Биохимическая и функциональная характеристика мультимеризованных белков, содержащих рецепторный домен CD40L

Резюме

Введение. В процессах активации В-лимфоцита важную роль играет взаимодействие рецептора CD40, экспрессированного на поверхности В-лимфоцита, и его лиганда CD40L, расположенного на поверхности Т-хелпера. CD40L в наибольшей степени проявляет свою стимулирующую активность, когда находится в тримеризованном состоянии, которое обеспечивается при экспрессии белка на поверхностной мембране. Для создания бесфидерной системы стимуляции В-лимфоцитов необходимо получить рекомбинантный мультимеризованный CD40L.

Цель исследования - получить растворимый олигомеризованный белок CD40L человека, пригодный для олигоклональной стимуляции В-лимфоцитов in vitro.

Материал и методы. Методами молекулярного клонирования были получены две генетические конструкции, кодирующие рецепторную часть молекулы CD40L, слитую с двумя типами мультимеризующих последовательностей. В одном случае для этого использовался Fc-фрагмент IgG1 человека, соединенный с тримеризующим изолейциновым зиппером. Эта конструкция получила название LIF. В другом случае для мультимеризации применялась последовательность коллагеноподобного домена адипонектина. Эта конструкция получила название LA. Плазмиды, кодирующие LIF и LA, были трансфецированы в клетки HEK293 и наработаны соответствующие растворимые рекомбинантные белки. Молекулярную массу белков определяли с помощью иммунопреципитации с последующим вестерн-блоттингом. Функциональную активность белков LIF и LA определяли в условиях бесфидерной стимуляции В-лимфоцитов in vitro.

Результаты. При временной трансфекции в клетки HEK293 наблюдалась внутриклеточная экспрессия белков LIF и LA, а также секреция этих белков в культуральный супернатант. После иммунопреципитации и последующего вестерн-блоттинга препарат LIF мигрировал при электрофорезе полосой ~ 55 кДа в редуцирующих и 100 кДа в нередуцирующих условиях. В аналогичных условиях препарат LA мигрировал полосами, соответствующими 30 и 85 кДа. В присутствии экзогенного интерлейкина (ИЛ)-21 препарат LA обеспечивал пролиферацию В-лимфоцитов, сравнимую с наблюдаемой в фидерной системе. Индекс пролиферации В-лимфоцитов под действием ИЛ-21 и LIF был в 3 раза ниже, чем в фидерной системе. Стимуляция с помощью LA приводила к образованию большего количества плазмабластов, чем с применением LIF. Кроме того, LA обеспечивал дифференцировку части стимулированных В-лимфоцитов в плазматические клетки. На 20-й день стимуляции В-лимфоцитов в бесфидерной системе с помощью LA в супернатантах наблюдалась секреция IgM и IgG даже в культурах, изначально содержавших единичные В-клетки.

Заключение. Рекомбинантные мультимеризованные белки, содержащие рецепторный домен CD40L, обладают хорошей стимулирующей активностью в отношении В-лимфоцитов периферической крови. CD40L, мультимеризованный за счет слияния с коллагеноподобным доменом адипонектина, проявляет более высокую физиологическую активность по сравнению с CD40L, мультимеризованным с помощью Fc-фрагмента IgG и тримеризующего изолейцинового зиппера. Слитый белок адипонектин-CD40L можно использовать для бесфидерной стимуляции единичных В-клеток или олигоклональных популяций В-лимфоцитов.

Ключевые слова:В-лимфоциты; стимуляция in vitro; молекула CD40L; гексамеризация; изолейциновый зиппер; коллагеноподобный домен адипонектина; культуры единичных В-лимфоцитов

Для цитирования: Бязрова М.Г., Михайлов А.А., Сухова М.М., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Биохимическая и функциональная характеристика мультимеризованных белков, содержащих рецепторный домен CD40L. Иммунология. 2023; 44 (6): 697-708. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-697-708

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-25-00486 (https://rscf.ru/project/23-25-00486).

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Сбор и обработка материала - Бязрова М.Г., Михайлов А.А., Сухова М.М.; написание текста, редактирование, окончательный вариант и целостность текста - Прилипов А.Г., Филатов А.В.

Введение

Важным показателем напряженности иммунитета является наличие в крови антиген-специфических В-клеток памяти [1]. В отличие от наивных В-лимфоцитов, В-клетки памяти уже встречались с антигеном, в результате этого их гены Ig уже претерпели мутагенез и соответствующие антитела прошли фазу созревания аффинности [2]. В-клетки памяти формируют пул лимфоцитов, которые могут быстро рекрутироваться для образования плазматических клеток и секреции антител при вторичном иммунном ответе. Для прогнозирования вторичного иммунного ответа особую важность представляет информация о количестве и репертуаре В-клеток памяти на клональном уровне, однако подсчет и идентификация антигенспецифических В-клеток памяти имеет некоторые трудности [3]. Это связано с тем, что В-клетки памяти являются покоящимися клетками, которые не пролиферируют и не секретируют антитела. Для того, чтобы добиться того и другого, необходимо их простимулировать. Для стимуляции используют различные комбинации лимфокинов [4]. Такая стимуляция активирует В-клетки памяти и довольно быстро приводит их в состояние плазматических клеток, которые активно секретируют антитела.

