Исследование антигенной специфичности Т-клеточных иммунных реакций в ответ на иммунизацию лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусным вектором, кодирующим Spike-белок SARS-CoV-2

• Атауллаханов Равшан Иноятович
• Ушакова Екатерина Игоревна
• Пичугин Алексей Васильевич
• Лебедева Екатерина Семеновна
• Иванов Сергей Витальевич
• Ожаровская Татьяна Андреевна
• Попова Ольга
• Щербинин Дмитрий Николаевич
• Банделюк Алина Сергеевна
• Зубкова Ольга Вадимовна
• Шмаров Максим Михайлович
• Логунов Денис Юрьевич
• Народицкий Борис Савельевич
• Гинцбург Александр Леонидович

Резюме

Введение. Рекомбинантные аденовирусные векторы являются одной из ведущих технологических платформ при разработке и производстве современных вакцин. В России и в других странах мира на базе рекомбинантных аденовирусов созданы и зарегистрированы вакцинные препараты против вируса лихорадки Эбола и коронавирусной инфекции SARS-CoV-2. Проводятся клинические испытания вакцин против гриппа, вируса Марбург, вирусов папилломы человека.

Закодированный в ДНК аденовирусного вектора целевой антиген экспрессируется в организме вакцинированного и против этого целевого белка-антигена развиваются адаптивные иммунные реакции. Векторная частица является вирусной и содержит в себе десятки вирусных антигенов. Следовательно, наряду с иммунными реакциями на целевой антиген в организме вакцинированного могут развиваться иммунные реакции на антигены самого вектора.

Цель данной работы - исследовать, как соотносятся между собой по интенсивности и качеству две разнонаправленные по антигенной специфичности иммунные реакции: против целевого антигена коронавируса и антигенов аденовирусного вектора.

Материал и методы. У мышей C57BL/6 исследовали интенсивность иммунных реакций CD4- и CD8-Т-клеток в ответ на иммунизацию рекомбинантным аденовирусным вектором, кодирующим S-белок SARS-CoV-2 (Ad5-S). Через 2 и 3 мес после иммунизации в селезенке мышей определяли количество и антигенную специфичность CD4- и CD8-T-клеток памяти. Реакцию Т-клеток индуцировали in vitro в совместной культуре с антиген-презентирующими дендритными клетками. Очищенные популяции CD4- и CD8-T-клеток получали сортировкой на лазерном проточном сортировщике BD FACS Aria II. Антиген-презентирующие клетки трансдуцировали аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-белок коронавируса, или контрольным рекомбинантным аденовирусным вектором без целевой вставки (Ad5-0). Ответ Т-клеток определяли методом ELISPOT по числу клеток, секретирующих ИФН-γ. В отдельных экспериментах для реактивации CD4-Т-клеток антиген-презентирующие дендритные клетки нагружали рекомбинантным RBD-фрагментом S-белка SARS-CoV-2. Для усиления ответа Т-клеток антиген-презентирующие дендритные клетки стимулировали агонистом TLR4.

Результаты. Установлено, что однократная интраназальная иммунизация вектором Ad5-S в дозе 10⁸ БОЕ индуцирует сильные системные Т-клеточные иммунные реакции у мышей C57BL/6. Через 2 мес после иммунизации в селезенке мышей обнаруживается около 100-200 тыс. антиген-реактивных Т-клеток памяти, секретирующих ИФН-γ при реактивации in vitro дендритными клетками, презентирующими целевой S-антиген SARS-CoV-2. Большинство антиген-реактивных CD8-T-клеток памяти специфично к S-антигену SARS-CoV-2. Содержание таких клеток после иммунизации вектором Ad5-S превышает 1 % от всех CD8-T-клеток. Количество антиген-реактивных CD8-T-клеток памяти, специфичных к аденовирусным антигенам вектора, было приблизительно в 3 раза ниже, чем количество антиген-реактивных CD8-T-клеток памяти, специфичных к целевому S-антигену. Интенсивность иммунной реакции CD4-T-клеток на иммунизацию вектором Ad5-S была сравнима с интенсивностью иммунной реакции CD8-T-клеток. Подавляющее большинство антиген-реактивных CD4-T-клеток памяти было специфично к антигенам аденовирусного вектора. Эти CD4-Т-клетки секретировали ИФН-γ в ответ на рестимуляцию in vitro дендритными клетками, трансдуцированными рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-0 без целевой вставки. Число CD4-T-клеток, реагирующих на рестимуляцию дендритными клетками, нагруженными рекомбинантным RBD, было исчезающе малым.

Показана возможность повышения интенсивности ответа CD8-T-клеток, специфичных к целевому S-антигену, путем увеличения дозы вектора Ad5-S при трансдукции антиген-презентирующих дендритных клеток, а также путем использования TLR4-агониста для стимуляции антиген-презентирующих дендритных клеток.

Предложены возможные механизмы кооперативного взаимодействия CD8-T-клеток, специфичных к целевому S-антигену SARS-CoV-2, и CD4-T-клеток, специфичных к антигенам аденовирусного вектора. Рассматриваются возможные пути усиления ответа CD4-T-клеток на целевой S-антиген.

