Оценка эффективности различных адъювантов при получении мышиных моноклональных антител к рецептор-связывающему домену S-белка SARS-CоV-2

• Иващенко Татьяна Александровна
• Романенко Яна Олеговна
• Марьин Максим Александрович
• Карцева Алена Сергеевна
• Силкина Марина Владимировна
• Зенинская Наталья Алексеевна
• Шемякин Игорь Георгиевич
• Фирстова Виктория Валерьевна

Резюме

Введение. Пандемия SARS-CoV-2-инфекции/COVID-19 началась в конце декабря 2019 г. В мае 2023 г. руководство Всемирной организации здравоохранения сделало заявление о завершении пандемии. Основанием для него послужило снижение смертности от SARS-CoV-2-инфекции/COVID-19. Однако циркуляция вируса продолжается, возникают новые мутации, появляются новые эпидемически значимые штаммы. Разработка эффективных вакцин и препаратов для противодействия SARS-CoV-2-инфекции/COVID-19 по-прежнему остается актуальной задачей. В качестве потенциальных препаратов для лечения SARS-CoV-2-инфекции рассматриваются моноклональные антитела (МкАт).

Большинство SARS-CoV-2-специфических сильнодействующих нейтрализующих МкАт направлено против рецептор-связывающего домена (RBD) S-белка вируса. Для получения МкАт существует много подходов, однако до сих пор их получение остается сложной задачей. Правильный выбор антигена и адъюванта играет ключевую роль в формировании напряженного иммунного ответа. Мы провели сравнительную оценку эффективности использования рекомбинантного RBD и RBD, слитого с Fc-фрагментом иммуноглобулина (RBD-Fc), эмульгированных с различными адъювантами, для достижения высокого иммунного ответа у мышей линии BALB/с.

Цель работы - подобрать наиболее эффективные антиген и адъювант для увеличения иммунного ответа у животных с целью получения МкАт.

Материал и методы. Для выполнения работы были получены рекомбинантный RBD и RBD, слитый с Fc-фрагментом IgG1 человека. Для получения МкАт, специфичных к RBD-домену S-белка SARS-CoV-2, мышей линии BALB/c иммунизировали по 9 схемам. На 3-й день после последней иммунизации у каждой группы животных был проведен забор крови для определения титра специфических антител. У группы гипериммунных мышей изолировали селезенки для получения суспензии спленоцитов и их дальнейшего слияния с клетками-партнерами Sp2/0-Ag14. После слияния клетки культивировали и после образования монослоя проводили скрининг, клонирование и наращивание.

Результаты. Сравнительный анализ титров специфических антител к RBD в крови мышей показал, что адъюванты гидроксид алюминия, полный адъювант Фрейнда (ПАФ), гидроксид алюминия в сочетании с ПАФ и Magic^TM Mouse обладают различной способностью индуцировать иммунный ответ в сочетании с рекомбинантным RBD или RBD-Fc. Наиболее эффективным иммуногеном является RBD-Fc, эмульгированный с гидроксидом алюминия и ПАФ, титр антител составил 1 : 256 000. По итогам электрослияния было получено 17 гибридов, 3 из них оказались стабильными.

Заключение. Адъювантная композиция гидроксида алюминия и ПАФ наиболее эффективна для стимуляции иммунного ответа с целью получения мышиных МкАт к RBD-домену S-белка SARS-CoV-2. Возможно, такой эффект в повышении иммуногенности был достигнут за счет механизмов действия двух адъювантов. ПАФ выполнял функцию депо антигена за счет минерального масла в своем составе, а гидроксид алюминия - функцию доставки антигена. Так как молекулярная масса рекомбинантного RBD была увеличена нами в 2 раза, это позволило адъюванту на основе гидроксида алюминия задержать антиген на своей поверхности и длительное время представлять его иммунным клеткам, стимулируя гуморальный иммунный ответ.

