Разработка экспериментальных моделей ксенотрансплантата опухолей человека на мышах для доклинических исследований in vivo препаратов для клеточной иммунотерапии

Резюме

Введение. В связи с активным развитием новых направлений в клеточной иммунотерапии остро встает вопрос подходов для проведения доклинических исследований безопасности и эффективности. Оптимальным для решения данной задачи является использование опухолевых ксенотрансплантатов для имитации опухолевого роста в организме с поддержанием гомеостаза, метаболизма и возможных механизмов толерантности к терапевтическому агенту. Эффективность такого подхода к анализу эффективности клеточных препаратов привела к следующему шагу: необходимости стандартизации методических подходов по подбору опухолевых клеточных линий человека и линий иммунодефицитных мышей.

Цель исследования - оценка эффективности формирования ксенотрансплантата у иммунодефицитных мышей различных линий для получения оптимальных моделей доклинических исследований препаратов модифицированных клеток человека.

Материал и методы. Для отработки моделей использовали мышей линий NRG (NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ) и SCID, а также линии опухолевых клеток человека SW620 (аденокарцинома толстой кишки человека), U-87MG (эпителиальная опухоль головного мозга человека), SK-MEL-37 (меланома), NW-MEL-38 (меланома) и S6 (меланома). Экспериментальным животным подкожно в область правой лопатки вводили 100 мкл суспензии опухолевых клеток в дозах 1, 3 и 5 млн/мышь с последующим измерением размера опухолевого узла.

Результаты. Была проведена оценка эффективности формирования ксенотрансплантатов различных клеточных линий человека в разных линиях мышей с иммунодефицитом. Показано, что линия мышей NRG по сравнению с мышами SCID обладает более высокой способностью по приживлению опухолевых клеточных линий, а сами клеточные линии отличаются по уровням экспрессии опухоль-ассоциированных белков и формируют ксенотрансплантат с разной эффективностью. Оптимальным оказалось использование мышей линии NRG и клеточной линии SK-MEL-37 с высоким уровнем экспрессии антигенов GD2, NY-ESO-1 и MAGE-A4. Эксперимент по терапии солидной опухоли, полученной после трансплантации животным опухолевых клеточных линий человека, с помощью анти-GD2-CAR-T-клеток показал эффективность в снижении размеров опухолевого узла при внутриопухолевом введении модифицированных клеток человека.

Заключение. Полученные результаты подтверждают эффективность использования ксенотрансплантатов для оценки эффективности противоопухолевого иммунного ответа препаратов модифицированных клеток в условиях in vivo.

Ключевые слова:опухоль; опухолевые ксенотрансплантаты; опухолевые клеточные линии; иммунодефицитные мыши; генетически модифицированные Т-лимфоциты

Для цитирования: Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю.А., Филиппова Ю.В., Фишер М.С., Облеухова И.А., Завьялов Е.Л., Соловьева О.И., Разумов И.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Разработка экспериментальных моделей ксенотрансплантата опухолей человека на мышах для доклинических исследований in vivo препаратов для клеточной иммунотерапии. Иммунология. 2023; 44 (6): 709-720. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-6-709-720

Финансирование. Исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект № 21-65-00004). URL: https://rscf.ru/project/21-65-00004/

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Лопатникова Ю.А., Сенников С.В.; работа с культурами клеточных линий - Шевченко Ю.А., Филиппова Ю.Г., Фишер М.С., Разумов И.А.; работа с первичными клетками человека - Фишер М.С., Облеухова И.А.; работа с экспериментальными животными - Завьялов Е.Л., Соловьева О.И.; получение ретровирусных конструкций - Акахори Я., Шику Х.; статистическая обработка данных - Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю.А.; написание текста - Лопатникова Ю.А., Шевченко Ю.А.; редактирование текста - Филиппова Ю.Г., Облеухова И.А., Завьялов Е.Л., утверждение окончательного варианта статьи - Сенников С.В.; ответственность за целостность всех частей статьи - Лопатникова Ю.А.