Ключевые слова:рекомбинантный аденовирусный вектор; S-антиген SARS-CoV-2; Т-клетки памяти; антигенная специфичность

Введение

Рекомбинантные аденовирусные векторы стали одной из ведущих технологических платформ при разработке и производстве современных вакцин. В России зарегистрированы вакцинные препараты против вируса лихорадки Эбола на основе рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа [1], а также вакцинные препараты против SARS-CoV-2-инфекции/COVID-19 на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов [2, 3]. В других странах мира зарегистрированы вакцины против COVID-19 на основе рекомбинантных аденовирусов человека и шимпанзе - Ad5-nCov (CanSino Biologics, Китай) [4], COVID-19 Ad26COVs1 (Johnson & Johnson, Нидерланды/США) [5] и ChAdOx1 nCoV-19 (Oxford University/AstraZeneca, Великобритания) [6]. Кроме указанных, на основе аденовирусных векторов разработаны и находятся на разных стадиях клинических испытаний вакцины против гриппа [7], вируса Марбург [8], вирусов папилломы человека [9].

Закодированный в ДНК аденовирусного вектора целевой антиген экспрессируется в организме вакцинированного и против этого целевого белка-антигена развиваются адаптивные иммунные реакции. Производятся специфические антитела, размножаются и дифференцируются Т-клетки, способные защищать от инфекции и регулировать различные варианты противоинфекционной защиты, формируются долгоживущие Т- и В-клетки памяти, которые обеспечивают организм многолетней защитой.

Векторная частица является вирусной и содержит в себе десятки вирусных антигенов. Следовательно, наряду с иммунными реакциями на закодированный целевой антиген, в организме вакцинированного могут развиваться иммунные реакции на антигены самого вектора. В случае аденовирусного вектора, кодирующего целевой антиген коронавируса, эти две антигенные сущности представляют собой антигены двух совершенно различных вирусов - аденовируса и коронавируса. Обе группы антигенов иммуногенны. В организме вакцинированного могут развиваться адаптивные реакции иммунной системы против целевого антигена коронавируса и против антигенов аденовируса.

Как соотносятся между собой по интенсивности и качеству две разнонаправленные по своей антигенной специфичности иммунные реакции: против целевого антигена коронавируса и антигенов аденовирусного вектора? Исследованию ответов на этот вопрос посвящена данная статья.

Мы исследовали интенсивность и антигенную специфичность адаптивных реакций CD4- и CD8-Т-клеток после иммунизации лабораторных мышей вакциной против коронавируса, представляющей собой аденовирусный вектор, кодирующий белковый S-антиген SARS-CoV-2. Интенсивность и качество Т-клеточных реакций, направленных против белковых компонентов вектора и целевого белка, закодированного в этом векторе, мы определяли по количеству CD4- и CD8-Т-клеток, специфичных к S-антигену или антигенам аденовирусного вектора, в селезенке иммунизированных мышей. Полученные данные весьма интересны, поскольку не только характеризуют интенсивность и природу Т-клеток, различающихся специфичностью к антигенам аденовируса и S-белка, но и указывают на ранее неизвестный синергизм CD4- и CD8-Т-клеток с разной антигенной специфичностью. Обсуждаются практически полезные аспекты использования полученных данных для повышения эффективности иммуногенов на основе аденовирусных векторов, кодирующих целевой антиген.

Материал и методы

Экспериментальные животные. В работе использованы инбредные мыши линии C57BL/6, самки 2-месячного возраста, полученные из питомника лабораторных животных ФИБХ РАН (Пущино, Московская область). Животные содержались в стандартных условиях вивария ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России и ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России.

Рекомбинантные аденовирусные векторы. В работе использован рекомбинантный аденовирус человека, серотипа 5 (Ad5-S), экспрессирующий ген S-белка коронавируса SARS-CoV-2 штамма Ухань (UniProt Id: P0DTC2). Искусственный синтез гена проведен компанией "Евроген" (Россия), нуклеотидная последовательность гена была оптимизирована для экспрессии в клетках человека и добавлена последовательность Козак.

Для получения рекомбинантного аденовируса Ad5-S∆N был использован ген S-белка SARS-CoV-2 с удаленной генетической последовательностью, кодирующей 13 N-концевых аминокислотных остатков, составляющих лидерный пептид. Рекомбинантный аденовирусный вектор Ad5-0 без целевой вставки был получен коллективом авторов ранее [10].

Иммунизация. Мыши были иммунизированы вектором Ad5-S в дозе 10⁸ БОЕ путем однократного интраназального введения в объеме 50 мкл. В качестве контрольных использовались мыши, получившие интраназально однократно 50 мкл буфера, в котором вводилась суспензия векторных частиц.

Культуры клеток in vitro. Суспензии клеток селезенки и костного мозга мыши получали в асептических условиях стандартными методами. Все культуры клеток инкубировали в полной среде (ПС), составленной из DMEM (Thermo Fisher Scientific, США) с 25 мМ HEPES, дополненной смесью заменимых аминокислот, 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Cytiva, GE Healthcare Life Sciences HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 50 мкМ β-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина (все реактивы "ПанЭко", Россия), при 37 ^оС, в увлажненной атмосфере с содержанием 5 % СО₂.

Мышей выводили из эксперимента с помощью цервикальной дислокации. В асептических условиях выделяли селезенку. Клеточную суспензию готовили в фосфатном буфере с 0,5 % бычьего альбумина (ФБ-БСА). Фракцию мононуклеарных клеток получали с помощью центрифугирования в градиенте фиколла ("ПанЭко", Россия). Клетки отмывали ФБ-БСА. Для сортировки CD4- и CD8-Т-клеток суспензию окрашивали антителами CD4-PE и CD8-APC (BD Biosciences, США). Лейкоциты подсчитывали с окрашиванием CD45-BV510 (BioLegend, США). Жизнеспособность суспензий определяли при окрашивании DAPI. Сортировку клеток проводили с помощью проточного цитометра-сортировщика BD FACS Aria II (Becton-Dickinson, США). Чистота полученных популяций CD4- и CD8-Т-клеток составляла 98 %.