Ключевые слова:SARS-CoV-2; рецептор-связывающий домен; ангиотензин-превращающий фермент 2; иммунизация; адъювант; моноклональные антитела

Введение

Коронавирусная инфекция (COVID-19), вызываемая SARS-CoV-2, представляет собой новое респираторное заболевание и является серьезной проблемой для мирового здравоохранения [1]. В настоящее время продолжается интенсивное изучение иммунопатогенеза COVID-19, а также ведется разработка новых препаратов для профилактики и лечения новой коронавирусной инфекции [2, 3].

Ключевую роль в иммунопатогенезе коронавирусной инфекции играет S-белок, который обусловливает прикрепление и проникновение вируса в клетку за счет связывания с рецептором клетки-хозяина - ангиотензин-превращающим ферментом 2 (ACE2) [4]. S-белок состоит из двух субъединиц: N-концевой субъединицы S1, на которой находится рецептор-связывающий домен (RBD), и мембраносвязывающей субъединицы S2 [5]. В ходе инфекционного процесса вирус-нейтрализующие антитела вырабатываются преимущественно к субъединице S1, а именно к RBD, что делает его главной мишенью для создания вакцин и получения лекарственных препаратов на основе моноклональных антител (МкАт) [6].

Однако иммунизация рекомбинантным RBD вызывает сравнительно слабый иммунный ответ у экспериментальных животных [7]. Для увеличения иммуногенности RBD предлагалось использовать адъювант или добавить к С-концу RBD Fc-фрагмент IgG1 человека, чтобы сформировать слитый белок RBD-Fc, что увеличивает молекулярную массу антигена в 2 раза и позволяет стимулировать В-клетки через Fc-рецептор [8]. Кроме того, Fc-фрагмент способствует правильному фолдингу слитого белка и усиливает связывание с антиген-презентирующими клетками [9].

Иммунизация животных является первым шагом в получении МкАт. На сегодняшний день не существует единого универсального способа иммунизации животных, который бы гарантировал получение продукта, идеально удовлетворяющего всем требованиям, но существуют определенные подходы [10]. Главное требование для получения достаточно высоких титров специфических антител - подбор подходящей схемы иммунизации. При ее разработке необходимо учитывать дозу антигена, количество инъекций и природу адъюванта. Применение адъювантов оказывает стимулирующее действие на иммунную систему животного для активной выработки антител [11].

В данном исследовании для получения мышиных МкАт мы использовали в качестве антигенов рекомбинантный RBD и RBD, слитый с Fc-фрагментом IgG1 (RBD-Fc), эмульгированный с различными адъювантами.

Материал и методы

Лабораторные животные. Для проведения исследования были использованы мыши инбредной лини BALB/с(H2^d) (питомник "Пущино", ФИБХ РАН, Московская обл., г. Пущино). Масса мышей составляла 18-20 г, возраст 6-8 недель. Все стадии исследования соответствовали законодательству Российской Федерации [12] и Директиве Европейского парламента и Совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [13]. Мыши содержались по 5 штук в клетках типа "микроизолятор" в контролируемых условиях окружающей среды (температура воздуха 20-24 °С, относительная влажность 35-40 %, освещение в помещениях - искусственное, с фиксированным режимом день-ночь). В качестве подстила использовали древесные опилки нехвойных пород, в качестве корма - стандартный комбикорм гранулированный полнорационный для лабораторных животных (экструдированный) ПК-120 ГОСТ 50258-92 производства ООО "Лабораторкорм" (Россия).

Получение и очистка рекомбинантных антигенов. Для иммунизации лабораторных животных было получено два варианта рекомбинантного антигена RBD с аминокислотными последовательностями, присущими рецептор-связывающему домену шиповидного (S-) белка коронавируса SARS-CoV-2 изолята Wuhan-Hu-1 (идентификационный номер UniProtKB: P0DTC2). Первый вариант антигена являлся доменом RBD (аминокислоты R319-F541) с C-концевым октагистидиновым кластером (RBD-His). Второй вариант антигена состоял из домена RBD (аминокислоты T333-K528), слитого с кристаллизующимся фрагментом IgG человека (RBD-Fc). Наработку рекомбинантных антигенов осуществляли в клетках линии ExpiCHO-S (Gibco, США).

