Роль остаточных ксеноантигенов в дегенерации ксеногенных биопротезов клапанов сердца

• Костюнин А.Е.
• Резвова М.А.

Резюме

Ксеногенные биологические протезы клапанов сердца имеют преимущества перед механическими протезами, обусловленные оптимальными показателями их гидродинамики и отсутствием необходимости в назначении пожизненной антикоагулянтной терапии. Однако ксенобиопротезы подвержены кальцификации, что ограничивает их широкое использование, особенно у детей и молодых людей. За последние годы накопился массив данных, свидетельствующих о том, что за дегенерацией ксенобиопротезов, помимо пассивных физических и физико-химических процессов, стоят активные механизмы, включающие гуморальный и клеточный иммунный ответ. Главным триггером иммунного ответа на ксеногенные ткани имплантатов, по-видимому, являются углеводные антигены, такие, как галактоза-α-1,3-галактоза и N-гликолилнейраминовая кислота. Предполагается, что совершенствование методов химической модификации биоматериала и/или использование нокаутных животных для изготовления клапанных заменителей может стать ключом к увеличению срока службы ксенобиопротезов и уменьшению числа операций репротезирования.

Ключевые слова:биопротезы клапанов сердца; дисфункции, кальцификация; ксеноантигены; галактоза-α-1,3-галактоза; N-гликолилнейраминовая кислота; обзор

Введение

В настоящее время основным способом лечения ряда клапанных пороков сердца являются операции протезирования, в ходе которых пораженные сердечные клапаны заменяются механическими или биологическими протезами [1, 2]. Ежегодно во всем мире имплантируется до 280 тыс. заменителей клапанов и половина из них приходится на биопротезы (БП) [3]. Использование последних связано со значительными преимуществами перед имплантацией механических клапанов, что обусловлено минимизацией риска тромбоэмболических осложнений у прооперированных пациентов и отсутствием необходимости в назначении им пожизненного приема антикоагулянтов [2, 3]. БП представлены ауто-, алло- и ксеноимплантатами, однако в связи с доступностью последних именно они чаще всего используются при протезировании клапанов [3, 4]. Тем не менее ксеногенные БП имеют ограниченную долговечность, что резко ограничивает их широкое использование, поскольку требует проведение операций репротезирования [1].

В качестве главной причины отказа ксеногенных БП выступает структурная дегенерация клапана (СДК), представляющая собой сложный многофакторный процесс, связанный с постепенным необратимым разрушением и кальцификацией ксеноткани [5]. Накапливается все больше доказательств того, что за развитием СДК, помимо пассивных физических и физико-химических процессов [6], стоят активные механизмы, в частности активация гуморального и клеточного иммуного ответа на ксеноимплантат [7]. Триггером иммунного ответа на ксеноткани БП, по-видимому, являются остаточные углеводные антигены животных [4]. Последние не только являются главным барьером для ксенотрансплантации живых тканей и органов, но они также задействованы в процессах дегенерации химически модифицированного ксенобиоматериала, хотя он и не является живой тканью [7].

Несмотря на применение современных методик химической обработки ксеноткани, направленных на устранение ее иммуногенности, ксеноантигены не удаляются полностью и обнаруживаются в биоматериале ряда используемых в современной клинической практике моделей ксеногенных БП [8, 9]. Таким образом, сохранение антигенов животных может играть ключевую роль в раннем появлении СДК, способствуя развитию иммунного ответа на ксеноткань, ускоренному ее повреждению и кальцификации, что в конечном итоге приводит к дисфункции БП. Особенно остро эта проблема стоит у детей и пациентов молодого возраста, чья иммунная система более реактивна и дисфункция БП возникает быстрее, чем у пожилых пациентов [7]. В настоящем обзоре проведен анализ актуальной информации по этому вопросу, рассматриваются перспективные пути уменьшения иммуногенных свойств ксеноимплантатов сердечных клапанов с целью увеличения их долговечности.

Стратегия поиска источников литературы

В обзоре анализируются данные релевантных статей, описывающих химическую природу ксеноантигенов и их значение для ксенобиопротезирования клапанов сердца, опубликованные с января 2009 по январь 2019 г. Также в статье приведен анализ некоторых более ранних трудов, содержащих важную информацию по исследуемому вопросу. Изученные работы представлены в базах данных PubMed и Google Scholar. Поисковые запросы основаны на сочетаниях слов: "xenoantigens", "xenotransplantation", "bioprosthetic heart valves", "galactose-α-1,3-galactose", "α-Gal", "α-Gal epitope", "N-glycolylneuraminic acid", "NeuGc", "antibody", "calcification", "decellularization". Также поиск работ происходил с использованием списков литературы, приведенных в релевантных статьях. В связи с тем, что в русскоязычных работах почти не представлены статьи по изучаемой тематике, предпочтение отдавалось зарубежным источникам.