Введение

В настоящее время активно развиваются методы терапии различных злокачественных новообразований, основанные на адоптивном переносе генетически модифицированных клеточных препаратов дендритных клеток, макрофагов, НК-клеток, НКТ-клеток и T-лимфоцитов. Такой тип клеточных препаратов требует тщательного изучения безопасности и эффективности на этапе доклинических исследований, т. е. до первого введения препарата человеку.

В последние годы разрабатываются новые подходы по изучению эффективности противоопухолевого действия клеточных препаратов: модели генетически модифицированных животных, модели ксенотрансплантатов (мыши, данио рерио), а также несколько вариантов моделей in vitro (органоиды, сфероиды) [1-4]. Указанные платформы имеют собственные характеристики с точки зрения архитектуры опухоли, микроокружения, клеточного состава и гетерогенности, моделей роста и реакции на лечение. В условиях in vitro используются двух- и трехмерные системы. Классические 2D-модели не могут воспроизвести ключевые элементы микроокружения in vivo. Трехмерные сфероиды - это группы роста, сформированные in vitro, они отражают морфологическую структуру опухолей человека, они полезны для изучения эффективности лекарств [5]. Модели на животных включают химическую индукцию и генетические манипуляции, а также ксенотрансплантаты клеточных опухолевых линий или первичных опухолей человека, которые эффективно используются в доклинических исследованиях и при изучении особенностей опухолевого роста [6].

Среди вариантов ксенотрансплантации существуют два подхода: использование клеточных линий и вариант с использованием биоптата первичных опухолей пациентов, полученных во время операционного вмешательства. Эти подходы имеют свои плюсы и минусы.

К положительным характеристикам подхода с использованием опухолевых клеточных линий для формирования опухолевого узла относятся высокая воспроизводимость и стабильность результатов даже спустя длительное время. Однако подход с использованием биоптата лучше отражает взаимодействия опухоли и стромы, присутствующие в первичных опухолях, и обеспечивает высокую однотипность гистологически и генетически с исходными опухолями пациентов [7]. Однако было показано, что после 2-5 пассажей строма опухоли почти полностью замещается внеклеточным матриксом и стромальными клетками мышиного происхождения, что создает существенные проблемы для временнóго окна исследований и вносит неопределенность в различные виды исследований. Кроме того, каждая такая модель отражает состояние опухолевых клеток определенного индивидуума только на одной стадии [8].

Таким образом, доклинические исследования на иммунодефицитных мышах с трансплантацией им клеток опухолевых линий человека оптимальны для скрининга эффективности новых препаратов для клеточной иммунотерапии злокачественных заболеваний.

Основные моменты, которые необходимо учитывать при работе с ксенотрансплантатами, - это подбор оптимальной клеточной линии согласно задачам исследования (в том числе по экспрессии таргетных молекул и молекул главного комплекса гистосовместимости), подбор линии мышей, у которых данная клеточная линия будет эффективно формировать опухолевый узел в сроках и размерах, подходящих для доклинических исследований, а также подбор условий трансплантации (количество клеток, способ введения).

В нашем исследовании был проведен анализ нескольких вариантов ксенотрансплантатов в различных моделях у мышей, что может быть востребовано исследовательскими группами, занимающимися разработкой и тестированием эффективности современных клеточных препаратов иммунотерапии онкологических заболеваний для подбора наиболее адекватной и информативной модели для исследования.

Цель данного исследования - оценка эффективности формирования ксенотрансплантата у иммунодефицитных мышей различных линий для получения оптимальных моделей доклинических исследований препаратов модифицированных клеток человека.

Материал и методы

Клеточные линии. Клеточные линии SW-620 (колоректальная аденокарцинома человека), U-87 (глиобластома человека) были предоставлены ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск); SK-MEL-37 (меланома человека), NW-MEL-38 (меланома человека), S6 (меланома человека), V9 (меланома) - профессором Х. Шику (Университет Мие, Япония). Клетки культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (FBS) (HyClone, США), 2 мМ L-глютамина (ООО "БиолоТ", Россия), 5 · 10-4 М 2-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich, США), 80 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения), 10 мМ HEPES буфера (Sigma-Aldrich, США), 100 мкг/мл бензилпенициллина (ОАО "Био-синтез", Россия), в инкубаторе во влажной атмосфере при 37 °С и концентрации СО2 5 %.