Получение антиген-презентирующих дендритных клеток. Дифференцировку дендритных клеток и макрофагов костного мозга мышей осуществляли in vitro в присутствии гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (Sigma, США). В асептических условиях выделяли бедренные и большие берцовые кости мышей. Костный мозг вымывали шприцем (игла 25G) в чашку Петри с раствором ФБ-БСА и тщательно суспендировали. Клетки отмывали ФБ-БСА. Эритроциты удаляли осмотическим лизисом. Ядросодержащие клетки культивировали в ПС с добавлением 10 нг/мл ГМ-КСФ при 37 ^оС и 5 % CO₂. Через 3-4 дня в культуры вносили равный объем ПС с теми же добавками. На 7-й день дендритные клетки активировали липополисахаридом (LPS) из E. coli (Sigma, США) в конечной концентрации 0,1 мкг/мл и нагружали антигеном. В качестве антигена использовали рекомбинантные аденовирусные векторы rAd5-S, rAd5-S∆N, rAd5-0, а также рекомбинантный RBD-фрагмент S-белка SARS-CoV-2.

Анализ Т-клеточных реакций, специфичных к целевым антигенам. Антиген-специфический ответ Т-клеток оценивали по секреции ИФН-γ через 2 и 3 мес после иммунизации. Специфический Т-клеточный ответ индуцировали в совместной культуре Т-клеток с антиген-презентирующими дендритными клетками, предварительно нагруженными целевым антигеном. Для анализа Т-клеток, распознающих эпитопы S-антигена SARS-CoV-2, дендритные клетки трансдуцировали Ad5-S или Ad5-S∆N, или нагружали рекомбинантным RBD-фрагментом S-белка SARS-CoV-2. Для анализа Т-клеток, распознающих антигены аденовирусного вектора, дендритные клетки трансдуцировали аденовирусным вектором Ad5-0 без целевой вставки. При трансдукции дендритных клеток одним из трех использованных Ad-векторов использовалась концентрация 100 БОЕ Ad-вектора в расчете на 1 дендритную клетку. В отдельных экспериментах сравнивали две концентрации Ad5-S - 30 и 100 БОЕ в расчете на 1 дендритную клетку.

В лунки планшета для ELISPOT (BD TM ELISPOT Mouse IFN-γ, кат. 551083, BD Bioscience, США) помещали 70 тыс. мононуклеаров или 30 тыс. CD4-Т-клеток, или 30 тыс. CD8-Т-клеток, выделенных из селезенки мыши и очищенных с помощью проточного сортировщика BD FACS Aria II. В те же лунки планшета в качестве антиген-презентирующих клеток вносили 50 тыс. дендритных клеток. Совместные культуры Т-клеток и дендритных клеток инкубировали в течение 36 ч при 37 °C и 5 % CO₂, после чего выявляли клетки, секретирующие ИФН-γ, в соответствии с инструкцией производителя ELISPOT. Фотографии каждой лунки делали с помощью микроскопа Levenhuk DTX 700 LCD (Levenhuk, США), количество спотов определяли с помощью компьютерной программы ImageJ (NIH, США). Количество ИФН-γ-секретирующих антиген-реактивных Т-клеток представляли в расчете на 1 млн CD4- или CD8-Т-клеток.

Число антиген-реактивных Т-клеток памяти определяли по секреции ИФН-γ после реактивации in vitro соответствующим антигеном. Число Т-клеток-эффекторов определяли по секреции ИФН-γ в культурах без рестимуляции антигеном.

Статистическая обработка. Статистический анализ данных выполняли с использованием программного обеспечения Graph-Pad Prism 9.0 (GraphPad Software Inc., США). Для оценки достоверности различий между двумя независимыми выборками использовали U-критерий Манна-Уитни. Для анализа различия между двумя связанными выборками применяли критерий Вилкоксона. Для анализа трех связанных групп использовали метод Фридмана. Различия между выборками при значениях p < 0,05 считались достоверными. На графиках представлены медианы, а также 25-й и 75-й процентили. В табл. 1 и на рис. 9 представлены средние значения и стандартное отклонение.

Результаты

Иммунизация мышей C57BL/6 вектором Ad5-S индуцирует мощный адаптивный Т-клеточный иммунный ответ

Принципиальная схема экспериментов представлена на рис. 1. Мышей C57BL/6 однократно иммунизировали рекомбинантным вектором Ad5-S. Через 2 и 3 мес в селезенках иммунизированных мышей определяли содержание Т-клеток, специфически реагирующих секрецией ИФН-γ на антигены аденовируса или закодированного в векторе S-белка SARS-CoV-2. Индивидуальные ИФН-γ-секретирующие клетки выявляли методом ELISPOT. В различных вариантах этого метода в популяциях мононуклеаров селезенки или очищенных сортировкой CD4- и CD8-T-клеток селезенки мы анализировали содержание клеток, секретирующих ИФН-γ. Уровни Т-клеточной реакции на вакцину сравнивали с фоновым уровнем ИФН-γ-секретирующих клеток в селезенке контрольных мышей, получавших ложную иммунизацию - введение соответствующего объема буферного раствора.

На рис. 2 и в табл. 1 представлены результаты репрезентативного эксперимента, демонстрирующие иммунный ответ мышей C57BL/6 на вакцинацию вектором Ad5-S. В селезенках иммунизированных мышей накапливалось >5000 ИФН-γ-секретирующих клеток в расчете на 1 млн мононуклеарных клеток. Количество ИФН-γ-секретирующих клеток в расчете на селезенку достигало 150-200 тыс., что доказывает высокий уровень иммунной реакции в ответ на иммунизацию.