Ранее нами была отработана система стимуляции В-лимфоцитов с использованием экзогенного интерлейкина(ИЛ)-21 и фидерной линии клеток A549, стабильно трансфецированных полноразмерным CD40L [5]. Сочетанное действие ИЛ-21 и CD40L в некоторой степени воспроизводит условия, которые создаются в герминативных центрах лимфоузлов, в тех нишах, в которых in vivo В-лимфоциты проходят созревание и дифференцировку. Ранее было показано, что система CD40L/ИЛ-21-стимуляции характеризуется высокой эффективностью [6].

Фидерные клетки для предотвращения пролиферации предварительно обрабатывают митомицином или облучают рентгеновскими лучами. Это приводит к тому, что при культивировании в течение ≥ 1 нед фидерные клетки массово погибают. Для восполнения погибших фидерных клеток необходимо подсаживать свежие, однако это увеличивает трудоемкость процесса. Главное неудобство использования фидерных клеток состоит в том, что в культуре накапливаются погибшие клетки и их фрагменты, которые значительно затрудняют наблюдение за стимулированными В-клетками. Лиганд CD40-рецептора имеет некоторые особенности. Он относится к суперсемейству ФНО-белков, общим свойством которых является тримеризация или гексамеризация на поверхности экспрессируемых клеток [7]. При замене фидерных клеток на растворимый рекомбинантный CD40L необходимо учитывать, что для поддержания функциональной активности молекула CD40L должна находится в тримеризованной или олигомеризованной форме [8].

В настоящей работе были получены и охарактеризованы два препарата растворимого рекомбинантного мультимеризованного CD40L, которые подходят для использования в бесфидерной стимуляции В-лимфоцитов. Гексамеризация CD40L в одном случае достигалась за счет введения в слитый рекомбинантный белок Fc-фрагмента IgG и тримеризующего изолейцинового зиппера (препарат получил условное название LIF), а в другом случае за счет слияния с коллагеноподобным доменом адипонектина (препарат получил условное название LA). Нами было определено, что препараты LIF и LA могут использоваться в бесфидерной стимуляции В-лимфоцитов.

Материал и методы

Выделение лимфоцитов. В исследовании были использованы образцы крови здоровых доноров. Исследование выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации "Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого". Письменное информированное согласие было получено от каждого участника исследования перед выполнением каких-либо процедур исследования. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен Этическим комитетом Института иммунологии (протокол № 3-1, 11 марта 2020 г.).

Образцы цельной крови собирали в гепаринизированные вакутейнерные пробирки (Sarstedt, Германия). Мононуклеарные клетки крови выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (ρ = 1,077 г/см3). B-лимфоциты обогащали методом отрицательной иммуномагнитной сепарации с использованием набора Dynabeads Untouched human B cell kit ("Thermo Fisher Scientific", США). Чистота выделенных В-лимфоцитов составляла не менее 98 % [9].

Молекулярное клонирование. Ген, кодирующий полипептид LIF, собирали на основе плазмиды pFUSE-hIgG1-Fc2 (Invivogen, США), которая кодирует сигнальный пептид ИЛ-2, состоящий из 20 аминокислотных остатков, и следующий за ним Fc-фрагмент IgG. В состав Fc-фрагмента входила шарнирная область [APLEPKSS], а также CH2- и CH3-домены IgG1 человека. Синтез нуклеотидной последовательности, которая кодировала тримеризующий изолейциновый зиппер, фланкированный гибкими линкерами [LGGGS] и [GHGGGS], заказывали в Synbio Technologies (Китай). Нуклеотидную последовательность внеклеточного домена CD40L (а. к. 112-261) амплифицировали из плазмиды EX-G0117-Lv105-CD40L (Genecopoeia, США). Тримеризующий изолейциновый зиппер и внеклеточный домен CD40L методом ПЦР с удлинением перекрытия добавляли на 3'-конец открытой рамки считывания вектора pFUSE-hIgG1-Fc2.

