Влияние детоксифицированного липополисахарида Shigella sonnei на экспрессию клетками меланомы В16 опухоль-ассоциированного антигена gp100 и антигенов MHC I

• Новикова Елена Михайловна
• Чухина Елена Станиславовна
• Разваляева Надежда Алексеевна
• Козырева Ольга Валентиновна
• Головина Марина Эдуардовна
• Львов Вячеслав Леонидович
• Апарин Петр Геннадьевич
• Степаненко Родион Николаевич

Резюме

Введение. В последние десятилетия ведутся активные исследования целесообразности включения в комплексную терапию злокачественной меланомы методов иммунокоррекции на основе препаратов, стимулирующих реакции врожденного иммунного ответа, в частности лигандов (агонистов) толл-подобных рецепторов (Toll-like receptors, TLRs). Агонисты TLRs рассматриваются в качестве перспективных лекарственных средств благодаря их способности стимулировать противоопухолевый иммунный ответ. TLRs представлены и на клетках иммунной системы, и на малигнизированных меланоцитах, поэтому влияние препаратов на основе агонистов TLRs на прогрессирование злокачественной меланомы может зависеть от их действия на клетки как опухоли, так и иммунной системы.

Цель исследования - изучение воздействия детоксифицированного липополисахарида (Ас3-S-ЛПС) Shigella sonnei, фаза I на экспрессию клетками меланомы В16 опухоль-ассоциированного антигена gp100 и антигенов MHC I в системе in vitro и на инфильтрацию первичных опухолевых узлов CD8⁺-Т-лимфоцитами после его введения in vivo.

Материал и методы. Для изучения влияния Ac3-S-ЛПС на клетки линии меланомы В16 использовали две экспериментальные модели: перевиваемую культуру клеток меланомы В16 (предоставлена лабораторией клеточного иммунитета НИИ ЭДиТО ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина" Минздрава России) и первичные опухолевые узлы (ПОУ), полученные после инокуляции клеток меланомы экспериментальным животным. При оценке влияния Ac3-S-ЛПС на клетки меланомы в культуре меланоциты культивировали с препаратом в течение 48 ч. Для изучения действия Ac3-S-ЛПС на субпопуляции клеток в ПОУ препарат вводили в область образовавшихся узлов.

Экспрессию антигенов TLR4 и gp100 на клетках меланомы, выращенных на покровных стеклах, определяли с помощью меченных флуорохромами поликлональных антител (Ат) с последующим анализом препаратов под флуоресцентным микроскопом.

Экспрессию CD8a, CD45, MHC I, CD F4/80 определяли с помощью моноклональных Ат, меченных флуорохромами, в клеточных суспензиях, полученных после культивирования клеток in vitro, и в клеточных суспензиях ПОУ с последующим анализом полученных суспензий с помощью проточного цитометра.

Для оценки влияния Ac3-S-ЛПС на пролиферацию опухолевых клеток в культуре использовали тест с красителем VPD450.

Результаты. Показано, что клетки меланомы линии В16 экспрессируют TLR4. Наличие данного рецептора на поверхности малигнизированных меланоцитов позволяет предположить, что эффекты, которые были отмечены при культивировании клеток с липополисахаридом Ac3-S-ЛПС, обусловлены его взаимодействием с TLR4, так как установлено, что липополисахариды грам-отрицательных микроорганизмов, к которым относится Shigella sonnei, являются лигандами этого рецептора. Культивирование клеток меланомы с Ac3-S-ЛПС приводит к изменению характера экспрессии gp100 и MHC I. Уровень экспрессии gp100 снижается, в то время как количество клеток, несущих MHC I, увеличивается. Снижается пролиферативная активность опухолевых клеток. При введении Ac3-S-ЛПС непосредственно в область ПОУ в опухолевом узле увеличивается относительное количество опухолевых клеток, экспрессирующих MHC I, и Т-лимфоцитов, несущих CD8а.

Заключение. На экспериментальных моделях in vitro и in vivo изучено влияние детоксифицированного липополисахарида (Ас3-S-ЛПС) Shigella sonnei, фаза I на клетки злокачественной меланомы В16. Установлено, что Ac3-S-ЛПС снижает экспрессию на опухолевых клетках меланома-ассоциированного антигена gp100 и увеличивает экспрессию MHC I, что сопровождается увеличением в ПОУ количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих CD8а.

Ключевые слова:меланома В16; малигнизированные клетки; детоксифицированный липополисахарид; TLR4; gp100; MHC I; VPD450-тест

Введение

В последние десятилетия ведутся активные исследования целесообразности включения в комплексную терапию злокачественной меланомы методов иммунокоррекции на основе препаратов, стимулирующих реакции врожденного иммунного ответа, в частности лигандов (агонистов) толл-подобных рецепторов (Toll-like receptors, TLRs). [1]. Агонисты TLRs рассматриваются как перспективные лекарственные средства благодаря своей способности стимулировать противоопухолевый иммунный ответ и проапоптотическому действию на опухолевые клетки [2]. Взаимодействие клеток иммунной системы с лигандами TLRs бактериального происхождения индуцирует продукцию цитокинов клеточного иммунитета и Т-регуляторной супрессии (ИЛ-6 и ИЛ-12), что приводит к переключению иммунного ответа в направлении Th1-дифференцировки, к активации ответа ИФН I типа, который существенен для дифференцировки дендритных клеток, перекрестной презентации антигенов (Аг) и пролиферации НК- и Т-клеток памяти [3].

