования (рис. 2А). Интересно, что нестимулированные В-лимфоциты не трансдуцировались под действием вируса и в них не обнаруживалось заметной флуоресценции (данные не приведены). У стимулированных В-лимфоцитов наблюдалась характерная морфология активированных В-лимфоцитов. В процессе активации они приобретали неправильную форму с псевдоподиями, клетки вступали в гомотипическую адгезию и образовывались плотные агрегаты (рис. 2Б). Кроме того, клетки приобретали подвижность. Экспрессия трансгена имела выраженный дозозависимый характер от количества вируса, использованного для трансдукции. Детектируемое количество GFP⁺-клеток наблюдалось при дозе вируса 9 - 10¹⁰ частиц/мл. Максимальная интенсивность флуоресценции достигалась при дозе вируса 81 - 10¹⁰ частиц/мл. При этом серотип AAV6 обеспечивал более чем 5-кратный уровень флуоресценции по сравнению с серотипами AAV2 и AAV-DJ. Жизнеспособность В-лимфоцитов не зависела от дозы AAV6 и немного снижалась при максимальных дозах AAV2 и AAV-DJ (рис. 2Г). Как было отмечено ранее [8], при ИЛ-21/CD40L-стимуляции значительная часть В-лимфоцитов дифференцируется и приобретает фенотип плазмабластов. В условиях вирусной трансдукции В-лимфоциты сохраняли способность к дифференцировке в плазмабласты. При дозе вируса 81 - 10¹⁰ частиц/мл ≥ 30 % В-лимфоцитов приобретало фенотип CD27⁺CD38⁺ (рис. 2Д).

Функциональная характеристика В-лимфоцитов, трансдуцированных с помощью AAV серотипа 6 (AAV6)

Для более полной характеристики влияния AAV-инфекции на функциональные характеристики В-лимфоцитов дальнейшие эксперименты были проведены с субпопуляциями В-клеток памяти: В-лимфоциты с переключенным (IgG⁺CD27⁺) и непереключенным (IgM⁺CD27⁺) фенотипом. Эти субпопуляции выделяли из общего пула В-лимфоцитов с помощью проточного сортировщика. Далее каждую субпопуляцию стимулировали in vitro смесью для активации В-клеток, на 2-й день культивирования добавляли AAV-GFP и на 7-й день анализировали клетки и культуральные супернатанты. Поскольку в предварительных опытах AAV6 показал наиболее высокую трансдуцирующую активность, в последующих экспериментах мы использовали только AAV6.

В опытных образцах (в условиях инфекции вирусом AAV6-GFP) стимуляция смесью лимфокинов приводила к 5- и 4-кратному увеличению количества В-клеток в субпопуляциях IgG⁺CD27⁺ и IgM⁺CD27⁺ соответственно (рис. 3A, верхний ряд). В отрицательном контроле (без добавления вируса) соответствующие индексы стимуляции в среднем равнялись 6 и 3 (рис. 3A, верхний ряд). Сравнение стимуляции в присутствии вируса и без его добавления показало отсутствие статистически значимой разницы между индексами стимуляции в присутствии и без AAV (n = 5; p = 0,44, p = 0,07 для IgG⁺CD27⁺- и IgM⁺CD27⁺-субпопуляций соответственно).

Другим проявлением стимуляции В-лимфоцитов являлась дифференцировка B-клеток памяти в плазмабласты с фенотипом CD19⁺CD27⁺CD38⁺. В опытных образцах с добавлением вируса в субпопуляциях IgG⁺CD27⁺ и IgM⁺CD27⁺ 70 и 35 % клеток соответственно приобретали фенотип плазмабластов (рис. 3Б, средний ряд). Примерно такие же уровни плазмабластов наблюдались в отрицательном контроле (n = 5; p = 0,81, p > 0,99 для IgG⁺CD27⁺- и IgM⁺CD27⁺-субпопуляций соответственно).