Ген, кодирующий полипептид LA, собирали на основе вектора pCMVpA, предназначенного для временной экспрессии целевого гена в клетках млекопитающих. В векторе сайты множественного клонирования расположены между CMV-промотором и сигналом полиаденилирования (polyA) из позднего антигена вируса SV40. В качестве сигнальной последовательности слитого LA использовали сигнальный пептид адипонектина [MLLLQALLFLLILPSHA], за которым следовала гистидиновая метка, состоявшая из 8 последовательно расположенных остатков гистидина. Затем следовала нуклеотидная последовательность адипонектина мыши (а. к. 18-111). Синтез этой части гена LA заказывали в Synbio Technologies (Китай). Нуклеотидную последовательность внеклеточного домена CD40L (а. к. 116-261) амплифицировали из плазмиды EX-G0117-Lv105-CD40L (Genecopoeia, США). Фрагмент адипонектина и CD40L сливали в одну последовательность методом ПЦР с удлинением перекрытия и клонировали на 3’-конец открытой рамки считывания вектора pCMVpA. Корректность полученных генов определяли путем секвенирования по Сэнгеру. Для выделения плазмид использовали наборы NucleoBond Xtra Midi ("Marcherey-Nagel", США).

Получение рекомбинантных белков. Tрансфекцию клеток HEK293 проводили в 10 см чашках Петри (Costar, США). 3,6 · 106 клеток в среде DMEM с добавлением 10 % ЭТС трансфецировали 30 мкг плазмидной ДНК. Для этого экспрессионные плазмиды, кодирующие LIF или LA, разводили стерильной водой до 675 мкл. К полученному раствору добавляли 75 мкл 2,5 мM CaCl2 и 750 мкл раствора, содержавшего 50 мM HEPES, 1,5 мM Na2HPO4, 280 мM NaCl, 10 мM KCl и 12 мM сахарозы. Полученную смесь общим объемом 1500 мкл распределяли по поверхности чашки Петри, перемешивая содержимое несколькими орбитальными движениями. Через 5-8 ч среду меняли на свежую бессывороточную среду FreeStyle 293 (Gibco, США). Через 5 дней культивирования культуральный супернатант собирали, концентрировали на патроне Amicon Ultracel - 50K (Merck, США) в 20 раз и использовали в качестве источника LIF и LA.

Иммунопреципитация, ДСН-ПААГ-электрофорез и вестерн-блоттинг. Иммунопреципитацию проводили путем добавления 1 мл клеточного супернатанта к 20 мкл сефарозы с протеином А (Thermo Fisher Scientific, США) с преформированным на ней комплексом преципитирующего антитела против CD40L (клон LGF3 был ранее получен в нашей лаборатории [9]) и последующей инкубации в течение ночи при 4 °C. Иммунопреципитаты отмывали трижды, каждый раз добавляя по 1 мл PBS. Связавшиеся белки элюировали с носителя прогреванием иммунопреципитатов с буфером образца для электрофореза в течение 5 мин при 95 °C. Элюированные белки разделяли электрофорезом в 12 % полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) в редуцирующих и нередуцирующих условиях в буферной системе Лэммли. Разделенные белки полусухим методом переносили из геля на PVDF-мембрану (Merck, США). Мембрану обрабатывали первичными антителами против IgG человека (клон CH1 был ранее получен в нашей лаборатории [9]) или против HisTag (BioLegend, США). Далее комплекс антиген-антитело проявляли вторичными антителами против IgG мыши, меченными пероксидазой хрена (GE Healthcare, США). Визуализацию блотов проводили на приборе ChemiDoc XRS (Bio-Rad, США) с использованием реагентов для хемилюминесценции (Merck, США). В качестве стандартов молекулярной массы использовали набор предокрашенных маркеров Prestained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Fisher Scientific, США).

Стимуляция лимфоцитов in vitro. Выделенные В-лимфоциты культивировали в среде DMEM с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES (все "Панеко", Россия). При бесфидерной стимуляции В-лимфоциты культивировали 7 дней в присутствии 25 нг/мл ИЛ-21 и препарата LIF или LA в разведении 1 : 10. В условиях фидерной стимуляции вместо препаратов LIF или LA использовали фидерные клетки A549, несущие CD40L и обработанные 10 мкг/мл митомицина-С ("Киова Хакко Когио", Япония) [10]. При олигоклональной бесфидерной стимуляции В-лимфоциты культивировали 20 дней в присутствии смеси лимфокинов, состоявшей из 10 нг/мл ИЛ-21, 10 нг/мл ИЛ-4, 50 нг/мл ИЛ-2, 10 нг/мл BAFF (все Peprotech, США) и LA в разведении 1 : 10. Культивирование проводили при 37 °C в 5 % CO2.

