Синтетические молекулы миРНК подавляют экспрессию генов Il4 и Il13 и уменьшают аллергическое воспаление и ремоделирование верхних дыхательных путей в модели на мышах

• Шиловский Игорь Петрович
• Тимотиевич Екатерина Драгановна
• Каганова Мария Михайловна
• Ковчина Валерия Ивановна
• Юмашев Кирилл Валерьевич
• Никольский Александр Аркадьевич
• Вишнякова Людмила Ивановна
• Сундукова Мария Сергеевна
• Тюлюбаев Вадлен Вадимович
• Брылина Вера Евгеньевна
• Русак Татьяна Евгеньевна
• Курбачева Оксана Михайловна
• Дынева Мирамгуль Есенгельдыевна
• Петухова Ольга Андреевна
• Гудима Георгий Олегович
• Кудлай Дмитрий Анатольевич
• Хаитов Муса Рахимович

Резюме

Введение. Воспаление верхних дыхательных путей развивается при таких патологиях, как аллергический ринит (АР), полипозный риносинусит (ПРС) и прочих. АР - одно из самых распространенных воспалительных заболеваний. Его патогенез включает увеличение продукции аллерген-специфических IgE-антител, инфильтрацию слизистой оболочки носовой полости воспалительными клетками и ремоделирование респираторного тракта. Показано, что при этой патологии ключевую роль играют Th2-цитокины (ИЛ-4 и ИЛ-13), что делает их многообещающими мишенями для терапии. Несколько препаратов на основе моноклональных антител против указанных цитокинов продемонстрировали клиническую эффективность, но их применение ограничено высокой стоимостью. В настоящее время появляются новые технологии регуляции экспрессии генов. Например, при помощи молекул малых интерферирующих РНК (миРНК) можно подавить экспрессию генов, кодирующих провоспалительные цитокины.

Цель работы - создание молекул миРНК, подавляющих экспрессию генов Il4 и Il13, а также исследование их биологического эффекта на модели воспаления верхних дыхательных путей у мышей.

Материал и методы. Проектирование молекул миРНК осуществляли с использованием специализированного программного обеспечения. Скрининг биологической активности миРНК проводили в экспериментах in vitro. Продукцию ИЛ-4 и ИЛ-13 оценивали с помощью иммуноферментного анализа (ИФА), а экспрессию соответствующих генов - с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Индукцию воспаления верхних дыхательных путей у мышей осуществляли путем подкожного и интраназального введения аллергена - овальбумина куриного яйца (OVA). Экспериментальную терапию осуществляли путем интраназального введения молекул миРНК в комплексе с пептидом-носителем LTP. В качестве положительного контроля использовался кортикостероидный препарат будесонид. В ходе эксперимента у животных определяли назальную гиперреактивность. Уровень аллерген-специфических IgE-, IgG1- и IgG2a-антител в сыворотках крови, а также уровни продукции цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13 клетками подчелюстных лимфоузлов определяли при помощи ИФА. Инфильтрацию слизистой оболочки носовой полости провоспалительными клетками оценивали гистологическими методами.

Результаты. Интраназальное введение миРНК против генов, кодирующих ИЛ-4 и ИЛ-13, снижало продукцию этих цитокинов в локальных (подчелюстных) лимфатических узлах. Подавление продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 приводило к снижению уровней аллерген-специфических IgE- и IgG1-антител в сыворотке крови мышей и назальной гиперреактивности, а также к уменьшению воспаления и ремоделирования верхних дыхательных путей.

Заключение. Экспериментальная терапия молекулами миРНК, подавляющими продукцию провоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13, заметно облегчала симптомы аллергического воспаления верхних дыхательных путей. Синтетические миРНК обладают значительным потенциалом в терапии воспалительных заболеваний.

Ключевые слова:аллергия; аллергический ринит; воспаление; цитокины; миРНК; пептид

Введение

Воспаление верхних дыхательных путей развивается при таких патологиях, как аллергический ринит (АР), полипозный риносинусит (ПРС) и прочих. При этом АР является едва ли не самым распространенным воспалительным заболеванием верхних дыхательных путей [1]. В мире наблюдается неуклонный рост распространенности АР. На сегодняшний день от этого заболевания страдает ~ 40 % населения [2]. Высокая заболеваемость АР регистрируется преимущественно в экономически развитых регионах и достигает 22-30 % населения Западной Европы и 12-30 % населения США [3]. Согласно данным эпидемиологических исследований, в Российской Федерации АР страдает не менее 25 % населения [1].

АР существенно ухудшает качество жизни человека, влияя на сон, социальную жизнь, продуктивность, обучаемость и эмоциональное состояние. Кроме того, отсутствие должного контроля АР способствует формированию более тяжелой, инвалидизирующей патологии - бронхиальной астмы (БА) [4]. Затраты на борьбу с АР постоянно растут, они превышают даже расходы, связанные с лечением диабета и ишемической болезни сердца [5]. По последним оценкам, прямые и непрямые затраты, связанные с АР, в США оцениваются от 2 до 5 млрд долларов ежегодно [6].

Существующая фармакотерапия АР включает применение интраназальных кортикостероидов, антигистаминных и антилейкотриеновых препаратов. Все они облегчают симптомы заболевания, но не способны влиять на его патогенез [5]. Аллерген-специфическая иммунотерапия (АСИТ) считается единственным патогенетическим способом лечения аллергии, в том числе АР [7], однако она тоже имеет свои ограничения в контексте безопасности [8]. В связи с продолжающимся ростом заболеваемости АР необходима разработка новых способов лечения этого воспалительного заболевания, а для этого требуется детальное изучение молекулярных и клеточных механизмов его патогенеза.

Согласно современным представлениям, патогенез АР включает увеличение продукции аллерген-специфических IgE-антител в сыворотке крови, инфильтрацию слизистой оболочки носовой полости воспалительными клетками (прежде всего эозинофилами) и ремоделирование респираторного тракта, которое характеризуется утолщением эпителия и гиперсекрецией им слизи [9]. Многими исследованиями доказано, что ключевую роль в патогенезе АР играют Th2-цитокины, прежде всего ИЛ-4 и ИЛ-13 [10, 11]. Именно благодаря этим провоспалительным цитокинам формируются основные проявления болезни.

Раскрытие патогенетической роли этих цитокинов способствовало появлению нового направления в разработке противовоспалительных лекарственных препаратов - антицитокиновой терапии. Для специфического подавления провоспалительных цитокинов и их рецепторов чаще всего используют препараты на основе моноклональных антител [12, 13]. В настоящее время для медицинского применения одобрен (в том числе в России) препарат дупилумаб (Dupilumab), который содержит терапевтическое моноклональное антитело против общей цепи рецептора для ИЛ-4 и ИЛ-13. Этот препарат продемонстрировал клиническую эффективность при лечении пациентов с БА (в том числе с сопутствующим АР) и атопическим дерматитом (АтД) [13]. Но использование подобных препаратов в широкой клинической практике ограничено их высокой стоимостью, что обусловливает необходимость разработки эффективных и доступных препаратов, способных супрессировать Th2-цитокины [14].

Использование РНК-интерференции (РНКи) - новый перспективный подход для создания препараторов, блокирующих активность цитокинов [15, 16]. Под РНКи понимается механизм негативной регуляции экспрессии гена молекулами малых интерферирующих РНК (миРНК) [16]. Одним из главных препятствий в создании подобных препаратов является сложность доставки миРНК к месту действия - в цитоплазму клеток. Для этого часто используют различные носители, например вирусы, полимеры, липосомы [17] или пептиды [18].

После того как были установлены гены, участвующие в патогенезе БА, ряд исследовательских групп начал работы по подавлению активности патогенетически значимых генов (прежде всего генов, кодирующих цитокины и транскрипционные факторы) при помощи РНКи [16]. В одной из своих работ C. Lee и соавт. продемонстрировали, что интратрахеальная инстилляция лентивирусных векторов, экспрессирующих короткую шпилечную РНК (кшРНК) против генов, кодирующих ИЛ-4 и ИЛ-13, уменьшает выраженность аллергического воспаления и гиперреактивность дыхательных путей в модели БА на мышах. Более того, они показали, что блокирование генов обоих цитокинов оказывает наибольший благоприятный эффект, что подтверждает необходимость подавлять оба гена одновременно [19]. Этот же коллектив авторов изучил эффекты подавления экспрессии гена, кодирующего транскрипционный фактор GATA-3, при помощи РНКи в модели БА на мышах. Известно, что GATA-3 необходим для дифференцировки наивных T-клеток в Тh2-клетки, продуцирующие ИЛ-4 и ИЛ-13, поэтому подавление продукции этого фактора приводило к существенному уменьшению аллергического воспаления и гиперреактивности дыхательных путей [20]. Однако стоит отметить, что в обеих этих работах [19, 20] молекулы миРНК доставляли при помощи вирусных векторов в виде кшРНК, что затрудняет внедрение данной разработки в медицинскую практику. Тем не менее эти эксперименты демонстрируют возможность использования РНКи для создания противовоспалительных препаратов, в том числе для лечения БА.

