Иммуногенность и протективная активность рекомбинантной вакцины против синегнойной инфекции

• Ахматова Н.К.
• Калиниченко Е.О.
• Курбатова Е.А.
• Михайлова Н.А.

Резюме

Синегнойная инфекция представляет серьезную социально-экономическую проблему здравоохранения, так как возбудитель обладает высоким уровнем резистентности к антибиотикам, а клинические проявления заболевания характеризуются многообразием и нередко тяжелым течением.

Цель - исследование антительного иммунного ответа у мышей, вакцинированных кандидатной вакциной против Pseudomonas aeruginosa, характеристика спектра изотипов вырабатываемых иммуноглобулинов.

Материал и методы. Мышам (BALB/с, самки) дважды внутрибрюшинно с интервалом в 2 нед вводили рекомбинантную вакцину против Pseudomonas aeruginosa, содержащую белки OprF (порин внешней мембраны P. aeruginosa, outer membrane porin, 25 мкг) и a-Tox (анатоксин, делеционная форма экзотоксина А, 50 мкг), адсорбированные на 225 мкг геля гидроксида алюминия. Через 3 нед после последней иммунизации у животных определяли уровни антител методом иммуноферментного анализа и протективную активность препарата при заражении летальной дозой P. aeruginosa.

Результаты. Двукратная иммунизация мышей рекомбинантной вакциной против P. aeruginosa индуцировала нарастание в крови титров IgM и IgG, а также изотипов IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 к OprF и a-Tox по сравнению с контролем (интактные мыши) (p < 0,01). При этом вакцина защищала мышей от летальной заражающей дозы P. aeruginosa в 80% случаев.

Заключение. Можно предположить, что действие вакцины на основе рекомбинантных белков OprF и анатоксина P. aeruginosa связано как с индукцией антител, так и с активацией клеточных механизмов иммунного ответа.

Ключевые слова:анатоксин; OprF; a-Tox Pseudomonas aeruginosa; изотипы иммуноголобулинов

Pseudomonas aeruginosa имеет важное медицинское значение вследствие своей широкой распространенности, высокой антибиотикоустойчивости, а течение заболеваний, вызванных данным возбудителем, характеризуется многообразием клинических проявлений [1, 2].

Действию данного патогена наиболее подвержены лица с вторичными иммунодефицитными состояниями, например с ожогами или муковисцидозом, у которых синегнойная инфекция часто осложняет течение патологического процесса [2-4].

Резистентность, вырабатывающаяся у возбудителя в результате широкого неконтролируемого применения антибиотиков, а также свойство образовывать биопленки, затрудняют лечение больных с синегнойной инфекцией, а развитие инфекций, вызванных P. aeruginosa, зачастую приобретает угрожающий жизни характер [5].

Учитывая вышеизложенное, можно утверждать, что существует острая потребность в новых высокоэффективных вакцинных препаратах против синегнойной палочки. Как показывают исследования [4], имеющиеся на сегодняшний день вакцины не способны обеспечить защиту от P. аeruginosa [3].

В ФГБУ "НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова" разработана кандидатная вакцина против P. aeruginosa на основе рекомбинантных белков этой бактерии: OprF - порин внешней мембраны P. aeruginosa (outer membrane porin F), и a-Tox - анатоксин (делеционная форма экзотоксина А) [6]. В настоящее время индукция иммунного ответа под воздействием P. aeruginosa и его антигенных компонентов остается недостаточно исследованной.

Цель работы - исследование антительного иммунного ответа у мышей, вакцинированных кандидатной вакциной против Pseudomonas aeruginosa, характеристика спектра изотипов вырабатываемых иммуноглобулинов.

Материал и методы

Получение рекомбинантных белков OprF и a-Tox P. aeruginosa

Рекомбинантные белки OprF и a-Tox P. aeruginosa были экспрессированы в клетках Escherichia coli. Штаммы-продуценты культивировали на среде LB (по Miller), индукцию экспрессии рекомбинантных белков проводили с помощью изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Бактериальную биомассу осаждали центрифугированием.

Рекомбинантные белки из биомассы выделяли методом аффинной хроматографии с использованием Ni-NTA-агарозы (QIAGEN, США). После хроматографической очистки проводили диализ полученных белков в буфере, содержащем 50 мМ Tris (pH 9,0) и 0,01% Tween 20. Расчетные молекулярные массы рекомбинантных белов соответствовали 38,9 кДа для OprF и 65,8 кДа для анатоксина (a-Tox). Полученные белки адсорбировали в течение 12 ч при 4 °С на гель Al(OH)₃ (Sigma, США) из расчета 1 мг Al(ОН)₃ на 1 мг белка.