Продукцию RBD-Fc осуществляли в режиме транзиентной экспрессии согласно инструкции к набору ExpiCHO Expression System Kit (Gibco, США). Плазмидный вектор для экспрессии антигена RBD-Fc pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-Fc (рис. 1А) был получен от K.K. Chan (плазмида Addgene # 141183) [14].

Для экспрессии белка RBD-His получали моноклональную клеточную линию-продуцент. Вначале сконструировали плазмидный вектор pcDNA3.4 RBD-His (рис. 1Б) на основе модифицированной нами плазмиды pcDNA3.4 (Invitrogen, США). Фрагмент ДНК RBD R319-F541 получали в результате амплификации участка плазмиды pLV-SpikeV1 (Invivogen, Франция) в ПЦР. Праймеры были сконструированы с учетом внедрения сигнального пептида "Secrecon"-Ala-Ala в N-конец [15] и последовательности Gly-Ser-Gly-8×His в С-конец белка. Продукт ПЦР клонировали в модифицированную плазмиду по сайтам XhoI и NotI, наличие которых было частью модификации pcDNA3.4. Далее проводили трансфекцию рекомбинантной плазмидой клеток ExpiCHO-S с помощью Lipofectamine LTX с реагентом Plus (Invitrogen, США). Штамм-продуцент получали благодаря селекции стабильно-экспрессирующей популяции под воздействием возрастающей концентрации пуромицина (0,5-5-10-15 мкг/мл) при субкультивировании, а затем выбирали максимально продуцирующий клон. Очищенный белок RBD-His получали после хроматографической очистки осветленной культуральной жидкости на колонке PureCube 100 INDIGO Ni-Cartridge (Cube Biotech, Германия). Чистоту и размер очищенных антигенов проверяли путем электрофореза в 10 % полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэммли.

Иммунизация животных. Для получения МкАт, специфичных к RBD-домену S-белка SARS-CoV-2, мышей линии BALB/c иммунизировали по девяти схемам.

Первой группе мышей в количестве 5 особей подкожно вводили рекомбинантный RBD в дозе 100 мкг/мышь с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) (Sigma-Aldrich, США). Через 2 нед повторно иммунизировали рекомбинантным RBD в дозе 100 мкг/мышь с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ) (DIFCO Laboratories, США). Спустя 2 нед мышей реиммунизировали подкожно рекомбинантным RBD в дозе 100 мкг/мышь в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), pH 7,4, без адъюванта.

Второй группе мышей в количестве 5 особей подкожно вводили рекомбинантный RBD в дозе 100 мкг/мышь, эмульгированный в ПАФ и гидроксиде алюминия (Al(OH)₃) (Brenntag Biosector, Дания). Через 2 нед мышей иммунизировали повторно рекомбинантным RBD в дозе 100 мкг/мышь с НАФ и гидроксидом алюминия. На 28-е сутки проводили реиммунизацию внутрибрюшинным введением рекомбинантного RBD в дозе 100 мкг/мышь в ФСБ, pH 7,4, без адъювантов.

Третьей группе мышей в количестве 5 особей вводили подкожно в дозе 100 мкг/мышь рекомбинантный RBD, эмульгированный с гидроксидом алюминия в объеме 0,2 мл. Через 14 дней проводили повторную иммунизацию по той же схеме, а через 28 дней животных реиммунизировали рекомбинантным RBD в дозе 50 мкг/мышь в ФСБ, рН 7,4, без адъюванта.

Четвертой группе мышей в количестве 5 особей внутримышечно вводили рекомбинантный RBD в дозе 100 мкг/мышь, эмульгированный с адъювантом Magic^TM Mouse (Creative Diagnostics, США) в соотношении 1 : 1. На 35-е сутки проводили реиммунизацию по той же схеме.