Y. Darcan-Nicolaisen и соавт. также продемонстрировали возможности РНКи подавлять проявления БА путем блокирования экспрессии гена, кодирующего транскрипционный фактор STAT6. Как и GATA-3, транскрипционный фактор STAT6 играет важную роль в дифференцировке наивных T-клеток в Th2-клетки и в активации продукции ими цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13. Авторы показали, что интратрахеальное введение миРНК против гена Stat6 существенно уменьшает выраженность проявлений патологии и продукцию Th2-цитокинов в модели БА на мышах [21]. Однако стоит отметить, что в данном исследовании молекулы миРНК вводились лабораторным животным без носителя, поэтому чтобы достичь значимого благоприятного эффекта исследователи водили большие дозы миРНК (100 мкг/мышь). Использование больших доз миРНК затратно, тем не менее эти исследования тоже демонстрируют возможности РНКи для создания противовоспалительных препаратов.

Нашей целью было создание молекул миРНК, подавляющих экспрессию генов Il4 и Il13, и исследование их биологического эффекта на модели воспаления верхних дыхательных путей у мышей.

Материал и методы

миРНК и плазмиды, кодирующие гены Il4 и Il13 мыши. миРНК против гена Il4, а также плазмиды, кодирующие гены Il4 и Il13, были сконструированы ранее и описаны в работах [22, 23].

Аллергены. В качестве модельного аллергена использовали овальбумин (ОVА) (Sigma, Grade V, США), содержащий не менее 99 % основного продукта. Молекулярная масса - 45кДа. Овальбумин растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS - phosphate-buffered saline) рН = 7,4 (ПанЭко, Россия).

Питательные среды и растворы. Полная среда RPMI 1640 (ПанЭко, Россия) содержала: 25 мМ HEPES (ПанЭко, Россия), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (Gibco, США), 300 мг/л L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США). Бессывороточная среда RPMI 1640 содержала 25 мМ HEPES (ПанЭко, Россия), 300 мг/л L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США). Полная среда DMEM (ПанЭко, Россия) содержала: 25 мМ HEPES (ПанЭко, Россия), 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США), 300 мг/л L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США). Бессывороточная среда DMEM содержала 25 мМ HEPES (ПанЭко, Россия), 300 мг/л L-глутамина (ПанЭко, Россия) и 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США).

Лизирующий буфер готовили путем растворения в 100 мл дистиллированной воды 42,7 г гуанидин-тиоцианата (Biochemica, Германия). Данным буфером лизировали клетки для последующего выделения общей РНК и постановки полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ).

Декальцинирующий раствор готовили путем добавления 20 мл муравьиной кислоты (Химмед, Россия) и 10 мл 40 % формальдегида (Carl Roth GmbH, Германия) к 70 мл PBS (ПанЭко, Россия). Данный раствор использовали для размягчения костной ткани с целью последующего приготовления гистологических препаратов.

Лабораторные животные. В исследовании были использованы мыши-самки линии BALB/с возрастом 6-8 нед, весом 18-20 г, полученные из питомника лабораторных животных филиала ФГБУН "Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова" РАН (г. Пущино, Россия). Животных кормили стандартизованным кормом для грызунов (Дельта Фидс, Россия). Мышам был предоставлен неограниченный доступ к еде и воде. Животные содержались в системе индивидуально вентилируемых клеток Smart Flow (TECHIPLAST, Италия). Вся работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с принципами Директивы Европейского союза 2010/63/EU "Законодательство о защите животных, используемых в научных целях" и были одобрены локальным этическим комитетом (Протокол № 008 от 23.04.2018).

Котрансфекция плазмид и миРНК. Клеточную линию эмбриональной почки человека HEK293T (Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) культивировали в полной среде DMEM (ПанЭко, Россия). Для трансфекции экспрессионной плазмидой, несущей Il13 и миРНК, клетки высевали в 24-луночные культуральные планшеты в количестве 1 - 10⁵ клеток/лунку в полной среде DMEM и культивировали (37 °С, 5 % CO₂) в течение 24 ч. Клетки были котрансфецированы 0,5 мкг плазмиды (кодирующей ген Il13) и 1 мкг миРНК, с использованием Lipofectamine 2000 (Life Technologies, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Соотношение плазмида/миРНК выбрано на основе предыдущих экспериментов in vitro [23]. В качестве отрицательного контроля использовали миРНК против гена p респираторно-синцитиального вируса (siRSV). В качестве положительного контроля использовали миРНК против гена, кодирующего зеленый флуоресцирующий белок GFP (siGFP). Через 24 ч после котрансфекции собирали супернатанты клеток для оценки концентрации ИЛ-13 с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческого набора (eBioscience, США). Клетки лизировали для последующего выделения РНК и анализа уровня экспрессии гена Il13 с помощью количественной ПЦР, как описано ниже.

Изменение экспрессии мРНК генов. Уровень экспрессии мРНК гена Il13 оценивали методом ПЦР-РВ. Для этого из лизатов клеток HEK293T выделяли общую РНК с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, США) в соответствии с рекомендацией производителя. Полученную РНК использовали в реакции обратной транскрипции для синтеза библиотеки кДНК с применением набора реактивов "Реверта L" (AmpliSens, Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. ПЦР-РВ проводили с использованием набора реактивов "2,5× Реакционная смесь для проведения ПЦР-РВ" (Синтол, Россия), специфических праймеров и зонда (см. ниже) и амплификатора DTprime 5 (ДНК-технология, Россия). В качестве выравнивающего гена использовали Hprt мыши.

Последовательность праймеров и зонда для Il13: прямой - GTGCCAAGATCTGTGTCTCTC, обратный - TCCACACTCCATACCATGC, зонд - (ROX) CTGAGCAACATCACACAAGACCAGACTC (RTQ2).

Последовательность праймеров и зонда для Hprt: прямой - GCACTGAATAGAAATAGTGATAGATCC, обратный - CAGTTAAAGTTGAGAGATCATCTCC, зонд - (ROX) CAGACTGAAGAGCTACTGTAATGATCAGTCAAC (RTQ2).

Выделение клеток тимуса и их трансфекция. Мышей линии BALB/c выводили из эксперимента с помощью цервикальной дислокации, после чего в стерильных условиях с помощью ножниц и пинцета выделяли тимус. Его гомогенизировали в пробирке пестиком для получения суспензии клеток, которую просеивали через сито (диаметр пор 70 мкм, Corning, США), подсчитывали концентрацию клеток в камере Горяева.

Для трансфекции высевали клетки в 24-луночные культуральные планшеты по 400 мкл на лунку с концентрацией клеток 5 млн/мл в бессывороточной среде RPMI 1640. Для стимуляции в клетки добавляли ФГА (Sigma, США) до конечной концентрации 10 мкг/мл. После этого осуществляли трансфекцию комплексом, содержащим молекулы миРНК против генов Il4 и Il13 (siIL-4-13/LTP) и пептида LTP (в массовом соотношении 1/12,5) в конечных концентрациях 10, 20 и 40 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля осуществляли трансфекцию аналогичными концентрациями комплекса, содержащего неспецифические молекулы миРНК и пептида LTP (siGFP/LTP). Инкубировали клетки в течение 4 ч (37 °С и 5 % CO₂), затем добавляли 50 мкл ЭТС (Thermo Fisher Scientific, США), повторно трансфецировали клетки комплексами миРНК/LTP как описано выше. Клетки инкубировали 1 сут при 37 °С и 5 % СО₂ после чего осуществляли третью трансфекцию комплексами и инкубировали клетки еще 1 сут. Собирали супернатанты клеток для дальнейшего анализа концентрации ИЛ-4 и ИЛ-13 методом ИФА с использованием коммерческих наборов "Mouse IL-4 ELISA Set" и "Mouse IL-13 ELISA Set" (BD Biosciences, США).

Моделирование АР у мышей и тестирование миРНК in vivo. Мыши были разделены на 7 групп: "АР", "siGFP Д1", "siGFP Д2", "siIL-4-13 Д1", "siIL-4-13 Д2", "Буд" и "Норма" - по 10 особей в каждой (см. табл. 1).

В 1-ой группе ("АР") осуществляли индукцию АР как описано в статье [24]. Для этого мышей иммунизировали подкожно OVA в дозе 20 мкг в объеме 0,2 мл PBS в дни 0, 14 и 24. Далее через 12 дней после последней иммунизации осуществляли провокацию путем интраназального введения раствора OVA в концентрации 10 мг/мл в объеме 25 мкл/особь; одно введение в сутки в течение 8 дней подряд (в дни 36-43).

Во 2-ой группе ("siGFP Д1") аналогичным образом моделировали АР, при этом на фоне провокации аллергеном осуществляли экспериментальную терапию путем интраназального введения 25 мкл комплекса siGFP/LTP, содержащего миРНК против gfp и пептид LTP, в дозе 5 мкг/мышь.