Уровень поствакцинальных антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных смесью рекомбинантных белков, определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) при адсорбции на твердой фазе рекомбинантных белков a-Tox и OprF синегнойной палочки. Для этого на планшетах Biomedicals (Россия) раздельно сорбировали растворенные в карбонатно-бикарбонатном буфере (Sigma, США) (pH = 9,4) рекомбинантные белки OprF и a-Tox в концентрации 10 мкг/мл в объеме 100 мкл/лунка. Адсорбцию производили в течение 2 ч при 37 ^оС в термостате, далее - при 4 °С в течение ночи. После этого раствор удаляли, планшеты высушивали и хранили при 4 °С в холодильнике.

Перед экспериментом планшеты трижды промывали фосфатно-солевым буфером, содержащим 0,05% Tween 20 (ФСБ-Т) (Sigma, США), pH = 7,4. Этот же раствор использовали для разведения сывороток. Далее разведенные сыворотки вносили в лунки планшет и инкубировали при 37 °С в термостате в течение 1 ч, после чего остатки сывороток с несвязавшимися антителами удаляли и трижды промывали планшеты. Далее в лунки вносили вторичные антимышиные IgM-, IgG-, IgG1-, IgG2a-, IgG2b-, IgG3-антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Thermo Fisher Scientific, США).

Инкубировали при 37 °С в термостате в течение 1 ч, после чего растворы конъюгатов удаляли и трижды промывали планшеты ФСБ-Т.

Для проявления реакции в лунки вносили по 100 мкл однокомпонентного субстрата тетраметилбензидина (Invitrogen, США), инкубировали 20 мин в темноте при комнатной температуре и останавливали реакцию добавлением 1 М раствора серной кислоты. Оптическую плотность (OП) продуктов ферментативной реакции измеряли на ИФА-ридере "iMark" (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. Интенсивность реакции оценивали полуколичественно, по наибольшему разведению сыворотки, при котором оптическая плотность в лунке не менее чем в 2 раза превышала контрольные значения (у неиммунизированных мышей). ОП < 0,2 считали точкой отсечения отрицательных результатов.

Исследовали содержание антител классов IgM и IgG (суммарных) и изотипов IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 в сыворотках мышей (BALB/c, самки), иммунизированных внутрибрюшинно, двукратно с интервалом 14 дней препаратом, содержащим смесь 50 мкг анатоксина (a-Tox) и 25 мкг OprF, сорбированных на 225 мкг геля гидроксида алюминия. Отбирали кровь тотально через 3 нед после второй иммунизации индивидуально у 10 иммунизированных мышей. Сыворотки консервировали добавлением мертиолята в концентрации 0,01% и хранили в холодильнике при 4 °С. Содержание антител исследовали в каждой сыворотке, полученных от 10 иммунизированных животных и в пуловой сыворотке 10 неиммунизированных мышей.

Получение культуры клеток P. aeruginosa. Культуру клеток P. aeruginosa (штамм PA103) хранили в лиофилизированном состоянии. Для получения живой культуры ампулу вскрывали и добавляли 1 мл бульона Мюллер-Хинтона (кислотный гидролизат казеина - 17,5 г/л, вытяжка из говядины - 300,0 г/л, растворимый крахмал - 1,5 г/л). Суспензию переносили в пробирку объемом 10 мл и инкубировали 4 ч при 37 ºС. Затем с использованием микробиологической петли инокулировали штрихом пробирки со скошенной агаризованной (1,5% бактоагара) средой (бульон Мюллер-Хинтона). Пробирки с культурой инкубировали в течение ночи при 37 ºС.

Микробиологическими петлями культуру из пробирок переносили на чашки Петри (с той же агаризованной средой) истончающимся штрихом до единичных колоний и выращивали в течение ночи при 37 ºС. Дальнейшее пассирование культуры с чашки на чашку проводили один раз в 2 нед.