Проточная цитометрия. Для окрашивания лимфоцитов использовали следующие моноклональные антитела: CD3-FITC (клон TB3), CD14-FITC (клон LT14), CD16-FITC (клон LNK16), CD19-PE (клон LT19), CD27-PECy5.5 (клон LT27), CD38-PECy7 (клон LT38), а также антитело против IgG человека (клон CH1). Указанные моноклональные антитела ранее были получены в нашей лаборатории [11]. Использовали также моноклональные антитела CD40L-PE (клон 24-31, BioLegend, США), CD138-APC (клон MI15, Sony, США), TACI-PECy7 (клон 1A1, Sony, США). Флуоресценцию клеток регистрировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США), оснащенного двумя диодными лазерами (488 и 561 нм). Клетки сортировали на проточном сортировщике SH800S (Sony Biotechnology, США). Обработку цитофлуориметрических данных проводили при помощи программы FlowJo X 10.0.7 (Becton Dickinson, США).

Определение Ig методом иммуноферментного анализа (ИФА). IgG и IgM человека определяли с помощью наборов Total Uncoated ELISA Kit (Invitrogen, США) согласно протоколу производителя. Оптическую плотность при 450 нм измеряли с помощью фотометра BioRad iMark Microplate Absorbance Reader (BioRad, США). Данные анализировали с помощью программы Zemfira 4.0 (BioRad, США).

Статистическая обработка. Статистическая обработка данных проведена с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версия 8.4.3 (GraphPad, США). Значимость различий между выборками оценивали с помощью критерия Краскела-Уоллиса и теста Данна. Различия сравниваемых параметров считались статистически значимыми при p ≤ 0,05. Данные на гистограммах показывают среднюю арифметическую величину. Разбросы показаны как среднеквадратические отклонения.

Результаты

Биохимическая характеристика рекомбинантных белков, содержащих рецепторный домен CD40L

Для получения растворимых рекомбинантных белков, содержащих рецепторный домен CD40L, нами были созданы 2 плазмиды, кодирующие внеклеточную часть CD40L (а. о. 116-261). CD40L относится к трансмембранным белкам типа II, у которых C-конец обращен в межклеточное пространство. Чтобы у рекомбинантного CD40L сохранить правильную ориентацию, мультимеризующие домены были слиты с N-концом CD40L. Для получения гексамеризованных форм CD40L мы использовали 2 конструкции.

В первой конструкции N-конец рецепторной части CD40L сливали с C-концом Fc-фрагмента IgG человека. S-S-связи в шарнирной области Fc-фрагмента должны обеспечивать димеризацию CD40L. Между Fc-фрагментом и рецепторной частью CD40L дополнительно вводили тримеризующий изолейциновый зиппер. В результате конечная конструкция, которая получила условное обозначение LIF, должна находиться в гексамеризованном состоянии (рис. 1А). В другой конструкции N-конец рецепторной части CD40L сливали с C-концом коллагеноподобного домена сывороточного адипонектина мыши (a. о. 18-111), который имеет склонность к образованию тримеров, гексамеров и олигомеров более высокого порядка [12]. Согласно рентгеноструктурным данным, коллагеноподобный домен приводит к образованию мультимеров в виде букета [13, 14]. Конструкция адипонектин-CD40L получила условное обозначение LA (рис. 1Б).

Соответствующие плазмиды были временно трансфецированы в клетки HEK293. Через 2 дня после трансфекции клетки при внутриклеточном окрашивании демонстрировали высокую экспрессию рецепторного домена CD40L (рис. 1В). При трансфекции LIF клетки также экспрессировали Fc-фрагмент IgG (рис. 1В). Через 5 дней после трансфекции культуральные супернатанты собирали и анализировали с помощью вестерн-блоттинга. При прямом блоттинге интенсивность полос была довольно слабая, поэтому для увеличения чувствительности перед вестерн-блоттингом проводили иммунопреципитацию. Белок LIF после иммунопреципитации на сефарозе с протеином А мигрировал в ДСН-ПААГ-электрофорезе в редуцирующих условиях в виде полосы, которая соответствовала белку с молекулярной массой (ММ) ~ 55 кДа (рис. 1Г), что было несколько выше, чем расчетное значение 47,4 кДа. Возможно, это превышение связано с гликозилированием белка LIF. В нередуцирующих условиях LIF мигрировал как белок с ММ 100 кДа (рис. 1Г), что примерно соответствовало димерной форме этого белка. В присутствии ДСН тримеризующий изолейциновый зиппер не работает и гексамеризованная форма LIF распадается.

Аналогичные результаты были получены для белка LA. После выделения белка на сефарозе с антителом против CD40L и последующего электрофореза в редуцирующих или нередуцирующих условиях и проявления с помощью анти-HisTag антитела LA обнаруживался в районе 30 и 85 кДа соответственно (рис. 1Д). Эти полосы примерно соответствовали его мономерной и тримерной форме. При ДСН-ПААГ-электрофорезе мы не наблюдали более мультимеризованных форм LA. Вероятно, они неустойчивы в присутствии ДСН и после прогрева образцов перед электрофорезом [15]. Таким образом, полученные рекомбинантные белки по своим биохимическим свойствам соответствовали заявленным конструкциям.