В 3-ей группе ("siGFP Д2") моделировали АР, при этом на фоне провокации аллергеном осуществляли экспериментальную терапию комплексом siGFP/LTP в дозе 15 мкг/мышь.

В 4-ой группе "siIL-4-13 Д1" моделировали АР, при этом на фоне провокации аллергеном осуществляли экспериментальную терапию путем интраназального введения 25 мкл комплекса siIL-4-13/LTP, содержащего миРНК против генов Il4 и Il13 и пептид LTP, в дозе 5 мкг/мышь.

В 5-ой группе "siIL-4-13 Д2" моделировали АР, при этом на фоне провокации аллергеном осуществляли экспериментальную терапию комплексом siIL-4-13/LTP в дозе - 15 мкг/мышь.

В 6-ой группе "Буд" моделировали АР, при этом на фоне провокации аллергеном в качестве положительного контроля интраназально вводили глюкокортикостероид для местного применения (будесонид) в дозе 0,7 мкг/мышь.

Мышей 7-ой, контрольной группы ("Норма") манипуляциям не подвергали.

Экспериментальную терапию комплексами и будесонидом осуществляли в течение 8 дней (в дни 36-43) по 2 интраназальных введения в сутки за 30 мин до провокации OVA и через 1 ч после провокации (рис. 1).

Таким образом, у мышей с индуцированным АР осуществляли экспериментальную терапию путем интраназального введения комплекса siIL-4-13/LTP, содержащего миРНК против Il4 и Il13 и пептид LTP, в двух дозах - 5 и 15 мкг/мышь. В качестве отрицательного контроля группам "siGFP Д1" и "siGFP Д2" вводили аналогичные дозы комплекса siGFP/LTP, содержащего неспецифические молекулы миРНК против гена gfp.

После курса провокаций и экспериментальной терапии у мышей оценивали выраженность проявлений АР. В день 43 оценивали назальную гиперреактивность, через сутки после последней провокации (в день 44) осуществляли взятие подчелюстных лимфоузлов для определения продукции цитокинов, слизистой оболочки носа для гистологического анализа, а также периферической крови для получения сыворотки и ее последующего анализа на содержание иммуноглобулинов.

Измерение назальной гиперреактивности. На следующий день после последней провокации (день 44) у мышей измеряли назальную гиперреактивность, которая оценивалась как количество чиханий и почесываний носа в течение 5 мин после интраназального введения аллергена.

Оценка уровней аллерген-специфических антител IgE, IgG1 и IgG2a в сыворотке крови. После завершения провокации (в день 44) производили забор крови из ретроорбитального синуса мышей с последующим получением сыворотки центрифугированием (400 g, 15 мин, 20 ºС). Уровни ОVА-специфических IgE-, IgG1- и IgG2a-антител определяли с помощью ИФА с использованием коммерческих антител "Rat Anti-Mouse IgG2a", "Rat Anti-Mouse IgG1", "Rat Anti-Mouse IgE", "Biotin Rat Anti-Mouse IgG2a", "Biotin Rat Anti-Mouse IgG1 и "Biotin Rat Anti-Mouse IgE" (BD OptEIA™, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Изменение продукции цитокинов клетками регионарных лимфоузлов. Забор образцов подчелюстных лимфоузлов проводили через сутки после этапа провокации (день 44). Лимфоузлы гомогенизировали с получением суспензии клеток, которую засевали в 24-луночные планшеты в полной среде RPMI-1640 и активировали раствором OVA в конечной концентрации 100 мкг/мл. Супернатанты отбирали через 72 ч. Измерение концентрации цитокинов ИЛ-4, ИЛ-13 и ИФН-γ осуществляли с помощью коммерческих наборов для ИФА "Mouse IL-4 ELISA Set", "Mouse IL-13 ELISA Set" и "Mouse IFNγ ELISA Set" (BD OptEIA™, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Гистопатологическое исследование слизистой оболочки носовой полости. После выведения животных из эксперимента цервикальной дислокацей черепные коробки отделяли, очищали от мягких тканей и помещали в 10 % забуференный формалин (Carl Roth, Германия) не менее, чем на 3 сут. Затем их помещали в декальцинирующий раствор на 2-3 сут до размягчения костей черепа. Для приготовления микропрепаратов черепные коробки обезвоживали путем проводки по спиртам и заливали в парафин. Микротомированием парафиновых блоков получали срезы толщиной 4-6 мкм. Полученные препараты окрашивали гематоксилином и эозином или альциановым синим (BioOptica, Италия) для идентификации гистологических изменений. Гистологическое исследование микропрепаратов осуществляли на световом микроскопе (Carl Zeiss, Германия). Измерение толщины эпителия слизистой оболочки носовой полости мыши, площади инфильтратов, подсчет количества клеток, инфильтрирующих слизистую оболочку носовой полости, а также оценка доли бокаловидных клеток в респираторном эпителии осуществлялась с помощью микрофотографий соответствующих срезов и программы Altami Studio (OOO "Альтами", Россия).

Статистический анализ данных. Для всех количественных данных вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (m). Определяли межгрупповые различия с помощью непараметрического критерия Краскелла-Уоллиса с использованием программы Statistica 12.0 (StatSoft inc., США).

Результаты

Проектирование миРНК и оценка их активности in vitro

миРНК, нацеленные на гены Il4 и мыши, были разработаны в нашем предыдущем исследовании [23]. Наиболее значимое подавление экспрессии этого гена обеспечивал вариант siIL4-408. Для конструирования миРНК против гена Il13 мыши использовали программное обеспечение OligoWalk (Mathews group, США) [25]. Всего было спроектировано 47 различных вариантов миРНК. Пять из них (siIL13-95, siIL13-195, siIL13-230, siIL13-280 и siIL13-371) были выбраны для синтеза и оценки активности в экспериментах in vitro. Выбранные варианты соответствовали следующим критериям: 1) прогнозируемая активность не менее 0,75; 2) идентичность с другими генами мыши должна быть < 84 %, чтобы избежать "off-target"-эффектов (табл. 1). Для оценки способности миРНК подавлять целевой ген в экспериментах in vitro была сконструирована плазмида pUCHR-IL-13-IRES-GFP, содержащая гены Il13 мыши и репортерный ген, кодирующий зеленый флуоресцирующий белок GFP, под контролем CMV-промотора. В эту плазмиду между Il13 и GFP был встроен внутренний сайт посадки рибосом IRES. В результате транскрибируется одна бицистронная мРНК, кодирующая белки ИЛ-13 и GFP, что позволяет оценить экспрессию Il13 на уровне мРНК и белка в клетках млекопитающих.

Для тестирования клетки HEK293T индивидуально трансфецировали смесью pUCHR-IL-13-IRES-GFP и синтетических миРНК с использованием Lipofectamine 2000. миРНК против GFP, которая способна нацеливаться на всю бицистронную мРНК, использовали в качестве положительного контроля. Неспецифическую миРНК против гена p респираторно-синцитиального вируса (siRSV) использовали в качестве отрицательного контроля. Два варианта миРНК (siIL13-95, siIL13-195) значительно ингибировали экспрессию Il13 мыши, о чем свидетельствуют результаты ОТ-ПЦР и ИФА. Эти миРНК снижали уровень мРНК Il13 на 70 и 79 % соответственно (по сравнению с неспецифическим siRSV) (рис. 2А). Уровень белка ИЛ-13, секретируемого в среду из клеток HEK293T, измеренный с помощью ИФА, снижался на 75 и 62 % соответственно (см. рис. 2А). Несмотря на то что siIL13-95 и siIL13-195 продемонстрировали сходную активность, для будущих исследований in vivo был выбран вариант siIL13-195, так как он показал более стабильную воспроизводимость в серии экспериментов in vitro.

Комплекс молекул миРНК и пептида-носителя LTP подавляет экспрессию генов Il4 и Il13 в клетках 293T и клетках тимуса

Учитывая тот факт, что молекулы миРНК не способны самопроизвольно проникать к месту действия - в цитоплазму клеток, для их доставки использовали созданный ранее пептид LTP. Этот пептид способен доставлять миРНК в широкий спектр клеток млекопитающих, включая лимфоциты [26]. В результате был создан комплекс siIL-4-13/LTP, состоящий из молекул миРНК против генов Il4 и Il13 мыши (siIL4-408 и siIL13-195) и пептида LTP, в массовом соотношении 1/12,5. Далее мы изучили способность этого комплекса подавлять экспрессию генов Il4 и Il13 мыши в перевиваемой культуре клеток HEK293T. Для этого клетки трансфецировали плазмидами, кодирующими соответствующие гены (pUCHR-IL-4-IRES-GFP и pUCHR-IL-13-IRES-GFP), при помощи пептида LTP, и одновременно комплексом siIL-4-13/LTP в различных концентрациях. Затем мы оценивали продукцию ИЛ-4 и ИЛ-13 клетками с помощью ИФА. Максимальная продукция этих цитокинов выявлялась в отсутствии комплекса siIL-4-13/LTP (концентрация 0 мкг/мл). Концентрация ИЛ-4 достигала 53 ± 1,9 пг/мл, концентрация ИЛ-13 - 300 ± 13 пг/мл. Добавление к клеткам возрастающих концентраций комплекса siIL-4-13/LTP приводило к значительному снижению продукции секретируемых цитокинов. Происходило снижение продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 до 2 ± 0,9 и 28 ± 7 пг/мл, соответственно. Стоит отметить, что с увеличением концентрации комплекса siIL-4-13/LTP происходило более выраженное снижение продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 (рис. 2Б).