Иммунизацию еще четырех групп животных проводили по описанным выше схемам, но в качестве антигена использовали RBD-Fc. Девятая группа животных выступала в качестве отрицательного контроля. Данной группе животных вводили раствор ФСБ, pH 7,4.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Для тестирования использовали 96-луночные планшеты (Costar, USA), сенсибилизированные RBD-His в концентрации 10 мкг/мл. На 3-и сутки после последней иммунизации у животных осуществляли забор цельной крови для определения титров специфических IgG-антител. Для анализа использовали последовательные 2-кратные разведения образцов в диапазоне от 1 : 1000 до 1 : 512 000. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку крови интактных мышей. В рабочем разведении применяли конъюгат кроличьих иммуноглобулинов с пероксидазой хрена против иммуноглобулинов мыши (Sigma-Aldrich, США). Реакцию проявляли раствором субстрата - 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (TMB, Sigma). Оптическую плотность измеряли на фотометре Multiskan (Labsystems, США) при длине волны 450 нм (ОП 450).

Получение гибридом. Слияние В-лимфоцитов селезенок гипериммунных мышей с клетками-партнерами Sp2/0-Ag14 (ATCC^® CRL-1581^™, США) проводили методом электрослияния с помощью системы BTX ECM 2001 (Harvard Bioscience, США). Параметры и методика электрослияния были опубликованы ранее [16]. По окончании электрослияния к суспензии клеток добавляли 60 мл среды RPMI‑1640 ("ПанЭко", Россия), содержащей 20 % ФСБ, однократный раствор HAT (Gibco, ThermoFisher, США), и переносили в 96-луночные культуральные планшеты по 100 мкл.

Результаты

Рекомбинантные антигены RBD-Fc и RBD-His были получены в системе экспрессии ExpiCHO-S. Для производства RBD-His была сконструирована плазмида pcDNA3.4 RBD-His (рис. 1А), которую использовали для создания стабильно экспрессирующей моноклональной клеточной линии. Продукция RBD-Fc осуществлена в режиме транзиентной экспрессии благодаря трансфекции клеток плазмидой pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-Fc (рис. 1Б). Выход очищенного белка составил 3 мг и 50 мг белка на 1 литр культуральной жидкости для RBD-Fc и RBD-His соответственно.

После проведения электрофореза в ПААГ (рис. 2) установили, что степень чистоты антигенов составляет > 95 %, белки в редуцирующих условиях (рис. 2, дорожки 4 и 5) обладают молекулярной массой ~ 50 и 30 кДа, что соответствует ожидаемым значениям и несколько больше расчетной молекулярной массы по аминокислотам (48 и 26 кДа) по причине гликозилирования.

Иммуногенность полученных рекомбинантных антигенов RBD и RBD-Fc определяли в комбинации с различными адъювантами на мышах линии BALB/c. Титры RBD-специфических антител в крови определяли с помощью непрямого твердофазного ИФА. Для покрытия лунок планшетов использовали белок RBD-His, а не RBD-Fc, поскольку иммунизированные мыши могли продуцировать антитела против Fc человека. Иммунизация мышей рекомбинантными белками RBD и RBD-Fc не вызывала у животных местных реакций или летальных исходов. Нами было установлено, что рекомбинантный RBD обладал более низкой иммуногенностью по сравнению с RBD-Fc, независимо от того, какой из адъювантов при этом использовался (рис. 3, 4).

Титры антител в группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании с ПАФ, составили 1 : 16 000 и 1 : 32 000 соответственно. В группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании с адъювантом Magic^TM Mouse, титры антител составили 1 : 8000 и 1 : 16 000 соответственно. В группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании с гидроксидом алюминия, титры антител составили 1 : 64 000 и 1 : 128 000 соответственно. В группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании со смесью адъюванта Фрейнда и гидроксида алюминия, титры антител составили 1 : 128 000 и 1 : 256 000 соответственно. Таким образом, совместное использование двух адъювантов - гидроксида алюминия и ПАФ - позволило получить наиболее напряженный иммунный ответ в группе животных, иммунизированных антигеном RBD-Fc.