Основные ксеноантигены и их химическая природа

В роли потенциальных мишеней для иммунной системы человека при ксенобиопротезировании сердечных клапанов могут выступать несколько углеводных антигенов, встречающихся у животных, но не у человека. К наиболее изученным из них относятся галактоза-α-1,3-галактоза и N-гликолилнейраминовая кислота.

Галактоза-α-1,3-галактоза (α-Гал). Олигосахарид α-Гал (рис. 1) выступает в качестве терминального звена невосстанавливающего конца молекул гликанов, связанных с поверхностными белками и липидами. Он относится к наиболее важным ксеноантигенам и отвечает как за сверхострое отторжение живых ксенотрансплантатов органов и тканей, так отчасти и за разрушение химически модифицированных ксенотканей БП клапанов сердца [4]. α-Гал образуется ферментативным путем при участии α-1,3-галактозилтрансферазы (α-1,3-ГТ) [10]. Указанный фермент катализирует следующую реакцию:

Основным субстратом для α-1,3-ГТ является N-ацетил-лактозамин (Gal(β1-4)GlcNAc), при этом в результате реакции образуется трисахарид Gal(α1-3)Gal(β1-4)GlcNAc-R, часто называемый α-галактозильным эпитопом [11, 12].

Известно, что гликоконъюгаты, углеводные компоненты которых содержат терминальный фрагмент α-Гал, обильно экспрессируются на поверхности эритроцитов и большинства ядросодержащих клеток сумчатых, а также плацентарных млекопитающих, не являющихся приматами [10-14]. Экспрессия α-Гал характерна и для клеток представителей некоторых групп приматов, включая лемуров и широконосых обезьян, однако у гоминоидов и обезьян Старого Света α-Гал в организме не вырабатывается, что связано с эволюционной инактивацией гена, кодирующего α-1,3-ГТ [10-12]. Вследствие потери α-1,3-ГТ и отсутствия синтеза α-Гал у всех узконосых обезьян, в том числе у человека, утрачена иммунная толерантность к данному олигосахариду. Таким образом, иммунная система человека распознает α-Гал-содержащие соединения как инородные. Известно, что антитела против α-Гал (анти-Гал), представленные изотипами IgG, IgM и IgA, имеют наиболее высокое содержание среди антител человека, составляющее 1-3% от общего уровня циркулирующих иммуноглобулинов [8, 15]. Считается, что главным источником антигенов, необходимым для постоянной продукции анти-Гал, являются α-галактозилоподобные эпитопы, располагающиеся на поверхности бактерий нормальной кишечной микрофлоры [15]. Стоит отметить, что анти-Гал отсутствуют у человека при рождении (за исключением IgG, полученных от матери), но начинают вырабатываться в течение первых месяцев жизни [16].

N-гликолилнейраминовая кислота (N-ГНК). Помимо α-Гал в тканях животных присутствуют и другие углеводные антигены, которые могут быть ответственны за активацию иммунного ответа и отторжение ксенотрансплантатов у человека и приматов [14]. В большинстве своем их роль в дегенерации ксеноткани БП не изучена. Тем не менее на сегодняшний день накоплен массив данных, свидетельствующих об участии в этих процессах N-ГНК [4, 7].

N-ГНК является гидроксилированной формой N-ацетилнейраминовой кислоты (N-АНК) и принадлежит к классу сиаловых кислот (рис. 2). Последние представляют собой α-кетомоносахариды с углеродной цепью, содержащей 9 атомов углерода. Они располагаются на концах гликанов, конъюгированных с белками и липидами клеточной поверхности [9]. N-ГНК наряду с N-АНК является наиболее распространенной из сиаловых кислот у млекопитающих [9], однако она не синтезируется в организме человека, а также однопроходных (утконос), куньих, ластоногих, широконосых обезьян и некоторых пород собак [17]. Потеря N-ГНК у человека связана с элиминацией гена CMAH, кодирующего ответственный за ее образование фермент гидроксилазу цитидин-монофосфат-N-ацетилнейраминовой кислоты [18]. Таким образом, у людей вырабатываются антитела, специфичные к N-ГНК [19-21]. Значение N-ГНК как одного из барьеров для ксенотрансплантации широко описано в литературе, что позволяет предполагать важную роль данного антигена в процессах дегенерации химически модифицированных тканей ксеногенных БП [20].