Поскольку основными продуцентами изучаемых цитокинов в организме являются Т-клетки, мы оценили способность комплекса siIL-4-13/LTP подавлять секрецию ИЛ-4 и ИЛ-13 тимоцитами мышей. Тимоциты были активированы ФГА и обработаны несколько раз различными концентрациями комплекса siIL-4-13/LTP. В результате мы наблюдали дозозазависимое снижение концентрации ИЛ-4 и ИЛ-13 в супернатантах клеток после обработки комплексом: с 233 до 107 пг/мл для ИЛ-4 и с 146 до 89 пг/мл для ИЛ-13 (рис. 2В).

Интраназальное введение комплекса siIL-4-13/LTP уменьшает продукцию ИЛ-4 и ИЛ-13 клетками лимфоузлов, уровень аллерген-специфических IgE-антител в сыворотке крови и назальную гиперреактивность в модели АР на мышах

Далее мы изучили активность комплекса в экспериментах in vivo на модели АР у мышей. Мышам с индуцированным АР вводили комплекс siIL-4-13/LTP интраназально в течение 8 дней в 2 дозах (5 и 15 мкг/мышь), в качестве отрицательного контроля вводили комплекс, содержащий неспецифические молекулы миРНК (siGFP/LTP) в аналогичных дозах. В качестве положительного контроля интраназально применяли кортикостероидный препарат будесонид.

Была изучена продукция целевых Th2-цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-13) клетками регионарных (подчелюстных) лимфоузлов. Выявлено, что у мышей с индуцированным АР наблюдалась значительная продукция этих цитокинов. Концентрации ИЛ-4 в супернатантах клеток подчелюстных лимфоузлов мышей в группе "АР" и мышей из группы "Норма" составляли 128 ± 32 и 20 ± 2 пг/мл, соответственно, а ИЛ-13 - 531 ± 68 и 36 ± 7 пг/мл, соответственно. Концентрации ИЛ-4 и ИЛ-13 в супернатантах активированных клеток подчелюстных лимфоузлов в группе "АР" были в 6,4 и 14,8 раз выше, чем в группе "Норма".

Интраназальное введение комплекса siIL-4-13/LTP в обеих дозах приводило к значительному снижению продукции этих цитокинов в сравнении как с группой "АР", так и с группами "siGFP Д1" и "siGFP Д2". Концентрация ИЛ-4 в группах "siIL-4-13 Д1" и "siIL-4-13 Д2" снижалась в 2,8 и 2 раза по сравнению с группами "siGFP Д1" и "siGFP Д2" (49 ± 3 и 45 ± 6 пг/мл против 137 ± 38 и 90 ± 14 пг/мл). Концентрации ИЛ-13 в группах "siIL-4-13 Д1" и "siIL-4-13 Д2" снижались в 1,6 и 2 раза по сравнению с группами "siGFP Д1" и "siGFP Д2" (483 ± 55 и 494 ± 52 пг/мл против 294 ± 12 и 234 ± 7 пг/мл) (рис. 3А).

В то же время экспериментальная терапия комплексом siIL-4-13/LTP не влияла на продукцию Th1-цитокина (ИФН-γ) клетками подчелюстных лимфоузлов. Концентрация этого цитокина была сопоставимой во всех группах (варьировала от 340 до 403 пг/мл), кроме группы "Норма" (52 ± 3 пг/мл) (см. рис. 3А). В группе, получавшей препарат будесонид, происходило статистически значимое снижение продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 в 2,5 и 2,6 раза по сравнению с группой "АР" (128 ± 32 и 531 ± 68 пг/мл против 51 ± 7 и 202 ± 12 пг/мл).

После курса экспериментальной терапии с помощью ИФА были определены уровни аллерген-специфических IgE, IgG1 и IgG2a в сыворотках крови мышей. Выявлено статистически значимое повышение уровней данных иммуноглобулинов в группе "АР" после этапа провокации; оптическая плотность в группе "АР" составила 0,39 ± 0,04 (для IgE), 1,18 ± 0,06 (для IgG1) и 0,34 ± 0,04 (для IgG2a) (рис. 3Б). У мышей, получавших экспериментальную терапию комплексом siIL-4-13/LTP в минимальной дозе 5 мкг/мышь (группа "siIL-4-13 Д1"), происходило статистически значимое снижение уровней аллерген-специфических антител IgE и IgG1 на 54 и 24 % (столбец "siIL-4-13 Д1") по сравнению с группой, получавшей аналогичную дозу комплекса, содержащего неспецифические молекулы миРНК (столбец "siGFP Д1"). При этом, несмотря на способность комплекса в максимальной дозе снижать продукцию ИЛ-4 и ИЛ-13 в регионарных лимфоузлах, не происходило уменьшения уровней аллерген-специфических IgE- и IgG1-антител в сыворотке крови. В то же время экспериментальная терапия обеими дозами комплекса не влияла на уровни сывороточных аллерген-специфических IgG2a-антител (см. рис. 3Б). Аналогично, у мышей, получавших препарат будесонид, несмотря на подавление продукции цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13, не происходило значимого снижения уровней аллерген-специфических иммуноглобулинов в сравнении с группой "АР".

Измерение назальной гиперреактивности осуществляли в день последней провокации аллергеном (см. рис. 1). У животных группы "АР" было продемонстрировано значительное повышение назальной гиперреактивности, что выражалось в увеличении частоты чиханий в 17 раз и почесываний носа в 12 раз по сравнению с группой "Норма" (рис. 3В). В группе, получавшей будесонид, наблюдалось статистически значимое снижение назальной гиперреактивности в сравнении с группой "АР". Частота чиханий уменьшалась в 4 раза (33 ± 4,6 против 8 ± 1,4), а частота почесываний носа - в 2 раза (23 ± 2,8 против 11 ± 1,8). Подавление активности генов, кодирующих ИЛ-4 и ИЛ-13, молекулами миРНК также приводило к значительному уменьшению назальной гиперреактивности. Частота чиханий в группе, получавшей комплекс siIL-4-13/LTP в минимальной дозе (группа "siIL-4-13 Д1"), была статистически значимо меньше (на 58 %) по сравнению с группой "siGFP Д1" (19 ± 1,6 против 11 ± 2,3 раз/5 мин) (см. рис. 3В). Однако применение максимальной дозы комплекса siIL-4-13/LTP не оказывало эффекта на назальную гиперреактивность.

Подавление продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 комплексом миРНК и пептида LTP уменьшает воспаление слизистой оболочки носовой полости

С помощью световой микроскопии оценивали патологические изменения в слизистой оболочке носовой полости. На окрашенных срезах ткани оценивали инфильтрацию носовой полости провоспалительными клетками. Показано, что у мышей с индуцированным АР количество клеток в инфильтратах и площадь инфильтратов возрастали в сравнении с группой "Норма" в 10 и в 4,8 раза соответственно: 40 ± 4 против 4 ± 1 клеток/поле зрения и 221 600 ± 11 150 против 46 555 ± 3 073 пкс². Также в группе "АР" значительно возрастала толщина респираторного эпителия в сравнении с группой "Норма" (265 ± 12 против 114 ± 7 пкс), то есть в 2,3 раза (рис. 4).

Учитывая, что эозинофилы играют решающую роль в развитии аллергического воспаления, мы оценили количество этих клеток в инфильтратах. Обнаружено, что в группе "АР" количество эозинофилов составило 9 ± 1 клеток/поле зрения по сравнению с 1 ± 0 клеток/поле зрения в группе "Норма", т. е. в 9 раз выше (см. рис. 4).

Снижение продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 комплексом миРНК и пептида LTP приводило к значительному уменьшению воспаления в слизистой оболочке носовой полости. У мышей, получавших комплекс siIL-4-13/LTP в обеих дозах (5 и 15 мкг/мышь) (столбец "siIL-4-13 Д1" и "siIL-4-13 Д2"), наблюдалось снижение количества клеток в инфильтратах в сравнении с мышами, получавшими аналогичные дозы комплекса, содержащего неспецифические миРНК (siGFP/LTP) (столбец "siGFP Д1" и "siGFP Д2"). В группе "siGFP Д1" насчитывалось 22 ± 2 клеток/поле зрения, в то время как в группе "siIL-4-13 Д1" - 12 ± 1 клеток/поле зрения, то есть в 1,8 раз меньше. В группе "siGFP Д2" насчитывалось 19 ± 1 клеток/поле зрения, в то время как в группе "siIL-4-13 Д2" - 8 ± 1 клеток/поле зрения, т. е. в 2,4 раза меньше. Кроме того, у животных группы "siIL-4-13 Д1", получавших минимальную дозу комплекса siIL-4-13/LTP, происходило статистически значимое снижение числа эозинофилов (на 55 %) в сравнении с группой "АР".