По результатам ИФА для получения гибридом была выбрана группа мышей, иммунизированных RBD-Fc в сочетании со смесью адъюванта Фрейнда и гидроксида алюминия. В результате гибридизации методом электрослияния нами было получено 17 гибридных клонов, продуцирующих МкАт к RBD S-белка SARS-CoV-2. Результаты скрининга перспективных клонов представлены в таблице.

Культуральную жидкость из лунок, в которых наблюдался рост гибридных клеток, тестировали с помощью ИФА в отношении специфического взаимодействия с рекомбинантным RBD. После образования монослоя гибридных клеток проводили скрининг, клонирование и наращивание. В результате исследования было получено 3 стабильных клона: 1E6, 5C3 и 3F11.

Обсуждение

Адъюванты делятся на природные и синтетические. Их добавляют в вакцины для стимуляции иммунной системы, но сами по себе адъюванты не вызывают специфического иммунного ответа [17]. Функция адъювантов заключается в транспортировке антигена или формировании его депо, уменьшении дозы антигена и количества повторных иммунизаций, достаточных для получения высоких титров антител [18].

Механизм действия адъювантов разнообразен. Самая распространенная схема - активация макрофагов с помощью инактивированных бактерий или вирусов. Рецепторы на поверхности макрофагов взаимодействуют с компонентами адъюванта, что приводит к активации продукции цитокинов, медиатора острого и хронического воспаления ИЛ-1 и фактора роста Т-клеток ИЛ-2 [19]. Таким образом, происходит усиление иммунного ответа и активация Т-клеточного звена иммунной системы. По такому принципу работает ПАФ [20].

Гидроксид алюминия относится к классу минеральных адъювантов и является одним из основных компонентов в составе вакцинных препаратов [21, 22]. Механизм действия адъювантов, в основу которых входит гидроксид алюминия, основан на эффекте депо [23]. Физические свойства гидроксида алюминия позволяют задерживать на поверхности антиген и передавать его длительное время иммунным клеткам. Гидроксид алюминия избирательно стимулирует гуморальный иммунный ответ, а также Т-хелперный иммунный ответ 2-го типа, который сопровождается выработкой ИЛ-4 и ИЛ-5, индуцируя синтез иммуноглобулина IgG1 [24]. Однако по данным литературы известно, что при сочетании гидроксида алюминия с другими адъювантами функция депо антигена заменяется на функцию доставки антигена [25].

Адъювант Magic^TM Mouse (Creative Diagnostics, США) на основе нуклеиновых кислот состоит из ДНК микобактерий и содержит большое количество CpG-мотивов, которые активируют врожденную иммунную систему через Toll-подобный рецептор 9 (TLR9) [26], локализующийся преимущественно в эндосомах B-клеток и отвечающий за распознавание неметилированных CpG-мотивов ДНК [27, 28]. TLR9 активирует сигнальный каскад, ведущий к продукции провоспалительных цитокинов и активации врожденной иммунной системы [29].

Результаты проведенного исследования показали, что различные адъюванты в сочетании с рекомбинантным RBD или RBD-Fc неодинаково повышают иммунный ответ у экспериментальных животных. В нашем исследовании наименьшей активностью обладал адъювант Magic^TM Mouse. Такая закономерность была отмечена как при иммунизации рекомбинантным RBD, так и RBD-Fc. В группе животных, иммунизированных RBD или RBD-Fc в сочетании с адъювантом Magic^TM Mouse, титр антител составил 1 : 8000 и 1 : 16 000 соответственно. В исследовании 2023 г. T.Y. Kuo и соавт. показали, что иммунизация животных с использованием адъюванта на основе CpG-мотивов также не способствовала индукции высокого иммунного ответа [30].

