Синтетические молекулы малых интерферирующих РНК против консервативного участка генома риновируса подавляют инфекцию in vitro

• Шиловский Игорь Петрович
• Тимотиевич Екатерина Драгановна
• Ковчина Валерия Ивановна
• Никольский Александр Аркадьевич
• Юмашев Кирилл Валерьевич
• Каганова Мария Михайловна
• Русак Татьяна Евгеньевна
• Тюлюбаев Вадлен Вадимович
• Шатилов Артем Андреевич
• Шатилова Анастасия Витальевна
• Андреев Сергей Михайлович
• Смирнов Валерий Валерьевич
• Сергеев Илья Викторович
• Маерле Артем Владимирович
• Кофиади Илья Андреевич
• Кудлай Дмитрий Анатольевич
• Хаитов Муса Рахимович

Резюме

Введение. Риновирусы человека (HRV) относятся к роду Enterovirus семейства Picornaviridae. HRV-инфекция верхних дыхательных путей может сопровождаться обострениями хронических респираторных заболеваний, таких, как бронхиальная астма. Из-за большого количества серотипов вакцинация против HRV невозможна. Несмотря на достижения в области антивирусных исследований, не было одобрено ни одного специфического противовирусного препарата для лечения заболеваний, вызванных HRV. Активно разрабатывают противовирусные средства, действующие на основе механизма РНК-интерференции. Такие препараты позволяют специфично блокировать репликацию вируса в зараженной клетке.

Цель данного исследования - проектирование молекул миРНК, специфично блокирующих репликацию риновируса.

Материал и методы. Биоинформационный анализ последовательностей генома риновируса проводили в программе Vector NTI. Проектирование миРНК и расчет их возможной эффективности проведены с использованием программы OligoWalk. Изучение противовирусных свойств миРНК проводили в экспериментах in vitro в культуре клеток Hela Ohio. В клетки миРНК доставляли при помощи коммерческого трансфекционного реагента Lipofectamine 3000 или пептида-носителя КК-6. Антивирусный эффект оценивали по способности уменьшать титр вируса в супернатантах клеток и количество копий вирусной РНК в лизатах клеток.

Результаты. Выявлены наиболее консервативные регионы в геноме риновируса и осуществлен дизайн 125 вариантов миРНК, комплементарных к ним. На основе биоинформационного анализы было отобрано 7 вариантов для изучения противовирусной активности in vitro. Установлено, что наибольшим антивирусным эффектом обладают два варианта миРНК: siRV-5UTR-4-3 и siRV-5UTR-5-3, способные значительно подавлять репликацию HRV в клетках млекопитающих. На основе этих вариантов миРНК были созданы комплексы с пептидом-носителем КК-46. В отдельных экспериментах in vitro доказана противовирусная активность комплексов siRV-5UTR-4-3/КК-46 и siRV-5UTR-5-3/КК-46 в отношении риновируса.

Заключение. Спроектированы молекулы миРНК против консервативных регионов генома риновируса и доказан их противовирусный эффект экспериментах in vitro. Созданные молекулы миРНК могут быть компонентами противовирусных лекарственных средств.

Ключевые слова:риновирус человека; HRV; респираторные вирусы; миРНК; РНК-интерференция; противовирусные препараты

Введение

Риновирусы человека (HRV), вызывающие инфекцию верхних дыхательных путей, относятся к роду Enterovirus семейства Picornaviridae. Риновирусы были открыты еще в 1950-х гг., но с тех пор их систематика претерпевала значительные изменения [1]. Текущая таксономия и классификация рино- и энтеровирусов основана на различиях в белках капсида, в частности VP4/VP2 и VP1 [2]. К настоящему моменту HRV подразделяются на следующие виды: HRV-А (100 генотипов), HRV-В (30 генотипов) и HRV-С (50 генотипов) [3, 4].

Риновирусы - это безоболочечные вирусы, их геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности длиной около 7200 нуклеотидов. Адгезия вируса на поверхности клетки происходит путем связывания белка капсида VP1 с поверхностным рецептором клетки-хозяина. В зависимости от вида клетки-мишени рецепторами могут быть молекулы межклеточной адгезии 1 (ICAM-1), рецепторы липопротеинов низкой плотности (LDLR) или гепарансульфаты [3]. Эти рецепторы обычно экспрессируются в эпителиальных клетках дыхательных путей. В зависимости от типа рецептора поглощение вируса происходит путем эндоцитоза или макропиноцитоза. Затем происходит высвобождение вирусного генома за счет понижения pH в эндосомах.

В цитозоле вирусная РНК транслируется в полипротеин, который расщепляется вирусными протеазами на более мелкие белки. Репликация вирусной РНК проходит через стадию РНК отрицательной полярности, на которой затем синтезируются РНК положительной полярности. На завершающем этапе происходит сборка новых вирионов. Выход вируса из клеток происходит путем их лизиса [2].

Риновирусы способны вызывать патологии респираторного тракта, включающие ринит, боль в горле, кашель, бронхит и пневмонию. Инфекция HRV также может быть связана с различными осложнениями дыхательных путей, такими как бронхиолит, пневмония, синусит и острое воспаление среднего уха. HRV также способствует обострению хронических респираторных заболеваний, таких как бронхиальная астма (БА), муковисцидоз и хроническая обструктивная болезнь легких [5].