Имея два вектора Ad5-S и Ad5-S∆N, которые кодируют две различные структуры S-белка SARS-CoV-2, мы могли трансдуцировать антиген-презентирующие дендритные клетки каждым из этих векторов, чтобы сравнить две версии S-антигена. Принципиальное различие между ними состояло в том, что полноразмерный S-белок, синтезирующийся при трансдукции Ad5-S, проникает с помощью лидирующего N-концевого пептида в эндоплазматический ретикулум. Напротив, лишенный N-концевого пептида S-белок, закодированный в Ad5-S∆N, не способен проникать в эндоплазматический ретикулум и остается в цитозоле, что оптимально для последующего процессинга через протеасому и презентации пептидных фрагментов белка в контексте MHC класса I. Сравнение количества клеток, секретирующих ИФН-γ при реактивации дендритными клетками, трансдуцированными Ad5-S или Ad5-S∆N, показало небольшое преимущество Ad5-S∆N, но оно не было статистически достоверным (табл. 1, рис. 2).

При трансдукции антиген-презентирующих дендритных клеток аденовирусным вектором Ad5-0 без целевой вставки мы имеем возможность представлять на поверхности дендритной клетки пептидные фрагменты белковых антигенов аденовируса. При этом наиболее вероятным является представление антигенных пептидов аденовируса в контексте MHC класса II, поскольку вектор Ad5-0 - это нереплицирующийся рекомбинантный вирус и, следовательно, белки аденовируса не могут синтезироваться de novo в дендритной клетке. Они должны процессироваться по пути, типичному для процессинга и презентации эндоцитированных антигенов, для которых характерна экспрессия на поверхности антиген-презентирующей клетки в комплексе с MHC класса II.

Результаты, представленные на рис. 2 и в табл. 1, свидетельствуют, что после иммунизации мышей C57BL/6 аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-антиген SARS-CoV-2, в селезенке мышей накапливались не только клетки, секретирующие ИФН-γ в ответ на реактивацию in vitro S-антигеном (в виде Ad5-S или Ad5-S∆N), но и клетки, секретирующие ИФН-γ в ответ на реактивацию in vitro антигенами аденовируса (в виде Ad5-0). Так, реактивация дендритными клетками, трансдуцированными аденовирусным вектором Ad5-0 без какой-либо целевой вставки, выявляла более 6000 ИФН-γ-секретирующих клеток в расчете на 1 млн мононуклеаров селезенки, что было вполне сравнимо с уровнем иммунной реакции в ответ на целевой S-антиген. Иными словами, иммунизация аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-антиген коронавируса, вызывает иммунные реакции против целевого S-антигена, а также антигенов самого аденовирусного вектора. Эти две разнонаправленные иммунные реакции равны по своей интенсивности.

Исследуя методом ELISPOT неразделенные клетки селезенки или фракцию мононуклеаров, невозможно определить природу клеток, реагирующих секрецией ИФН-γ на реактивацию in vitro дендритными клетками, которые представляют на своей поверхности аденовирусные или коронавирусные антигенные пептиды, или те и другие одновременно. Для идентификации природы реагирующих клеток мы изучили реакции CD4- и CD8-Т-клеток, очищенных сортировкой из селезенки иммунизированных или контрольных мышей.

CD8-Т-клетки, специфично реагирующие на целевой S-антиген и на антигены аденовирусного вектора

CD8-Т-клетки распознают чужеродные антигенные пептиды в контексте MHC класса I. Антигенные пептиды белков, de novo синтезирующихся в дендритной клетке, ассоциируются с MHC класса I и такой комплекс пригоден для распознавания рецепторами CD8-Т-клеток [9]. Имея в виду эти классические знания, мы нагружали дендритные клетки векторами, кодирующими S-антиген (Ad5-S или Ad5-S∆N), или вектором Ad5-0 без экспрессионной кассеты с целевой вставкой. В последнем случае не должно было происходить презентации каких-либо чужеродных антигенных пептидов в комплексе с MHC класса I, поскольку вектор Ad5-0 не индуцирует de novo синтеза каких-либо вирусных белков. В литературе имеются сообщения о так называемой кросс-презентации, когда классический путь презентации антигена нарушается и эндоцитированные белки, точнее их пептидные фрагменты, представляются в контексте MHC класса I. По этой причине мы проверили, не происходит ли кросс-презентации белков рекомбинантного аденовируса, что можно было бы увидеть по реактивации CD8-Т-клеток в контакте с дендритными клетками, нагруженными Ad5-0.

В наших экспериментах при культивировании CD8-T-клеток, выделенных сортировкой из селезенки иммунизированных Ad5-S мышей, совместно с антиген-презентирующими дендритными клетками, трансдуцированными Ad5-S, или Ad5-S∆N, или Ad5-0, мы оценивали количество CD8-T-клеток, реагирующих на закодированный в указанных векторах S-антиген SARS-CoV-2 или на собственные антигены аденовирусного вектора.

Результаты исследования представлены на рис. 3 и 4. Они позволяют точно определить антигенную специфичность CD8-T-клеток памяти, сформировавшихся в организме мыши через 2 или 3 мес после иммунизации рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-белок SARS-CoV-2. В среднем в селезенке мышей, иммунизированных Ad5-S, накапливалось более 10 тыс. CD8-T-клеток, специфично распознающих целевой S-антиген коронавируса (в расчете на 1 млн CD8-T-клеток селезенки). Следовательно, иммунный ответ мышей C57BL/6 на иммунизацию вектором Ad5-S был так силен, что число CD8-T-клеток памяти, специфично распознающих целевой S-антиген, составило > 1 % от всех CD8-T-клеток.