Экспрессия TLRs не ограничивается клетками иммунной системы. Они обнаружены на многих других типах клеток, в том числе на нормальных и малигнизированных меланоцитах. В частности, на них были идентифицированы TLR2-5, TLR7, TLR9 и TLR10 [4, 5].

Наличие TLRs на меланоцитах позволяет рассматривать их как клетки иммунной системы кожи [6]. При этом при малигнизации меланоциты сохраняют на своей поверхности TLRs и после активации соответствующими лигандами начинают активно продуцировать цитокины и хемокины. После взаимодействия со специфическими лигандами TLR2, TLR3 и TLR4 в клетках меланомы были выявлены высокие уровни ФНОα, ИЛ-1, ИЛ-6 и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) (провоспалительные цитокины); CCL2 и CXCL10 (провоспалительные хемокины); ИЛ-10 (ингибирующий фактор опухолевого иммунитета) и циклооксигеназа-2 (воспалительный фактор) [7].

Развитие первичного опухолевого узла (ПОУ), образующегося в результате размножения малигнизированных меланоцитов, сопровождается активной миграцией в него клеток иммунной системы. Инфильтрация опухоли различными субпопуляциями клеток иммунной системы - это один из элементов, влияющих на рост опухоли. Количество, локализация и фенотипы лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (tumor-infiltrating lymphocytes, TIL), не только формируют ответ на иммунотерапию, но и являются ключевыми модуляторами прогрессирования заболевания [8].

Клинические наблюдения свидетельствуют о том, что увеличение TIL в опухоли коррелирует с благоприятным прогнозом течения заболевания. Практически на всех клетках иммунной системы, инфильтрирующих опухоль, включая антиген-презентирующие клетки, моноциты, макрофаги и различные субпопуляции Т-лимфоцитов, присутствуют TLRs. Активация TLRs на этих клетках приводит к синтезу провоспалительных цитокинов и хемокинов, который контролируется адаптивным иммунитетом [9]. В условиях микроокружения опухоли активация TLRs может оказывать как противоопухолевый эффект [активация дендритных клеток, цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и НК-клеток] [10, 11], так и стимулировать или подавлять рост опухоли в результате развития воспалительной реакции [12]. Таким образом, конечный эффект от воздействия агонистов TLRs на прогрессию злокачественной меланомы будет зависеть от действия как на малигнизированные меланоциты, так и на клетки адаптивной иммунной системы.

Известно, что ЛПС грам-отрицательных микроорганизмов являются лигандами TLR4 [1]. Ранее нами было установлено, что введение химически детоксифицированного ЛПС (Ac3-S-ЛПС) Shigella sonnei, фаза I, мышам линии С57Bl/6 с привитой меланомой В16, приводит к замедлению роста ПОУ [13]. Ac3-S-ЛПС представляет собой ЛПС с длинной цепью О-специфического полисахарида и липидом А, содержащим 3, а не 6 остатков высших жирных кислот, как в липидах А, выделенных из нативных ЛПС различных микроорганизмов. Удаление трех жирных кислот позволило значительно снизить эндотоксическую активность Ac3-S-ЛПС, характерную для нативных ЛПС.

Полученные нами ранее результаты свидетельствуют о том, что клетки меланомы линии В16, которую мы использовали для экспериментов, при культивировании с Ac3-S-ЛПС продуцируют ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10. В то же время клетки ПОУ, образовавшиеся после инокуляции опухолевых клеток, при культивировании с Ac3-S-ЛПС наряду с цитокинами ИЛ-1β, ИЛ-6 и ИЛ-10, продуцировали ФНО, ГМ-КСФ и ИЛ-4, что, по-видимому, связано с инфильтрацией опухолевых узлов лимфоцитами и макрофагами. Известно, что эти клетки активно мигрируют в опухолевые узлы, особенно на начальных этапах развития опухоли [14].

Как уже отмечалось, способность клеток меланомы продуцировать цитокины обусловлена взаимодействием малигнизированных клеток с TLRs. В то же время агонист будет активировать TIL в ПОУ, и результат его действия будет зависеть от влияния как непосредственно на клетки меланомы, так на клетки иммунной системы, инфильтрирующие опухоль. Поэтому при изучении влияния Ac3-S-ЛПС на прогрессию ПОУ мы использовали две экспериментальные модели: перевиваемую культуру клеток меланомы В16, в которой отсутствовали TIL, что подтверждалось отсутствием в субпопуляции CD45⁺, и клетки ПОУ, полученные после инокуляции клеток меланомы экспериментальным животным.

Было установлено, что клетки линии меланомы В16, которую мы использовали для экспериментов, экспрессируют TLR4. Культивирование клеток меланомы с Ac3-S-ЛПС приводит к изменению характера экспрессии поверхностных Аг - gp100, MHC I. Уровень экспрессии gp100 снижается, в то время как количество клеток, несущих MHC I, увеличивается. К тому же снижается пролиферативная активность опухолевых клеток. При введении Ac3-S-ЛПС непосредственно в область ПОУ в нем увеличивается относительное количество клеток, экспрессирующих MHC I и CD8а.