К настоящему моменту четко установлена связь между сезонными обострениями БА и HRV [6]. Респираторные вирусы (среди которых часто преобладает HRV) являются триггерами обострений БА более чем в 50 % случаев [6]. По прогнозам Всемирной организации здравоохранения, в ближайшие несколько десятилетий подобные обострения станут одной из основных причин смертности среди пациентов, страдающих БА [7].

Показано, что HRV вовлечен в активацию Th2-иммунного ответа, усиливая его [8]. В частности, риновирусы способны активировать фактор транскрипции STAT6, а следовательно, продукцию Th2-цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-13), а также ИЛ-25 и ИЛ-33 и хемокинов. Показано, что повышение уровня продукции ИЛ-33 эпителием в ответ на инфекцию коррелирует с тяжестью БА, а продукция ИЛ-5 и ИЛ-13 - с вирусной нагрузкой.

Клетки ILC2 являются важными источниками Th2-цитокинов (ИЛ-5 и ИЛ-13), которые способствуют привлечению в дыхательные пути эозинофилов, активации тучных клеток, а также гиперпродукции слизи бронхиальным эпителием. У пациентов с БА инфекция HRV приводит к увеличению эозинофилии в дыхательных путях, а также числа ILC2, причем их количество коррелирует с тяжестью обострения и продолжительностью инфекции HRV [6].

Из-за большого разнообразия серотипов вируса вакцинация против HRV невозможна [9]. Несмотря на достижения в области разработки противовирусных средств, к настоящему времени не были одобрены специфические противовирусные препараты против HRV-инфекции [10].

Можно выделить несколько групп антивирусных препаратов против риновируса: ингибиторы связывания вируса с клеткой (самые распространенные - пиродавир и плеконарил), ингибиторы репликации (рибавирин, кверцитин), блокаторы вирусных протеаз (рупинтривир), ингибиторы провоспалительных цитокинов (будесонид), экзогенные "усилители" врожденного иммунного ответа хозяина (дефензины, ИФН-β, азитромицин) [11].

Имеются данные об исследовании приема витамина С, цинк-содержащих и антигистаминных препаратов при риновирусной инфекции. Прием этих препаратов улучшал состояние пациентов, однако значительного снижения вирусной нагрузки не происходило [3]. В настоящее время активно продолжается поиск средств противовирусной терапии в отношении HRV-инфекции.

В последнее время активно развивается стратегия создания противовирусных препаратов, основанная на применении механияма РНК-интерференции [12, 13]. Под РНК-интерференцией понимают естественный механизм регуляции экспрессии генов в клетке с участием фермента Dicer и молекул малых интерферирующих РНК (миРНК) [14]. С началом пандемии COVID-19 внимание разработчиков лекарственных средств было сосредоточено на создании препаратов для противовирусной терапии. Так, в России был разработан и зарегистрирован препарат МИР 19^® (siR-7-EM/KK-46) для лечения COVID-19 [15-17], который активно применяется в клинической практике [17].

Цель данного исследования - создание молекул миРНК для подавления репликации риновируса.

Материал и методы

Питательные среды, культуры клеток и штамм вируса. В работе использовали питательные среды optiMEM (Gibco, США), DMEM ("ПанЭко", Россия) с добавлением 25 мМ HEPES ("ПанЭко", Россия), 300 мг/л L-глутамина ("ПанЭко", Россия), 50 мкг/мл гентамицина (Gibco, США). Для получения полной питательной среды к вышеуказанному составу добавляли 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Biosera, Франция).

В работе использовали клеточную линию HeLa Ohio (карцинома шейки матки, производное от основной клеточной линии HeLa), приобретенную в Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России.

Риновирус человека штамм 1В (HRV-1В) был предоставлен ФГБУ НИИВС им. И.И. Мечникова Минобрнауки России.

Проектирование молекул миРНК. Биоинформационный анализ геномов риновируса проводился в программе Vector NTI (ThermoFisher, США). Последовательности расшифрованных референтных геномов риновируса получены из базы данных Gene Bank (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGETYPE=BLASTHome). Проектирование молекул миРНК и расчет их возможной эффективности проведено с использованием программы OligoWalk (https://rna.urmc.rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_form.cgi), которая рассчитывает термодинамические параметры гибридизации РНК-олигонуклеотидов, предсказывает их свободную энергию связывания с мРНК-мишенью.

Синтез и получение двухцепочечных молекул миРНК. Синтез и очистка смысловых и антисмысловых цепей миРНК осуществлялись компанией "Синтол" (Россия) методами стандартного твердофазного амидофосфатного синтеза на автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе (Polygen, Германия).

Сборку двухцепочечных молекул миРНК из индивидуальных цепей проводили путем их отжига. Для этого смешивали водные растворы эквимолярных количеств смысловой и антисмысловой цепей РНК с последующим образованием между ними водородных связей по принципу комплементарности. В результате отжига две цепи РНК образуют прочный дуплекс - двухцепочечную молекулу миРНК. Для этого каждый олигонуклеотид индивидуально растворяли в объеме деионизованной воды, необходимом для достижения во всех образцах концентрации 100 мкг/мкл миРНК. Растворитель для молекул РНК имел следующий состав: 100 мМ CH₃COOK, 30 мМ HEPES, pH = 7,5 в воде. Далее смесь помещали в программируемый термостат "ТП4-ПЦР-01-Терцик" ("ДНК-технология", Россия) и запускали следующую температурную программу: 92 ºС - 2 мин, 37 ºС - 1 ч, 10 ºС - 10 мин. Хранение полученного раствора двухцепочечных молекул миРНК осуществляли при -20 ºС.