Известно, что только самые большие клонотипы Т-клеток памяти, специфичные к какому-либо антигену, достигают размеров > 1 % относительно всей популяции Т-клеток.

Через 2 и 3 мес после иммунизации Ad5-S содержание в селезенке иммунизированных мышей CD8-T-клеток памяти, реагирующих на антигены аденовируса (реактивация вектором Ad5-0), было в несколько раз ниже, чем содержание антиген-реактивных CD8-T-клеток, реагирующих на целевой S-антиген SARS-CoV-2 (реактивация векторами Ad5-S или Ad5-S∆N) (рис. 3 и 4). Следовательно, кросс-презентация собственных белков аденовирусного вектора в какой-то мере происходила, что обеспечивало представление антигенных пептидов аденовируса в контексте MHC класса I и позволяло CD8-T-клеткам распознавать и реагировать на антигены рекомбинантного аденовирусного вектора, несмотря на отсутствие синтеза de novo белков аденовируса в антиген-презентирующих дендритных клетках.

Сравнение через 2 и 3 мес после иммунизации количества CD8-Т-клеток памяти, реагирующих секрецией ИФН-γ на S-антиген или на антигены аденовируса, не выявило достоверных различий в эти два срока иммунной реакции мышей C57BL/6 на иммунизацию Ad5-S (рис. 5). Это означает, что уже через 2 мес после иммунизации завершилась экспоненциальная (пролиферативная) фаза иммунной реакции и произошла контракция размножившейся популяции Т-клеток с формированием пула долгоживущих CD8-Т-клеток памяти. Количество CD8-Т-клеток-эффекторов в селезенке мышей через 2 и 3 мес после иммунизации Ad5-S было на порядок меньше количества CD8-T-клеток памяти, что тоже свидетельствовало о завершении эффекторной фазы иммунной реакции и наступлении фазы долговременной иммунной памяти (рис. 6).

CD4-Т-клетки, специфично реагирующие на целевой S-антиген и на антигены аденовирусного вектора

Исследование антигенной специфичности очищенной популяции CD4-T-клеток, выделенных сортировкой из селезенки мышей, иммунизированных Ad5-S, показало, что практически все CD4-Т-клетки памяти реагируют на антигены аденовирусного вектора. CD4-T-клеток, специфичных к S-белку коронавируса, либо было очень мало, либо они вообще отсутствовали в селезенке мышей, иммунизированных Ad5-S (рис. 7, 8). При реактивации дендритными клетками, нагруженными Ad5-0, количество CD4-T-клеток, секретирующих ИФН-γ, было таким же, как и при реактивации дендритными клетками, нагруженными Ad5-S или Ad5-S∆N. Эти данные указывают на то, что практически все антиген-реактивные CD4-T-клетки памяти распознают антигены аденовирусного вектора, а не целевой S-антиген. С таким заключением согласуется и отсутствие реакции CD4-T-клеток из селезенки мышей, иммунизированных Ad5-S, на реактивацию in vitro дендритными клетками, нагруженными рекомбинантным RBD-фрагментом S-белка коронавируса (рис. 8, нижняя панель).

Возможности усиления Т-клеточного ответа путем повышения дозы вектора Ad5-S и/или использования молекулярного адъюванта

В предшествующих разделах статьи мы представили данные о том, что иммунизация Ad5-S индуцирует интенсивную реакцию CD8-Т-клеток, специфически реагирующих на целевой S-белок коронавируса. Одновременно вакцина вызывает интенсивный ответ CD4-T-клеток, специфичных к антигенам аденовирусного вектора, но не вызывает желаемого ответа CD4-T-клеток на целевой S-антиген.

Интенсивность слабых иммунных реакций можно повысить. Для этого имеются различные методы. Один из простых способов - увеличить дозу иммуногена. Другой метод - использовать усилитель иммунных реакций, молекулярный адъювант, действующий на уровне антиген-презентирующих клеток. В данной работе мы испытали оба указанных метода для усиления ответа T-клеток, специфичных к S-антигену SARS-CoV-2. Результаты представлены на рис. 9-11.

Повышение дозы иммуногена действительно может существенно повысить ответ Т-клеток, распознающих данный антиген на поверхности антиген-презентирующих дендритных клеток (рис. 9А). При увеличении дозы Ad5-S с 30 до 100 БОЕ (в расчете на 1 дендритную клетку), количество CD8-Т-клеток, реагирующих на S-антиген, повысилось приблизительно в 2 раза. Еще большего усиления удалось добиться при активации антиген-презентирующих клеток с помощью молекулярного адъюванта. В данном случае мы использовали агонист TLR4, кислый пептидогликан с молекулярной массой более 2 млн Да (Авексима, Россия) (рис. 9Б, 10). При дозе 30 БОЕ Ad5-S стимуляция дендритных клеток агонистом TLR4 увеличивала количество реагирующих CD8-T-клеток примерно в 6 раз, а при дозе 100 БОЕ Ad5-S Т-клеточный ответ усиливался в 4 раза (см. рис. 9, 10).

Примечательно, что использование того же молекулярного адъюванта, агониста TLR4, не позволило достоверно усилить исчезающе слабый ответ CD4-T-клеток на RBD (см. рис. 11). Под влиянием агониста TLR4 в реакции ELISPOT проявились единичные ИФН-γ-секретирующие CD4-T-клетки, но их число оставалось слишком малым, чтобы считать это достоверной иммунной реакцией Т-клеток на RBD-антиген.