Оценка экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов. Для оценки экспрессии опухоль ассоциированных белков на клетках опухолевых линий использовали следующие реагенты anti-GD-2-PE (BioLegend, США), моноклональные кроличьи антитела NY-ESO-1-PE (Cell Signaling Technology, США), моноклональные антитела MAGE-A4-Coralite 650 (ProteinTech, США) согласно инструкции производителей. Анализ проводили на проточном цитофлуориметре Attune (ThermoFisher, США).

Линии мышей. В работе использовали линии иммунодефицитных мышей NRG (NOD.Cg-Rag1tm1Mom Il2rgtm1Wjl/SzJ) и SCID (SHO-PrkdcscidHrhr). Исследование выполнено на базе Центра генетических ресурсов лабораторных животных ИЦиГ СО РАН (RFMEFI62119X0023). В работе использовали самцов и самок в возрасте 8 нед SPF-статуса. Животных содержали однополыми группами по 2-5 особей в индивидуально вентилируемых клетках (IVC) системы Opti Mice (Animal Care Systems, США) в контролируемых условиях, при температуре 21-24 °C, относительной влажности 30-50 % и световом режиме свет/темнота 12/12 ч с рассветом в 02:00. Корм Ssniff (Германия) и вода после обратного осмоса, обогащенная минеральной смесью, животным предоставлялись ad libitum.

Трансплантация и оценка эффективности формирования опухолевого узла. За 2-3 нед до начала эксперимента опухолевые клетки размораживали и культивировали в течение 4-5 пассажей на среде RPMI-1640 с 10 % FBS (HyClone, США), при 37 °С в культуральных пластиковых флаконах (TPP, Швейцария). Перед инъекцией клетки опухоли снимали с подложки смесью раствора трипсина и раствора Версена (БиолоТ, Россия) и после 5 мин центрифугирования при 1000 об/мин осадок тщательно ресуспендировали в среде без сыворотки. Для получения ксенотрансплантатов животным подкожно в область правой лопатки вводили 100 мкл суспензии клеток в культуральной среде. При проведении экспериментальной терапии клетки анти-GD2-CAR-T вводили внутривенно или в районе формирующегося опухолевого узла в объеме 50 мкл.

Эксперименты были выполнены с соблюдением принципов гуманности в соответствии с директивой Европейского сообщества (86/609/ЕЕС). В течение эксперимента состояние мышей регистрировали каждые 2-3 сут. В частности, оценивали изменения состояния кожных покровов, двигательной активности и поведения. Если мышь демонстрировала выраженные признаки токсичности (например, изогнутость, сгорбленность, снижение активности), потерю массы тела > 20 % или значительный объем ксенотрансплантата, этих особей выводили из эксперимента в соответствии с требованиями гуманного отношения к животным с помощью передозировки CO2, сопровождаемой цервикальной дислокацией. Для оценки объемов ксенотрансплантатов при помощи штангенциркуля определяли линейные размеры опухоли и затем рассчитывали объем по формуле: V = а × b2 × 0,52 (a - длина, b - ширина).

Получение CAR-T-GD-2-клеток. МНК выделяли из периферической крови на градиенте плотности фиколла-урографина. Далее 1 млн МНК в 2 мл среды GT-T551 (Takara Bio, Япония) с добавлением 300 ед/мл ИЛ-2 (Ронколейкин, Россия), 6 мкл/мл сыворотки IV группы крови человека высевали в лунку 12-луночного планшета, заранее покрытого 400 мкл раствора, содержащего 25 мг/мл ретронектина (Takara Bio, Япония) и 5 мг/мл анти-CD3-антител (Biolegend, США). На 2-е и 3-и сутки культивирования меняли половину среды. На 3-и сутки готовили планшеты для ретровирусной трансдукции. Для получения CAR-T-клеток, специфичных к антигену GD-2, лимфоциты условно-здорового донора трансдуцировали ретровирусными векторами (синтезированы научной группой профессора Х. Шику на базе Высшей школы медицины Университета Мие). Растворы ретровирусов размораживали при 37 °С и разводили в соотношении 1 : 4.