Скрининг биологической активности молекул миРНК in vitro. Скрининг биологической активности молекул миРНК проводили по их способности подавлять репликацию штамма HRV-1В. Для этого клетки HeLa Ohio высаживали в 24-луночный планшет в количестве 70 000 кл/лунку в 600 мкл полной питательной среды DMEM накануне эксперимента и инкубировали сутки при 37 ^оС в СО₂-инкубаторе до достижения 75 % конфлюентности. Перед внесением миРНК в лунках с клетками заменяли полную питательную среду на бессыворточную среду DMEM того же объема.

Клетки трансфецировали смесью 0,5 мкг миРНК и 1 мкл коммерческого трансфекционного реагента Lipofectamine 3000 (Invitrogen, США) в 100 мкл в бессывороточной среды optiMEM (Gibco, США). Приготовленную смесь инкубировали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с клетками. В качестве отрицательного контроля клетки обрабатывали физиологическим раствором. Для контроля специфичности противовирусного эффекта клетки обрабатывали смесью Lipofectamine 3000 и неспецифических молекул миРНК, направленных против мРНК гена gfp (siGFP) или региона 5'UTR вируса гепатита С (siHCV).

Клетки инкубировали в течение 4 ч при 37 ^оС в СО₂-инкубаторе. Затем проводили инфекцию HRV-1В (при MOI = 0,01) путем внесения в клетки 100 мкл вирус-содержащего материала. Клетки инкубировали с вирусом при покачивании 1 ч при 37 ^оС в СО₂-инкубаторе. После этого производили замену культуральной среды на полную питательную среду DMEM для создания оптимальных условий культивирования клеток.

На протяжении 3 сут после инфекции отбирали аликвоты культуральной среды для последующего титрования на монослое клеток. На 3-й день инкубации собирали клеточные лизаты, а затем из них выделяли РНК для последующей постановки ОТ-ПЦР с целью определения количества копий вирусной РНК.

Определение противовирусной активности комплекса миРНК с КК-46 in vitro. Противовирусную активность комплекса in vitro оценивали по уменьшению вирусной нагрузки на модели репликации штамма HRV-1В. Для этого культуру клеток HeLa Ohio в количестве 70 000 кл/лунку засевали в 24-луночный планшет в полной питательной среде DМЕМ и инкубировали до образования монослоя конфлюентностью 75 %. Далее заменяли среду на бессывороточную и вносили раствор комплекса, содержащего миРНК против риновируса и пептид-носитель КК-46 [16] в конечной концентрации 125 мкг/мл. Комплекс неспецифической миРНК siHCV и КК-46 использовали в качестве отрицательного контроля. Дополнительным отрицательным контролем выступали клетки, обработанные пептидом КК-46 без миРНК.

Комплексы миРНК и пептида готовили, исходя из соотношения 1 : 20 по массе. Данное соотношение было выбрано на основе предыдущих исследований [17, 18]. Приготовленные смеси инкубировали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. Клетки инкубировали в течение 4 ч, затем проводили инфекцию HRV-1В, как описано выше. Вирусную нагрузку оценивали на 3-й день двумя методами, как описано выше.

Титрование супернатантов на монослое клеток. Титрование супернатантов, отобранных в течение 3 сут после инфекции, осуществляли на монослое клеток HeLa Ohio. Для этого клетки засевали в 96-луночный планшет в количестве 15 000 клеток на лунку в 100 мкл полной питательной среды DMEM накануне эксперимента и инкубировали до достижения 75 % конфлюентности. Перед внесением супернатантов в лунках с клетками заменяли полную питательную среду на бессыворточную среду DMEM в количестве 100 мкл/лунку. Затем вносили исследуемые супернатанты (каждый в 4 повторах) и осуществляли титрование с шагом в 10. Клетки инкубировали при 37 ºС в атмосфере 5 % СО₂ в течение 3 сут и оценивали цитопатическое действие вируса с помощью световой микроскопии. Титр вируса рассчитывали методом Спирмена-Кербера. Противовирусную активность миРНК оценивали относительно отрицательного контроля - клеток, обработанных физиологическим раствором.

Выделение общей РНК и синтез кДНК. Общую РНК из лизатов клеток выделяли с помощью набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, США) в соответствии с рекомендацией производителя. Концентрацию РНК измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop (ThermoFisher, США) при длине волны 280 нм.

Общую РНК использовали в реакции обратной транскрипции для получения библиотеки кДНК с применением набора Реверта L (Fermentas, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Был проведен вариант реакции обратной транскрипции с использованием гексамерного праймера.

