Ингибиторы внутриклеточных сигнальных путей подавляют воспалительный ответ, вызванный синергически действующими веществами бактериальной природы

• Масютина Анна Михайловна
• Муругин Владимир Владимирович
• Пащенков Михаил Владимирович

Резюме

Введение. Сочетанная активация NOD- и Toll-подобных рецепторов клеток врожденного иммунитета является мощным провоспалительным стимулом и может лежать в основе системного воспалительного ответа при бактериальном сепсисе.

Цель исследования - оценить возможности подавления продукции провоспалительных цитокинов макрофагами, активированными сочетанием агонистов NOD1 и TLR4, путем ингибирования сигнальных путей с участием фактора транскрипции NF-κB и митоген-активируемых протеинкиназ (МАПК).

Материал и методы. Макрофаги, полученные из моноцитов крови здоровых доноров, стимулировали агонистами NOD1 и TLR4 раздельно и в сочетании. Активность сигнальных путей с участием фактора транскрипции NF-κB и МАПК подавляли с помощью низкомолекулярных ингибиторов киназ, добавляемых до или после начала активации клеток. На выходе оценивали экспрессию мРНК генов провоспалительных цитокинов TNF, IL6, IL12B и IL23A с помощью ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией, а также секрецию ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 с помощью иммуноферментного анализа.

Результаты. Ингибирование сигнальных путей с участием NF-κB и МАПК позволило предотвратить или прервать экспрессию и продукцию ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 макрофагами, активированными мощным провоспалительным стимулом - комбинацией агонистов NOD1 + TLR4. Наибольший эффект оказывало одновременное ингибирование обоих сигнальных путей. Показан вклад сигнальных путей с участием NF-κB и МАПК в синергическое усиление экспрессии гена IL12B.

Заключение. Полученные данные могут быть использованы при разработке новых подходов к противовоспалительной терапии при тяжелых бактериальных инфекциях.

Ключевые слова:макрофаги; NOD1; TLR4; мурамилпептиды; липополисахарид; митоген-активируемые протеинкиназы; ядерный фактор κB; ингибиторы

Введение

Инфекционные заболевания остаются одной из важнейших проблем медицины. Так, по оценке Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), число случаев сепсиса в мире в 2017 г. составило 49 млн, из них 11 млн завершились гибелью пациентов [1]. Среди пациентов отделений интенсивной терапии частота сепсиса достигает 25 %, летальность при сепсисе - 40 % [1, 2].

Повреждение клеток, тканей и органов при инфекционных заболеваниях обусловлено двумя основными факторами: самим возбудителем и иммунным ответом на него. Высоковирулентные микроорганизмы оказывают выраженное повреждающее действие на клетки, но при этом они стремятся ингибировать адаптивный и врожденный иммунный ответ хозяина или ускользнуть от него [3-6]. Однако при инфекциях, вызванных низковирулентной флорой, ведущим повреждающим фактором становится иммунный ответ, в том числе системное воспаление, обусловленное избыточной активацией клеток врожденного иммунитета [7-9]. На экспериментальных моделях таких состояний показано, что ингибирование индукционной фазы врожденного иммунного ответа, а также нейтрализация отдельных эффекторных провоспалительных цитокинов, в частности фактора некроза опухолей (ФНО), уменьшает тяжесть полиорганной недостаточности [10-12]. В клинической практике для борьбы с системным воспалительным ответом традиционно применяются глюкокортикостероиды, однако данные об их эффективности при сепсисе противоречивы [13], что требует поиска других, более действенных средств подавления избыточного воспалительного ответа.

Большинство микроорганизмов обладают несколькими патоген-ассоциированными молекулярными паттернами (ПАМП) и при инфицировании организма хозяина активируют несколько паттерн-распознающих рецепторов (ПРР) клеток врожденного иммунитета. В частности, при бактериальных инфекциях происходит одновременная активация рецепторов, распознающих фрагменты пептидогликана (NOD1 и/или NOD2) и представителей семейства Toll-подобных рецепторов, распознающих липополисахариды грам-отрицательных бактерий (TLR4), липопептиды грам-положительных бактерий (TLR2 в сочетании с TLR1 или TLR6), бактериальные нуклеиновые кислоты (TLR7, TLR8, TLR9). Во многих парах NOD-TLR возникает синергическая кооперация, при которой эффект сочетания агонистов существенно превышает сумму эффектов отдельно взятых агонистов [14-17]. На примере активации макрофагов человека сочетанием агонистов NOD1 и TLR4 - рецепторов, играющих главную роль в распознавании грамотрицательных бактерий [18, 19], - мы показали, что синергические эффекты затрагивают сравнительно небольшую группу генов, в число которых входят гены основных провоспалительных цитокинов - IL12B и IL23A (кодируют субъединицы ИЛ-23), IL1B, IL6, TNF [20]. Синергическая кооперация ПРР, приводящая к усилению продукции провоспалительных цитокинов, является одной из вероятных причин гиперергического врожденного иммунного ответа при тяжелых инфекционных заболеваниях, в частности при сепсисе [21, 22].