Материал и методы

Животные. Мыши линии С57Вl/6J, самки массой 18-20 г, были получены из питомника СМК "Стезар". Мыши содержались в виварии отдела лабораторных животных ФГБУ "НМИЦ им. Н.Н. Блохина" Минздрава России на стандартном пищевом рационе брикетированных экструзированных кормов со свободным доступом к корму и питьевой воде. Все экспериментальные процедуры с животными проводили в соответствии с Правилами исследовательской работы с лабораторными животными в ФГБУ "ГНЦ Институт иммунологии" ФМБА России (приказ от 12.11.2015), сертифицированными Местным комитетом по этике (резолюция 4/17 от 13.07.2017). Экспериментальные группы животных формировали методом случайной выборки с учетом массы тела в качестве ведущего показателя.

Культивирование клеток. Клетки линии меланомы В16 мышей, хранившиеся при -70°С, размораживали, дважды центрифугировали в среде RPMI-1640 при 250 g в течение 5 мин. Культивировали клетки в полной культуральной среде (ПКС), состоящей из RPMI-1640 с 25мМ Hepes, 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 2 мМ глютамина и 40 мкг/мл гентамицина (все реактивы "ПанЭко", Россия) в пластиковых культуральных флаконах в СО₂-инкубаторе при 37°С. На 4-е сутки, после образования плотного монослоя, клетки снимали раствором трипсин-ЭДТА. Полученную клеточную суспензию дважды отмывали центрифугированием при 250 g в течение 5 мин, ресуспендировали, подсчитывали количество живых и мертвых клеток с трипановым синим в камере Горяева и использовали для дальнейших экспериментов.

Культивирование клеток меланомы на стекле. В стерильные чашки Петри (диаметр 6 см) (NUNCLON, Дания) помещали покровные стекла 18×18×0,17 мм (ООО "МиниЛаб", Россия), простерилизованные в течение 2 ч при 160 °С. Затем в чашки вносили клетки меланомы В16 в количестве 0,5 - 10⁶ клеток в 5 мл ПКС с добавлением или без добавления Ac3-S-ЛПС. Чашки помещали в СО₂-инкубатор при 37 °С. Через 48 ч на всех стеклах образовывался монослой опухолевых клеток, который фиксировали 4 % формальдегидом (10 мин) и отмывали фостфатно-солевым буфером (ФБ) 3 раза по 5 мин и в дальнейшем определяли экспрессию на клетках TLRs и gp100.

Определение экспрессии TLRs на клетках меланомы. Клетки меланомы, зафиксированные на покровных стеклах 4 % формальдегидом, обрабатывали пермеабилизирующим буфером 0,1 % Triton-X-100 (MP Biomedicals, КНР) в течение 10 мин и отмывали ФБ 3 раза по 5 мин. После этого добавляли на 45 мин блокирующий буфер - 1 % бычий сывороточный альбумин (БСА). Затем без отмывки к клеткам были добавлены первичные Ат Polyclonal Antibody to Toll Like Receptor 4 (TLR4) (Cloud-Clone Corp., Китай) в разведении 1 : 50 в блокирующем буфере в объеме 100 мкл на стекло и в качестве контроля - тот же объем 1 % БСА без первичных Ат. Стекла инкубировали ночь при 4 °С во влажной камере. На следующий день стекла трижды отмывали ФБ и инкубировали с вторичными Ат PE-Linked Guinea pig Anti Rabbit IgG Antibody (Cloud-Clone Corp., Китай) в разведении 1 : 400 в 1 % БСА 1 ч при комнатной температуре в темноте. После инкубации стекла отмывали ФБ и окрашивали ядерным красителем DAPI (Invivogen, США) в течение 10 мин. Затем стекла отмывали ФБ и деионизированной водой. Окрашенные и высушенные покровные стекла наклеивали на предметные стекла клетками вниз с помощью монтирующей среды гистофлюида (Marienfeld, Германия) и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica 5000B.

Определение экспрессии PMEL17/GP100 на клетках меланомы. После фиксации клеточного слоя на покровных стеклах 4 % формальдегидом проводили термическое извлечение Аг в антиген-восстанавливающем буфере (100 мМ Tris, 5 % мочевина, рН 9,5) на водяной бане при 95 °С в течение 10 мин с последующей отмывкой ФБ. Затем стекла обрабатывали пермеабилизирующим буфером 0,1 % Triton-X-100 в течение 10 мин и после отмывки добавляли блокирующий буфер на 45 мин. После этого на стекла были нанесены первичные Ат DF2953 (БелкиАнтитела, Россия) в разведении 1 : 200 в объеме 100 мкл, на контрольные стекла - блокирующий буфер. Все стекла инкубировали ночь при 4 °С во влажной камере. На следующий день стекла трижды отмывали ФБ и инкубировали с вторичными Ат - PE-Linked Guinea pig Anti Rabbit IgG Antibody в разведении 1 : 400 1 ч при комнатной температуре в темноте. После инкубации и отмывки стекла были окрашены DAPI (1 мкг/мл) в течение 10 мин с последующей отмывкой ФБ и деионизированной водой. Высохшие покровные стекла наклеивали гистофлюидом клетками вниз на предметные стекла и анализировали под флуоресцентным микроскопом Leica 5000B (Германия).

Проточная цитометрия. Для проточной цитометрии использовали меченные флуорохромами моноклональные Ат (МкАт) фирмы eBioscience (США) CD8a APC, CD45 FITC, MHC I PE, CD F4/80 APC. Пробы анализировали на проточном цитометре Gallios 6 Color (Beckman Coulter, США) согласно инструкции фирмы-производителя МкАт.