Постановка количественной ПЦР. РВ-ПЦР проводили с использованием набора реактивов "Синтол" ("Синтол", Россия) согласно инструкции производителя. В реакции использовали праймеры, направленные к геному HRV-1В (табл. 1) и 3 мкл образцов кДНК. РВ-ПЦР проводили в амплификаторе "ДТпрайм" ("ДНК-технология", Россия) по нижеследующей температурной программе:

Результаты

Биоинформационный анализ генома риновинуса и проектирование молекул миРНК

Проведено выравнивание последовательностей 9 геномов вируса HRV-A (вид А). Номера последовательностей в GeneBank: JN815255.1, JN837694.1, JQ837724.1, KC894166.1, KC894167.1, KC894169.1, MF973193.1, MF973194.1 и MK989733.1. Выявлено, что внутри вида HRV-A наиболее консервативны два участка: первый кодирует РНК-зависимую РНК-полимеразу (сходство данного региона среди геномов риновируса составляет 68 %), второй регион - это 5'UTR (нетранслируемый регион 5'-конца), сходство среди геномов риновируса составляет 75 % (рис. 1). Основываясь на полученных данных, можно заключить, что наиболее перспективной мишенью для миРНК является 5'UTR-регион вследствие его высокой консерватиности среди геномов вируса HRV-A.

Чтобы создать миРНК, активную против всех трех видов риновируса (А, В и С), мы провели дополнительный анализ наиболее консервативного региона 5'UTR с использованием трех референтных последовательностей геномов HRV-A, HRV-B и HRV-С. Номера референтных последовательностей в GeneBank: NC_038311.1, NC_038312.1 и NC_038878.1. В результате проведенного анализа показано, что среди трех видов риновируса имеются лишь 2 участка (размером 20 и 22 нуклеотида) со 100 % идентичностью и протяженностью, достаточной для отжига молекул миРНК (рис. 1). Комплементарность миРНК к соответствующим участкам генома может обеспечить им потенциальную активность в отношении трех видов риновируса.

С использованием программы OligoWalk было спрогнозировано 125 различных вариантов молекул миРНК против 5'UTR-региона генома HRV-A. 7 оптимальных вариантов миРНК были синтезированы и изучены в экспериментах in vitro.

Выбор осуществлялся в соответствии с критериями, описанными в ряде публикаций [19-22]. Во-первых, учитывалась предсказанная теоретическая активность миРНК; программа OligoWalk относится ко II поколению и позволяет рассчитывать этот показатель. Во-вторых, выбраковывали варианты миРНК, в последовательности которых содержатся повторы четырех и более нуклеотидов (например "АААА", "GGGG" и т. д.). Кроме того, рекомендуется изучить нуклеотидную последовательность миРНК на сходство с генами в геноме человека, чтобы избежать так называемых нецелевых эффектов - подавления молекулой миРНК экспрессии иных генов, что может вызвать побочные эффекты будущего лекарственного средства. Были выбраны варианты миРНК, отличающиеся на 2 и более нуклеотидов от последовательностей генов человека (идентичность < 89 %). Также рекомендовано для 19-нуклеотидных последовательностей смысловой и антисмысловой цепей добавить динуклеотид "ТТ". Этот динуклеотид не участвует во взаимодействии с мРНК и необходим для связывания с мультисубъединичным комплексом, который обеспечивает интерференцию РНК. Последовательности и характеристики выбранных вариантов миРНК представлены в табл. 2.

Четыре из 7 вариантов миРНК (siRV-5UTR-1-3, siRV-5UTR-2-2, siRV-5UTR-3-19 и siRV-5UTR-4-3) были направлены против консервативных участков 5'UTR-региона HRV-А, в то время как в геномах HRV-В и HRV-С мишень для этих миРНК отсутствует ввиду изменчивости. Один вариант миРНК (siRV-5UTR-5-3) направлен к самому консервативному участку 5'UTR-региона, в связи с этим мишень для этого варианта присутствует в геномах всех 3 видов риновируса (HRV-А, HRV-В и HRV-С). Еще 2 варианта миРНК были направлены к наименее консервативному участку 5'UTR-региона, соответственно мишень для них присутствует лишь у отдельных изолятов HRV-А.

Скрининг биологической активности молекул миРНК in vitro

Скрининг биологической активности миРНК проводили на модели репликации штамма HRV-1В in vitro. Изменение вирусной нагрузки в клетках оценивали двумя методами: методом титрования и с помощью количественной ПЦР, как описано выше.

В результате титрования супернатантов было показано, что на 2-й день после инфекции все варианты миРНК статистически значимо снижали титр вируса. На 3-й день 5 из 7 вариантов (siRV-5UTR-2-2, siRV-5UTR-3-19, siRV-5UTR-4-3, siRV-5UTR-110, siRV-5UTR-5-3) статистически значимо снижали титр вируса, в среднем в 5 раз относительно отрицательных контролей (siGFP и siHCV) (рис. 2А, табл. 3).

Определение количества копий вирусной РНК в лизатах клеток, полученных на 3-й день после инфекции, в целом подтвердили результаты титрования супернатантов. Продемонстрировано, что 6 из 7 синтезированных вариантов миРНК статистически значимо снижали вирусную нагрузку по сравнению с отрицательными контролями (siGFP и siHCV) (рис. 2Б, см. табл. 3).