В группе животных, иммунизированных RBD-Fc, эмульгированным с ПАФ, титр антител составил 1 : 32 000, а с рекомбинантным антигеном RBD - 1 : 16 000. Недавно Z. Liu и соавт. продемонстрировали, что иммунизация животных антигеном RBD-Fc, эмульгированным с ПАФ, способствует индукции высокого титра специфических антител, который составил 1 : 117 000, но это несопоставимо с нашими результатами [31].

Наиболее выраженный иммунный ответ проявлялся в группе животных, иммунизированных RBD-Fc с гидроксидом алюминия. В 2021 г. Y-S. Sun и соавт. продемонстрировали схему иммунизации мышей, которая в качестве антигена включала RBD-Fc, эмульгированный с адъювантом на основе гидроксида алюминия. Титр антител у животных составил 1 : 100 000 [32]. В нашем исследовании при аналогичной схеме иммунизации титр антител в сыворотке крови составил 1 : 128 000, что является сопоставимым результатом.

На основе полученных нами экспериментальных данных было принято решение о совместном использовании ПАФ и гидроксида алюминия в качестве адъювантов для достижения наиболее эффективного иммунного ответа. Результаты наших исследований показали, что совместное использование гидроксида алюминия и ПАФ в сочетании с RBD-Fc заметно усиливало иммунный ответ по сравнению только с гидроксидом алюминия или ПАФ. Данная адъювантная композиция эффективна для стимуляции иммунного ответа с целью получения МкАт к S-белку SARS-COV-2. Использование гидроксида алюминия и ПАФ в сочетании с RBD-Fc позволило достичь наиболее напряженного иммунного ответа, что отражалось в получении у мышей титра антител к RBD 1 : 256 000. Использование спленоцитов этой группы животных для гибридизации методом электрослияния позволило получить 17 гибридом, 3 из них оказались стабильными и продуцировали МкАт к RBD S-белка SARS-CoV-2.

Заключение

Использование для иммунизации мышей RBD, слитого с Fc-фрагментом IgG1 человека, привело к увеличению молекулярной массы антигена в 2 раза, что усилило его иммуногенность. Благодаря использованию RBD-Fc в сочетании одновременно с двумя адъювантами - гидроксидом алюминия и ПАФ - удалось достигнуть высоких тиров антител (1 : 256 000) в сыворотке крови мышей через 6 нед после первой иммунизации. Данный подход может быть использован для получения МкАт к RBD различных штаммов SARS-CoV-2, что актуально как для получения препаратов МкАт как для диагностики, так и для лечения COVID-19.

Литература

1. Yang H., Rao Z. Structural biology of SARS-CoV-2 and implications for therapeutic development. Nat. Rev. Microbiol. 2021; 19 (11): 685-700. DOI: https://doi.org/10.1038/s41579-021-00630-8

2. Гудима Г.О., Хаитов Р.М., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Молекулярно-иммунологические аспекты диагностики, профилактики и лечения коронавирусной инфекции. Иммунология. 2021; 42 (3): 198-210. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-198-210

3. Gudima G., Kofiadi I., Shilovskiy I., Kudlay D., Khaitov M. Antiviral Therapy of COVID-19. Int J Mol Sci. 2023 May 16; 24 (10): 8867. DOI: 10.3390/ijms24108867.