Протективную активность вакцины против синегнойной инфекции оценивали при заражении мышей вирулентной культурой P. aeruginosa (штамм PA103). Мышам вводили смесь рекомбинантных белков, содержащую 50 мкг a-Tox и 25 мкг OprF, сорбированных на 225 мкг геля гидроксида алюминия. Мышей иммунизировали двукратно с интервалом в 2 нед в объеме 0,5 мл. Спустя 3 нед после второй иммунизации мышей заражали пятью двукратно уменьшающимися дозами культуры P. aeruginosa. Перед заражением колонии P. аeruginosa, выращенные на агаризованной среде, смывали изотоническим раствором хлорида натрия и разводили до концентрации 1 ∙ 10⁹ в 1 мл, используя спектрофотометр и стандарты мутности. Полученную взвесь разводили для приготовления доз заражения различной концентрации. Контроль заражающей дозы проводили путем высева на агаризованную среду взвеси культуры, соответствующей минимальной дозе заражения, с последующим подсчетом образовавшихся колоний. В качестве контрольной группы использовали неиммунизированных мышей, зараженных теми же дозами P. aeruginosa, что и в опытной группе. Результаты опыта учитывали по количеству погибших и выживших животных в течение 7 дней. Определяли ЛД₅₀ по формуле Кербера в модификации Ашмарина-Воробьева, согласно которой ЛД₅₀ равно обратному логарифму следующего значения:

lgA - lgD (B₁/C₁ + - + B_n/C_n) - 0,5,

где А - максимальная инфекционная доза в опыте; D - кратность разведения заражающих доз культуры, В - количество животных, павших в группе, С - первоначальное количество животных в группе, n - количество групп. Индекс эффективности рассчитывали по отношению ЛД₅₀ в опыте к ЛД₅₀ в контроле.

Методы статистической обработки данных. Использовали метод Манна-Уитни для независимых выборок. Статистически достоверными считали различия при p < 0,05. Использовали программное обеспечение Statistica 8.

Результаты

Исследование у мышей уровня поствакцинальных антител

У мышей через 3 нед после двукратной иммунизации кандидатной вакциной против P. aeruginosa, содержащей смесь рекомбинантных белков OprF и a-Tox P. aeruginosa, адсорбированных на гидроксиде алюминия, в сыворотках крови определяли титры антител M- и G-классов, а также изотипов IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3, специфичных к исследуемым белкам.

При исследовании титров антител к рекомбинантному OprF у иммунизированных мышей было обнаружено, что титр IgM-антител составлял от 1 : 200 до 1 : 3200, тогда как у контрольных животных - 1 : 100 (p < 0,01) (рис. 1).

Исследование суммарных специфических антител класса IgG к белку OprF показало присутствие данного иммуноглобулина в титрах от 1 : 200 до 1 : 3200 по сравнению с контролем (1 : 100) (p < 0,01). IgG1-антитела выявляли в титрах (от 1 : 800 до 1 : 51 200 против ≤ 1 : 100 в контроле) (p < 0,01).

IgG2a-антитела к белку OprF у иммунизированных мышей выявлялись в титрах от 1 : 800 до 1 : 25 600. IgG2b-антитела к данному белку определяли в пределах 1 : 3200 - 1 : 25 600, тогда как у неиммунизированных животных титры IgG2a- и IgG2b-антител в сыворотке составляли 1 : 100 (p < 0,01). Иммунизация стимулировала повышение IgG3-антител к OprF, при этом их титры изменялись от 1 : 800 до 1 : 25 600 по сравнению с контролем (p < 1 : 100).

Резюмируя вышеизложенное, следует отметить, что у мышей, иммунизированных рекомбинантной вакциной против синегнойной палочки, выявлено существенное повышение OprF-индуцированных антител классов IgМ и IgG и изотипов IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 по сравнению с интактными животными. Меньше всего было выражено повышение титров IgG3-антител.

При исследовании изотипов и уровня a-Tox-индуцированных антител выявлены иммуноглобулины класса M в титрах от 1 : 400 до 1 : 3200, что превышало их уровень относительно группы контроля (титр 1 : 200) (p < 0,01) (рис. 2).

Исследование суммарных специфических IgG-антител к рекомбинантному анатоксину показало повышение его уровня в сыворотках иммунизированных мышей от 1 : 6400 до 1 : 102 400, тогда как у интактных мышей титр антител составил 1 : 200 (p < 0,01). Выявлено существенное повышение синтеза изотипа IgG1 от 1 : 800 до 1 : 102 400, тогда как IgG1-антитела у интактных животных практически не обнаруживались (≤ 1 : 100) (p < 0,01). Изотип IgG2a к a-Tox выявляли в титрах от 1 : 1600 до 1 : 51 200, IgG2b-антитела в титрах 1 : 1600 - 1 : 102 400. В сыворотке неиммунизированных животных уровень антител IgG2a и IgG2b составил 1 : 100 (p < 0,01 соответственно). Антитела изотипа IgG3 к a-Tox у иммунизированных мышей выявляли в титрах от 1 : 1600 до 1 : 51 200, а в контроле - 1 : 200 (p < 0,01).