По данным титрования супернатантов максимальным противовирусным эффектом обладали варианты siRV-5UTR-4-3, siRV-5UTR-5-3 и siRV-5UTR-110, снижающие титр риновируса на 87, 85 и 83 % (в 8, 7 и 6 раз). По данным количественного ПЦР-анализа максимальным противовирусным эффектом обладали эти же варианты, обеспечивая уменьшение количества копий вирусной РНК на 95, 92 и 95 % (в 20, 12 и 20 раз) (см. табл. 3). Учитывая, что вариант siRV-5UTR-110 направлен к наименее консервативному участку 5'UTR-региона (см. табл. 2), в качестве наиболее перспективных вариантов для дальнейших исследований выбраны siRV-5UTR-4-3 и siRV-5UTR-5-3.

Противовирусная активность комплекса миРНК и пептида-носителя КК-46

Известно, что нуклеиновые кислоты обладают отрицательным зарядом, вследствие чего не способны самопроизвольно проникать в цитоплазму клеток. Поэтому для их доставки применяют различные положительно заряженные векторы (липосомы, полимеры, наночастицы, пептиды и пр.) [22, 23]. В данной работе в качестве носителя использован катионный дендримерный пептид КК-46 [17, 23]. При формировании комплекса миРНК/КК-46 использовали соотношение компонентов 1 : 20 по массе [24].

Учитывая результаты скрининга биологической активности миРНК, в данной серии экспериментов мы испытали противовирусные свойства двух вариантов миРНК (siRV-5UTR-4-3 и siRV-5UTR-5-3) в комплексе с пептидом-носителем KK-46 (комплексы siRV-5UTR-4-3/КК-46 и siRV-5UTR-5-3/КК-46). Противовирусные эффекты комплексов изучены на модели риновирусной инфекции клеток HeLa Ohio, как было описано выше.

Оба варианта миРНК в комплексе с КК-46 статистически значимо снижали титр вируса по сравнению с отрицательным контролем. Титр вируса в супернатантах клеток, обработанных комплексами siRV-UTR-4-3/KK-46 и siRV-UTR-5-3/KK-46 снижался в 61 раз по сравнению с отрицательным контролем (рис. 3А). Данные титрования были подтверждены оценкой количества копий вирусной РНК. Исследуемые комплексы статистически значимо снижали вирусную нагрузку по сравнению с отрицательным контролем. Количество копий вирусной РНК в лизатах клеток, обработанных комплексами siRV-UTR-4-3/KK-46 и siRV-UTR-5-3/KK-46, снижалось в 42 и 14 раз по сравнению с отрицательным контролем (рис. 3Б). Примечательно, что обработка пептидом КК-46 без миРНК не приводила к уменьшению вирусной нагрузки. Это свидетельствует о том, что противовирусный эффект комплексов обеспечивается специфическим действием молекул миРНК.

Обсуждение

Риновирусы - одни из самых распространенных респираторных патогенов. Среди трех видов HRV (A, B и С) вид А является наиболее распространенным, вирулентным и включает наибольшее количество штаммов. Инфекция HRV-A (наравне с HRV-C) часто протекает тяжело и характеризуется сильными воспалительными реакциями респираторного тракта, особенно у пациентов, страдающих БА [6]. Кроме того, инфекция HRV-A часто сопровождается бактериальный инвазией респираторного тракта [25]. Поэтому нами был проведен биоинформационный анализ геномов HRV-A для установления оптимальных мишеней для молекул миРНК. Выявлено, что наиболее консервативным участком генома является регуляторный 5'UTR-регион.

Чтобы создать миРНК, потенциально активную против всех трех видов риновируса, мы провели дополнительный биоинформационный анализ региона 5'UTR. Для этого были использованы референтные последовательности геномов HRV-A, HRV-В и HRV-С. Проведенный анализ показал, что среди трех видов риновируса имеются лишь 2 участка со 100 % идентичностью и протяженностью, достаточной для отжига молекул миРНК (см. рис. 1). Комплементарность миРНК к соответствующим участкам генома позволит им проявлять противовирусную активность в отношении трех видов риновируса. В результате анализа 125 вариантов спроектированных миРНК для исследования в экспериментах in vitro было отобрано 7, при этом 6 из них направлены только против HRV-А, и лишь 1 вариант миРНК имеет мишень в геномах всех трех видов риновируса (см. табл. 2).

Скрининг биологической активности миРНК проводили на модели репликации штамма HRV-1В (относится к виду А) в культуре клеток HeLa Ohio. Максимальный противовирусный эффект обеспечивали варианты молекул siRV-5UTR-4-3 и siRV-5UTR-5-3. Обработка клеток этими миРНК приводила к сиквенс-специфическому снижению титра вируса в супернатантах и количества копий вирусной РНК в клетках (см. рис. 2, см. табл. 3), что свидетельствует о их способности блокировать репликацию риновируса. Важно отметить, что вариант siRV-5UTR-4-3 из всех синтезированных вариантов имеет наименьшее сходство с последовательностями в геноме человека (см. табл. 2), что с наибольшей вероятностью позволит избежать нежелательных побочных эффектов. Однако этот вариант имеет мишень только в геноме HRV-A, но не в геномах HRV-В и HRV-С, что значительно сужает широту его применения. В то же время вариант siRV-5UTR-5-3 имеет мишень в геномах всех 3 видов риновируса (см. табл. 2) и потенциально обладает более широким противовирусным эффектом.