Обсуждение

В данной работе мы провели подробное исследование интенсивности и антигенной специфичности иммунных реакций CD8- и CD4-Т-клеток, индуцированных в организме мыши рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим S-белок SARS-CoV-2. Иммунизация таким аденовирусным вектором, в принципе, имеет потенциал для индукции иммунных реакций, направленных против антигенов двух совершенно различных вирусов - коронавируса и аденовируса. На рис. 12 представлены мажорные антигены аденовируса и их количество в расчете на каждую аденовирусную частицу. При иммунизации человека дозой 10¹¹ частиц аденовирусного вектора общая масса только мажорных вирусных белков составляет ~ 75 мкг. Этой дозы вполне достаточно для индукции иммунных реакций против антигенов аденовируса. На самом деле хорошо известно, что при иммунизации подобными рекомбинантными векторами с целевой вставкой в организме вакцинируемых развиваются достаточно интенсивные реакции не только против целевого антигена, но и против антигенов самого вектора. Чтобы минимизировать влияние антител, специфичных к аденовирусному вектору, на эффективность иммунизации, вакцина "Спутник V" против коронавирусной инфекции COVID-19 составлена из двух компонентов на основе рекомбинантных аденовирусов человека 5-го и 26-го серотипов [2, 3].

Описанные в данной статье результаты исследования антигенной специфичности CD4- и CD8-Т-клеток доказывают, что вакцинный вектор Ad5-S индуцирует у мышей C57BL/6 сильные Т-клеточные иммунные реакции. Через 2 мес после иммунизации количество Т-клеток, распознающих целевой коронавирусный S-антиген, превысило 1 % от всех Т-клеток селезенки (см. рис. 3, 4). Такой большой размер популяции Т-клеток, реагирующих на один антиген, сравним с самыми крупными (hyper-expanded) клонотипами T-клеток, образующимися в организме мыши или человека в результате интенсивных реакций в ответ на инфекции или вакцинацию.

Интенсивная Т-клеточная реакция имела системный характер, поскольку вакцина вводилась интраназально, а указанное большое количество CD8-T-клеток, специфичных к S-антигену, мы регистрировали в селезенке мышей. Сравнение количества специфичных к S-антигену CD8-T-клеток памяти через 2 и 3 мес после иммунизации доказывает, что пролиферативная и эффекторная фазы иммунной реакции завершились уже через 2 мес. К этому времени произошло образование устойчивого пула долгоживущих Т-клеток памяти. Через 2 мес после иммунизации вектором Ad5-S 9 из 10 CD8-Т-клеток, специфичных к S-антигену, находились в фазе долгоживущих клеток памяти, и лишь 1 из 10 клеток имела свойства Т-клеток-эффекторов (см. рис. 5, 6).

CD8-T-клетки памяти, специфически реагирующие на антигены аденовирусного вектора, тоже обнаруживались в достаточно большом количестве в селезенке мышей через 2-3 мес после иммунизации Ad5-S. И хотя количество этих клеток было в несколько раз меньше, чем количество CD8-T-клеток памяти, специфично реагирующих на целевой S-антиген коронавируса, полученные результаты свидетельствуют о кросс-презентации антигенов рекомбинантного аденовирусного вектора.

Интенсивность реакции CD4-T-клеток на вакцинацию вектором Ad5-S была так же высока, как интенсивность реакции CD8-T-клеток. Однако подавляющее большинство CD4-T-клеток памяти в селезенке мышей через 2-3 мес после иммунизации Ad5-S было специфично к антигенам аденовирусного вектора, а не к целевому S-антигену, закодированному в этом векторе (см. рис. 7, 8).

Мы показали, что интенсивную реакцию CD8-T-клеток, специфичных к S-антигену, можно дополнительно усилить путем увеличения дозы аденовирусного вектора (см. рис. 9) и/или с помощью агониста TLR4 (см. рис. 10), стимулирующего антиген-презентирующие клетки [11]. Исчезающе слабый ответ CD4-Т-клеток на S-антиген повысить с помощью TLR4-агониста не удалось (см. рис. 11).

Дефицитный ответ CD4-T-клеток, специфичных к S-антигену, вполне реально существенно повысить. Для этого достаточно слегка модифицировать целевой ген S-белка в аденовирусном векторе Ad5-S. Вместо мембранной версии S-белка коронавируса или вместе с ней можно закодировать секреторную версию этого же S-белка. Секреторная форма S-белка будет секретироваться в среду вблизи дендритной клетки, в которой экспрессируется модифицированный таким образом вектор Ad5-S. Возникнет реальная возможность эндоцитоза секреторного S-белка, процессинга этого антигена по эндоцитозному пути и презентации пептидных фрагментов в контексте с MHC класса II. Такой вариант презентации фрагментов S-белка на поверхности антиген-презентирующей дендритной клетки индуцирует ответ CD4-Т-клеток, специфичных к эпитопам S-антигена. Дефицит S-специфичных хелперов будет устранен.