Уменьшение воспаления также выражалось в снижении площади клеточных инфильтратов в слизистой оболочке носовой полости после подавления продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 специфическими миРНК. У мышей, получавших комплекс siIL-4-13/LTP в минимальной и в максимальной дозах, наблюдалось снижение площади инфильтратов в сравнении с мышами, получавшими аналогичные дозы комплекса, содержащего неспецифические молекулы миРНК. В группах "siGFP Д1" и "siGFP Д2" площади клеточных инфильтратов составляли 154 452 ± 9 057 и 124 871 ± 11 091 пкс² по сравнению с 95 976 ± 8 065 и 71 560 ± 3 863 пкс² в группах "siIL-4-13 Д1" и "siIL-4-13 Д2" (см. рис. 4), т. е. были в 1,6 и 1,7 раза меньше, соответственно.

Кроме того, подавление продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 специфическими миРНК приводило к уменьшению выраженности признаков ремоделирования, что проявлялось в восстановлении толщины эпителия респираторного тракта и уменьшении количества бокаловидных клеток в нем. После экспериментальной терапии комплексом siIL-4-13/LTP в дозах 5 и 15 мкг/мышь толщина эпителия уменьшилась на 20 и 11 % по сравнению с группами, получавшими аналогичные дозы siGFP/LTP; этот показатель в группах siGFP Д1" и "siGFP Д2" составлял 217 ± 9 и 193 ± 6 пкс против 174 ± 6 и 173 ± 5 пкс в группах "siIL-4-13 Д1" и "siIL-4-13 Д2".

Окраска образцов альциановым синим позволила выявить слизепродуцирующие бокаловидные клетки в респираторном эпителии. После индукции экспериментального АР доля этих клеток значительно (в 19 раз) увеличивалась в сравнении с группой "Норма" (37 ± 5 против 2 ± 0 %). Доля бокаловидных клеток в респираторном эпителии мышей, получавших комплекс siIL-4-13/LTP в дозах 5 и 15 мкг/мышь, уменьшалась в 1,8 и 1,7 раза по сравнению с группами, получавшими аналогичные дозы комплекса siGFP/LTP; этот показатель в группах "siGFP Д1" и "siGFP Д2" составлял 42 ± 3 и 29 ± 2 % против 24 ± 3 и 17 ± 1 % в группах "siIL-4-13 Д1" и "siIL-4-13 Д2" (рис. 5).

У мышей, получавших будесонид, происходило значительное уменьшение воспаления в слизистой оболочке носовой полости, что выражалось в 5-кратном уменьшении количества провоспалительных клеток в инфильтратах и в 3-кратном уменьшении площади инфильтратов в сравнении с группой "АР" (см. рис. 4). Кроме того, после приема будесонида в 2,7 раза снижалось число эозинофилов, происходило восстановление толщины эпителия на 47 % по сравнению с группой "АР" (см. рис. 4), а также уменьшалась доля бокаловидных клеток в респираторном эпителии на 41 % (см. рис. 5).

Обсуждение

Аллергический ринит (АР) - это хроническое воспалительное заболевание верхних дыхательных путей, характеризующееся чиханием, зудом, заложенностью носа и ринореей. Патогенез АР включает повышение титра аллерген-специфического IgE в сыворотке крови, инфильтрацию слизистой оболочки носовой полости воспалительными клетками и повышенную продукцию Th2-цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13) клетками иммунной системы, прежде всего лимфоцитами, макрофагами, эозинофилами и др. Современная фармакотерапия, включающая применение интраназальных кортикостероидов, антигистаминных и антилейкотриеновых препаратов, облегчает симптомы заболевания, но не способна влиять на его патогенез. В последние десятилетия активно создаются антицитокиновые препараты на основе моноклональных антител, способные влиять на ключевые звенья патогенеза воспалительных заболеваний (БА, АтД, АР и др.) [12]. Одним из препаратов, успешно применяемых для лечения пациентов с БА и сопутствующим АР является дупилумаб, мишенью которого служит цепь рецептора IL-4Rα, обеспечивающая передачу сигнала от обоих цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13. Однако широкое использование этого препарата ограничено его высокой стоимостью [27-29].

Появляются новые способы регуляции экспрессии патогенетически значимых генов, например при помощи молекул миРНК. Дизайн и химический синтез этих молекул относительно прост. Попадая внутрь клетки, миРНК инициируют процесс деградации мРНК целевого гена по механизму РНКи. Учитывая неспособность молекул миРНК проникать к месту действия - в цитоплазму клеток, их часто используют в комплексе с носителями. В данном исследовании мы создали комплекс, состоящий из молекул миРНК против генов Il4 и Il13 и пептида-носителя LTP и изучили его противовоспалительные свойства на ранее разработанной модели АР у мышей [24].

В наших предыдущих исследованиях были разработаны и протестированы миРНК против генов Il4 и Il13 [23], а также разветвленный (дендримерный) катионный пептид LTP, выступающий в роли носителя для миРНК. Этот пептид способен доставлять нуклеиновые кислоты в широкий спектр клеток млекопитающих, включая лимфоциты (основные продуценты - ИЛ-4 и ИЛ-13) [26]. В данном исследовании мы создали комплекс siIL-4-13/LTP, состоящий из молекул миРНК против генов Il4 и Il13 и пептида-носителя LTP. Массовое соотношение миРНК/LTP составило 1/12,5. Как показали наши прошлые исследования, данное соотношение является оптимальным, чтобы доставить нуклеиновые кислоты в целевые клетки, не оказывая на них цитотоксического действия [26]. В отдельных экспериментах in vitro мы показали, что этот комплекс способен подавлять продукцию ИЛ-4 и ИЛ-13 в культуре перевиваемых клеток HEK293T (см. рис. 2Б). Также была подтверждена способность комплекса siIL-4-13/LTP трансфецировать лимфоциты. Добавление этого комплекса существенно снижало продукцию цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13 в стимулированных тимоцитах по сравнению с неспецифической миРНК (см. рис. 2B), что свидетельствует о его сиквенс-специфическом механизме действия.

Для оценки терапевтического потенциала комплекса siIL-4-13/LTP его вводили мышам с индуцированным АР интраназально в дозах 5 и 15 мкг. Кортикостероид будесонид, широко используемый для лечения АР [30], служил положительным контролем. Интраназальное введение комплекса siIL-4-13/LTP, содержащего миРНК против Il4 и Il13, эффективно подавляло продукцию этих Th2-цитокинов в локальных лимфатических узлах, не оказывая влияние на уровень Th1-цитокина - ИФН-γ (см. рис. 3А). Важно отметить, что неспецифические молекулы миРНК не подавляли продукцию ИЛ-4 и ИЛ-13 (см. рис. 3А), что дополнительно свидетельствует о сиквенс-специфическом механизме действия комплекса siIL-4-13/LTP.

Подавление продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 молекулами миРНК в свою очередь приводило к снижению уровней сывороточных OVA-специфичных IgE- и IgG1-антител, но не влияло на уровень IgG2a-антител (см. рис. 3Б). Эти данные указывают на переключение иммунного ответа от Th2- на Th1-тип. Полученные результаты в целом согласуются с ранее известной информацией о том, что цитокины ИЛ-4 и ИЛ-13 способствуют переключению синтеза антител В-клетками с IgM на IgE [31, 32].

Мы не наблюдали зависимости снижения продукции IgE от дозы миРНК. Это может объясняться тем фактом, что комплекс миРНК/пептид за счет агрегации образует наноструктуры. При этом при дозе 15 мкг/мышь образуются наноструктуры большего размера по сравнению с таковыми при дозе 5 мкг/мышь. Более крупные наноструктуры значительно хуже проникают в цитоплазму клеток, и, следовательно, оказывают менее выраженный эффект. Аналогичное наблюдение было сделано M. Tuttolomondo и соавт., которые показали, что агрегированные комплексы уменьшали интернализацию миРНК в цитоплазму клетки. Это может объяснить меньшую эффективность комплекса миРНК/пептид в дозе 15 мкг/мышь по сравнению с дозой 5 мкг/мышь [32]. Сходный эффект наблюдался и в клинических исследованиях препарата МИР 19^®. Меньшая доза 3,7 мг при ингаляционном применении демонстрировала значимую клиническую эффективность при лечении COVID-19, тогда как более высокая доза 11,1 мг не была эффективной [33].