Экспрессия генов провоспалительных цитокинов в клетках врожденного иммунитета, активированных агонистами ПРР, регулируется несколькими семействами факторов транскрипции (ФТ), в том числе NF-κB (nuclear factor-κB), AP-1 (activation protein-1), EGR (early growth response), C/EBP (CCAAT/enhancer binding protein), SP (specificity protein) [23-25]. По некоторым данным, наличия сайтов связывания NF-κB и AP-1 в промоторе достаточно для синергического усиления экспрессии репортерного гена при сочетанной активации NOD- и Toll-подобных рецепторов в моноцитарных клетках THP-1 [26].

В данной работе мы оценили влияние ингибирования NF-κB- и AP-1-зависимого сигнальных путей на экспрессию провоспалительных цитокинов, индуцированную сочетанием агонистов NOD1 и TLR4 в макрофагах человека. Для блокирования сигналинга с участием NF-κB использовали PF-184 - низкомолекулярный ингибитор β-субъединицы IκB-киназы (IKKβ). Эта киназа фосфорилирует ингибиторные белки IκB, что приводит к их деградации и является необходимым условием для транслокации ФТ семейства NF-κB в ядро.

Активаторами ФТ семейства AP-1 являются митоген-активируемые протеинкиназы (МАПК) p38α/β, ERK1/2 и JNK1/2/3. Для подавления активности p38 и JNK использовали вещества VX-745 и SP600125 соответственно; активность ERK подавляли путем ингибирования вышележащих киназ MEK1/2 с помощью вещества PD98059.

Нас интересовали два вида эффектов ингибиторов: 1) собственно подавление экспрессии IL6, IL12B, IL23A и TNF, индуцированной агонистами NOD1, TLR4 и их сочетанием; 2) подавление синергического усиления экспрессии цитокинов при сохранении или частичном ингибировании ответа на отдельные агонисты. Экспрессию мРНК цитокинов IL6, IL12B, IL23A и TNF оценивали через 4 ч после добавления агонистов - время, когда эффекты синергизма в отношении этих мРНК наиболее выражены [14, 20]. Уровни соответствующих цитокинов в супернатантах также оценивали в более поздние сроки, учитывая отставание секреции белков от экспрессии их мРНК.

Материал и методы

Реактивы. Синтетический агонист NOD1 - лауроил-D-изоглутамил-мезо-диаминопимелиновая кислота (C₁₂-iE-DAP, далее С12), высокоочищенный агонист TLR4 - липополисахарид (ЛПС) E. coli O111:B4 были закуплены у фирмы InvivoGen (США), рекомбинантный человеческий гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) - у Miltenyi Biotec (ФРГ). В качестве полной культуральной среды (ПКС) использовали RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной телячьей сыворотки и 2 мМ L-глутамина (все Thermo Fisher Scientific, США). Ингибиторы PF-184, VX-745, PD98059, SP600125 были закуплены у фирмы Tocris (США). Рабочие концентрации ингибиторов были подобраны в предварительных экспериментах и составили: для PF-184 - 5 мкМ, для трех остальных - 10 мкМ. Коктейль ингибиторов VX-745, PD98059 и SP600125 в концентрациях 10 мкМ далее называется МАПКи.

Доноры крови. Для экспериментов получали венозную гепаринизированную кровь от здоровых доноров. Исследование было одобрено локальным Комитетом по этике ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии ФМБА России", протокол 10/2017. Все доноры дали информированное согласие на участие в исследовании.

Культивирование и стимуляция макрофагов. Макрофаги получали путем культивирования моноцитов крови с ГМ-КСФ в течение 6 сут, как описано ранее [20], после чего пересевали в 24-луночные планшеты по 100 тыс. клеток/400 мкл ПКС. На следующие сутки меняли среду на свежую ПКС. Через 2 ч добавляли C12 (1 мкг/мл), ЛПС (10 нг/мл), их сочетание либо равный объем ПКС (отрицательный контроль). Далее клетки инкубировали в течение 1 и 4 ч (для оценки уровней мРНК), либо 3 и 24 ч (для оценки уровней цитокинов в супернатантах и жизнеспособности макрофагов).

Ингибиторы применяли по трем схемам. По схеме 1 ингибиторы или ПКС (контроль) вносили за 15 мин до внесения агонистов NOD1 и/или TLR4. По схеме 2 ингибиторы или ПКС вносили через 1 ч после добавления агонистов. По схеме 3 ингибиторы вносили за 15 мин до внесения агонистов, через 3 ч после начала стимуляции супернатанты полностью удаляли, заполняли лунки свежей ПКС, добавляли те же агонисты до первоначальной концентрации и инкубировали еще 21 ч, после чего оценивали уровни цитокинов в супернатанте и жизнеспособность клеток.

ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией (ПЦР-РВ). Относительную экспрессию (ОЭ) мРНК IL6, IL12B, IL23A и TNF определяли с помощью ПЦР-РВ по методике, описанной ранее [14]. ОЭ нормировали на мРНК GAPDH.

Иммуноферментный анализ (ИФА). Уровни ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 в культуральных супернатантах определяли с помощью тест-систем фирмы eBioscience/Thermo Fisher (США) в соответствии с инструкцией производителя.

Оценка жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста. По истечении требуемого времени культивирования к клеткам добавляли МТТ-реагент (Merck, США) до конечной концентрации 0,3 мг/мл. Через 4 ч удаляли супернатант, гранулы МТТ-формазана растворяли в диметилсульфоксиде. Численность жизнеспособных клеток в лунке определяли полуколичественно по разности оптической плотности (ОП) при 492 и 670 нм.

Статистическая обработка данных. Для каждого показателя П в каждом экспериментальном образце вычисляли индекс стимуляции (ИС) по формуле ИС_{агонист} = П_{агонист}/П₀, где П_{агонист} - значение показателя после стимуляции агонистом или их сочетанием, П₀ - базальное значение показателя в той же временнóй точке у того же донора. Эффекты агонистов или их сочетания считали биологически значимыми при ИС ≥ 2.

Взаимное влияние агонистов NOD1 и TLR4 оценивали по индексам потенцирования (ИП):

где Ответ_{агонист} = ИС_{агонист} - 1.

ИП для данного гена/точки/ингибитора рассчитывали только при наличии биологически значимого ответа на сочетание агонистов. Отрицательные ответы приравнивали к 0. Если ответ на оба отдельно взятых агонистов равнялся 0, то значением ИП считали значение ответа на C12 + ЛПС. Достоверность отличий ИП от 1 оценивали с помощью парного t-теста. Эффект сочетания агонистов на измеряемый показатель считали синергическим при ИП > 1 (p < 0,05 в парном t-тесте), аддитивным при отсутствии достоверных отличий ИП от 1, инфрааддитивным при 0,5 < ИП < 1 и достоверном отличии ИП от 1 (p < 0,05).

Эффекты ингибиторов на индуцибельные показатели - экспрессию и продукцию цитокинов - представляли в виде остаточных значений (ОЗ) измеряемых показателей:

Если этот показатель значимо не изменялся при стимуляции данным агонистом в отсутствие ингибиторов (ИС < 2), то значения ОЗ не рассчитывали. При сравнениях в парах "опыт-контроль" использовали парный t-тест, различия считали значимыми при p < 0,05.

Все результаты в таблицах и на графиках представлены в виде M ± σ.

Результаты

Цитокиновый ответ макрофагов при активации рецепторов NOD1 и TLR4

При сочетанной стимуляции макрофагов агонистами NOD1 (C12) и TLR4 (ЛПС) в течение 4 ч наблюдалось синергическое усиление экспрессии мРНК генов TNF, IL6, IL12B, IL23A, о чем свидетельствуют значения ИП, существенно и достоверно превышающие 1 (рис. 1А). В более поздние сроки также происходило синергическое увеличение уровней ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 в супернатантах макрофагов (рис. 1Б).

Влияние предварительного ингибирования IKKβ и МАПК на экспрессию и продукцию цитокинов (схема 1)

Согласно схеме 1 (см. раздел "Материал и методы"), ингибиторы киназ вносили за 15 мин до начала активации макрофагов. Ингибитор IKKβ PF-184 примерно на 70-75 % подавлял экспрессию TNF, индуцированную как отдельно взятыми агонистами NOD1 и TLR4, так и их сочетанием (табл. 1). Влияние PF-184 на экспрессию IL6, IL12B и IL23A было более выраженным; так, индукция гена IL12B практически отменялась (табл. 1).

Ингибиторы MEK/ERK- и JNK-зависимого сигнальных путей (PD98059 и SP600125) не оказывали биологически значимого ингибирующего влияния на экспрессию мРНК цитокинов (остаточная экспрессия > 50 %), тогда как ингибитор p38 (VX-745) значимо подавлял только экспрессию IL6 и IL12B при стимуляции ЛПС и сочетанием C12 + ЛПС (данные не представлены). Поскольку разные по составу комплексы AP-1 и, следовательно, разные МАПК могут частично замещать друг друга [27], мы заблокировали одновременно все три МАПК-зависимых пути с помощью коктейля ингибиторов (МАПКи). Коктейль оказал сравнительно слабое влияние на экспрессию цитокинов, индуцированную C12 (например, полностью отсутствовал эффект на C12-индуцированную экспрессию IL12B), однако подавление экспрессии цитокинов при индукции ЛПС или сочетанием C12 + ЛПС было гораздо более выражено (табл. 1).