Функциональная характеристика рекомбинантных белков, содержащих рецепторный домен CD40L

В-лимфоциты получали методом магнитной сепарации. Чистота полученных В-лимфоцитов составляла не менее 98 %. В-лимфоциты высевали в лунки 96-луночных планшетов по 5000 клеток на лунку. К клеткам добавляли препараты LIF и LA в разведении 1 : 10. В контроле клетки высевали на фидерные клетки A549, экспрессирующие на своей поверхности CD40L. Во все культуры добавляли экзогенный ИЛ-21 (25 нг/мл). К сожалению, мы не располагали тест-системой для количественного определения LIF и LA. В предварительных экспериментах при титровании LIF и LA были подобраны разведения, которые обеспечивали выход на плато по стимулирующей активности. Препарат LA на 7-й день культивирования обеспечивал пролиферацию В-лимфоцитов примерно на уровне фидерной системы (рис. 2). Препарат LIF по сравнению с фидерной системой в 3 раза хуже стимулировал рост клеток. На 7-й день культивирования доля плазмабластов (CD27+CD38+) в культуре с LA достигала 43 % и была выше, чем в культуре с фидерными клетками (26 %) или при бесфидерной стимуляции с помощью LIF (22 %). Доля плазматических клеток (CD138+) при бесфидерной стимуляции с LA была ниже, чем в фидерной культуре (26 против 43 %), однако эти культуры не отличались между собой по экспрессии маркера активированных В-лимфоцитов молекуле TACI (Transmembrane activator and CAML interactor), которая является рецептором лимфокинов APRIL и BAFF [16]. Таким образом, препарат LA по физиологическим характеристикам не уступал природному CD40L, экспрессированному на поверхности фидерных клеток, и намного превышал препарат LIF. Для дальнейших экспериментов мы использовали препарат LA.

Бесфидерная стимуляция олигоклональных культур В-лимфоцитов

В-лимфоциты выделяли с помощью проточного цитометра по фенотипу CD19+CD3-CD14-CD16-. Чистота полученных В-лимфоцитов составляла не менее 95 %. Клетки пересчитывали, делали серийные разведения с шагом в 2 и переносили в лунки 384-луночного планшета, рассевая от 250 и до 1 клетки на лунку. В каждую лунку также добавляли белок LA в разведении 1 : 10 и коктейль цитокинов, содержавший рИЛ-21 (10 нг/мл), рИЛ-2 (50 нг/мл), рИЛ-4 (10 нг/мл), rBAFF (10 нг/мл). На 20-й день стимуляции супернатанты клеточных культур собирали и секрецию IgG и IgM антител оценивали методом ИФА (рис. 3).

По мере уменьшения количества В-клеток на лунку пропорционально падала оптическая плотность при определении уровня секретированного IgG и IgM. Начиная с некоторой концентрации клеток, обнаруживались лунки с фоновыми значениями оптической плотности. С уменьшением количества клеток доля "нулевых" лунок увеличивалась, однако даже при рассеве по 1 клетке на лунку обнаруживались лунки с оптической плотностью выше фона. Обращает на себя внимание, что в лунках с малой плотностью клеток положительные сигналы для IgG и IgM регистрировались альтернативно. Исключением являлась только лунка H3, которая имела положительный сигнал как по IgG, так и по IgM. При визуальном контроле в лунках с положительным сигналом Ig, отмечался рост клонов. Учитывая распределение Пуассона, а также тот факт, что в рядах от F до I встречаются негативные лунки, можно утверждать, что в позитивных лунках этих рядов с высокой вероятностью присутствовали единичные клоны. Полученные данные демонстрируют, что растворимый рекомбинантный CD40L, мультимеризованный путем слияния с коллагеноподобным доменом адипонектина, обеспечивал бесфидерную стимуляцию В-лимфоцитов в олигоклональных и даже в моноклональных условиях.

Обсуждение

Белок CD40L принадлежит к ФНО-суперсемейству, в которое входят также такие важные сигнальные молекулы, как OX40L, FasL, CD27L, CD30L, GITRL, CD137L и некоторые другие. Все они относятся к трансмембранным белкам типа II, которые характеризуются внеклеточным C-концом и имеют внеклеточный ФНО-подобный домен [7]. Молекулы из ФНО-суперсемейства играют решающую роль в поддержании иммунного гомеостаза, например, подавая костимулирующие сигналы соседним антиген-презентирующим клеткам и лимфоцитам или, напротив, посылая сигналы апоптоза избыточно активированным иммунным клеткам [17].