Далее 1 мл полученного раствора переносили в лунку 24-луночного планшета, заранее покрытого 25 мг/мл ретронектина (Takara Bio, Япония) и центрифугировали с ускорением 2000 g 2 ч при 32 °С. После центрифугирования раствор ретровируса удаляли и в лунки добавляли 1,5-2 · 105 полученных лимфоцитов (преимущественно CD3+-лимфоцитов после анти-CD3-стимуляции), в среде RPMI-1640, содержащей 10 % FBS (Invitrogen, США), 2 мМ L-глутамина (ООО "БиолоТ", Россия), 5 · 10-4 М 2-меркаптоэтанола (Sigma-Aldrich, США), 80 мкг/мл гентамицина (KRKA, Словения), 10 мМ HEPES-буфера (Sigma-Aldrich, США), 100 мкг/мл бензилпенициллина (ОАО "Био-синтез", Россия). Клетки в планшетах центрифугировали при ускорении 1000 g 10 мин при 32 оС. На 4-й день трансдукцию повторяли и через 4-5 ч клетки переносили в 6-луночные планшеты в 3,5 мл культуральной среды. На 7-й день полученные клетки использовали для инъекции экспериментальным животным.

Статистическая обработка. Статистическую обработку данных проводили с использованием программного обеспечения STATISTICA 7.0 (StatSoft, США). В качестве порогового уровня статистической значимости во всех проводимых анализах использовался p < 0,05. Данные для количественных показателей представлены в виде среднего и ошибки среднего, сравнение независимых выборок с определением статистической значимости отличий проводилось с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Результаты

Сравнительная эффективность формирования ксенотрансплантатов опухолевыми клеточными линиями SW-620 и U-87 у мышей линий NRG и SCID

Для эффективного приживления трансплантируемых клеток человека используются модели на мышах с генетическим иммунодефицитом, однако разные линии мышей имеют различные повреждения системы иммунитета, что является определяющим фактором в эффективности формирования ксенотрансплантата. Линии мышей NRG и SCID имеют минимальное количество Т- и В-лимфоцитов с олигоклональным репертуаром рецепторов. Успешность трансплантации солидных опухолей мышам линии SCID, согласно данным литературы, составляет 20-50 %, тогда как для линии NRG данный показатель достигает значений 95-100 %.

При исследовании динамики роста ксенотрансплантата SW620 (рис. 1) оказалось, что как для NRG, так и для SCID характерен устойчивый рост опухолевого узла при введении опухолевых клеток в дозе 5 млн/мышь на протяжении всего периода наблюдения, а именно до 30 сут с момента введения клеток. При этом объемы опухолевых узлов для различных линий на 30-е сутки не различались. При оценке размеров ксенотрансплантатов у мышей NRG с различной дозой введения клеток, оказалось, что динамика роста и объемы опухолевых узлов у животных, которым вводили 3 и 5 млн клеток, практически не различалась.

Рост ксенотрансплантатов с дозой введения 1 млн клеток замедлялся начиная с 23-х суток после введения клеток относительно опухолевых узлов у мышей с другими дозами введения клеток. Иная картина наблюдалась при оценке роста ксенотрансплантатов, полученных введением клеток глиобластомы человека U-87MG (рис. 2).

Для мышей линии NRG было обнаружено, что при введении 5 млн клеток ксенотрансплантаты демонстрировали высокие темпы роста, начиная с 16-х суток, по сравнению с ксенотрансплантатами, полученными введением 1 и 3 млн клеток (рис. 2А). Причем эти темпы превосходили темпы роста опухолевого узла, полученного введением 5 млн клеток мышам SCID (рис. 2Б). Кроме того, рост ксенотрансплантатов значительно отставал у мышей SCID от NRG для всех доз и при введении 5 млн клеток соответствовал темпам, которые отмечались для ксенотрансплантатов, полученных введением 1 или 3 млн клеток мышам NRG. Таким образом, было показано, что инокуляция клеток SW620 и U-87MG во всех использованных дозах (1, 3, 5 млн на животное) позволяет получить стабильно растущие гетеротопические ксенотрансплантаты у иммунодефицитных мышей линии NRG. Для получения ксенотрансплантатов глиобластомы или карциномы кишечника с целью проведения каких-либо исследований наиболее подходящими являются модели, полученные введением 3 млн клеток как U-87MG, так и SW620 мышам линии NRG.