При стимуляции В-лимфоциты приобретали способность секретировать IgG и IgM. В опытных образцах на 7-й день культивирования в культуральных супернатантах IgG⁺CD27⁺- и IgM⁺CD27⁺-клеток в среднем регистрировался уровень 1116 нг/мл IgG и 687 нг/мл IgM соответственно (рис. 3В, нижний ряд). В контрольных образцах уровень секреции IgG и IgM практически не отличался (n = 4, p = 0,25, p = 0,25 для IgG⁺CD27⁺- и IgM⁺CD27⁺-субпопуляций соответственно). Вполне ожидаемо мы не обнаружили заметной секреции в культуральный супернатант IgM и IgG в образцах, содержавших клетки IgG⁺CD27⁺ и IgM⁺CD27⁺ соответственно (результаты не показаны).

Полученные результаты продемонстрировали, что вирусная инфекция с помощью AAV6 заметным образом не влияла на такие функциональные характеристики стимулированных В-лимфоцитов, как пролиферация, дифференцировка в плазмабласты и секреция Ig.

Обсуждение

Доставка трансгенов с помощью AAV является перспективным направлением в инженерии В-лимфоцитов человека [12]. Широкому использованию этого подхода препятствует высокая резистентность покоящихся В-лимфоцитов к AAV-инфекции. Эффективность AAV-трансдукции зависит от таких факторов, как наличие необходимых рецепторов на клеточной поверхности, эндоцитоз и внутриклеточный процессинг, а также синтез комплементарной цепи ДНК [13].

Считается, что первичными рецепторами для AAV являются гепарансульфатпротеогликаны (HSPGs). После прикрепления к клетке AAV интернализуется путем клатрин-опосредованного эндоцитоза с участием молекул интегринов. Роль корецептора при проникновении AAV в клетки-мишени выполняет молекула рецептора 1 фактора роста фибробластов (FGFR-1). Клетки, которые не экспрессируют ни HSPG, ни FGFR-1, не способны связывать AAV и устойчивы к инфекции AAV [14].

Тканевый тропизм AAV определяется с одной стороны экспрессией определенных рецепторов, а с другой стороны - разновидностью капсида AAV [15]. За последние десятилетия были идентифицированы 12 серотипов AAV и более 100 их вариантов. Серотипы AAV2, AAV3, AAV5, AAV6 обнаруживаются в клетках человека, а серотипы AAV1, AAV4, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 и AAV12 встречаются в клетках нечеловекообразных приматов [16]. В дополнении к природным серотипам генно-инженерными методами были созданы искусственные AAV, которые несут химерные капсиды [17]. Такие гибридные AAV обладают более эффективной трансдукцией целевых тканей и ограниченным тропизмом по отношению к посторонним клеткам. В частности, к химерным векторам принадлежит серотип AAV-DJ с капсидом, который получен сочетанием восьми природных серотипов [18].

Для сравнительного исследования нами были выбраны 3 серотипа (AAV2, AAV6 и AAV-DJ), которые существенно отличались по тканевому тропизму. Если на клетках HEK293T все 3 тестированных серотипа (AAV2, AAV6 и AAV-DJ) обладали примерно равными уровнями трансдукции, то на В-лимфоцитах AAV6 обеспечивал более эффективную трансдукцию, чем серотипы AAV2 и AAV-DJ.

Одним из решающих условий трансдукции клеток-мишеней является их пролиферация. Так, для В-лимфоцитов при хроническом лимфолейкозе было показано, что увеличение до 5 % доли клеток, находящихся в S-фазе, приводило к возрастанию эффективности трансдукции до 97 % [14]. Можно предположить, что для эффективной AAV-трансдукции нормальных В-лимфоцитов необходимо перевести их из покоящегося состояния в пролиферирующее. Нами была установлена основная закономерность - эффективная трансдукция В-лимфоцитов возможна только после их стимуляции. В качестве стимулирующего агента мы использовали смесь лимфокинов, состоявшую из ИЛ-2, ИЛ-4, BAFF, ИЛ-21 и мультимеризованного CD40L. Не исключено, что другие стимулирующие агенты, например ИЛ-2, ИЛ-6, CpG-содержащие олигонуклеотиды (CpG-ODNs) [5], лиганды Толл-подобных рецепторов TLR7/TLR8 [19], антитела против IgM [4], наконец, бактерии Staphylococcus aureus, несущие поверхностный ProtA, а также другие факторы могут приводить В-лимфоциты в состояние восприимчивости к AAV-инфекции. Интересно отметить, что активация В-лимфоцитов под действием вируса Эпштейна-Барр также может переводить клетки в состояние чувствительности к AAV [20]. Для стимуляции В-лимфоцитов мы использовали смесь, состоявшую из 5 лимфокинов. Не исключено, что для эффективной AAV-трансдукции достаточно использовать смесь, содержащую меньшее число лимфокинов.