При одновременном ингибировании IKKβ и МАПК агонист-индуцированная экспрессия генов цитокинов подавлялась более чем на 98 % (табл. 1). Ответ на отдельно взятые агонисты NOD1 и TLR4 для генов TNF и IL6 полностью отменялся, для IL12B и IL23A сохранялся на минимальном уровне; также сохранялся минимальный ответ всех генов на сочетание агонистов NOD1 + TLR4 (на 2-3 порядка ниже, чем в отсутствие ингибиторов).

Ингибиторы IKKβ и МАПК также эффективно подавляли секрецию ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23, индуцированную как отдельными агонистами, так и их сочетанием (табл. 2). Одновременное ингибирование IKKβ и МАПК оказывало наибольший эффект. Интересно, что коктейль МАПКи почти полностью подавлял секрецию ФНО (см. табл. 2), несмотря на неполное ингибирование экспрессии соответствующей мРНК (см. табл. 1), что может быть связано с участием МАПК в активации не только транскрипции, но и трансляции цитокинов [28, 29]. Секрецию ИЛ-12p70 не оценивали, так как макрофаги в данных условиях не вырабатывают этот цитокин, поскольку не экспрессируют ген IL12A, кодирующий p35-субъединицу ИЛ-12 (данные не представлены).

Влияние ингибиторов IKKβ и МАПК на экспрессию и продукцию цитокинов активированными макрофагами (схема 2)

Чтобы оценить влияние ингибиторов на уже развившийся ответ макрофагов, их добавляли к клеткам через 1 ч после внесения агонистов (схема 2). В данных условиях влияние ингибиторов на экспрессию мРНК TNF и IL6 в целом сохранялось, влияние на экспрессию мРНК IL12B и IL23A было несколько ослаблено по сравнению со схемой 1 (ср. табл. 3 и табл. 1). Однако сочетание ингибиторов PF-184 + МАПКи по-прежнему глубоко подавляло экспрессию мРНК всех 4 цитокинов, индуцированную сочетанием агонистов NOD1 + TLR4 (остаточная экспрессия < 5 %; см. табл. 3).

При применении по схеме 2 практически отсутствовал эффект ингибитора IKKβ на секрецию ФНО (табл. 4), при этом ингибирующий эффект МАПКи и сочетания PF-184 + МАПКи сохранялся (ср. табл. 4 и табл. 2). Влияние PF-184, МАПКи и PF-184 + МАПКи на секрецию ИЛ-6 и ИЛ-23 при применении ингибиторов по схемам 1 и 2 было сопоставимым (ср. табл. 4 и табл. 2)

Влияние ингибиторов IKKβ и МАПК на жизнеспособность макрофагов

При культивировании по схеме 1 с PF-184 и, особенно, с сочетанием PF-184 + МАПКи в течение 24 ч наблюдалось достоверное снижение жизнеспособности макрофагов (табл. 5). В отсутствие PF-184 коктейль МАПКи не влиял на жизнеспособность макрофагов. Также не было значительного снижения жизнеспособности после кратковременного воздействия ингибиторов (3 ч). Жизнеспособность макрофагов по схеме 2 не оценивали, однако можно предположить схожие результаты, так как время инкубации с ингибиторами по схемам 1 и 2 различалось незначительно.

Влияние кратковременного воздействия ингибиторов IKKβ и МАПК на экспрессию и продукцию цитокинов (схема 3)

Применяемые в работе ингибиторы обладают коротким периодом полувыведения in vivo: T_1/2 для PF-184 составляет ≈ 1 ч, для VX-745 ≈ 2 ч [30, 31]. Поэтому инкубация клеток в присутствии постоянной концентрации ингибиторов в течение 24 ч может не вполне отражать действие этих препаратов in vivo. В то же время связавшийся с мишенью PF-184 диссоциирует довольно медленно - до 12 ч [31], поэтому мы модифицировали схему применения ингибиторов так, чтобы они присутствовали в культуральной среде только в течение первых 3 ч стимуляции (схема 3). Для стимуляции использовали только сочетание C12 + ЛПС. После 3 ч культивирования в присутствии агонистов и ингибиторов клетки отмывали, вновь добавляли C12 + ЛПС, но без ингибиторов, и культивировали еще 21 ч. Показатели жизнеспособности клеток при таком режиме культивирования с ингибиторами не отличались от контрольных без ингибиторов (рис. 2А).

Секрецию цитокинов по схеме 3 оценивали за период с 3 до 24 ч после начала стимуляции. Содержание ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 при данном режиме культивирования составило соответственно ≈ 30, ≈ 63 и ≈ 98 % от их содержания при непрерывном культивировании в течение 24 ч (рис. 2Б). Таким образом, бóльшая часть ФНО высвобождается в культуральную среду в первые 3 ч стимуляции C12 + ЛПС, а бóльшая часть ИЛ-6 и ИЛ-23 - после 3 ч. Присутствие PF-184 в первые 3 ч стимуляции не влияло на секрецию ФНО в последующие 21 ч, но существенно снижало секрецию ИЛ-6 и ИЛ-23 (рис. 2В). Присутствие МАПКи и в особенности сочетания PF-184 + МАПКи в первые 3 ч подавляло секрецию всех трех цитокинов в последующие 21 ч (рис. 2В). Таким образом, после падения концентрации ингибиторов во внеклеточной среде их действие на продукцию цитокинов в целом сохраняется, тогда как отрицательное влияние на жизнеспособность практически исчезает.