Анализ уровня экспрессии специфических опухолевых антигенов на клеточных линиях SK-MEL-37, NW-MEL-38 и S6

Одним из важных этапов подбора оптимальной клеточной линии для проведения экспериментов по ксенотрансплантации является оценка поверхностных и внутриклеточных таргетных молекул. Клеточные линии SK-MEL-37, NW-MEL-38 и S6 были проанализированы по экспрессии опухоль-ассоциированных белков: GD2, HER2, MAGE-A4, NY-ESO-1 (рис. 3).

Показано, что клеточные линии значимо различались по экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов, в частности клеточная линия меланомы SK-MEL-37 экспрессировала все исследуемые антигены почти на 100 % клетках и с высокой плотностью, тогда как линия меланомы NW-MEL-38 не экспрессировала GD-2, уровень экспрессии MAGA-A4 был аналогичным с клеточной линией SK-MEL-37, а содержание клеток с экспрессией NY-ESO-1 в среднем составляло 83 %. Линии S6 и V9 являются оппозитными по экспрессии GD-2.

Сравнительная эффективность ксенотрансплантатов опухолевых клеточных линий SK-MEL-37, NW-MEL-38 и S6 у мышей линий NRG

Анализ экспрессии опухоль-ассоциированных антигенов показал, что клетки линии меланомы SK-MEL-37 экспрессируют все исследуемые опухолевые антигены (GD2, MAGE-A4, NY-ESO-1) с относительным содержанием от 80 до 100 %. Для сравнительного исследования скорости роста ксенотрансплантатов клетки линии SK-MEL-37 вводили подкожно в дозах по 1, 3 и 5 млн/мышь (рис. 4).

Для дозы 5 млн/мышь был характерен устойчивый рост опухолевого узла на протяжении всего периода наблюдения и начиная с 30-х суток значимо отличался от группы с введением дозы 3 млн/мышь.

Для клеточной линии NW-Mel-38, которая показала высокий уровень экспрессии опухолевых антигенов MAGE-A4 и NY-ESO-1, для подбора оптимальной дозы и срока развития опухоли трем группам мышей (по 5 мышей в группе) выполнено введение опухолевых клеток в дозах 1, 3 и 5 млн/мышь (рис. 5).

Для данной опухолевой линии показано, что объемы опухолевых узлов 300 мм3 были достигнуты одновременно на срок 16 сут после инокуляции в дозах 3 и 5 млн/мышь. Однако при дальнейшем росте ксенотрансплантата в группе мышей с дозой введения 3 млн/мышь наблюдался более выраженный рост опухолевого узла. Доза 1 млн/мышь, как и в случае с клеточной линией SK-Mel-37, показала значимо меньшую эффективность формирования опухолевого узла.

Для проверки эффективности формирования ксенотрансплантата была также проверена линия S6, которая является производной от линии SK-Mel-37 и активно используется в Mie University Graduate School of Medicine Department of Personalized Cancer Immunotherapy Center for Comprehensive Cancer Immunotherapy (Япония) как мишень для GD2-специфических клеток. Однако в наших экспериментах у мышей линии NRG данная клеточная линия не показала формирования опухолевого узла (рис. 6). Введение дозы 5 млн/мышь привело к полной самоэлиминации опухолевого узла к 21-м суткам, а дозы 1 и 3 млн/мышь вообще не способны были сформировать опухолевый узел.

Таким образом, нами показаны существенные различия в росте опухоли с помощью различных линий клеток, что еще раз подчеркивает необходимость внимательного подбора клеточных линий как по экспрессии целевых антигенов, так и по эффективности формирования ксенотрансплантата у мышей различных линий.

Полученные данные подтверждают эффективность модели ксенотрансплантата с использованием клеточных линий SK-MEL-37 и NW-MEL-38 для оценки эффективности противоопухолевых препаратов, нацеленных на такие молекулы, как GD2, NY-ESO-1, MAGE-A4.