Нами было обнаружено, что в умеренных дозах AAV-инфекция не оказывала токсического действия и не влияла на такие физиологические параметры В-клеток человека, как пролиферация В-клеток памяти, созревание плазмабластов, продукция и секреция Ig. В качестве гена-репортера мы использовали GFP, который характеризуется высоким уровнем экспрессии. Вследствие этого наше исследование имеет некоторое ограничение. Реальные целевые гены могут проявлять свою функциональную активность при более низком уровне экспрессии, соответственно для трансдукции потребуются меньшие дозы AAV.

При AAV-трансдукции трансген не интегрируется в ДНК клетки-хозяина и существует в клеточном ядре в виде эписомы, которая не может независимо реплицироваться. При последовательных делениях клетки эписома со временем элиминируется, а экспрессия трансгена исчезает. Более надежным методом перепрограммирования клетки является интеграция трансгена в геном с использованием гомологичной рекомбинации. Для этого также можно использовать AAV-инфекцию. Сначала с помощью AAV-вектора в клетку доставляют донорскую матрицу с плечами гомологии. Затем под действием дополнительно введенной нуклеазы Cas9 в цепи ДНК будет образован разрыв, в который может встраиваться трансген. Недавно этот прием с успехом был использован для редактирования генома плазматических клеток [12]. Были получены В-клетки, активно секретирующие фактор IX (FIX) и фактор активации В-клеток (BAFF).

Таким образом, нами были отработаны условия для эффективной трансдукции В-лимфоцитов с помощью AAV. Этот протокол может найти применение при перепрограммировании В-лимфоцитов ex vivo и дальнейшем использовании в клинической практике.

Заключение

Стимулированные В-лимфоциты восприимчивы для трансдукции аденоассоциированными вирусами серотипов AAV2, AAV6 и AAV-DJ, из них наиболее эффективен AAV6. Предварительная стимуляция В-лимфоцитов является необходимым условием для последующей трансдукции. Инфекция В-лимфоцитов с помощью AAV6 не меняет такие функциональные характеристики В-клеток, как пролиферация, дифференцировка в плазмабласты и секреция Ig. AAV6 можно рассматривать как основу для создания векторов для переноса генов в В-лимфоциты.

Благодарности. Мы благодарим за предоставленное оборудование Центр высокоточного редактирования генома и генетических технологий для биомедицины (ФГБУН ИБГ РАН Минобрнауки России), развиваемый при поддержке Минобрнауки России.

Литература

1. Shahryari A., Saghaeian Jazi M., Mohammadi S., Razavi Nikoo H., Nazari Z., Hosseini E.S., Burtscher I., Mowla S.J., Lickert H. Development and Clinical Translation of Approved Gene Therapy Products for Genetic Disorders. Front. Genet. 2019; 10: 868. DOI: https://www.doi.org/10.3389/fgene.2019.00868

2. Wang D., Tai P.W.L., Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat. Rev. Drug. Discov. 2019; 18: 358-78. DOI: https://www.doi.org/10.1038/s41573-019-0012-9

3. Keeler A.M., Flotte T.R. Recombinant adeno-associated virus gene therapy in Light of Luxturna (and Zolgensma and Glybera): where are we, and how did we get here? Annu. Rev. Virol. 2019; 6: 601-21. DOI: https://www.doi.org/10.1146/annurev-virology-092818-015530

4. Wendtner C-M., Kofler D., Mayr C., Bund D., Hallek M. The potential of gene transfer into primary B-CLL cells using recombinant virus vectors. Leukemia & Lymphoma. 2004; 45: 897-904. DOI: https://www.doi.org//10.1080/10428190310001638896

5. Theiss H.D., Kofler D.M., Büning H., Aldenhoff A-L., Kaess B., Decker T. et al. Enhancement of gene transfer with recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors into primary B-cell chronic lymphocytic leukemia cells by CpG-oligodeoxynucleotides. Exp. Hematol. 2003; 31: 1223-9. DOI: https://www.doi.org//10.1016/j.exphem.2003.09.010