Влияние ингибиторов IKKβ и МАПК на синергическую кооперацию агонистов NOD1 и TLR4

Помимо подавления экспрессии и продукции цитокинов как таковой, нас интересовала возможность ингибирования синергического эффекта (снижения ИП) при полной или частичной сохранности ответа на отдельные агонисты. Такую ситуацию наблюдали для мРНК IL12B (табл. 6). Коктейль МАПКи, а также сочетание PF-184 + МАПКи при добавлении за 15 мин до начала стимуляции вызывали достоверное снижение ИП через 4 ч после начала стимуляции. Достоверное снижение ИП IL12B наблюдалось также при добавлении PF-184 и PF-184 + МАПКи через 1 ч после начала стимуляции (табл. 6). Для остальных исследованных генов и секретируемых цитокинов достоверных изменений ИП под действием ингибиторов не отмечалось.

Обсуждение

Избыточная активация врожденного иммунного ответа при острых инфекционных заболеваниях может быть причиной тяжелых, в том числе системных, воспалительных реакций, приводящих к полиорганной недостаточности. Предотвращение или купирование таких реакций - одна из задач терапии.

Поскольку вещества микробного происхождения распознаются через ПРР, эти рецепторы представляются логичной мишенью при борьбе с избыточным воспалительным ответом. Из препаратов, таргетирующих ПРР, наиболее известны антагонисты и ингибиторы TLR4, которые либо конкурируют с естественным ЛПС за связывание с рецептором (эриторан), либо блокируют начальный этап внутриклеточного сигналинга (TAK-242). В эксперименте эти препараты эффективно предотвращали развитие эндотоксинового шока, вызванного введением ЛПС [32, 33], однако в клинических испытаниях у пациентов с сепсисом не оказали влияния на летальность [33, 34]. Этот пример иллюстрирует неэффективность подхода к лечению сепсиса, нацеленного на отдельные ПРР, даже если эти ПРР играют важную роль в распознавании этиологически значимых микроорганизмов. Ранее мы выдвинули предположение, что одной из причин клинической неэффективности антагонистов TLR4 могли быть неучтенные синергические эффекты между TLR4 и другими ПРР, в частности NOD-подобными рецепторами [35].

Более действенным представляется подход, направленный на ингибирование сигнальных путей, которые отвечают за продукцию провоспалительных цитокинов и используются не одним ПРР, а целыми их семействами. В представленной работе мы показали, что ингибирование сигнальных путей с участием IKKβ/NF-κB и/или МАПК/AP-1 позволяет эффективно подавить экспрессию и продукцию основных провоспалительных цитокинов в макрофагах, стимулированных не только отдельно взятыми агонистами NOD1 и TLR4, но и их сочетанием.

Механизмы действия ингибиторов различались: если PF-184 в первую очередь подавлял транскрипцию мРНК цитокинов, то коктейль ингибиторов МАПК действовал на этапах как транскрипции, так и трансляции. Сочетание ингибиторов IKKβ и МАПК обладало синергическим эффектом, практически полностью блокируя цитокиновый ответ макрофагов при сочетанной стимуляции NOD1 и TLR4. С точки зрения возможного клинического применения представляется важным, что МАПКи и сочетание МАПКи + PF-184 не только предотвращали, но и прерывали уже начавшуюся продукцию цитокинов, так как были эффективны при добавлении к макрофагам через 1 ч после их активации.

Сигнальные пути с участием NF-κB и МАПК контролируют не только продукцию провоспалительных цитокинов, но и в целом защитный ответ макрофагов, а также их адаптацию к внешним воздействиям, выживание и апоптоз. В этой связи представляется важным, что ингибирование NF-κB-зависимого сигнального пути у мышей с острым перитонитом не влияло на механизмы антибактериальной защиты, но приводило к уменьшению повреждения легочной ткани [12]. Более того, сочетанное ингибирование трех МАПК в эксперименте приводило к существенному улучшению результатов вакцинации [36]. Таким образом, кратковременное ингибирование сигнальных путей с участием NF-κB и МАПК in vivo не только не ослабляет, но даже усиливает противоинфекционную защиту и минимизирует повреждение тканей. Что касается токсичности ингибиторов, использованных в нашей работе, она была наиболее выражена при пролонгированной (24 ч) инкубации макрофагов с сочетанием ингибиторов IKKβ и МАПК. Коктейль ингибиторов МАПК в данных условиях токсичность не проявлял. Сокращение времени присутствия ингибиторов в культуральной среде до 3 ч, обоснованное данными о периоде их полувыведения in vivo, позволяет минимизировать токсичность при сохранении значительного ингибирующего действия на продукцию цитокинов.