Таким образом, у иммунизированных мышей происходило статистически значимое повышение титров антител, специфичных к антигенам OprF и a-Tox, относящимся к разным изотипам Ig (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3), по сравнению с интактными животными.

Оценка протективной активности рекомбинантной вакцины против P. aeruginosa

Через 3 нед после второй иммунизации рекомбинантной вакциной против синегнойной инфекции, мышей заражали живой вирулентной культурой штамма РА103 P. aeruginosa. Пять доз культуры в двукратных разведениях вводили опытной и контрольной группам мышей внутрибрюшинно в объеме 0,5 мл. Подсчет погибших и выживших животных проводили в течение 7 дней с последующим определением ЛД₅₀ и индекса эффективности (ИЭ).

Рекомбинантная вакцина против синегнойной инфекции (см. таблицу) защищала мышей в 80% случаев при введении P. aeruginosa в дозах 50 млн и 25 млн микробных клеток (м. к.) При этом в контроле отмечалась гибель 100% мышей при заражающей дозе 50 млн м. к. и гибель 60% животных при заражении дозой 25 млн м. к.

В группе интактных мышей ЛД₅₀ соответствовала 20,3 млн м. к., в группе иммунизированных - 65,9 млн м. к. Таким образом, было показано, что вакцина против синегнойной инфекции на основе рекомбинантных белков OprF и a-Tox защищала мышей линии BALB/с от заражения P. aeruginosa с индексом эффективности 3,2.

Обсуждение

Исследование содержания IgM и IgG, а также изотипов IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG3 в крови мышей, иммунизированных вакциной против P. aeruginosa на основе рекомбинантных белков OprF и a-Tox, адсорбированных на гидроксиде алюминия, показало, что через 3 нед у животных выявлялись антитела к одноименным белкам в достаточно высоких титрах. Эти мыши были защищены в 30-80% случаев от летальной дозы синегнойной инфекции.

Белковые антигены в основном вызывают тимус-зависимый иммунный ответ с образование IgG и иммунологической памяти. При участии ИЛ-4 происходит переключение синтеза IgM на IgG1, и развитие иммунного ответа направляется по Th2-типу; ИФН-γ способствует переключению синтеза IgM на продукцию IgG2a, IgG2b и IgG3 и поляризует иммунный ответ по Th1-типу [7].

Известно, что иммунный ответ на антигены, адсорбированные на солях алюминия, также главным образом реализуется по Th2-пути с выработкой соответствующих цитокинов и доминирующим образованием антител этого изотипа [8]. IgG2a и IgG2b в наибольшей степени способствуют опсонофагоцитозу и комплемент-зависимому лизису [9, 10].

Полученные данные показывают, что после иммунизации мышей титр IgM-антител, специфичных к исследуемым белкам синегнойной палочки, невелик, но превышает таковой у контрольных животных.

Наиболее высокие титры наблюдали у антител субкласса IgG1, меньшие - у Ig2b, еще чуть меньшие - у IgG2a, а IgG3 представляли собой минорный субкласс.

Двукратная иммунизация мышей рекомбинантной вакциной на основе белков a-Tox и OprF P. aeruginosa индуцировала максимальное (более чем в 300 раз по сравнению с контролем) нарастание титров IgG1 к a-Tox и IgG к OprF в крови. Вакцина против синегнойной инфекции защищала мышей от летальной (25-50 млн м. к.) дозы заражения P. aeruginosa в 80% случаев с ИЭ 3,2.

Учитывая существенное нарастание IgG-антител у иммунизированных мышей по сравнению с неиммунизированными, но недостаточно высокую защиту при заражающей дозе 25 млн м. к. (выжило 80% против 40% в контроле), можно предположить, что выработка иммуноглобулинов не является эффективным показателем, обеспечивающим надежную защиту от летальной инфекции P. aeruginosa. Вероятно, в иммунном ответе против синегнойной инфекции важную роль играют клеточные механизмы адаптивного иммунитета, контролирующие иммунные реакции на этапах распознавания чужеродных антигенов, представления и уничтожения патогена.

До сих пор остается неясным, какой тип иммунного ответа необходим для предотвращения колонизации дыхательных путей. Из классических представлений вытекало, что для формирования защиты от синегнойной инфекции может быть достаточно опсонизирующих антител. Однако в настоящее время выявлено, что одни только антитела не способны в достаточной мере защитить организм от данного патогена, особенно от легочной инфекции. Необходима стимуляция как клеточного, так и гуморального звеньев иммунной системы с активацией нейтрофилов, комплемента, NKT- и Th17-клеток [3].