В проведенном исследовании мы показали, что комплекс siIL-4-13/LTP значительно снижает продукцию целевых цитокинов лимфоцитами, концентрацию аллерген-специфического IgE в сыворотке, а также назальную гиперреактивность (см. рис. 3В). Это снижение, скорее всего, обусловлено уменьшением уровня аллерген-специфических IgE-антител у животных, получавших этот комплекс (см. рис. 3Б, столбец "siIL-4-13 Д1"). Известно, что антитела этого класса сорбируются на поверхности тучных клеток, локализующихся в том числе в слизистой оболочке дыхательных путей, и после контакта с аллергеном вызывают их дегрануляцию. В результате дегрануляции в окружающие ткани попадают медиаторы (в первую очередь гистамин), которые обеспечивают гиперреактивность [34]. Кроме того, у мышей аллерген-специфические IgG1-антитела также способны сорбироваться на поверхности гранулоцитов и вызывать их дегрануляцию при контакте с аллергеном [35, 36]. Мы показали, что экспериментальная терапия комплексом siIL-4-13/LTP уменьшает уровень не только IgE-, но и IgG1-антител, внося дополнительный вклад в уменьшение назальной гиперреактивности. Аналогичные наблюдения были сделаны в исследовании K. Hosoya и соавт., в котором местное введение миРНК против Stat6 снижало выработку ИЛ-4 и ИЛ-5 в локальных лимфатических узлах, что сопровождалось уменьшением назальной гиперреактивности у мышей с индуцированным АР [37, 38].

Подавление продукции целевых цитокинов молекулами миРНК приводило к уменьшению воспаления и признаков ремоделирования слизистой оболочки носовой полости. Уменьшение воспаления выражалось в снижении количества клеток, инфильтрирующих верхние дыхательные пути, прежде всего эозинофилов, а также в сокращении площади инфильтратов (см. рис. 4). Восстановление толщины респираторного эпителия и уменьшение количества бокаловидных клеток в нем свидетельствовало о нивелировании проявлений ремоделирования (см. рис. 4, 5).

Известно, что цитокины ИЛ-4 и ИЛ-13 привлекают провоспалительные клетки (прежде всего эозинофилы) в участок воспаления за счет хемоаттракции и увеличения экспрессии молекул адгезии (ICAM-1 и VCAM-1) на эндотелии сосудов [31]. Кроме того, IgE-антитела при контакте с аллергеном способствуют высвобождению таких медиаторов, как гистамин, лейкотриены, простагландины и фактор активации тромбоцитов, которые повышают проницаемость сосудов, усиливая привлечение провоспалительных клеток в ткань. Вышеуказанные медиаторы, действуя на респираторный эпителий, вызывают трансформацию эпителиальных клеток в бокаловидные и гиперсекрецию слизи. В результате дегрануляции высвобождаются ферменты, в том числе химаза тучных клеток, триптаза, сериновые эстеразы, матриксные металлопротеиназы, которые разрушают белки тканевого матрикса. В результате репарации этих повреждений происходит утолщение стенок респираторного тракта [31]. Гистологическая картина, которую наблюдали в эксперименте, соответствует этим данным. В группе "АР" развивалось воспаление слизистой оболочки носовой полости и происходила трансформация эпителиальных клеток в бокаловидные. При этом подавление продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 молекулами миРНК значительно уменьшало воспаление и ремоделирование верхних дыхательных путей (см. рис. 4, 5).

Мы продемонстрировали, что интраназальный глюкокортикостероид будесонид, использованный в качестве положительного контроля, уменьшал продукцию провоспалительных цитокинов (см. рис. 3А), назальную реактивность (см. рис. 3В) и воспаление слизистой оболочки носа в модели АР на мышах (см. рис. 4). Будесонид активно используется в клинической практике для лечения АР. Ряд клинических исследований ранее подтвердил его эффективность [38, 39]. В этих исследованиях было показано, что у пациентов с АР, получавших назально будесонид, наблюдалось значительное улучшение симптомов заболевания (уменьшение отека, снижение продукции слизи и пр.) [40], снижение уровня провоспалительных цитокинов ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-6 [41, 42], а также уменьшение числа инфильтрирующих провоспалительных клеток в респираторном тракте [43]. В целом это согласуется с данными, полученными нами в модели АР на мышах, что свидетельствует о ее адекватности.

Примечательно, что в клинических исследованиях при назальном применении будесонид не оказывал системного действия на уровень эозинофилов в крови и на уровень сывороточных IgE-антител. Это объясняется тем, что при назальном пути введения биодоступность препарата составляет < 5 % [44, 45]. Мы не обнаружили влияния назального введения будесонида на уровень аллерген-специфических IgE-антител в сыворотке крови (рис. 3Б).

Таким образом, подавление продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 молекулами миРНК имеет значительный благоприятный эффект на проявления АР. При этом эффект миРНК сходен с таковым для глюкокортикостероидов, традиционно используемых для лечения АР.

Однако стоит отметить, что применение глюкокортикостероидов часто ограничено их побочными эффектами и возникновением резистентности. Наиболее распространенные побочные эффекты интраназальных глюкокортикостероидов являются результатом местного раздражения, включают сухость, жжение, покалывание, выделения с примесью крови и носовое кровотечение. Частота нежелательных явлений в различных исследованиях колеблется от 4 до 20 % в зависимости от длительности приема препарата. Продолжительность нежелательных явлений может достигать 2-12 нед. У детей глюкокортикостероидные препараты могут негативно влиять на рост, но не ясно, приводят ли эти эффекты к долгосрочному нарушению роста [46]. Кроме того, длительное применение назальных глюкокортикостероидов может повреждать носовую перегородку и негативно влиять на микрофлору слизистой оболочки носовой полости, в частности способствуя росту грибов, например рода Candida [47, 48].

Кроме того, некоторые пациенты резистентны к терапии глюкокортикостероидами [49, 50], что требует поиска иных способов лечения. Использование новых противовоспалительных препаратов на основе молекул миРНК может улучшить контроль заболевания, в том числе у кортикостероид-резистентных пациентов, а также минимизировать нежелательные эффекты этих препаратов.

Заключение

Несмотря на существенные успехи в терапии АР, распространенность этого заболевания продолжает расти, особенно в развитых странах. Исследования патогенеза АР на клеточном и молекулярном уровне позволило установить основные биомишени для разработки препаратов. В частности, перспективными мишенями являются Th2-цитокины (ИЛ-4 и ИЛ-13), так как они участвуют в формировании основных проявлений заболевания. Создан ряд технологий, позволяющих регулировать экспрессию генов. Одна из перспективных технологий основывается на механизме РНКи. РНКи эффективно и специфично блокирует экспрессию целевых генов. В данной работе был сконструирован комплекс молекул миРНК, подавляющих экспрессию генов провоспалительных цитокинов ИЛ-4 и ИЛ-13, и пептида-носителя LTP. Интраназальное введение этого комплекса приводило к уменьшению продукции ИЛ-4 и ИЛ-13 и нивелированию основных проявлений АР в экспериментальной модели на мышах. Проведенные эксперименты доказывают принципиальную возможность успешного применения РНКи для подавления генов, участвующих в патогенезе АР, что открывает перспективы для дальнейшего использования этого подхода при разработке новых специфичных и безопасных лекарственных средств для терапии АР.

Литература

1. Астафьева Н.Г., Баранов А.А., Вишнева Е.А., Дайхес Н.А., Жестков А.В., Ильина Н.И., Карнеева О.В., Карпова Е.П., Ким И.А., Крюков А.И., Курбачева О.М., Мешкова Р.Я., Намазова-Баранова Л.С., Ненашева Н.М., Новик Г.А., Носуля Е.В., Павлова К.С., Пампура А.Н., Свистушкин В.М., Селимзянова Л.Р., Хаитов М.Р., Хаитов Р.М. Аллергический ринит. Российский аллергологический журнал. 2022; 19 (1): 100-41. DOI: https://www.doi.org/10.36691/RJA1524

2. Yoo E.R., Corey P.J. Allergic rhinitis in the elderly. Global atlas of allergic rhinitis and chronic rhinosinusitis. European Academy of Allergy and Clinical Immunology. 2015; 252-3.