Ключевая особенность этого типа белков заключается в том, что для функциональной активности они должны находиться в мультимеризованном состоянии. Эти молекулы уже давно рассматриваются в качестве основы для создания иммунотерапевтических препаратов [18], однако при их получении и использовании необходимо учитывать, что адекватной функциональной активности можно добиться, только получив тримеры или олигомеры этих лигандов. Как правило, олигомеризация этих молекул повышает их активность на несколько порядков. Олигомеризация достигается за счет использования различных приемов. Самым простым способом, который применялся в ранних работах, являлось кросс-линкирование с помощью антител против пептидной последовательности, включенной в его состав [19]. Однако в общем случае такой подход оказался малоэффективным.

Более успешный пример мультимеризации - включение в состав лиганда изолейцинового зиппера. Ранее прием мультимеризации за счет изолейцинового зиппера был использован для одного из белков этого семейства - лиганда рецептора ФНО, индуцированного глюкокортикоидами (GITRL) человека [20]. Мультимеризация рекомбинантного белка GITRL приводила к многократному повышению его цитотоксической активности по сравнению с мономерной формой [21]. Далее тримерный FasL, полученный с помощью изолейцинового зиппера, был дополнительно гексамеризован за счет слияния с Fc-фрагментом IgG человека [22]. Этот же прием был использован для гексамеризации OX40L - другого белка из ФНО-суперсемейства [23]. Была также предпринята попытка мультимеризации CD40L с использованием в качестве пентамеризующего каркаса спирального домена белка хрящевого олигомерного матрикса (COMP) [24], однако функциональная активность такого рекомбинантного белка была невысокой.

Ранее было отмечено, что рецепторные домены молекул ФНО-суперсемейства имеют структурную гомологию с C-концевым коллагеноподобным доменом белка адипонектина, который, в свою очередь, принадлежит к семейству белков первого компонента комплемента C1q. Адипонектин представляет собой сывороточный белок, секретируемый адипоцитами, который стимулирует сжигание жирных кислот и взаимодействует с инсулином при регуляции гликемии [13]. Интересно, что коллагеноподобный домен адипонектина проявляет склонность к олигомеризации. На основании структурной гомологии адипонектина и молекул ФНО-суперсемейства было сделано предположение о том, что адипонектин может представлять удобный и естественный каркас для гексамеризации молекул ФНО-суперсемейства. Впервые эта идея была использована для мультимеризации молекулы Fas-лиганда (FasL) [22].

Для гексамеризации CD40L мы использовали ранее высказанные идеи мультимеризации за счет совместного действия Fc-фрагмента IgG и тримеризующего изолейцинового зиппера, а также за счет фибриллярного домена адипонектина. Оба подхода дали функционально активные рекомбинантные белки, однако было обнаружено, что LA обладал более высокой физиологической активностью, чем LIF. Возможно, это связано с тем, что адипонектин может приводить к образованию не только гексамеров, но и мультимеров более высокого порядка [25], которые обладают повышенной функциональной активностью. Нельзя исключить, что в молекуле LA геометрия расположения доменов рецепторной части CD40L более способствует корректному взаимодействию с рецептором CD40, чем в молекуле LIF.

Последние годы были ознаменованы значительными успехами в получении и функциональном анализе кратковременных клонов В-лимфоцитов. Такая работа в значительной степени была стимулирована интенсивными исследованиями, связанными с пандемией COVID-19 и SARS-CoV-2 инфекцией [26]. Это направление исследований даже получило самостоятельное название - single-cell multiomics [27]. Блок-схему методики можно описать следующим образом: выделение антиген-специфических В-клеток памяти; стимуляция В-клеток in vitro; получение кратковременных клонов В-лимфоцитов; тестирование моноклональных антител в тестах на связывание с панелью антигенов, а также в функциональных тестах по вирус-нейтрализации; отбор наиболее интересных клонов; секвенирование генов Ig; получение моноклональных антител с хорошим терапевтическим потенциалом [28].

Пользуясь этой методикой, некоторые лаборатории уже получили многие сотни человеческих моноклональных антител [27]. Наша работа была сосредоточена на получение препаратов, пригодных для бесфидерной стимуляции В-лимфоцитов. Нами были получены препараты растворимого рекомбинантного CD40L с высокой физиологической активностью. Это открывает возможности для получения кратковременных клонов В-лимфоцитов и изучения репертуара В-клеточных рецепторов. Предполагается, что в последующем эту методику можно будет использовать для изучения тонкой антигенной специфичности полученных клонов, а также для секвенирования генов Ig.

Заключение

Рекомбинантные мультимеризованные белки, содержащие рецепторный домен CD40L, обладают хорошей стимулирующей активностью в отношении В-лимфоцитов периферической крови. CD40L, мультимеризованный за счет слияния с коллагеноподобным доменом адипонектина, проявляет более высокую физиологическую активность, чем CD40L, мультимеризованный с помощью Fc-фрагмента IgG и тримеризующего изолейцинового зиппера. Слитый белок адипонектин-CD40L можно использовать для бесфидерной стимуляции единичных или олигоклональных популяций В-лимфоцитов.