Экспериментальная терапия анти-GD2-CAR-T-клетками опухолей ксенотрансплантата линии SK-Mel-37

Мышам линии NRG было выполнено подкожное введение клеток линии SK-Mel-37 в дозе 5 млн/мышь и по достижении среднего объема опухоли 100 мм3 начата экспериментальная терапия. Были сформированы следующие группы по 8 мышей:

1. Интактная группа.

2. Контроль с внутривенным введением активированных Т-лимфоцитов в дозе 8 млн/мышь.

3. Контроль с внутриопухолевым введением активированных Т-лимфоцитов в дозе 8 млн/мышь.

4. Терапия с внутривенным введением анти-GD2-CAR-T-клеток в дозе 8 млн/мышь.

5. Терапия с внутриопухолевым введением анти-GD2-CAR-T-клеток в дозе 8 млн/мышь.

Для получения CAR-T клеток был выбран донор, у лимфоцитов которого по результатам предыдущих экспериментов была показана максимальная эффективность трансдукции и хорошая пролиферативная активность. Эффективность трансдукции составила 72 %. В качестве контроля были использованы активированные Т-лимфоциты, полученные в тех же экспериментальных условиях, но без трансдукции ретровирусным вектором. В первые 2 нед после введения клеток человека группа с внутриопухолевым введением анти-GD2-CAR-T-клеток показала значимое снижение размера опухолевого узла по сравнению с группами контроля и интактной группой (рис. 7).

Обсуждение

Бурное развитие новых подходов в клеточной иммунотерапии привело к острой потребности в стандартизированных методах для оценки эффективности получаемых препаратов на этапе доклинических исследований [1]. Все разнообразные варианты культуральных экспериментов, включая 3D-модели сфероидов, не могут обеспечить условия, которые создаются в живом модельном организме. С этой точки зрения поиск сочетаний линий мышей и линий клеток с определенным ландшафтом экспрессии опухоль-ассоциированных и опухоль-специфических белков имеет большое значение для формирования платформы для проведения доклинических исследований с возможностью стандартизации.

При сравнении ксенотрансплантатов у мышей с помощью клеточных опухолевых линий и биоптатов первичных опухолей человека можно заключить, что, несмотря на сохранность гистологической и клеточных структур первичной опухоли у экспериментальных животных данный вариант оптимален для изучения биологии опухоли, но не для скрининга эффективности различных вариантов препаратов, поскольку не может обеспечить длительной стабильности результатов [8].

Таким образом, подход с формированием у мышей опухолевого узла из клеточных линий представляется оптимальным для доклинических исследований. Однако в данном направлении остро встают вопросы подбора линии мышей и линии клеток с экспрессией специфических молекул. Иммунодефицитные мыши с возможностью переноса иммунокомпетентных клеток человека представляют собой эффективные модели для изучения иммунологии человека in vivo, а модели на основе ксенотрансплантатов являются важным инструментом оценки взаимодействия иммунных клеток с опухолевыми. В настоящее время для создания моделей на основе ксенотрансплантатов используются несколько линий мышей с иммунодефицитом: голые мыши, мыши с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), мыши SCID/Beige, мыши с диабетом без ожирения (NOD), мыши NOD/SCID, мыши NSG/NRG. Линии мышей с мутациями IL2rg (такие как NRG, NSG) обладают сильно выраженным иммунодефицитом и в основном используются для доклинических исследований эффективности терапии онкологических заболеваний [9, 10]. Разные линии мышей имеют различную степень иммуносупрессии и, таким образом, у них наблюдается разная скорость приживления ксенотрансплантатов, которая выше у мышей с более ослабленным иммунитетом (BRG/BRJ > NSG/NRG > NOD/SCID > SCID > nude) [8].

Мы также подтвердили, что мыши линии SCID имеют существенно меньший потенциал по приживлению клеточных линий человека, что объясняется более слабым подавлением собственного иммунитета. Линия мышей NRG в свою очередь показала высокую перспективность в качестве базы для проведения экспериментов по оценке эффективности клеточной терапии солидных опухолей.