Оценка пролиферативной активности клеток - VPD450-тест. Клеточную суспензию меланомы В16 помещали в полипропиленовую 15 мл пробирку, отмывали 2 раза центрифугированием 5 мин при 250 g в ФБ, чтобы убрать остатки ЭТС, считали клетки в камере Горяева и разводили в ФБ до концентрации 1-10 - 10⁶/мл. Добавляли 1 мкл VPD450 (США) на 1 мл клеточной суспензии и инкубировали 15 мин при 37 °С на водяной бане. После инкубации еще раз отмывали ФБ в соотношении 9 частей ФБ - 1 часть клеточной суспензии 5 мин при 250 g и ПКС для последующего культивирования клеток. Клетки культивировали в течение 48 ч с добавлением или без добавления Ac3-S-ЛПС. До и после окончания культивирования определяли среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ) клеток в опытных и контрольных культурах, анализируя препараты под флуоресцентным микроскопом.

Индукция образования ПОУ. Мышей линии С57Bl/6J заражали клетками меланомы В16 внутримышечно в дозе 100 тыс. клеток в 50 мкл стерильного физиологического раствора в бедро правой задней лапы. На 14-18-е сутки узел измеряли, выделяли, измельчали, фильтровали через клеточное сито, центрифугировали при 250 g 5 мин.

Статистический анализ данных. Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью стандартной прикладной программы Microsoft Excel 2013, рассчитывая средние значения показателей, ошибку средней и достоверность различий по t-критерию Стьюдента. Разницу считали достоверной при уровне значимости р < 0,05. Для анализа изображений, полученных под флуоресцентным микроскопом, использовали программу LAS X Office 1.4.4 (Leica Microsystems, GmbH, Германия). При учете результатов регистрировали как процент клеток, экспрессирующих маркер, так и СИФ, которую выражали в условных единицах (усл. ед.), соответствующих среднему каналу максимального свечения маркера. Позитивность определяли по отношению к негативному контролю.

Результаты

Экспрессия TLR4 на клетках меланомы В16

Для определения экспрессии TLR4 клетки меланомы В16 выращивали на покровных стеклах в чашках Петри в течение 48 ч (рис. 1). На рис. 1А представлена микрофотография (световой микроскоп) участка клеточного монослоя после фиксации 4 % формальдегидом и окраски азур-эозином. Это клетки с многогранным телом и длинными отростками-дендритами. В центре клетки локализуется большое ядро овальной формы. На рис. 1Б представлена микрофотография (флуоресцентный микроскоп) клеток монослоя, окрашенных первичными Ат, специфичными к TLR4 (Rabbit Anti-Mouse), а затем вторичными Ат (Guinea pig Anti-Rabbit IgG polyclonal AB PE-Linked), меченными фикоэритрином. На рис. 1В представлена микрофотография (флуоресцентный микроскоп) контрольной культуры, окрашенной только вторичными Ат.

На микрофотографии (см. рис. 1Б) достаточно четко видно, что клетки монослоя культуры меланомы В16, которую мы использовали для экспериментов, взаимодействуют с Ат, специфичными для TLR4.

Известно, что меланома относится к иммуногенным опухолям, на поверхности клеток которой присутствуют опухоль-специфичные Аг, такие как gp100, меланомный Аг 1, распознаваемый Т-клетками (MART-1), tyrosinase-related protein 2 (TRP-2) и ряд других, индуцирующих противоопухолевый иммунный ответ в результате активации Т-клеток, что позволяет использовать их для создания вакцинных препаратов [15].

Наиболее часто для этих целей используется gp100 (меланоцитарный белок PMEL) или его фрагменты. Gp100 представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I с молекулярной массой 100 кДа, он является структурным компонентом меланосом. Установлено, что gp100 несет различные иммуногенные эпитопы, которые распознаются цитотоксическими Т-лимфоцитами, инфильтрирующими опухоль и оказывающими значительное влияние на ее иммуногенность [16, 17].

Для оценки влияния детоксифицированного ЛПС на экспрессию gp100 размороженные клетки меланомы В16 культивировали в присутствии Ac3-S-ЛПС в течение 48 ч, а затем окрашивали поликлональными Ат к PMEL.17/GP100 согласно протоколу фирмы-производителя Ат (Affinit, КНР) и анализировали под флуоресцентным микроскопом. Культивирование клеток меланомы В16 с Ac3-S-ЛПС привело к значительному снижению экспрессии gp100 (рис. 2). Полученные результаты позволяют предположить, что под воздействием Ac3-S-ЛПС иммуногенность опухоли будет снижаться. Однако было показано, что пептиды, выделенные из опухоль-ассоциированных Аг, вызывают ответ цитотоксических Т-лимфоцитов, рестриктированный по МНС [18], причем эффективность иммунных реакций зависит как от уровня экспрессии меланома-ассоциированных Аг, так и от уровня экспрессии молекул МНС класса I [19].

Поэтому в следующей серии экспериментов мы изучали влияние Ac3-S-ЛПС на экспрессию Аг МНС класса I на клетках меланомы В16. Для этого суспензию клеток культивировали в течение 48 ч с агонистом, окрашивали МкАт к МНС I, меченными фикоэритрином и затем сравнивали среднюю интенсивность флуоресценции отдельных клеток. Полученные результаты представлены на рис. 3.