Литература

1. Inoue T., Kurosaki T. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 2023. DOI: https://doi.org/10.1038/s41577-023-00897-3

2. Cancro M.P., Tomayko M.M. Memory B cells and plasma cells: The differentiative continuum of humoral immunity. Immunol. Rev. 2021; 303: 72-82. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.13016

3. Boonyaratanakornkit J., Taylor J.J. Techniques to study antigen-specific B cell responses. Front. Immunol. 2019; 10: 1694. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2019.01694

4. Henn A.D., Rebhahn J., Brown M.A., Murphy A.J., Coca M.N., Hyrien O., Pellegrin T., Mosmann T., Zand M.S. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. J. Immunol. 2009; 183: 3177-87. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.0804233

5. Byazrova M., Yusubalieva G., Spiridonova A., Efimov G., Mazurov D., Baranov K., Baklaushev V., Filatov A. Pattern of circulating SARS-CoV-2-specific antibody-secreting and memory B-cell generation in patients with acute COVID-19. Clin. Transl. Immunol. 2021; 10 (2): e1245. DOI: https://doi.org/10.1002/cti2.1245

6. Byazrova M.G., Kulemzin S.V., Astakhova E.A., Belovezhets T.N., Efimov G.A., Chikaev A.N., Kolotygin I.O., Gorchakov A.A., Taranin A.V., Filatov A.V. Memory B Cells Induced by Sputnik V vaccination produce SARS-CoV-2 neutralizing antibodies upon ex vivo restimulation. Front. Immunol. 2022; 13: 840707. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.840707

7. Kucka K., Wajant H. Receptor oligomerization and its relevance for signaling by receptors of the tumor necrosis factor receptor superfamily. Front. Cell. Dev. Biol. 2021; 8: 615141. DOI: https://doi.org/10.3389/fcell.2020.615141

8. Naito M., Hainz U., Burkhardt U.E., Fu B., Ahove D., Stevenson K.E., Rajasagi M., Zhu B., Alonso A., Witten E., Matsuoka K., Neuberg D., Duke-Cohan J.S., Wu C.J., Freeman G.J. CD40L-Tri, a novel formulation of recombinant human CD40L that effectively activates B cells. Cancer Immunol. Immunother. 2013; 62: 347-57. DOI: https://doi.org/10.1007/s00262-012-1331-4

9. Бязрова М.Г., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Васильева Ю.В., Прилипов А.Г., Филатов А.В. Стимуляция В-лимфоцитов человека in vitro с помощью ИЛ-21/CD40L и их характеристика. Иммунология. 2020; 41 (6): 501-10. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-6-501-510

10. Астахова Е.А., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Бязрова М.Г., Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов А.В. Стимуляции В-клеток в системе ИЛ-21/CD40L в норме и у пациентов с общей вариабельной иммунной недостаточностью. Иммунология. 2021; 41 (6): 631-40. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-631-640

11. Лушова А.А., Жеремян Э.А., Астахова Е.А., Спиридонова А.Б., Бязрова М.Г., Филатов А.В. Субпопуляции В-лимфоцитов: функции и молекулярные маркеры. Иммунология. 2019; 40 (6) 63-75. DOI: https://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16009

12. Wang Y., Lam K.S.L., Chan L., Chan K.W., Lam J.B.B., Lam M.C., Hoo R.C., Mak W.W., Cooper G.J., Xu A. Post-translational modifications of the four conserved lysine residues within the collagenous domain of adiponectin are required for the formation of its high molecular weight oligomeric complex. J. Biol. Chem. 2006; 281: 16391-400. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M513907200

13. Achari A., Jain S. Adiponectin, a therapeutic target for obesity, diabetes, and endothelial dysfunction. Int. J. Mol. Sci. 2017; 18: 1321. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms18061321

14. Wang Y., Lam K.S.L., Yau M., Xu A. Post-translational modifications of adiponectin: mechanisms and functional implications. Biochem. J. 2008; 409: 623-33. DOI: https://doi.org/10.1042/BJ20071492

15. Ruotsalainen H., Risteli M., Wang C., Wang Y., Karppinen M., Bergmann U., Kvist A.P., Pospiech H., Herzig K.H., Myllylä R. The activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3) regulate the amount and oligomerization status of adiponectin. PLoS ONE. 2012; 7: e50045. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0050045

16. Mackay F., Schneider P. TACI, an enigmatic BAFF/APRIL receptor, with new unappreciated biochemical and biological properties. Cytokine Growth Factor Rev. 2008; 19: 263-76. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cytogfr.2008.04.006

17. Locksley R.M., Killeen N., Lenardo M.J. The TNF and TNF receptor superfamilies. Cell. 2001; 104: 487-501. DOI: https://doi.org/10.1016/S0092-8674(01)00237-9