Только для одной исследуемой линии S6 (меланома) было обнаружено отсутствие формирующихся опухолевых узлов при введении низкой дозы клеток опухоли, а при высоких дозах формирующийся опухолевый узел самоэлиминировался в течение 10-14 сут, что свидетельствует о высокой антигенности данных клеток.

Для двух клеточных линий (SK-MEL-37 и NW-MEL-38) линия мышей NRG показала эффективное приживление и рост опухолевого узла без признаков элиминации в течение 30 дней. Клетки линии SK-Mel-37 экспрессируют поверхностный антиген GD2 и внутриклеточные антигены NY-ESO-1, MAGE-A4, что было подтверждено с помощью моноклональных антител. Все эти антигены относятся к классу опухоль-ассоциированных и часто используются в качестве таргетных молекул при разработке препаратов для терапии онкологических заболеваний.

Дисиалоганглиозид GD2 экспрессируется на поверхности опухолевых клеток различного происхождения, включая меланому, нейробластому, глиобластому, рак молочной железы и ряд других [11]. NY-ESO-1 - это опухоль-ассоциированный белок, который ограниченно экспрессируется в нормальных тканях, но резко повышает уровень экспрессии в эпителиальных опухолях яичников и других солидных новообразованиях. Функция NY-ESO-1 до сих пор неизвестна, но предполагается, что он может участвовать в иммортализации, самообновлении, миграции [12]. Раково-тестикулярный антиген MAGE-A4 имеет высокий уровень экспрессии в метастазах солидных опухолей по сравнению с первичными опухолями, но отсутствует в большинстве нормальных тканей [13]. К настоящему времени для каждого описанного выше антигена активно изучаются специфические клеточные продукты: дендритные клетки, CAR-T-клетки, TCR-Т-клетки.

В эксперименте по оценке цитотоксического эффекта на солидную опухоль использовались мыши NRG, клеточная линия SK-MEL-37 и CAR-T-клетки, специфичные к GD2. Ранее было показано, что CAR-T-клетки были эффективны для лечения гематологических злокачественных новообразований [14]. При этом данных по эффективности данной терапии при солидных опухолях к настоящему моменту недостаточно, однако такие подходы активно разрабатываются [15]. В данной работе в эксперименте на солидной опухоли, индуцированной клетками меланомы, было показано, что внутриопухолевое введение лимфоцитов, трансдуцированных ретровирусной конструкцией, кодирующей CAR-GD2, приводит к значимому снижению размеров опухолевого узла. Полученные результаты свидетельствуют об эффективности модели, которая позволяет как обеспечить приживление и рост опухоли, так и функционирование трансплантированных лимфоцитов человека.

Дальнейшее развитие технологий модификации клеток на уровне генома позволяет все более тонко настраивать иммунокомпетентные клетки и обучать их корректному распознаванию опухолевых клеток. При этом следующим этапом идут доклинические исследования, на основании которых необходимо оценивать эффективность и безопасность применения клеточных продуктов при различных патологических состояниях. Таким образом, ксенотрансплантаты на экспериментальных животных представляют собой оптимальную модель как для первичного скрининга эффективности клеточных препаратов для иммунотерапии, так и для более глубокого изучения процессов противоопухолевого иммунного ответа.

Заключение

В результате исследования была проведена оценка эффективности формирования ксенотрансплантатов различных клеточных линий человека линиям мышей с иммунодефицитом. Показано, что линия мышей NRG по сравнению с линей мышей SCID обладает более высокой способностью по приживлению опухолевых клеточных линий, а сами клеточные линии отличаются по уровням экспрессии опухоль-ассоциированных белков и формируют ксенотрансплантат с разной эффективностью.

Оптимальным оказалось использование мышей линии NRG и клеточной линии SK-MEL-37 с высоким уровнем экспрессии антигенов GD2, NY-ESO-1 и MAGE-A4. Эксперимент по терапии полученной солидной опухоли с помощью анти-GD2-CAR-T-клеток показал эффективность в снижении размеров опухолевого узла при внутриопухолевом введении модифицированных клеток человека. Полученные результаты подтверждают эффективность использования ксенотрансплантатов в оценке эффективности противоопухолевого иммунного ответа модифицированных клеточных препаратов в условиях in vivo.