Различные схемы применения ингибиторов позволили уточнить временные рамки влияния сигнальных путей на экспрессию и продукцию конкретных цитокинов. Так, ингибитор IKKβ вызывал понижение выработки ФНО только при добавлении с самого начала стимуляции (см. табл. 2), тогда как через 1 ч после начала активации и позже этот ингибитор на выработку ФНО практически не влиял (см. табл. 4, рис. 2В). Однако эффект этого ингибитора на продукцию ИЛ-6 и ИЛ-23 сохранялся и в эти сроки (см. табл. 4, рис. 2В). Эти различия коррелируют с кинетикой активации соответствующих генов: ФНО является ранним цитокином и пиковые уровни его мРНК в макрофагах достигаются через 1-2 ч после начала стимуляции агонистами NOD1 и/или TLR4, тогда как пик экспрессии остальных генов приходится на более поздние сроки: IL6 - на 3-4 ч, IL23A - на 2-3 ч, IL12B - на 4 ч и позже ([14] и наши неопубликованные данные).

Ингибиторный анализ показал также гетерогенность механизмов, лежащих в основе синергического усиления экспрессии цитокинов. Хотя все четыре исследованных гена синергически отвечали на сочетанную стимуляцию NOD1 + TLR4 (см. рис. 1), ослабление синергического эффекта в присутствии PF-184 и МАПКи, выражающееся в уменьшении индекса потенцирования, наблюдалось только в отношении гена IL12B (см. табл. 6). При этом ингибиторы МАПК уменьшали ИП IL12B при их добавлении до начала стимуляции, тогда как ингибитор IKKβ оказывал такой эффект только при внесении через 1 ч после начала стимуляции, что указывает на довольно короткие временные интервалы, в течение которых данные сигнальные пути вносят вклад в формирование синергического эффекта.

Таким образом, ингибирование сигнальных путей с участием NF-κB и МАПК позволяет подавить или прервать экспрессию и продукцию цитокинов макрофагами, активированными мощным провоспалительным стимулом - комбинацией агонистов NOD1 + TLR4. Полученные данные можно использовать при разработке новых подходов к противовоспалительной терапии при тяжелых бактериальных инфекциях.

Выводы

1. Ингибирование сигнальных путей с участием NF-κB и МАПК позволяет предотвратить или прервать экспрессию и продукцию провоспалительных цитокинов ФНО, ИЛ-6 и ИЛ-23 макрофагами, активированными комбинацией агонистов NOD1 + TLR4. Наиболее эффективно одновременное ингибирование обоих сигнальных путей.

2. Сигнальные пути с участием NF-κB и МАПК участвуют в формировании синергических эффектов при сочетанной активации рецепторов NOD1 и TLR4 в макрофагах.

Литература

1. Global report on the epidemiology and burden of sepsis: current evidence, identifying gaps and future directions. World Health Organization 2020. URL: https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/334216/9789240010789-eng.pdf

2. Lei S., Li X., Zhao H., Xie Y., Li J. Prevalence of sepsis among adults in China: A systematic review and meta-analysis. Front Public Heal. 2022; 10: 977094. DOI: https://doi.org/10.3389/FPUBH.2022.977094

3. Park J.M., Greten F.R., Li Z.W., Karin M. Macrophage apoptosis by anthrax lethal factor through p38 MAP kinase inhibition. Science. 2002; 297 (5589): 2048-51. DOI: https://doi.org/10.1126/SCIENCE.1073163

4. Zhou H., Monack D.M., Kayagaki N., Wertz I., Yin J., Wolf B., Dixit V.M. Yersinia virulence factor YopJ acts as a deubiquitinase to inhibit NF-kappa B activation. J. Exp. Med. 2005; 202 (10): 1327-32. DOI: https://doi.org/10.1084/JEM.20051194

5. Lei X., Dong X., Ma R., Wang W., Xiao X., Tian Z., Wang C., Wang Y., Li L., Ren L., Guo F., Zhao Z., Zhou Z., Xiang Z., Wang J. Activation and evasion of type I interferon responses by SARS-CoV-2. Nat. Commun. 2020; 11: 3810. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-020-17665-9

6. Fukao T. Immune system paralysis by anthrax lethal toxin: The roles of innate and adaptive immunity. Lancet Infect. Dis. 2004; 4 (3): 166-70. DOI: https://doi.org/10.1016/S1473-3099(04)00940-5

7. Nau R., Eiffert H. Minimizing the release of proinflammatory and toxic bacterial products within the host: a promising approach to improve outcome in life-threatening infections. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005; 44 (1): 1-16. DOI: https://doi.org/10.1016/J.FEMSIM.2005.01.001

8. Cecconi M., Evans L., Levy M., Rhodes A. Sepsis and septic shock. Lancet. 2018; 392: 75-87. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(18)30696-2