Хорошо известно, что помощь CD4-Т-клеток необходима на начальной стадии первичной реакции CD8-T-клеток, в эффекторной фазе и при формировании долговременной CD8-T-клеточной памяти, а также при индукции вторичной реакции CD8-T-клеток [12-16]. Наше исследование показало, что после иммунизации Ad5-S интенсивная CD8-T-клеточная реакция на S-антиген с формированием большого количества CD8-T-клеток памяти происходила в отсутствие ответа CD4-Т-клеток, специфичных к S-антигену. Одновременно происходил сильный CD4-T-клеточный ответ на антигены аденовирусного вектора. Эти данные позволяют предположить, что в процессе своего реагирования на S-антиген CD8-Т-клетки получали помощь от многочисленных CD4-Т-клеток, специфичных к антигенам аденовирусного вектора. Такое вполне возможно, если вспомнить, что аденовирусный вектор Ad5-S несет в себе обе коллекции антигенных пептидов - коронавирусного S-белка и аденовирусных белков капсида. Когда векторные частицы Ad5-S трансдуцируют дендритную клетку, возникает мозаичная презентация разных по своей природе антигенов на поверхности одной и той же антиген-презентирующей клетки. Антигенные пептиды S-белка экспонируются в комплексе с MHC класса I, а пептиды белков аденовирусного вектора экспонируются на поверхности этой же дендритной клетки в комплексе с MHC класса II (рис. 13). CD8-Т-клетки распознают и реагируют на пептиды S-белка в комплексе с MHC класса I, а CD4-Т-клетки распознают и реагируют на антигенные пептиды аденовирусных белков в комплексе с MHC класса II (рис. 13А). Находясь в непосредственной близости друг от друга на поверхности одной и той же антиген-презентирующей клетки, CD4- и CD8-Т-клетки вполне могут взаимодействовать. В частности, CD4-Т-клетки могут способствовать активации, пролиферации и дифференцировке соседствующих с ними CD8-Т-клеток с помощью ИЛ-2, ФНОα, ИФН-γ и других секретируемых цитокинов (рис. 13Б). Такое взаимодействие CD4- и CD8-Т-клеток никак не будет зависеть от происхождения антигенных пептидов (коронавирусные или аденовирусные), которые распознают эти две Т-клетки. Важно пространственное соседство CD4- и CD8-Т-клеток на одной антиген-презентирующей клетке, а также активное состояние обеих клеток, т. е. наличие необходимых для активации этих Т-клеток сигналов на поверхности дендритной клетки.

Описанный выше механизм взаимодействия CD4- и CD8-Т-клеток на поверхности антиген-презентирующей клетки - это гипотеза, подлежащая экспериментальной проверке. В литературе имеются сообщения о кооперации CD4- и CD8-Т-клеток, специфичных к одному и тому же антигену, при их контакте с антиген-презентирующей дендритной клеткой [17]. Новизна нашей гипотезы в том, что мы предполагаем наличие взаимодействия CD4- и CD8-Т-клеток, специфичных к двум разным антигенам, при условии, что пептидные фрагменты этих антигенов экспонируются на поверхности одной и той же антиген-презентирующей клетки. Такое условие в полной мере соблюдается, когда антиген-презентирующие клетки трансдуцированы рекомбинантным вирусом со вставкой, кодирующей целевой антиген. Частный случай, когда выполняется это условие, мы рассмотрели в данной работе - это аденовирусный вектор, кодирующий коронавирусный S-антиген.

Выводы

1. Иммунизация мышей линии C57BL/6 рекомбинантным аденовирусным вектором Ad5-S, кодирующим полноразмерный S-белок SARS-CoV-2, вызывает интенсивные реакции CD4- и CD8-T-клеток, завершающиеся через 2 мес образованием массивной популяции долгоживущих антиген-реактивных Т-клеток памяти.

2. Большинство образующихся в результате иммунизации рекомбинантным вектором Ad5-S антиген-реактивных CD8-Т-клеток памяти специфично распознает и реагирует на антигенные эпитопы S-белка коронавируса. CD4-Т-клетки, индуцированные иммунизацией Ad5-S, распознают и реагируют на антигенные эпитопы аденовирусного вектора.

Литература

1. Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatulin A.I., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheblyakov D.V., Shmarov M.M., Tokarskaya E.A., Simakova Y.V., Egorova D.A., Scherbinin D.N., Tutykhina I.L., Lysenko A.A., Kostarnoy A.V., Gancheva P.G., Ozharovskaya T.A., Belugin B.V., Kolobukhina L.V., Pantyukhov V.B., Syromyatnikova S.I., Shatokhina I.V., Sizikova T.V., Rumyantseva I.G., Andrus A.F., Boyarskaya N.V., Voytyuk A.N., Babira V.F., Volchikhina S.V., Kutaev D.A., Bel’skih A.N., Zhdanov K.V., Zakharenko S.M., Borisevich S.V., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and immunogenicity of GamEvac-Combi, a heterologous VSV- and Ad5-vectored Ebola vaccine: An open phase I/II trial in healthy adults in Russia. Hum Vaccin Immunother. 2017; 13 (3): 613-20. DOI: https://doi.org/10.1080/21645515.2016.1238535 PMID: 28152326

2. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Zubkova O.V., Tukhvatullin A.I., Shcheblyakov D.V., Dzharullaeva A.S., Grousova D.M., Erokhova A.S., Kovyrshina A.V., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovskaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokarskaya E.A., Lubenets N.L., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Morozova L.F., Smolyarchuk E.A., Kryukov E.V., Babira V.F., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and immunogenicity of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine in two formulations: two open, non-randomised phase 1/2 studies from Russia. Lancet. 2020; 396 (10255): 887-97. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31866-3

3. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukhvatulin A.I., Zubkova O.V., Dzharullaeva A.S., Kovyrshina A.V., Lubenets N.L., Grousova D.M., Erokhova A.S., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovskaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokarskaya E.A., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Gushchin V.A., Smolyarchuk E.A., Zyryanov S.K., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Gam-COVID-Vac Vaccine Trial Group. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet. 2021; 397 (10275): 671-81. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)00234-8