Ранее нами было установлено [11-13], что вакцина на основе рекомбинантных белков OprF и a-Tox против синегнойной палочки тоже оказывает влияние на молекулярно-клеточные механизмы иммунного ответа, приводящие к изменению уровня экспрессии дифференцировочных молекул и молекул активации, а также синтеза цитокинов у мышей.

Заключение

Можно предположить, что действие вакцины против синегнойной инфекции на основе рекомбинантных белков OprF и a-Tox P. aeruginosa связано с активирующим влиянием не только на гуморальное звено, но и на клеточные механизмы иммунного ответа, которые могут запускать каскад иммунных реакций, направленных на формирование поствакцинального адаптивного иммунитета.

Литература

1. Калошин А.А., Солдатенкова А.В., Зимина Е.М., Михайлова Н.А. Перспективы рекомбинантных препаратов для иммунопрофилактики инфекций, вызываемых Pseudomonas aeruginosa. Мед. иммунология. 2017; 19 (спец. вып.): 48.

2. Lund-Palau H., Turnbull A.R., Bush A., Bardin E. et al. Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis: pathophysiological mechanisms and therapeutic approaches. Expert Rev. Respir. Med. 2016; 10 (6): 685-97. doi: 10.1080/17476348.2016.1177460. Epub 2016 May 13.

3. Pier G.B., Ramphal R. Pseudomonas aeruginosa. In: G.L. Mandell, J.E. Bennett, R. Dolin (eds). Mandell, Douglas, and Bennett’s Principles and Practice of Infectious Diseases. 7th ed. New York, 2010.

4. Priebe G.P., Goldberg J.B. Vaccines for Pseudomonas aeruginosa: a long and winding road. Expert Rev. Vaccines. 2014; 13 (4): 507-19. doi: 10.1586/14760584.2014.890053.

5. Лазарева А.В., Чеботарь И.В., Крыжановская О.А., Чеботарь В.И. и др. Pseudomonas aeruginosa: патогенность, патогенез и патология. Клин. микробиол. и антимикроб. химиотер. 2015; 17 (3): 170-86.

6. Калошин А.А., Леонова, Е.И., Солдатенкова, А.В., Михайлова, Н.А. Исследование протективных свойств рекомбинантного комплекса белка F наружной .мембраны и анатоксина Pseudomonas aeruginosa. Вестн. РАМН. 2016; 71 (1): 5-10.

7. Chu J.Q., Huang S., Ye W., Fan X.Y. et al. Evaluation of protective immune response induced by a DNA vaccine encoding GRA8 against acute toxoplasmosis in a murine model. Korean J. Parasitol. 2018; 56 (4): 325-34. doi: 10.3347/kjp.2018.56.4.325.

8. Valiante N.M., O’Hagan D.T., Ulmer J.B. Innate immunity and biodefence vaccines. Cell. Microbiol. 2003; 5 (11): 755-60.

9. Michaelsen T.E., Kolberg J., Aase A., Herstad T.K. et al. The four mouse IgG isotypes differ extensively in bactericidal and opsonophagocytic activity when reacting with the P1.16 epitope on the outer membrane PorA protein of Neisseria meningitidis. Scand. J. Immunol. 2004; 59 (1): 34-9.

10. Nimmerjahn F., Ravetch J.V. Divergent immunoglobulin g subclass activity through selective Fc receptor binding. Science. 2005; 310 (5753): 1510-2.

11. Ахматова Н.К., Калиниченко Е.О., Макаренкова И.Д., Ахматова Э.А. и др. Цитокиновый профиль дендритных клеток мышей под воздействием белков Pseudomonas aeruginosa OprF и aTox. Журн. микробиол. 2018; 2: 15-23.

12. Калиниченко Е.О., Сходова С.А., Ахматова Н.К., Михайлова Н.А. Иммунизация белками Pseudomonas aeruginosa OprF и aTox усиливает фагоцитарную и бактерицидную активность лейкоцитов у мышей. Журн. микробиол. 2018; 2: 10-5.

13. Солдатенкова А.В., Калошин А.А., Борисова О.В., Калиниченко Е.О. и др. Влияние комплекса рекомбинантных антигенов Pseudomonas aeruginosa на ключевые эффекторы иммунной системы. Мед. иммунология. 2017; 19 (5): 86.