Эти результаты свидетельствуют о значительном увеличении количества клеток меланомы В16, несущих Аг МНС класса I, после культивирования с Ac3-S-ЛПС, что подтверждается результатами анализа этих же популяций клеток с помощью проточного цитометра (рис. 4).

Ac3-S-ЛПС снижает экспрессию на малигнизированных клетках меланома-ассоциированного Аг gp100, увеличивает экспрессию на этих клетках Аг МНС I и, следовательно, детоксифицированный ЛПС, непосредственно взаимодействуя с опухолевыми клетками, может изменять их свойства, что, естественно, будет оказывать влияние на прогрессирование опухоли.

В следующей серии экспериментов мы оценили влияние Ac3-S-ЛПС на интенсивность пролиферации клеток меланомы В16. Перед началом культивирования с Ac3-S-ЛПС доля живых опухолевых клеток в культуре, согласно тесту с трипановым синим, составляла 98 %. После окончания культивирования через 48 ч она не изменялась, что свидетельствует об отсутствии прямого цитотоксического действия препарата на клетки меланомы В16. При этом количество клеток в культуре, в которую добавляли Ac3-S-ЛПС, было статистически достоверно ниже, чем в контрольной. Количество клеток во флаконах без препарата составляло (12,75 ± 0,92) - 10⁵ в 0,5 мл, а во флаконах с препаратом - (6,25 ± 0,39) - 10⁵ в 0,5 мл. Это позволяет предположить, что наблюдаемое в экспериментах снижение количества клеток в культурах, в которые добавляли Ac3-S-ЛПС, связано с увеличением продолжительности клеточного цикла. Данное предположение подтверждается результатами экспериментов с использованием красителя VPD 450 (BD Horizon^TM Violet Proliferation Dye 450, BD Biosciences, Люксембург). При добавлении в культуру клеток нефлуоресцирующий краситель VPD 450 пассивно диффундирует через клеточную мембрану внутрь клетки, где он гидролизуется внутриклеточными неспецифическими эстеразами и ковалентно связывается с клеточными компонентами, приобретая при этом способность флуоресцировать под действием излучения с длиной волны 450 нм.

Мертвые клетки VPD 450 не окрашиваются. При каждом делении клеток, предварительно окрашенных VPD 450, интенсивность флуоресценции уменьшается приблизительно в 2 раза, что позволяет оценивать влияние различных препаратов на пролиферацию в течение того или иного периода культивирования клеток [20]. Перед началом культивирования в опытные и контрольные культуры добавляли VPD 450 и определяли начальную среднюю интенсивность флуоресценции (СИФ), выраженную в условных единицах (усл. ед.), анализируя препараты под флуоресцентным микроскопом. Клетки культивировали в течение 48 ч и после окончания культивирования определяли СИФ клеток в опытных и контрольных культурах (рис. 5).

Из представленных на рис. 5 данных следует, что значение СИФ клеток культур, в которые добавляли Ac3-S-ЛПС, было статистически достоверно выше, чем контрольных, что свидетельствовало о замедлении пролиферации клеток под влиянием препарата в культурах, в которые добавляли агонист.

На следующем этапе было изучено влияния Ac3-S-ЛПС на субпопуляционный состав ПОУ после введения препарата invivo. Для этого мышам линии С57ВL/6 в мышцу бедра правой задней конечности вводили 100 тыс. клеток меланомы В16. На 3-и, 8, 14 и 16-е сутки после инокуляции клеток меланомы мышам внутрибрюшинно вводили раствор Ac3-S-ЛПС в концентрации 100 мкг/мышь в объеме 100 мкл. На 11-12-е сутки после введения опухолевых клеток у мышей при пальпации было зарегистрировано появление ПОУ. На 18, 21 и 22-е сутки мышам из опытной группы в область ПОУ вводили раствор Ac3-S-ЛПС в концентрации 2 мкг/мл в объеме 50 мкл (0,1 мкг/мышь). Мышам из контрольной группы в опухолевый узел вводили стерильный физиологический раствор в те же сроки и в том же объеме.

Анализ субпопуляционного состава ПОУ показал, что относительное содержание CD45⁺-лимфоцитов было значительно выше в узлах, образовавшихся у мышей, которым вводили Ac3-S-ЛПС (рис. 6). При этом у животных опытной группы отмечено значительное увеличение в ПОУ относительного количества лимфоцитов CD45⁺/CD8а⁺ (рис. 7).

При цитометрическом анализе субпопуляций клеток ПОУ у животных, которым вводили Ac3-S-ЛПС, было отмечено значительное увеличение количества клеток, экспрессирующих Аг MHC I, и некоторое увеличение количества клеток, экспрессирующих детерминанты CD F4/80 (см. таблицу).

Таким образом, введение invivo Ac3-S-ЛПС Shigella sonnei приводит к увеличению в ПОУ количества клеток, экспрессирующих MHC I, и стимулирует миграцию в них CD8a⁺-лимфоцитов (см. рис. 7).