9. Coburn J., Garcia B., Hu L.T., Jewett M.W., Kraiczy P., Norris S.J., Skare J. Lyme Disease Pathogenesis. Curr. Issues Mol. Biol. 2021; 42: 473-518. DOI: https://doi.org/10.21775/CIMB.042.473

10. Beutler B., Milsark I.W., Cerami A.C. Passive immunization against cachectin/tumor necrosis factor protects mice from lethal effect of endotoxin. Science. 1985; 229 (4716): 869-71. DOI: https://doi.org/10.1126/SCIENCE.3895437

11. Oh S.J., Kim J.H., Chung D.H. NOD2-mediated Suppression of CD55 on Neutrophils Enhances C5a Generation During Polymicrobial Sepsis. PLoS Pathog. 2013; 9: e1003351. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1003351

12. Li H., Han W., Polosukhin V., Yull F.E., Segal B.H., Xie C.M., Blackwell T.S. NF-κB inhibition after cecal ligation and puncture reduces sepsis-associated lung injury without altering bacterial host defense. Mediators Inflamm. 2013; 2013: 503213. DOI: https://doi.org/10.1155/2013/503213

13. Long B., Koyfman A. Controversies in Corticosteroid use for Sepsis. J. Emerg. Med. 2017; 53 (5): 653-61. DOI: https://doi.org/10.1016/J.JEMERMED.2017.05.024

14. Budikhina A.S., Murugina N.E., Maximchik P.V., Dagil Y.A., Nikolaeva A.M., Balyasova L.S., Murugin V.V., Selezneva E.M., Pashchenkova Y.G., Chkadua G.Z., Pinegin B.V., Pashenkov M.V. Interplay between NOD1 and TLR4 receptors in macrophages: nonsynergistic activation of signaling pathways results in synergistic induction of proinflammatory gene expression. J. Immunol. 2021; 206 (9): 2206-20. DOI: https://doi.org/10.4049/JIMMUNOL.2000692

15. Fritz J.H., Girardin S.E., Fitting C., Werts C., Mengin-Lecreulx D., Caroff M., Cavaillon J.M., Philpott D.J., Adib-Conquy M. Synergistic stimulation of human monocytes and dendritic cells by Toll-like receptor 4 and NOD1- and NOD2-activating agonists. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2459-70. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200526286

16. van Heel D.A., Ghosh S., Butler M., Hunt K., Foxwell B.M.J., Mengin-Lecreulx D., Playford R.J. Synergistic enhancement of Toll-like receptor responses by NOD1 activation. Eur. J. Immunol. 2005; 35 (8): 2471-6. DOI: https://doi.org/10.1002/eji.200526296

17. Пичугин А.В., Багаев А.В., Лебедева А.В., Чулкина М., Атауллаханов Р.И. Синергическая продукция цитокинов дендритными клетками в ответ на одновременную активацию парами агонистов различных рецепторов врожденного иммунитета. Иммунология. 2017; 38 (2): 118-23. DOI: https://doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-2-118-123

18. Poltorak A., He X., Smirnova I., Liu M.Y., Van Huffel C., Du X., Birdwell D., Alejos E., Silva M., Galanos C., Freudenberg M., Ricciardi-Castagnoli P., Layton B., Beutler B. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: Mutations in Tlr4 gene. Science. 1998; 282 (5396): 2085-8. DOI: https://doi.org/10.1126/science.282.5396.2085

19. Girardin S.E., Travassos L.H., Hervé M., Blanot D., Boneca I.G., Philpott D.J., Sansonetti P.J., Mengin-Lecreulx D. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nod1 and Nod2. J. Biol. Chem. 2003; 278 (43): 41702-8. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M307198200

20. Масютина А.М., Пащенков М.В. Транскрипционный ответ макрофагов на сочетанную стимуляцию NOD- и Toll-подобного рецептора. Иммунология. 2023; 44 (4): 408-18. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-4-408-418

21. Takada H., Galanos C. Enhancement of endotoxin lethality and generation of anaphylactoid reactions by lipopolysaccharides in muramyl-dipeptide-treated mice. Infect. Immun. 1987; 55 (2): 409-13. DOI: https://doi.org/10.1128/iai.55.2.409-413.1987

22. Murch O., Abdelrahman M., Kapoor A., Thiemermann C. Muramyl dipeptide enhances the response to endotoxin to cause multiple organ injury in the anesthetized rat. Shock. 2008; 29 (3): 388-394. DOI: https://doi.org/10.1097/SHK.0b013e3181453e59

23. Falvo J.V., Tsytsykova A.V., Goldfeld A.E. Transcriptional control of the TNF Gene. Curr. Dir. Autoimmun. 2010; 11: 27. DOI: https://doi.org/10.1159/000289196

24. Litvak V., Ramsey S.A., Rust A.G., Zak D.E., Kennedy K.A., Lampano A.E., Nykter M., Shmulevich I., Aderem A. Function of C/EBPδ in a regulatory circuit that discriminates between transient and persistent TLR4-induced signals. Nat. Immunol. 2009; 10 (4): 437-43. DOI: https://doi.org/10.1038/ni.1721