4. Zhu F.C., Li Y.H., Guan X.H., Hou L.H., Wang W.J., Li J.X., Wu S.P., Wang B.S., Wang Z., Wang L., Jia S.Y., Jiang H.D., Wang L., Jiang T., Hu Y., Gou J.B., Xu S.B., Xu J.J., Wang X.W., Wang W., Chen W. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 2020; 395 (10240): 1845-54. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31208-3

5. Solforosi L., Kuipers H., Jongeneelen M., Rosendahl Huber S.K., van der Lubbe J.E.M., Dekking L., Czapska-Casey D.N., Izquierdo Gil A., Baert M.R.M., Drijver J., Vaneman J., van Huizen E., Choi Y., Vreugdenhil J., Kroos S., de Wilde A.H., Kourkouta E., Custers J., van der Vlugt R., Veldman D., Huizingh J., Kaszas K., Dalebout T.J., Myeni S.K., Kikkert M., Snijder E.J., Barouch D.H., Böszörményi K.P., Stammes M.A., Kondova I., Verschoor E.J., Verstrepen B.E., Koopman G., Mooij P., Bogers W.M.J.M., van Heerden M., Muchene L., Tolboom J.T.B.M., Roozendaal R., Brandenburg B., Schuitemaker H., Wegmann F., Zahn R.C. Immunogenicity and efficacy of one and two doses of Ad26.COV2.S COVID vaccine in adult and aged NHP. J Exp Med. 2021; 218 (7): e20202756. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.20202756

6. ChAdOx1-S vaccine for prevention of COVID-19. Aust Prescr. 2021; 44 (2): 59-61. DOI: https://doi.org/10.18773/austprescr.2021.012

7. Online database of Clinical trials. URL: https://www.clinicaltrials.gov/study/NCT01006798?cond=%20Influenza%20Vaccines&page=4&limit=100&rank=371

8. Online database of Clinical trials. URL: https://www.clinicaltrials.gov/study/NCT05817422?cond=adenovirus%20vectored%20vaccine%20&limit=100&rank=5

9. Kedzierska K., Koutsakos M. The ABC of major histocompatibility complexes and T cell receptors in health and disease. Viral Immunol. 2020; 33 (3): 160-78. DOI: https://doi.org/10.1089/vim.2019.0184

10. Шмаров М.М., Седова Е.С., Верховская Л.В., Руднева И.А., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Лысенко А.А., Тутыхина И.Л., Логунов Д.Ю., Смирнов Ю.А., Народицкий, Б.С., Гинцбург А.Л. Индукция протективного гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа при иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами, экспрессирующими гемагглютинин вируса гриппа H5. Acta Naturae. 2010; 2 (1): 111-18.

11. Lebedeva E., Bagaev A., Pichugin A., Chulkina M., Lysenko A., Tutykhina I., Shmarov M., Logunov D., Naroditsky B., Ataullakhanov R. The differences in immunoadjuvant mechanisms of TLR3 and TLR4 agonists on the level of antigen-presenting cells during immunization with recombinant adenovirus vector. BMC Immunol. 2018; 19 (1): 26. DOI: https://doi.org/10.1186/s12865-018-0264-x

12. Janssen E.M., Lemmens E.E., Wolfe T., Christen U., von Herrath M.G., Schoenberger S.P. CD4⁺ T cells are required for secondary expansion and memory in CD8⁺ T lymphocytes. Nature. 2003; 421 (6925): 852-56. DOI: https://doi.org/10.1038/nature01441

13. Sun J.C., Bevan M.J. Defective CD8 T cell memory following acute infection without CD4 T cell help. Science. 2003; 300 (5617): 339-42. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1083317

14. Shedlock D.J., Shen H. Requirement for CD4 T cell help in generating functional CD8 T cell memory. Science. 2003; 300 (5617): 337-39. DOI: https://doi.org/10.1126/science.1082305

15. Novy P., Quigley M., Huang X., Yang Y. CD4 T cells are required for CD8 T cell survival during both primary and memory recall responses. J Immunol. 2007; 179 (12): 8243-51. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.179.12.8243

16. Phares T.W., Stohlman S.A., Hwang M., Min B., Hinton D.R., Bergmann C.C. CD4 T cells promote CD8 T cell immunity at the priming and effector site during viral encephalitis. J Virol. 2012; 86 (5): 2416-27. DOI: https://doi.org/10.1128/JVI.06797-11

17. Gressier E., Schulte-Schrepping J., Petrov L., Brumhard S., Stubbemann P., Hiller A., Obermayer B., Spitzer J., Kostevc T., Whitney P.G., Bachem A., Odainic A., van de Sandt C., Nguyen T.H.O., Ashhurst T., Wilson K., Oates C.V.L., Gearing L.J., Meischel T., Hochheiser K., Greyer M., Clarke M., Kreutzenbeck M., Gabriel S.S., Kastenmüller W., Kurts C., Londrigan S.L., Kallies A., Kedzierska K., Hertzog P.J., Latz E., Chen Y.E., Radford K.J., Chopin M., Schroeder J., Kurth F., Gebhardt T., Sander L.E., Sawitzki B., Schultze J.L., Schmidt S.V., Bedoui S. CD4⁺ T cell calibration of antigen-presenting cells optimizes antiviral CD8⁺ T cell immunity. Nat Immunol. 2023; 24 (6): 979-90. DOI: https://doi.org/10.1038/s41590-023-01517-x

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)