Литература

1. Терещенко В.П., Сенников С.В. Опухолевые ксенотрансплантаты как модель для доклинических испытаний генетически модифицированных клеточных препаратов. Иммунология. 2021; 42 (6): 730-41. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-730-741

2. Zhu Y., Huang W., Wu Y., Jia L., Li Y., Chen R., Guo L., Chen Q. Establishment of a patient-derived xenotransplantation animal model for small cell lung cancer and drug resistance model. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 2019; 22 (1): 6-14. Chinese. DOI: https://doi.org/10.3779/j.issn.1009-3419.2019.01.03

3. Mahmoudian R.A., Farshchian M., Abbaszadegan M.R. Genetically engineered mouse models of esophageal cancer. Exp. Cell Res. 2021; 406 (2): 112757. DOI: https://doi.org/10.1016/j.yexcr.2021.112757

4. Xing J., Ding P., Wan X., Xu G., Mao Y., Sang X., Du S., Yang H. Application and progress of cultured models of gallbladder carcinoma. J. Clin. Transl. Hepatol. 2023; 11 (3): 695-704. DOI: https://doi.org/10.14218/JCTH.2022.00351

5. Nunes A.S., Barros A.S., Costa E.C., Moreira A.F., Correia I.J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnol Bioeng. 2019; 116 (1): 206-26. DOI: https://doi.org/10.1002/bit.26845

6. Barroca C.B., Della Santa G., Suchecki D., García-Cairasco N., Umeoka E.H. Challenges in the use of animal models and perspectives for a translational view of stress and psychopathologies. Neurosci. Biobehav. Rev. 2022; 40: 104771. DOI: https://doi.org/10.1016/j.neubiorev.2022.104771

7. Lallo A., Schenk M.W., Frese K.K., Blackhall F., Dive C. Circulating tumor cells and CDX models as a tool for preclinical drug development. Transl. Lung Cancer Res. 2017; 6 (4): 397-408. DOI: https://doi.org/10.21037/tlcr.2017.08.01

8. Liu Y., Wu W., Cai C., Zhang H., Shen H., Han Y. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduct. Target Ther. 2023; 8 (1): 160. DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01419-2

9. Zeng M., Ruan Z., Tang J., Liu M., Hu C., Fan P., Dai X. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 2023; 23 (1): 120. DOI: https://doi.org/10.1186/s12935-023-02953-3

10. Neto Í., Rocha J., Gaspar M.M., Reis C.P. Experimental murine models for colorectal cancer research. Cancers (Basel). 2023; 15 (9): 2570. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers15092570

11.Suzuki M., Cheung N.K. Disialoganglioside GD2 as a therapeutic target for human diseases. Expert Opin. Ther. Targets. 2015; 19 (3): 349-62. DOI: https://doi.org/10.1517/14728222.2014.986459

12. Giesen E., Jilaveanu L.B., Parisi F., Kluger Y., Camp R.L., Kluger H.M. NY-ESO-1 as a potential immunotherapeutic target in renal cell carcinoma. Oncotarget. 2014; 5 (14): 5209-17. DOI: https://doi.org/10.18632/oncotarget.2101

13. Ishihara M., Kageyama S., Miyahara Y., Ishikawa T., Ueda S., Soga N., Naota H., Mukai K., Harada N., Ikeda H., Shiku H. MAGE-A4, NY-ESO-1 and SAGE mRNA expression rates and co-expression relationships in solid tumours. BMC Cancer. 2020; 20 (1): 606. DOI: https://doi.org/10.1186/s12885-020-07098-4

14. Mancikova V., Smida M. Current State of CAR T-Cell Therapy in chronic lymphocytic leukemia. Int. J. Mol. Sci. 2021; 22 (11): 5536. DOI: https://doi.org/10.3390/ijms22115536

15. Филиппова Ю.Г., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Фишер М.С., Курилин В.В., Пашкина Е.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотип и эффекторные функции GD2-специфичных CAR-T-клеток in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952- 2022-43-5-525-535

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)

Главный редактор
ГЛАВНЫЙ РЕДАКТОР
Хаитов Муса Рахимович

Член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России


Журналы «ГЭОТАР-Медиа»