3. Pols D.H.J., Wartna J.B., Moed H., van Alphen E.I., Bohnen A.M., Bindels P.J.E. Atopic dermatitis, asthma and allergic rhinitis in general practice and the open population: a systematic review. Scand J Prim Health Care. 2016; 34 (2): 143-50. DOI: https://www.doi.org/10.3109/02813432.2016.1160629

4. Xiao J., Wen-Xu W., Yuan-Yuan Y., Lin W.J., Wang L. A network meta-analysis of randomized controlled trials focusing on different allergic rhinitis medications. Am J Ther. 2016; 23 (6): 1568-78. DOI: https://www.doi.org/10.1097/mjt.0000000000000242

5. May J.R., Dolen K.W. Management of allergic rhinitis: a review for the community pharmacist. Clin Ther. 2017; 39: 2410-9. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.clinthera.2017.10.006

6. Vandenplas O., Vinnikov D., Blanc P.D., Agache I., Bachert C., Bewick M., Cardell L., Cullinan P., Demoly P., Descatha A., Fonseca J., Haahtela T., Hellings P.W., Jamart J., Jantunen J., Kalayci Ö., Price D., Samolinski B., Sastre J., Tian L., Valero A., Zhang X., Bousquet J. Impact of rhinitis on work productivity: a systematic review. J Allergy Clin Immunol Pract. 2018; 6: 1274-86. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.jaip.2017.09.002

7. Pipet A., Botturi K., Pinot D., Vervloet D., Magnan A. Allergen-specific immunotherapy in allergic rhinitis and asthma. Mechanisms and proof of efficacy. Respir Med. 2009; 103: 800-12. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.rmed.2009.01.008

8. Winther L., Arnved J., Malling H.J., Nolte H., Mosbech H. Side-effects of allergen-specific immunotherapy. A prospective multi-centre study. Clin Exp Allergy. 2006; 36 (3): 254-60. DOI: https://www.doi.org/10.1111/j.1365-2222.2006.02340.x

9. Гусниев С.А., Польнер С.А., Михалева Л.М., Ильина Н.И., Есакова А.П., Курабчева О.М., Шиловский И.П., Хаитов М.Р. Влияние экспрессии гена интерлейкина-33 на клинико-морфологические характеристики слизистой оболочки носа при аллергическом рините. Иммунология. 2021; 42 (1): 68-79. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-1-68-79

10. Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Barvinskaia E.D., Kaganova M.M., Nikolskii A.A., Vishnyakova L.I., Kovchina V.I., Yumashev K.V., Korneev A.V., Petukhova O.A., Kudlay D.A., Smirnov V.V., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Shatilov A.A., Shatilova A.V., Maerle A.V., Sergeev I.V., Trofimov D.Y., Khaitov M.R. Anti-inflammatory effect of siRNAs targeted IL-4 and IL-13 in a mouse model of allergic rhinitis. Allergy. 2022; 77 (9): 2829-32. DOI: https://www.doi.org/10.1111/ALL.15366

11. Nur Husna S.M., Shukri N.M., Mohd Ashari N.S., Wong K.K. IL-4/IL-13 axis as therapeutic targets in allergic rhinitis and asthma. Peer J. 2022; 10. DOI: https://www.doi.org/10.7717/peerj.13444

12. Shilovskiy I.P., Eroshkina D.V., Babakhin A.A., Khaitov M.R. Anticytokine therapy of allergic asthma. Mol Biol. 2017; 51 (1): 3-17. DOI: https://www.doi.org/10.7868/S0026898416060197

13. Akdis C.A., Hellings P.W., Agache I., eds. Global atlas of allergic rhinitis and chronic rhinosinusitis. 2015; 1-442

14. Harb H., Chatila T.A. Mechanisms of Dupilumab. Clin Exp Allergy. 2020; 50 (1): 5-14. DOI: https://www.doi.org/10.1111/cea.13491

15. Tohda Y., Matsumoto H., Miyata M., Taguchi Y., Ueyama M., Joulain F., Arakawa I. Cost-effectiveness analysis of dupilumab among patients with oral corticosteroid-dependent uncontrolled severe asthma in Japan. J Asthma. 2022; 59 (11): 2162-73. DOI: https://www.doi.org/10.1080/02770903.2021.1996596

16. Шиловский И.П., Сундукова М.С., Гайсина А.Р., Ласкин А.А., Смирнов В.В., Бабахин А.А., Хаитов М.Р. Интерференция РНК - новый подход в терапии аллергической бронхиальной астмы (обзор). Экспериментальная и клиническая фармакология. 2016; 79 (4): 35-44.

17. Shilovskiy I.P., Sundukova M.S., Korneev A.V., Nikolskii A.A., Barvinskaya E.D., Kovchina V.I., Vishniakova L.I., Turenko V.N., Yumashev K.V., Kaganova M.M., Brylina V.E., Sergeev I., Maerle A., Kudlay D.A., Petukhova O.A., Khaitov M.R. The mixture of siRNAs targeted to IL-4 and IL-13 genes effectively reduces the airway hyperreactivity and allergic inflammation in a mouse model of asthma. Int Immunopharmacol. 2022; 103. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.intimp.2021.108432.

18. Колоскова О.О., Носова А.С., Илюхина А.А., Шиловский И.П. Липосомальные средства доставки миРНК. Биофармацевтический журнал. 2017; 9: 3-10.

19. Lee C.C., Huang H.Y., Chiang B.L. Lentiviral-mediated interleukin-4 and interleukin-13 RNA interference decrease airway inflammation and hyperresponsiveness. Hum Gene Ther. 2011; 22 (5): 577-86. DOI: https://www.doi.org/10.1089/hum.2009.105

20. Lee C.C., Huang H.Y., Chiang B.L. Lentiviral-mediated GATA-3 RNAi decreases allergic airway inflammation and hyperresponsiveness. Molecular Therapy. 2008; 16: 60-5. DOI: https://www.doi.org/10.1038/sj.mt.6300309

21. Darcan-Nicolaisen Y., Meinicke H., Fels G., Hegend O., Haberland A., Kühl A., Loddenkemper C., Witzenrath M., Kube S., Henke W., Hamelmann E. Small interfering RNA against transcription factor STAT6 inhibits allergic airway inflammation and hyperreactivity in mice. J Immunol. 2009; 182: 7501-08. DOI: https://www.doi.org/10.4049/jimmunol.0713433

22. Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Uspenskaya D.V., Shatilova A.V., Turetskiy E.A., Shatilov A.A., Lushnikova A.A., Vishnyakova L.I., Shilovskiy I.P., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Supercationic peptide dendrimers as vectors for nucleic acids delivery to mammalian cells. Immunologiya. 2022; 43 (3): 320-32. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-3-320-332

23. Khaitov M.R., Shilovskiy I.P., Nikonova A.A., Shershakova N.N., Kamyshnikov O.Y., Babakhin A.A., Zverev V.V., Johnston S.L., Khaitov R.M. Small interfering RNAs targeted to interleukin-4 and respiratory syncytial virus reduce airway inflammation in a mouse model of virus-induced asthma exacerbation. Hum Gene Ther. 2014; 25: 642-50. DOI: https://www.doi.org/10.1089/hum.2013.142

24. Шиловский И.П., Барвинская Е.Д., Каганова М.М., Ковчина В.И., Юмашев К.В., Корнеев А.В., Никольский А.А., Вишнякова Л.И., Брылина В.Е., Русак Т.Е., Курбачева О.М., Дынева М.Е., Петухова О.А., Гудима Г.О., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Модель аллергического ринита у мышей, имитирующая основные проявления патологии человека. Иммунология. 2022; 43 (6): 654-72. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-654-672

25. Lu Z.J., Mathews D.H. OligoWalk: an online siRNA design tool utilizing hybridization thermodynamics. Nucleic Acids Res. 2008; 36: 104-8. DOI: https://www.doi.org/10.1093/nar/gkn250

26. Kozhikhova K.V., Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofeeva A.V., Gaisina A.R., Shatilov A.A., Turetskiy E.A., Andreev I.M., Smirnov V.V., Dvornikov A.S., Khaitov M.R. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org Biomol Chem. 2018; 16: 8181-90. DOI: https://www.doi.org/10.1039/c8ob02039f

27. Beck L.A., Thaci D., Hamilton J.D., Graham N.M., Bieber T., Rocklin R., Ming J.E., Ren H., Kao R., Simpson E., Ardeleanu M., Weinstein S.P., Pirozzi G., Guttman-Yassky E., Suárez-Fariñas M., Hager M.D., Stahl N., Yancopoulos G.D., Radin A.R. Dupilumab treatment in adults with moderate-to-severe atopic dermatitis. N Engl J Med. 2014; 371: 130-9. DOI: https://www.doi.org/10.1056/NEJMoa1314768

28. Weinstein S.F., Katial R., Jayawardena S., Pirozzi G., Staudinger H., Eckert L., Joish V.N., Amin N., Maroni J., Rowe P., Graham N.M., Teper A. Efficacy and safety of dupilumab in perennial allergic rhinitis and comorbid asthma. J Allergy Clin Immunol 2018; 142: 171-7. DOI: https://www.doi.org/10.1016/J.JACI.2017.11.051

29. Busse W.W., Maspero J.F., Rabe K.F., Papi A., Wenzel S.E., Ford L.B., Pavord I.D., Zhang B., Staudinger H., Pirozzi G., Amin N., Akinlade B., Eckert L., Chao J., Graham N.M., Teper A. Liberty asthma QUEST: phase 3 randomized, double-blind, placebo-controlled, parallel-group study to evaluate dupilumab efficacy/safety in patients with uncontrolled, moderate-to-severe asthma. Adv Ther. 2018; 35: 737-48. DOI: https://www.doi.org/10.1007/S12325-018-0702-4