4. Hoffmann M., Kleine-Weber H., Schroeder S., Krüger N., Herrler T., Erichsen S., Schiergens T.S., Herrler G., Wu N.H., Nitsche A., Müller M.A., Drosten C., Pöhlmann S. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2 and is blocked by a clinically proven protease inhibitor. Cell. 2020; 181 (2): 271-80.e8. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052

5. Zhang H., Penninger J.M., Li Y., Zhong N., Slutsky A.S. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) as a SARS-CoV-2 receptor: molecular mechanisms and potential therapeutic target. Intensive Care Med. 2020; 46 (4): 586-90. DOI: https://doi.org/10.1007/s00134-020-05985-9

6. Huang Y., Yang C., Xu X.F., Xu W., Liu S.W. Structural and functional properties of SARS-CoV-2 spike protein: potential antivirus drug development for COVID-19. Acta Pharmacol. Sin. 2020; 41 (9): 1141-9. DOI: https://doi.org/10.1038/s41401-020-0485-4

7. Dai L., Zheng T., Xu K., Han Y., Xu L., Huang E., An Y., Cheng Y., Li S., Liu M., Yang M., Li Y., Cheng H., Yuan Y., Zhang W., Ke C., Wong G., Qi J., Qin C., Yan J., Gao G.F. A universal design of betacoronavirus vaccines against COVID-19, MERS, and SARS. Cell. 2020; 182 (3): 722-33.e11. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.035

8. Liu L. Pharmacokinetics of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins. Protein Cell. 2018; 9: 15-32. DOI: https://doi.org/10.1007/s13238-017-0408-4

9. Martyn J.C., Cardin A.J. Wines B.D., Cendron A., Li S., Mackenzie J., Powell M., Gowans E.J. Surface display of IgG Fc on baculovirus vectors enhances binding to antigen-presenting cells and cell lines expressing Fc receptors. Arch. Virol. 2009; 154 (7): 1129-38. DOI: https://doi.org/10.1007/s00705-009-0423-8

10. Antipova N.V., Larionova T.D., Siniavin A.E., Nikiforova M.A., Gushchin V.A., Babichenko I.I., Volkov A.V., Shakhparonov M.I., Pavlyukov M.S. Establishment of murine hybridoma cells producing antibodies against spike protein of SARS-CoV-2. Int. J. Mol. Sci. 2020; 21 (23): 9167. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms21239167

11. Сердюкова Н.С., Радкович Е.В., Родькина И.А., Гуща Г.Н., Халимоненко Ю.А. Применение адъювантов Фрейнда и ISA-70 в схеме иммунизации для получения высокоактивной антисыворотки к ХВК. Картофелеводство. 2022; 28 (1): 97-106.

12. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации от 19.06.2003 года № 267 "Правила лабораторной практики в Российской Федерации".

13. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях. Санкт-Петербург: 48.

14. Chan K.K., Dorosky D., Sharma P., Abbasi S.A., Dye J.M., Kranz D.M., Herbert, A.S., Procko E. Engineering human ACE2 to optimize binding to the spike protein of SARS coronavirus 2. Science. 2020; 369 (6508): 1261-5. DOI: https://doi.org/10.1126/science.abc0870

15. Güler-Gane G., Kidd S., Sridharan S., Vaughan T.J., Wilkinson T. C., Tigue N.J. Overcoming the refractory expression of secreted recombinant proteins in mammalian cells through modification of the signal peptide and adjacent amino acids. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155340. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155340

16. Силкина М.В., Карцева А.С., Рябко А.К., Марьин М.А., Романенко Я.О., Калмантаева О.В., Хлынцева А.Е., Шемякин И.Г., Дятлов И.А., Фирстова В.В. Оптимизация условий электрослияния для получения гибридом, синтезирующих человеческие моноклональные антитела. Биотехнология. 2021; 37 (2): 77-87.

17. Vogel F.R. Adjuvants in perspective. Dev. Biol. Stand. 1998; 92: 241-8. PMID: 9554280.

18. Wu J.Y., Gardner B.H., Kushner N.N., Pozzi L.A., Kensil C.R., Cloutier P.A., Coughlin R.T., Newman M.J. Accessory cell requirements for saponin adjuvant-induced class I MHC antigen-restricted cytotoxic T-lymphocytes. Cell. Immunol. 1994; 154 (1): 393-406. DOI: https://doi.org/10.1006/cimm