18. Dostert C., Grusdat M., Letellier E., Brenner D. The TNF family of ligands and receptors: communication modules in the immune system and beyond. Physiol. Rev. 2019; 99: 115-60. DOI: https://doi.org/10.1152/physrev.00045.2017

19. Schneider P., Holler N., Bodmer J.-L., Hahne M., Frei K., Fontana A., Tschopp J. Conversion of membrane-bound Fas(CD95) ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity. J. Exp. Med. 1998; 187: 1205-13. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.187.8.1205

20. Cui D., Wang S., Chen Y., Tong J., Ma J., Tang L., Yang X., Shi Y., Tian J., Lu L., Xu H. An isoleucine-zipper motif enhances costimulation of human soluble trimeric GITR ligand. Cell. Mol. Immunol. 2010; 7: 316-22. DOI: https://doi.org/10.1038/cmi.2010.7

21. Han J.H., Moon A.R., Chang J.H., Bae J., Choi J.M., Lee S.H. et al. Potentiation of TRAIL killing activity by multimerization through isoleucine zipper hexamerization motif. BMB Reports. 2016; 49: 282-7. DOI: https://doi.org/10.5483/BMBRep.2016.49.5.245

22. Holler N., Tardivel A., Kovacsovics-Bankowski M., Hertig S., Gaide O., Martinon F., Tinel A., Deperthes D., Calderara S., Schulthess T., Engel J., Schneider P., Tschopp J. Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex. Mol. Cell. Biol. 2003; 23: 1428-40. DOI: https://doi.org/10.1128/MCB.23.4.1428-1440.2003

23. Morris N.P., Peters C., Montler R., Hu H.-M., Curti B.D., Urba W.J., Weinberg A.D. Development and characterization of recombinant human Fc:OX40L fusion protein linked via a coiled-coil trimerization domain. Mol. Immunol. 2007; 44: 3112-21. DOI: https://doi.org/10.1016/j.molimm.2007.02.004

24. Holler N., Kataoka T., Bodmer J.-L., Romero P., Romero J., Deperthes D., Engel J., Tschopp J., Schneider P. Development of improved soluble inhibitors of FasL and CD40L based on oligomerized receptors. J. Immunol. Methods. 2000; 237: 159-73. DOI: https://doi.org/10.1016/S0022-1759(99)00239-2

25. Dadson K., Liu Y., Sweeney G. Adiponectin Action: a combination of endocrine and autocrine/paracrine effects. Front. Endocrin. 2011; 2. DOI: https://doi.org/10.3389/fendo.2011.00062

26. Zost S.J., Gilchuk P., Chen R.E., Case J.B., Reidy J.X., Trivette A., Nargi R.S., Sutton R.E., Suryadevara N., Chen E.C., Binshtein E., Shrihari S., Ostrowski M., Chu H.Y., Didier J.E., MacRenaris K.W., Jones T., Day S., Myers L., Eun-Hyung Lee F., Nguyen D.C., Sanz I., Martinez D.R., Rothlauf P.W., Bloyet L.M., Whelan S.P.J., Baric R.S., Thackray L.B., Diamond M.S., Carnahan R.H., Crowe J.E. Rapid isolation and profiling of a diverse panel of human monoclonal antibodies targeting the SARS-CoV-2 spike protein. Nat. Med. 2020; 26: 1422-7. DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-020-0998-x

27. Sokal A., Barba-Spaeth G., Hunault L., Fernández I., Broketa M., Meola A., Fourati S., Azzaoui I., Vandenberghe A., Lagouge-Roussey P., Broutin M., Roeser A., Bouvier-Alias M., Crickx E., Languille L., Fournier M., Michel M., Godeau B., Gallien S., Melica G., Nguyen Y., Canoui-Poitrine F., Pirenne F., Megret J., Pawlotsky J.M., Fillatreau S., Reynaud C.A., Weill J.C., Rey F.A., Bruhns P., Mahévas M., Chappert P. SARS-CoV-2 Omicron BA.1 breakthrough infection drives late remodeling of the memory B cell repertoire in vaccinated individuals. Immunity. 2023; 56 (9): 2137-51.e7. DOI: https://doi.org/10.1016/j.immuni.2023.07.007

28. Kotaki R., Adachi Y., Moriyama S., Onodera T., Fukushi S., Nagakura T., Tonouchi K., Terahara K., Sun L., Takano T., Nishiyama A., Shinkai M., Oba K., Nakamura-Uchiyama F., Shimizu H., Suzuki T., Matsumura T., Isogawa M., Takahashi Y. SARS-CoV-2 Omicron-neutralizing memory B cells are elicited by two doses of BNT162b2 mRNA vaccine. Sci. Immunol. 2022; 7: eabn8590. DOI: https://doi.org/10.1126/sciimmunol.abn8590

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»