Мы провели дополнительную серию экспериментов, в которых изучили противовирусные эффекты двух вариантов миРНК, доставляемых в клетки при помощи пептида-носителя КК-46, созданного ранее. Данный пептид-носитель используется в составе зарегистрированного лекарственного средства МИР 19^®, предназначенного для лечения пациентов с COVID-19. МИР 19^® представляет собой комплекс молекул миРНК против жизненно важного гена SARS-CoV-2 и катионного пептида-носителя КК-46. В рамках разработки препарата МИР 19^® был проведен обширный скрининг катионных пептидных носителей для миРНК. Наилучшим из них с точки зрения безопасности и эффективности оказался КК-46 [15, 17]. В данном исследовании мы доказали противовирусный эффект комплексов миРНК (siRV-5UTR-4-3 и siRV-5UTR-5-3) и пептида КК-46 на модели риновирусной инфекции in vitro (см. рис. 3).

Известны неспецифические препараты, активные в отношении риновирусов. Большую группу представляют ингибиторы адгезии, предотвращающие начальный этапы инфекции - прикрепление вируса к клетке, например, блокаторы рецепторов ICAM-1 и LDLR [3]. Такие препараты эффективны только на ранних стадиях инфекции - они не позволяет снижать репликацию вируса в зараженных клетках. В то же время молекулы миРНК действуют внутри зараженной клетки, нарушая репликацию вируса и экспрессию его генов.

Еще одну обширную группу противовирусных средств представляют неспецифические блокаторы синтеза РНК, например нуклеозидный аналог рибавирин. Он часто используется в качестве эффективного терапевтического средства для лечения гепатита С, а также используется при терапии инфекций дыхательных путей, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом и аденовирусом [26]. Однако препарат имеет ограниченную активность против ряда вирусов, например вируса простого герпеса. Показано, что в контексте HRV-инфекции рибавирин и ряд его модифицированных аналогов обладают умеренной или низкой противовирусной активностью [27].

Разрабатываются специфические средства для борьбы с риновирусной инфекцией, например препараты на основе дезоксирибозимов, морфолиноолигомеров и миРНК [3]. В одном из исследований авторы показали перспективность применения миРНК против риновируса [28]. В этом исследовании K.M. Phipps и соавт. разработали библиотеку молекул миРНК, направленных против генома HRV-16. Разработанные молекулы миРНК направлены против различных участков генома риновируса: 5'-UTR, vp1-4, 2А, 2C, 3A, 3C. Созданные нами молекулы миРНК против региона 5'-UTR риновируса имеют уникальные последовательности, отличающиеся от используемых в работе K.M. Phipps и соавт.

К тому же молекула siRV-5UTR-5-3, спроектированная в нашем исследовании, имеет мишень в геномах всех трех видах риновируса, в то время как в работе K.M. Phipps и соавт. миРНК направлены только против HRV-16. Авторы показали, что ингибирование вируса является специфичным и зависит от концентрации миРНК. В качестве агента доставки миРНК в клетки HeLa в исследовании K.M. Phipps и соавт. был использован коммерческий реагент на основе липидов Oligofectamine. В нашем исследовании также был использован подобный реагент Lipofectamine для скрининга биологической активности миРНК. В последние десятилетия активно развивается область использования пептидных векторных систем для доставки терапевтических нуклеиновых кислот. Поэтому после выбора эффективных миРНК трансфекционный агент был заменен на пептид КК-46. Катионный дендримерный пептид КК-46 был создан de novo и не проявил токсичных свойств [17].

На сегодняшний день выбор средств, одобренных для профилактики или лечения заболеваний, вызванных РСВ-инфекцией, невелик, а применение многих из них сопровождается возникновением нежелательных побочных явлений. Примером может служить капсид-связывающий препарат плеконарил - первый препарат против риновируса, прошедший клинические испытания. Препарат значительно уменьшает продолжительность и тяжесть заболевания, однако имеет ряд неблагоприятных побочных эффектов (нарушения менструального цикла, снижение эффективности пероральных контрацептивов у женщин) [2].

Разработанные нами молекулы миРНК предполагают местное, назальное, применение, что снижает риск развития нежелательных системных побочных явлений, т. е. является преимуществом перед другими пероральными противовирусными средствами, имеющими системное действие. Кроме того, доклинические и клинические исследования препарата МИР 19^® продемонстрировали его безопасность и эффективность при одно- и многократном применении [16]. Учитывая, что в данном исследовании в качестве носителя был использован пептид КК-46, входящий в состав препарата МИР 19^®, есть основания полагать, что потенциальный препарат против риновируса будет не только эффективен, но и безопасен.

Основной сложностью в разработке противовирусных препаратов против HRV является крайне высокая вариабельность вируса. Из-за большого количества серотипов, циркулирующих в популяции, применение препаратов на основе антител для профилактики или терапии риновирусной инфекции считается неперспективным подходом. Например, препарат WIN56921 способен ингибировать HRV-A16 и HRV-C15, но не HRV-B14 [29]. В отличие от антител, направленных на вариабельные поверхностные антигены вируса, молекулы миРНК могут таргетировать консервативные участки его генома. Благодаря биоинформатционному анализу геномов риновируса в рамках вида HRV-А, а затем среди трех видов (HRV-A, -B, -C) нам удалось выявить наиболее консервативные регионы, пригодные для таргеторования миРНК, а также создать миРНК соответствующей специфичности и показать их эффективность in vitro на примере штамма HRV-1В, принадлежащего к виду HRV-А.