Обсуждение

В представленном исследовании на экспериментальных моделях invitro и invivo было изучено влияние детоксифицированного ЛПС Shigella sonnei, фаза I, на клетки злокачественной меланомы В16. Было показано, что клетки перевиваемой линии меланомы экспрессируют TLR4. Наличие данного рецептора на поверхности малигнизированных меланоцитов позволяет предположить, что эффекты, которые были отмечены при культивировании клеток с Ac3-S-ЛПС, обусловлены его взаимодействием с TLR4, так как установлено, что ЛПС грам-отрицательных микроорганизмов, к которым относятся Shigella sonnei, являются лигандами этого рецептора [21].

Полученные результаты свидетельствуют о том, что культивирование клеток меланомы с Ac3-S-ЛПС приводит к уменьшению экспрессии опухоль-ассоциированного меланомного Аг gp100 (см. рис. 2), от которого в значительной степени зависит иммуногенность опухоли. Известно, что гидрофобный гликопротеин gp100 относится к семейству дифференцировочных Аг, экспрессируемых большинством малигнизированных меланоцитов. В его молекуле представлены различные иммуногенные эпитопы, которые распознаются цитотоксическими CD8⁺-Т-лимфоцитами пациентов со злокачественной меланомой [17]. Возможно, снижение экспрессии gp100 будет приводить к снижению иммуногенности клеток опухоли. Однако установлено, что активация опухоль-специфичных CD8⁺-Т-лимфоцитов происходит в результате взаимодействия Аг-распознающего рецептора с фрагментами опухолевых Аг в комплексе с молекулами MHC I, поэтому эффективность иммунных реакций зависит как от уровня экспрессии опухолевых Аг, так и от уровня экспрессии молекул МНС класса I.

Как известно, молекулы МНС класса I экспрессируются всеми ядросодержащими клетками организма, а их присутствие является обязательным условием для формирования эффективного иммунного ответа и распознавания опухолевых клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами. Экспериментально доказано, что в процессе роста опухоли малигнизированные клетки теряют молекулы МНС класса I [22].

Согласно существующим представлениям, утрата поверхностных Аг МНС I является одним из механизмов защиты малигнизированных клеток от цитотоксических лимфоцитов хозяина. Результаты исследования ранее нелеченных пациентов с меланомой показали, что частичная или полная потеря экспрессии MHC класса I приводит к значительному снижению эффективности противоопухолевого Т-клеточного иммунного ответа [23].

При исследовании первичных меланом и метастатических поражений было установлено, что отсутствие или низкий уровень Аг HLA класса I характерны для большинства первичных опухолей, коррелируют со стадией заболевания и продолжительностью жизни пациентов. При этом количество молекул HLA, присутствующих на поверхности опухолевых клеток, может количественно влиять на их лизис цитотоксическими лимфоцитами.

Поэтому нами было изучено влияние Ac3-S-ЛПС не только на экспрессию опухолевого Аг gp100, но и на экспрессию Аг MHC класса I. Установлено, что культивирование клеток меланомы В16 в присутствии Ac3-S-ЛПС приводит к повышению экспрессии Аг MHC класса I на малигнизированных меланоцитах (см. рис. 3).

При введении invivo Ac3-S-ЛПС в область первичного опухолевого узла (см. таблицу) также было зафиксировано увеличение количества клеток, несущих Аг MHC класса I. При этом в ПОУ животных, которым вводили препарат, относительное количество MHC I⁺/CD45⁺- и MHC I^-/CD45⁺-клеток было значительно выше. И если стимулирующее влияние продуктов бактериального происхождения на экспрессию Аг MHC класса I на Аг-представляющих клетках было неоднократно описано [24], то данных в научной литературе о модуляции экспрессии этих Аг непосредственно на малигнизированных меланоцитах нами не обнаружено.

Увеличение экспрессии Аг MHC класса I после воздействия лигандов толл-подобных рецепторов было отмечено в экспериментах с глиомой GL261, клетки которой, как и клетки меланомы В16, несут TLR2, TLR3 и TLR4 [25]. Возможно, следует ожидать, что и на клетках других опухолей, экспрессирующих TLRs, после взаимодействия с соответствующими лигандами будет увеличиваться экспрессия Аг MHC класса I, а это, в свою очередь, будет способствовать интенсивности противоопухолевого иммунного ответа.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что увеличение на клетках меланомы экспрессии Аг MHC класса I, после введения invivo Ac3-S-ЛПС, сопровождается увеличением содержания CD8⁺-T-лимфоцитов в опухолевых узлах, что подтверждается результатами цитометрического анализа (рис. 7). Так, при анализе 100 000 клеток ПОУ контрольной группы мышей в гейте, содержащем CD8⁺CD45⁺-лимфоциты, было зарегистрировано 427 клеток, в то время как в группе мышей, получавших Ac3-S-ЛПС, среди 100 000 клеток ПОУ в аналогичном гейте было зарегистрировано 3310 CD8⁺CD45⁺-лимфоцитов.

Особый интерес к изучению уровня экспрессии Аг МНС I на поверхности клеток меланомы в настоящее время связан с впечатляющими результатами, полученными при комбинированной терапии больных меланомой c применением МкАт к CTLA-4 и к PD-1, которая обеспечивала хорошие клинические результаты на поздних стадиях развития заболевания [23, 26]. Клинические наблюдения высокой эффективности терапии больных меланомой МкАт к CTLA-4 и к PD-1 также подтверждаются результатами экспериментов по изучению комбинированной терапии меланомы B16F0 у мышей C57BL/6J. Показано, что блокирование CTLA-4 и PD-1 совместно с перепрограммированием миелоидных клеток с помощью агониста TLR-4 оказалось гораздо более эффективным по сравнению с чекпойнт-блокадой и использованием TLR-4-агониста по отдельности в виде монотерапии [27].