30. Juel-Berg N., Darling P., Bolvig J., Foss-Skiftesvik M.H., Halken S., Winther L., Hansen K.S., Askjaer N., Heegaard S., Madsen A.R., Opstrup M.S. Intranasal corticosteroids compared with oral antihistamines in allergic rhinitis: A systematic review and metaanalysis. Am J Rhinol Allergy. 2017; 31: 19-28. DOI: https://www.doi.org/10.2500/ajra.2016.30.4397

31. Bernstein D.I., Schwartz G., Bernstein J.A. Allergic rhinitis: mechanisms and treatment. Immunol Allergy Clin North Am. 2016; 36: 261-78. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.iac.2015.12.004

32. Tuttolomondo M., Casella C., Hansen P.L., Polo E., Herda L.M., Dawson K.A., Ditzel H.J., Mollenhauer J. Human DMBT1-derived cell-penetrating peptides for intracellular siRNA delivery. Mol Ther Nucleic Acids. 2017; 8: 264-76. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.omtn.2017.06.020

33. Khaitov M.R., Nikonova A.A., Kofiadi I.A., Shilovskiy I.P., Smirnov V.V., Elisytina O.G., Maerle A.V., Shatilov A.A., Shatilova A.V., Andreev S.M., Sergeev I.V., Trofimov D.Y., Latysheva T.V., Ilyna N.I., Martynov A.I., Rabdano S.O., Ruzanova E.A., Savelev N.S., Pletiukhina I.V., Safi A.S., Ratnikov V.A., Gorelov V.P., Kaschenko V.A., Kucherenko N.G., Umarova I.A., Moskaleva S.S., Fabrichnikov S.V., Zuev O.V., Pavlov N.B., Kruchko D.S., Berzin I.A., Goryachev D.V., Merkulov V.A., Shipulin G.A., Udin S.M., Trukhin V.P., Valenta R., Skvortsova V.I. Treatment of COVID-19 patients with a SARS-CoV-2-specific siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2023; 78 (6): 1639-153. DOI: https://www.doi.org/10.1111/ALL.15663

34. Hofmaier S., Comberiati P., Matricardi P.M. Immunoglobulin G in IgE-mediated allergy and allergen-specific immunotherapy. Eur Ann Allergy Clin Immunol. 2014; 46: 6-11.

35. Miyajima I., Dombrowicz D., Martin T.R., Ravetch J.V., Kinet J.P., Galli S.J. Systemic anaphylaxis in the mouse can be mediated largely through IgG1 and Fc gammaRIII. Assessment of the cardiopulmonary changes, mast cell degranulation, and death associated with active or IgE- or IgG1-dependent passive anaphylaxis. J Clin Invest. 1997; 99: 901-14. DOI: https://www.doi.org/10.1172/JCI119255

36. Oettgen H.C., Martin T.R., Wynshaw-Boris A., Deng C., Drazen J.M., Leder P. Active anaphylaxis in IgE-deficient mice. Nature. 1994; 370: 367-70. DOI: https://www.doi.org/10.1038/370367a0

37. Hosoya K., Satoh T., Yamamoto Y., Saeki K., Igawa K., Okano M., Moriya T., Imamura O., Nemoto Y., Yokozeki H. Gene silencing of STAT6 with siRNA ameliorates contact hypersensitivity and allergic rhinitis. Allergy. 2011; 66: 124-31. DOI: https://www.doi.org/10.1111/j.1398-9995.2010.02440.x

38. Kaszuba S.M., Baroody F.M., deTineo M., Haney L., Blair C., Naclerio R.M. Superiority of an intranasal corticosteroid compared with an oral antihistamine in the as-needed treatment of seasonal allergic rhinitis. Arch Intern Med. 2001; 161: 2581-87. DOI: https://www.doi.org/10.1001/archinte.161.21.2581

39. Pullerits T., Praks L., Ristioja V., Lötvall J. Comparison of a nasal glucocorticoid, antileukotriene, and a combination of antileukotriene and antihistamine in the treatment of seasonal allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 2002; 109: 949-55. DOI: https://www.doi.org/10.1067/mai.2002.124467

40. Mygind N., Nielsen L.P., Hoffmann H.J., Shukla A., Blumberga G., Dahl R., Jacobi H. Mode of action of intranasal corticosteroids. J Allergy Clin Immunol. 2001; 108: 16-25. DOI: https://www.doi.org/10.1067/mai.2001.115561

41. Hermelingmeier K.E., Weber R.K., Hellmich M., Heubach C.P., Mösges R. Nasal irrigation as an adjunctive treatment in allergic rhinitis: A systematic review and meta-analysis. Am J Rhinol Allergy. 2012; 26 (5): 119-25. DOI: https://www.doi.org/10.2500/ajra.2012.26.3787

42. Satdhabudha A., Poachanukoon O. Efficacy of buffered hypertonic saline nasal irrigation in children with symptomatic allergic rhinitis: A randomized double-blind study. Int J Pediatr Otorhinolaryngol. 2012; 76: 583-8. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.ijporl.2012.01.022

43. Carr W., Bernstein J., Lieberman P., Meltzer E., Bachert C., Price D., Munzel U., Bousquet J. A novel intranasal therapy of azelastine with fluticasone for the treatment of allergic rhinitis. J Allergy Clin Immunol. 2012; 129 (5): 1282-9. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.jaci.2012.01.077

44. Broek J.L., Bousquet J., Baena-Cagnani C.E., Bonini S., Canonica W.G., Casale T.B., van Wijk R.G., Ohta K., Zuberbier T., Schünemann H.J. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) guidelines: 2010 Revision. J Allergy Clin Immunol. 2010; 126 (3): 466-76. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.jaci.2010.06.047

45. Ishak M.N., Shukri N.M., Ramli R.R. The effectiveness of budesonide nasal irrigation in patients with allergic rhinitis. Malays J Med Sci. 2022; 29 (1): 34-42. DOI: https://www.doi.org/10.21315/mjms2022.29.1.4

46. Wise S.K., Lin S.Y., Toskala E., Orlandi R.R., Akdis C.A., Alt J.A., Azar A., Baroody F.M., Bachert C., Canonica G.W., Chacko T., Cingi C., Ciprandi G., Corey J., Cox L.S., Creticos P.S., Custovic A., Damask C., DeConde A., DelGaudio J.M., Ebert C.S., Eloy J.A., Flanagan C.E., Fokkens W.J., Franzese C., Gosepath J., Halderman A., Hamilton R.G., Hoffman H.J., Hohlfeld J.M., Houser S.M., Hwang P.H., Incorvaia C., Jarvis D., Khalid A.N., Kilpeläinen M., Kingdom T., Krouse H., Larenas-Linnemann D., Laury A.M., Lee S.E., Levy J.M., Luong A.U., Marple B.F., McCoul E.D., McMains K.C., Melén E., Mims J.W., Moscato G., Mullol J., Nelson H.S., Patadia M., Pawankar R., Pfaar O., Platt M.P., Reisacher W., Rondón C., Rudmik L., Ryan M., Sastre J., Schlosser R.J., Settipane R.A., Sharma H.P., Sheikh A., Smith T.L., Tantilipikorn P., Tversky J.R., Veling M.C., Wang D.Y., Westman M., Wickman M., Zacharek M. International consensus statement on allergy and rhinology: allergic rhinitis. Int Forum Allergy Rhinol. 2018; 8: 108-352. DOI: https://www.doi.org/10.1002/alr.22073

47. Yurttas V., Şereflican M., Erkoçoğlu M., Terzi E.H., Kükner A., Oral M. Histopathological effects of intranasal phototherapy and nasal corticosteroids in allergic rhinitis in a rabbit model. J Photochem Photobiol B. 2015; 149: 289-91. DOI: https://www.doi.org/10.1016/j.jphotobiol.2015.06.011

48. Petty D.A., Blaiss M.S. Intranasal corticosteroids topical characteristics: Side effects, formulation, and volume. Am J Rhinol Allergy. 2013; 27: 510-3. DOI: https://www.doi.org/10.2500/ajra.2013.27.3949

49. Hirahara K., Mato N., Hagiwara K., Nakayama T. The pathogenicity of IL-33 on steroid-resistant eosinophilic inflammation via the activation of memory-type ST2 + CD4 + T cells. J Leukoc Biol. 2018; 104: 895-901. DOI: https://www.doi.org/10.1002/JLB.MR1117-456R

50. Порошина А.С., Шершакова Н.Н., Шиловский И.П., Кадушкин А.Г., Таганович А.Д., Гудима Г.О., Хаитов М.Р. Роль ИЛ-25, ИЛ-33 и TSLP в развитии кортикостероидной резистентности. Иммунология. 2023; 44 (4): 500-510. DOI: https://www.doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-4-500-510