Таким образом, в данном исследовании выявлены наиболее консервативные регионы в геноме риновируса, осуществлен дизайн специфических к ним миРНК и доказан их противовирусный эффект в экспериментах in vitro. Созданные молекулы миРНК могут быть активными компонентами противовирусных лекарственных средств.

Литература

1. Jacobs S.E., Lamson D.M., Kirsten S., Walsh T.J. Human rhinoviruses. Clin Microbiol Rev. 2013; 26 (1): 135-62. DOI: https://doi.org/10.1128/CMR.00077-12

2. To K.W, Yip C.Y, Yuen K.Y. Rhinovirus - From bench to bedside. J Formos Med Assoc. 2017; 116 (7): 496-504. DOI: https://doi.org/10.1016/J.JFMA.2017.04.009

3. Rollinger J.M., Schmidtke M. The human rhinovirus: human-pathological impact, mechanisms of antirhinoviral agents, and strategies for their discovery. Med Res Rev. 2011; 31 (1): 42-92. DOI: https://doi.org/10.1002/MED.20176

4. Hayashi Y., Sada M., Shirai T., Okayama K., Kimura R., Kondo M., Okodo M., Tsugawa T., Ryo A., Kimura H. Rhinovirus Infection and Virus-Induced Asthma. Viruses. 2022; 14 (12): 2616. DOI: https://doi.org/10.3390/V14122616

5. Lee J.S., Kim S.R., Song J.H., Lee Y.P., Ko H.J. Anti-Human Rhinovirus 1B Activity of Dexamethasone viaGCR-Dependent Autophagy Activation. Osong Public Health Res Perspect. 2018; 9 (6): 334-39. DOI: https://doi.org/10.24171/J.PHRP.2018.9.6.07

6. Jackson D.J., Gern J.E. Rhinovirus Infections and Their Roles in Asthma: Etiology and Exacerbations. J Allergy Clin Immunol Pract. 2022; 10 (3): 673-81. DOI: https://doi.org/10.1016/J.JAIP.2022.01.006

7. Gunawardana N., Finney L., Johnston S.L., Mallia P. Experimental rhinovirus infection in COPD: implications for antiviral therapies. Antiviral Res. 2014; 102: 95-105. DOI: https://doi.org/10.1016/J.ANTIVIRAL.2013.12.006

8. Price A.S., Kennedy J.L. T-helper 2 mechanisms involved in human rhinovirus infections and asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 2022; 129 (6): 681-91. DOI: https://doi.org/10.1016/J.ANAI.2022.08.015

9. Casanova V., Sousa F.H., Stevens C., Barlow P.G. Antiviral therapeutic approaches for human rhinovirus infections. Future Virol. 2018; 13 (7): 505-18. DOI: https://doi.org/10.2217/FVL-2018-0016

10. Ruuskanen O., Waris M., Ramilo O. New aspects on human rhinovirus infections. Pediatr Infect Dis J. 2013; 32 (5): 553-5. DOI: https://doi.org/10.1097/INF.0B013E3182833C90

11. Coultas J.A., Cafferkey J., Mallia P., Johnston S.L. Experimental Antiviral Therapeutic Studies for Human Rhinovirus Infections. J Exp Pharmacol. 2021; 13: 645-59. DOI: https://doi.org/10.2147/JEP. S255211

12. Shilovskiy I.P., Yumashev K. V., Nikolsky A.A., Vishnyakova L.I., Khaitov M.R. Molecular and Cellular Mechanisms of Respiratory Syncytial Viral Infection: Using Murine Models to Understand Human Pathology. Biochemistry (Moscow) 2021; 86 (3): 290-306. DOI: https://doi.org/10.1134/S0006297921030068

13. Khaitov M.R., Litvin L.S., Shilovsky I.P., Bashkatova Y.N., Faizuloev E.B., Zverev V.V. RNA interference. New approaches to the development of antiviral agents. Immunologiya. 2010; 31: 69-76.

14. Whangbo J.S., Hunter C.P. Environmental RNA interference. Trends Genet. 2008; 24 (6): 297-305. DOI: https://doi.org/10.1016/J.TIG.2008.03.007

15. Khaitov M., Nikonova A., Shilovskiy I., Kozhikhova K., Kofiadi I., Vishnyakova L., Nikolsky A., Gattinger P., Kovchina V., Barvinskaya E., Yumashev K., Smirnov V., Maerle A., Kozlov I., Shatilov A., Timofeeva A., Andreev S., Koloskova O., Kuznetsova N., Vasina D., Nikiforova M., Rybalkin S., Sergeev I., Trofimov D., Martynov A., Berzin I., Gushchin V., Kovalchuk A., Borisevich S., Valenta R., Khaitov R., Skvortsova V. Silencing of SARS-CoV-2 with modified siRNA-peptide dendrimer formulation. Allergy. 2021; 76 (9): 2840-54. DOI: https://doi.org/10.1111/all.14850