25. Gri G., Savio D., Trinchieri G., Ma X. Synergistic regulation of the human interleukin-12 p40 promoter by NFkappaB and Ets transcription factors in Epstein-Barr virus-transformed B cells and macrophages. J. Biol. Chem. 1998; 273 (11): 6431-8. DOI: https://doi.org/10.1074/JBC.273.11.6431

26. Tukhvatulin A., Dzharullaeva A.S., Tukhvatulina N.M., Shcheblyakov D.V., Shmarov M.M., Dolzhikova I.V., Stanhope-Baker P., Naroditsky B.S., Gudkov A.V., Logunov D.Y., Gintsburg A.L. Powerful complex immunoadjuvant based on synergistic effect of combined TLR4 and NOD2 activation significantly enhances magnitude of humoral and cellular adaptive immune responses. PLoS One. 2016; 11 (5): e0155650. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0155650

27. Seo J., Koçak D.D., Bartelt L.C., Williams C.A., Barrera A., Gersbach C.A., Reddy T.E. AP-1 subunits converge promiscuously at enhancers to potentiate transcription. Genome Res. 2021; 31 (4): 538-50. DOI: https://doi.org/10.1101/GR.267898.120

28. Waskiewicz A.J., Flynn A., Proud C.G., Cooper J.A. Mitogen-activated protein kinases activate the serine/threonine kinases Mnk1 and Mnk2. EMBO J. 1997; 16 (8): 1909-20. DOI: https://doi.org/10.1093/emboj/16.8.1909

29. Pashenkov M.V., Balyasova L.S., Dagil Y.A., Pinegin B.V. The role of the p38-MNK-eIF4E signaling axis in TNF production downstream of the NOD1 receptor. J. Immunol. 2017; 198 (4): 1638-48. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1600467

30. Duffy J.P., Harrington E.M., Salituro F.G., Cochran J.E., Green J., Gao H., Bemis G., Evindar G., Galullo V.P., Ford P.J., Germann U.A., Wilson K.P., Bellon S.F., Chen G., Taslimi P., Jones P., Huang C., Pazhanisamy S., Wang Y.M., Murcko M.A., Su M.S.S. The discovery of VX-745: a novel and selective p38α kinase inhibitor. ACS Med. Chem. Lett. 2011; 2 (10): 758. DOI: https://doi.org/10.1021/ML2001455

31. Sommers C.D., Thompson J.M., Guzova J.A., Bonar S.L., Rader R.K., Mathialagan S., Venkatraman N., Holway V.W., Kahn L.E., Hu G., Garner D.S., Huang H.C., Chiang P.C., Schindler J.F., Hu Y., Meyer D.M., Kishore N.N. Novel tight-binding inhibitory factor-κB kinase (IKK-2) inhibitors demonstrate target-specific anti-inflammatory activities in cellular assays and following oral and local delivery in an in vivo model of airway inflammation. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2009; 330 (2): 377-88. DOI: https://doi.org/10.1124/JPET.108.147538

32. Sha T., Sunamoto M., Kitazaki T., Sato J., Ii M., Iizawa Y. Therapeutic effects of TAK-242, a novel selective Toll-like receptor 4 signal transduction inhibitor, in mouse endotoxin shock model. Eur. J. Pharmacol. 2007; 571 (2-3): 231-9. DOI: https://doi.org/10.1016/J.EJPHAR.2007.06.027

33. Rice T.W., Wheeler A.P., Bernard G.R., Vincent J.L., Angus D.C., Aikawa N., Demeyer I., Sainati S., Amlot N., Cao C., Ii M., Matsuda H., Mouri K., Cohen Jon. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial of TAK-242 for the treatment of severe sepsis. Crit. Care Med. 2010; 38 (8): 1685-94. DOI: https://doi.org/10.1097/CCM.0b013e3181e7c5c9

34. Opal S.M., Laterre P.F., Francois B., LaRosa S.P., Angus D.C., Mira J.P. et al. Effect of eritoran, an antagonist of MD2-TLR4, on mortality in patients with severe sepsis: The ACCESS randomized trial. JAMA. 2013; 309 (11): 1154-62. DOI: https://doi.org/10.1001/jama.2013.2194

35. Pashenkov M.V., Murugina N.E., Budikhina A.S., Pinegin B.V. Synergistic interactions between NOD receptors and TLRs: Mechanisms and clinical implications. J. Leukoc. Biol. 2019; 105 (4): 669-80. DOI: https://doi.org/10.1002/JLB.2RU0718-290R

36. Lanna A., Gomes D.C.O., Muller-Durovic B., McDonnell T., Escors D., Gilroy D.W., Lee J.H., Karin M., Akbar A.N. A sestrin-dependent Erk-Jnk-p38 MAPK activation complex inhibits immunity during aging. Nat. Immunol. 2017; 18 (3): 354-63. DOI: https://doi.org/10.1038/NI.3665

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)