При изучении корреляции экспрессии белков MHC класса I и II на опухолевых клетках пациентов с меланомой, ранее не получавших лечения, и результатами транскрипционного и геномного анализа, а также с клиническим ответом на анти-CTLA-4 МкАт, анти-PD-1-МкАт или комбинированную терапию было установлено, что частичная или полная потеря мембранной экспрессии Аг MHC класса I на клетках меланомы наблюдалась в 78 из 181 случая (43 %), связана с подавлением транскрипции генов HLA-A, HLA-B, HLA-C и B2M и приводит к первичной резистентности к терапии анти-CTLA-4 МкАт, но не анти-PD-1-МкАт. Таким образом, экспрессия молекул MHC может модулировать реакцию на ингибиторы иммунной контрольной точки у пациентов с прогрессирующей меланомой. Результаты клинических исследований свидетельствуют, что пациенты с низкой экспрессией Аг MHC класса I реагируют на ингибитор PD-1 в гораздо меньшей степени, чем пациенты с более высокой экспрессией MHC класса I [23]. Потеря Аг MHC класса I тесно связана с прогрессированием заболевания и указывает на отсутствие клинического ответа.

Согласно существующим представлениям, основным следствием терапии ингибиторами контрольной точки является развитие ЦТЛ, которым требуется опосредованная MHC класса I презентация Аг опухолевыми клетками, значительно сниженная у пациентов с данным заболеванием. Возможно, этим можно объяснить отсутствие реакции на иммунокорригирующую терапию. Полученные результаты позволяют предположить, что включение в комплексную терапию меланомы препаратов, восстанавливающих на малигнизированных меланоцитах экспрессию Аг МНС класса I, в частности, детоксифицированного Ac3-S-ЛПС, поможет решить эту проблему.

Заключение

Установлено, что детоксифицированный ЛПС Shigella sonnei, фаза I, оказывает влияние на экспрессию поверхностных Аг на малигнизированных меланоцитах и замедляет пролиферацию опухолевых клеток меланомы В16. Культивирование опухолевых клеток с Ac3-S-ЛПС приводит к снижению экспрессии опухоль-ассоциированного Аг gp100 и значительно увеличивает экспрессию Аг MHC класса I на клетках меланомы (см. рис. 3, 4). Увеличение экспрессии Аг MHC класса I на клетках меланомы было выявлено как при культивировании опухолевых клеток с Ac3-S-ЛПС, так и при введении его в область опухолевого узла, что приводило к усилению противоопухолевого иммунного ответа.