16. Хаитов М.Р., Никонова А.А., Шиловский И.П., Кожихова К.В., Кофиади И.А., Гудима Г.О., Вишнякова Л.И., Никольский А.А., Ковчина В.И., Тимотиевич Е.Д., Юмашев К.В., Смирнов В.В., Маерле А.В., Козлов И.Б., Шатилов А.А., Шатилова А.В., Андреев С.М., Колоскова О.О., Кузнецова Н.А., Васина Д.В., Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И.А., Гущин В.А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. МИР 19^® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения COVID-19: разработка и доклинические исследования. Иммунология. 2023; 44 (3): 270-90. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-270-290

17. Хаитов М.Р., Никонова А.А., Кофиади И.А., Шиловский И.П., Смирнов В.В., Елисютина О.Г., Гудима Г.О., Маерле А.В., Шатилов А.А., Шатилова А.В., Андреев С.М., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Латышева Т.В., Ильина Н.И., Мартынов А.И., Рабдано С.О., Рузанова Э.А., Савельев Н.С., Плетюхина Ю.В. Сафи А.С., Ратников В.А., Горелов В.П., Кащенко В.А., Кучеренко Н.Г., Умарова И.А., Москалева С.С., Фабричников С.В., Зуев О.В., Павлов Н.Б., Крючко Д.С., Берзин И.А., Горячев Д.В., Меркулов В.А., Шипулин Г.А., Юдин С.М., Трухин В.П., Валента Р., Скворцова В.И. Результаты I и II фазы клинических исследований препарата МИР 19^®. Иммунология. 2023; 44 (3): 291-316. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-3-291-316

18.  Harborth J., Elbashir S.M., Bechert K., Tuschl T., Weber K. Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs. J Cell Sci. 2001; 114 (24): 4557-65. DOI: https://doi.org/10.1242/JCS.114.24.4557

19. Ui-Tei K., Naito Y., Takahashi F., Haraguchi T., Ohki-Hamazaki H., Juni A., Ueda R., Saigo K. Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. Nucleic Acids Res. 2004; 32 (3): 936-48. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkh247

20. Reynolds A., Leake D., Boese Q., Scaringe S., Marshall W.S., Khvorova A. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 2004; 22 (3): 326-30. DOI: https://doi.org/10.1038/nbt936

21. Gatta A.K., Hariharapura R.C., Udupa N., Reddy M.S., Josyula V.R. Strategies for improving the specificity of siRNAs for enhanced therapeutic potential. Expert Opinion on Drug Discovery. 2018; 13 (8): 709-25. DOI: https://doi.org/10.1080/17460441.2018.1480607

22. Колоскова О.О., Носова А.С., Илюхина A.A., Шиловский И.П., Себякин Ю.Л., Хаитов М.Р. Липосомальные средства доставки миРНК (обзор). Биофармацевтический Журнал. 2017; 9 (5).

23. Шиловский И.П., Юмашев К.В., Кожихова К.В., Вишнякова Л.И., Смирнов В.В., Гудима Г.О., Брылина В.Е., Каганова М.М., Никольский А.А., Тимотиевич Е.Д., Ковчина В.И., Русак Т.Е., Шатилова А.В., Шатилов А.А., Андреев С.М., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Синтетический пептид, имитирующий антигенный сайт белка F, подавляет инфекцию респираторно-синцитиального вируса в экспериментах in vitro. Иммунология. 2023; 44 (2): 134-46. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-2-134-146

24. Shilovskiy I.P., Andreev S.M., Kozhikhova K.V., Nikolskii A.A., Khaitov MR. Prospects For the Use of Peptides against Respiratory Syncytial Virus. Mol Biol. 2019; 53 (4): 484-500. DOI: https://doi.org/10.1134/S0026893319040125/FIGURES/3

25. Vandini S., Biagi C., Fischer M., Lanari M. Impact of Rhinovirus Infections in Children. Viruses. 2019; 11 (6). DOI: https://doi.org/10.3390/V11060521

26. Casanova V., Sousa F.H., Stevens C., Barlow P.G. Antiviral therapeutic approaches for human rhinovirus infections. Future Virol. 2018; 13 (7): 505-18. DOI: https://doi.org/10.2217/FVL-2018-0016

27. Smee D.F., Evans W.J., Nicolaou K.C., Tarbet E.B., Day C.W. Susceptibilities of enterovirus D68, enterovirus 71, and rhinovirus 87 strains to various antiviral compounds. Antiviral Res. 2016; 131: 61-5. DOI: https://doi.org/10.1016/J.ANTIVIRAL.2016.04.003

28. Phipps K.M., Martinez A., Lu J., Heinz B.A., Zhao G. Small interfering RNA molecules as potential anti-human rhinovirus agents: In vitro potency, specificity, and mechanism. Antiviral Res. 2004; 61 (1): 49-55. DOI: https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2003.08.005

29. Bochkov Y.A., Palmenberg A.C., Lee W.M., Rathe J.A., Amineva S.P., Sun X., Pasic T., Jarjour N., Liggett S., Gern J. Molecular modeling, organ culture and reverse genetics for a newly identified human rhinovirus C. Nature Medicine. 2011; 17 (5): 627-32. DOI: https://doi.org/10.1038/nm.2358

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)