6. Zincarelli C., Soltys S., Rengo G., Rabinowitz J.E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol. Ther. 2008; 16: 1073-80. DOI: https://www.doi.org//10.1038/mt.2008.76

7. Haery L., Deverman B.E., Matho K.S., Cetin A., Woodard K., Cepko C., Guerin K.I., Rego M.A., Ersing I., Bachle S.M., Kamens J., Fan M. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Front. Neuroanat. 2019; 13: 93. DOI: https://www.doi.org//10.3389/fnana.2019.00093

8. Бязрова М.Г., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Васильева Ю.В., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (1): 18-27. DOI: https://www.doi.org//10.33029/0206-4952-2020-41-6-00-00

9. Астахова Е.А., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Бязрова М.Г., Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Стимуляции В-клеток в системе ИЛ-21/CD40L в норме и у пациентов с общей вариабельной иммунной недостаточностью. Иммунология. 2021; 41 (6) 631-40. DOI: https://www.doi.org//10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640

10. Лунев Е.А., Шмидт А.А., Васильева С.Г., Савченко И.М., Логинов В.А., Марина В.И., Егорова Т.В., Бардина М.В. Эффективная вирусная доставка в нейрональную культуру генетических конструкций для моделирования и генной терапии GNAO1-энцефалопатии. Мол. биол. 2022; 56 (4): 631-40. DOI: 10.31857/S0026898422040061

11. Лушова А.А., Жеремян Э.А., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Бязрова М.Г., Филатов А.В. Субпопуляции В-лимфоцитов: функции и молекулярные маркеры. Иммунология. 2019; 40 (6) 63-75. DOI: https://www.doi.org//10.24411/0206-4952-2019-16009

12. Hung K.L., Meitlis I., Hale M., Chen C-Y., Singh S., Jackson S.W., Miao C.H., Khan I.F., Rawlings D.J., James R.G. Engineering Protein-Secreting Plasma Cells by Homology-Directed Repair in Primary Human B Cells. Mol. Ther. 2018; 26(2): 456-67. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.11.012

13. Wu Z., Asokan A., Samulski R.J. Adeno-associated virus serotypes: vector toolkit for human gene therapy. Mol. Ther. 2006; 14: 316-27. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.ymthe.2006.05.009

14. Wendtner C-M., Kofler D.M., Theiss H.D., Kurzeder C., Buhmann R., Schweighofer C. et al. Efficient gene transfer of CD40 ligand into primary B-CLL cells using recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Blood. 2002; 100: 1655-61. DOI: https://www.doi.org/10.1182/blood.V100.5.1655.h81702001655_1655_1661

15. Vandenberghe L.H., Wilson J.M., Gao G. Tailoring the AAV vector capsid for gene therapy. Gene Ther. 2009; 16: 311-9. DOI: https://www.doi.org/10.1038/gt.2008.170

16. Gao G., Vandenberghe L.H., Alvira M.R., Lu Y., Calcedo R., Zhou X. et al. Clades of adeno-associated viruses are widely disseminated in human tissues. J. Virol. 2004; 78: 6381-8. DOI: https://www.doi.org/10.1128/JVI.78.12.6381-6388.2004

17. Hauck B., Chen L., Xiao W. Generation and characterization of chimeric recombinant AAV vectors. Mol. Ther. 2003; 7: 419-25. DOI: https://www.doi.org/10.1016/S1525-0016(03)00012-1

18. Grimm D., Lee J.S., Wang L., Desai T., Akache B., Storm T.A., Kay M.A. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J. Virol. 2008; 82 (12): 5887-911. DOI: https://www.doi.org/10.1128/JVI.00254-08

19. Lanzavecchia A. Dissecting human antibody responses: useful, basic and surprising findings. EMBO Mol. Med. 2018; 10: e8879. DOI: https://www.doi.org/10.15252/emmm.201808879

20. Wendtner C-M., Kofler D., Mayr C., Bund D., Hallek M. The potential of gene transfer into primary b-cll cells using recombinant virus vectors. Leukemia & Lymphoma. 2004; 45: 897-904. DOI: https://www.doi.org/10.1080/10428190310001638896

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)