Литература

1. Coati I., Miotto S., Zanetti I., Alaibac M. Toll-like receptors and cutaneous melanoma (Review). Oncology Letters. 2016; 12: 3655-61. DOI: https://doi.org/10.3892/ol.2016.5166
2. Salaun B., Lebecque S., Matikainen S., Rimoldi D., Romero P. Toll-like receptor 3 expressed by melanoma cells as a target for therapy? Clin. Cancer Res. 2007; 13: 4565-74. DOI: https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-07-0274
3. Adams S. Toll-like receptor agonists in cancer therapy. Immunotherapy. 2009; 1: 949-64. DOI: https://doi.org/10.2217/imt.09.70
4. Burns E.M., Yusuf N. Toll-like receptors and skin cancer. Front Immunol. 2014; 5: 135. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2014.00135
5. Joo Hee Ahn, Tae Jun Park, Sun Hee Jin, Hee Young Kang. Human melanocytes express functional Toll-like receptor 4. Experimental Dermatology. 2008; 17: 412-7. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1600-0625.2008.00701.x
6. Hong Y., Song B., Chen H.-D., Gao X.-H. Melanocytes and skin immunity. J. Invest. Dermatol. Symp. Proc. 2015; 17 (1): 37-9. DOI: https://doi.org/10.1038/jidsymp.2015.14
7. Goto Y., Arigami T., Kitago M., Nguyen S.L., Narita N., Ferrone S., Morton D.L., Irie R.F., Hoon D.S. Activation of Toll-like receptors 2, 3 and 4 on human melanoma cells induces inflammatory factors. Mol. Cancer Ther. 2008; 7 (11): 3642-53. DOI: https://doi.org/10.1158/1535-7163.MCT-08-0582 PMID: 19001446
8. Maibach F., Sadozai H., Seyed Jafari S.M., Hunger R.E., Schenk M. Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Their Prognostic Value in Cutaneous Melanoma. Front Immunol. 2020; 11: 2105. DOI: https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.02105
9. Patra M.C., Shah M., Choi S. Toll-like receptor-induced cytokines as immunotherapeutic targets in cancers and autoimmune diseases. Semin. Cancer Biol. 2020; 64: 61-82. DOI: https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2019.05.002
10. Abarca-Merlin D.M., Maldonado-Bernal C., Alvarez-Arellano L. Toll-like receptors as therapeutic targets in central nervous system tumors. Biomed. Res. Int. 2019; 2019: 5286358. DOI: https://doi.org/10.1155/2019/5286358
11. Tran T.H., Tran T.T.P., Truong D.H., Nguyen H.T., Pham T.T., Yong C.S., Kim J.O. Toll-like receptor-targeted particles: a paradigm to manipulate the tumor microenvironment for cancer immunotherapy. Acta Biomater. 2019; 94: 82-96. DOI: https://doi.org/10.1016/j.actbio.2019.05.043
12. Korneev K.V., Atretkhany K.N., Drutskaya M.S., Grivennikov S.I., Kuprash D.V., Nedospasov S.A. TLR-signaling and proinfammatory cytokines as drivers of tumorigenesis. Cytokine. 2017; 89: 127-35. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cyto.2016.01.021
13. Новикова Е.М., Козырева О.В., Разваляева Н.А., Чухина Е.С., Головина М.Э., Львов В.Л., Апарин П.Г., Степаненко Р.Н. Влияние капсульного полисахарида и детоксифицированного липополисахарида Shigella sonnei на рост опухолевого узла и синтез цитокинов у мышей линии С57Bl/6 после инокуляции меланомы В16. Иммунология. 2023; 44 (2): 167-80. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-2-167-80
14. Gata V.A., Lisencu C.I., Vlad C.I., Piciu D., Irimie A., Achimas-Cadariu P. Tumor infiltrating lymphocytes as a prognostic factor in malignant melanoma. Review of the literature. J. Buon. 2017; 22 (3): 592-8. PMID: 28730761
15. Hailemichael Y., Overwijk W.W. Cancer vaccines: Trafficking of tumor-specific T cells to tumor after therapeutic vaccination. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2014; 53: 46-50. DOI: https://doi.org/10.1016/j.biocel.2014.04.019
16. Kawakami Y., Dang N., Wang X., Tupesis J., Robbins P.F., Wang R.F., Wunderlich J.R., Yannelli J.R., Rosenberg S.A. Recognition of shared melanoma antigens in association with major HLA-A alleles by tumor infiltrating T lymphocytes from 123 patients with melanoma. J. Immunother. 2000; 23 (1): 17-27. DOI: https://doi.org/10.1097/00002371-200001000-00004
17. Eisenberg G., Machlenkin A., Frankenburg S., Mansura A., Pitcovski J., Yefenof E., Peretz T., Lotem M. Transcutaneous immunization with hydrophilic recombinant gp100 protein induces antigen-specific cellular immune response. Cell Immunol. 2010; 266 (1): 98-103. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2010.09.003
18. Boon T., van der Bruggen P. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. J. Exp. Med. 1996; 183 (3): 725-9. DOI: https://doi.org/10.1084/jem.183.3.725
19. Rivoltini L., Barracchini K.C., Viggiano V., Kawakami Y., Smith A., Mixon A., Restifo N.P., Topalian S.L., Simonis T.B., Rosenberg S.A., Marincola F.M. Quantitative correlation between HLA class I allele expression and recognition of melanoma cells by antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. Cancer Res. 1995; 55 (14): 3149-57. PMID: 7541714
20. Elia J., Sundarrajan M., Ernst D. Technique for Loading Cells with BD Horizon™ Violet Proliferation Dye 450 (VPD450). BD Biosciences Technical Bulletin. 2012; 1-11.
21. Ciesielska A., Matyjek M., Kwiatkowska K. TLR4 and CD14 trafficking and its influence on LPS-induced pro-inflammatory signaling. Cell Mol Life Sci. 2021; 78 (4): 1233-61. DOI: https://doi.org/10.1007/s00018-020-03656-y
22. Garrido F., Aptsiauri N. Cancer immune escape: MHC expression in primary tumours versus metastases. Immunology. 2019; 158: 255-66. DOI: https://doi.org/10.1111/imm.13114
23. Rodig S.J., Gusenleitner D., Jackson D.G., Gjini E., Giobbie-Hurder A., Jin C., Chang H., Lovitch S.B., Horak C., Weber J.S., Weirather J.L., Wolchok J.D., Postow M.A., Pavlick A.C., Chesney J., Hodi F.S. MHC proteins confer differential sensitivity to CTLA-4 and PD-1 blockade in untreated metastatic melanoma. Sci. Transl. Med. 2018; 10 (450): 3342. DOI: https://doi.org/10.1126/scitranslmed.aar3342
24. Muzio M., Bosisio D., Polentarutti N., D’amico G., Stoppacciaro A., Mancinelli R., van’t Veer C., Penton-Rol G., Ruco L.P., Allavena P., Mantovani A. Differential expression and regulation of toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells. Immunol. 2000; 164: 5998-6004. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.164.11.5998
25. Visintin A., Mazzoni A., Spitzer J.H., Wyllie D.H., Dower S.K., Segal D.M. Regulation of Toll-like receptors in human monocytes and dendritic cells. J. Immunol. 2001; 166: 249-55. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.166.1.249
26. MHC Expression Predicts Checkpoint Blockade Response. [No authors listed]. Cancer Discov. 2018; 8 (9): 1052. DOI: 10.1158/2159-8290.CD-NB2018-104
27. Пичугин А.В., Подсвирова С.А., Ушакова Е.И., Спирин Д.М., Лебедева Е.С., Атауллаханов Р.И. Перепрограммирование миелоидных клеток опухолевого микроокружения повышает эффективность блокады рецепторов CTLA-4 и PD-1 при иммунотерапии злокачественной меланомы в эксперименте. Иммунология. 2022; 43 (6): 673-690. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-6-673-690

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)