19. Vogel F.R. Improving vaccine performance with adjuvants. Clin. Infect. Dis. 2000; 30 (suppl 3): 266-70. DOI: https://doi.org/10.1086/313883

20. Freund J., Casals J., Hosmer E.P. Sensitization and antibody formation after injection of tubercle bacilli and paraffin oil. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1937; 37 (3): 509-13. DOI: https://doi.org/10.3181/00379727-37-9625

21. He P., Zou Y., Hu Z. Advances in aluminum hydroxide-based adjuvant research and its mechanism. Hum. Vaccin. Immunother. 2015; 11 (2): 477-88. DOI: https://doi.org/10.1080/21645515.2014.1004026

22. Dai L., Zheng T., Xu K., Han Y., Xu L., Huang E., An Y., Cheng Y., Li S., Liu M., Yang M., Li Y., Cheng H., Yuan Y., Zhang W., Ke C., Wong G., Qi J., Qin C., Yan J., Gao G.F. A universal design of betacoronavirus vaccines against COVID-19, MERS, and SARS. Cell. 2020; 182 (3): 722-33. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.06.035

23. Hem S.L., Hogenesch H. Relationship between physical and chemical properties of aluminum-containing adjuvants and immunopotentiation. Expert Rev. Vaccines. 2007; 6 (5): 685-98. DOI: https://doi.org/10.1586/14760584.6.5.685

24. Gupta R.K. Aluminum compounds as vaccine adjuvants. Adv. Drug Deliv. Rev. 1998; 32: 155-72. DOI: https://doi.org/10.1016/s0169-409x(98)00008-8

25. Алпатова Н.А., Авдеева Ж.И., Лысикова С.Л., Головинская О.В., Гайдерова Л.А. Общая характеристика адъювантов и механизм их действия (часть 1). Биопрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020; 20 (4): 245-56.

26. Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Лысикова С.Л., Гайдерова Л.А., Бондарев В.П. Анализ механизмов развития иммунного ответа при инфицировании вирусом гепатита В и способы повышения эффективности вакцинации. Иммунология. 2021; 42 (4): 403-14. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-3-403-414

27. Weiner G.J., Liu H.M., Wooldridge J.E., Dahle C.E., Krieg A.M. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing the CpG motif are effective as immune adjuvants in tumor antigen immunization. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1997; 94 (20): 10 833-7. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.94.20.10833

28. Андреев Ю.Ю., Топтыгина А.П. Адъюванты и иммуномодуляторы в составе вакцин. Иммунология. 2021; 42 (6): 720-9. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-720-729

29. Greenfield E.A. Standard immunization of mice, rats, and hamsters. Cold Spring Harb. Protoc. 2020; 2020 (3). DOI: https://doi.org/10.1101/pdb.prot100297

30. Kuo T.Y., Lin M.Y., Coffman R.L., Campbell J.D., Traquina P., Lin Y.J., Liu L.T., Cheng J., Wu Y.C., Wu C.C., Tang W.H., Huang C.G., Tsao K.C., Chen C. Development of CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike antigen as a subunit vaccine against COVID-19. Sci. Rep. 2020; 10 (1): 20085. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-77077-z

31. Liu Z., Xu W., Xia S., Gu C., Wang X., Wang Q., Zhou J., Wu Y., Cai X., Qu D., Ying T., Xie Y., Lu L., Yuan Z., Jiang S. RBD-Fc-based COVID-19 vaccine candidate induces highly potent SARS-CoV-2 neutralizing antibody response. Signal Transduct. Target. Ther. 2020; 5 (1): 282. DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-020-00402-5

32. Sun Y.S., Zhou J.J., Zhu H.P., Xu F., Zhao W.B., Lu H.J., Wang Z., Chen, S.Q., Yao P.P., Jiang J.M., Zhou Z. Development of a recombinant RBD subunit vaccine for SARS-CoV-2. Viruses. 2021; 13 (10): 1936. DOI: https://doi.org/10.3390/v13101936

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)