Остаточные ксеноантигены как один из главных триггеров развития структурной дегенерации клапана

Известно, что α-Гал и N-ГНК обильно экспрессируются в нативных тканях перикарда свиней, лошадей и крупного рогатого скота [22], а также свиных клапанах [23, 24], используемых для производства БП. Кроме того, современные способы химической обработки ксеноткани обычно не обеспечивают полную маскировку или удаление углеводных ксеноантигенов, которые остаются доступными для связывания с антителами, благодаря чему выявляются в биоматериале коммерческих БП иммунофлюоресцентным и иммуногистохимическим методами [8, 9, 25, 26]. Важно отметить, что после замены нативных клапанов сердца ксеногенными БП в плазме прооперированных пациентов значительно увеличиваются титры анти-Гал [27-29], что не наблюдается при имплантации механических протезов [27, 28].

При связывании с антигенами животных антитела человека, по-видимому, способствуют опсонизации ксеноткани БП. Связывание антител с антигенами происходит посредством Fab-фрагментов, тогда как их свободные Fc-фрагменты распознаются Fcγ-рецепторами (CD16, CD32, CD64) моноцитов [30]. Также было показано, что моноциты способны распознавать α-Гал на эндотелиальных клетках аорты свиньи через рецепторы галектина-3 [31]. Таким образом, благодаря ксеноантигенам и антителам моноциты оседают на поверхности БП и проникают в ткань, становясь макрофагами. Эту гипотезу подтверждают результаты оригинальных исследований, демонстрирующие присутствие в ксеноткани эксплантированных БП-антител класса IgM, IgG и C4d-фрагмента комплемента, а также клеточных инфильтратов, состоящих из макрофагов и других иммунных клеток, включая T- и B-лимфоциты, нейтрофилы, эозинофилы и гигантские многоядерные клетки [32-34]. Стоит отметить, что исследуемая иммуногистохимическим методом ткань эксплантированных БП не окрашивается на α-Гал, но имеет интенсивное окрашивание на IgM и IgG человека [35]. Этот факт предполагает деградацию α-Гал-содержащих эпитопов и/или их маскировку антителами человека [35].

По-видимому, стимулируемая осаждением на имплантате антител лейкоцитарная инфильтрация способствует разрушению коллагеновой основы ксеноткани с последующим отложением фосфата кальция на поврежденных участках. Показано, что формирующиеся в тканях БП воспалительные инфильтраты колокализуются с местами, где наблюдается расслоение, фрагментация и дезорганизация волокон коллагена [34, 36], а атакующие имплантат макрофаги продуцируют плазминоген [33], гликозаминогликаны [34] и матриксные металлопротеиназы [34]. Также известно, что макрофаги могут выделять остеопонтин - полифункциональный белок, который активируется при различных воспалительных состояниях и обладает провоспалительными и кальций-связывающими свойствами [37]. В дальнейшем фрагменты разрушенных матрикс-деградирующими протеазами волокон коллагена, апоптировавшие иммунные клетки и связываемые гликозаминогликанами липопротеины служат ядрами кальцификации [33, 34]. В частности, методом электронной микроскопии показано присутствие кристаллических структур на поверхности моноцитов и макрофагов, атакующих ксеногенные БП, что подтверждает их участие в инициации минерализации [36].

Благодаря химической сшивке ксеноткани, придающей последней большую прочность и устойчивость к протеолизу, активация иммунного ответа на БП не приводит к быстрому его разрушению, однако может способствовать развитию хронического воспаления, обуславливающего постепенную кальцификацию имплантата [7]. С течением времени данный процесс может самоусиливаться, поскольку активированные лейкоциты продуцируют различные цитокины, хемокины и факторы роста, привлекая в очаг воспаления новые иммунные клетки.

Все вышесказанное позволяет заключить, что связывание антител с антигенами животных является исходным иммунологическим триггером для опосредованной макрофагами дегенерации ксеноткани, что со временем способствует кальцификации и дисфункции БП. Важно отметить, что данная концепция отчасти объясняет ранние отказы ксеногенных БП у детей и молодых людей [38], имеющих более быстрый метаболизм кальция и большую реактивность иммунной системы по сравнению с пациентами преклонного возраста [4, 7]. Как известно, существует четкая обратная связь между возрастом и скоростью развития СДК [38].

Пути снижения иммуногенности ксеноткани

В настоящее время можно выделить два наиболее перспективных пути снижения иммуногенности ксенобиоматериала, используемого для изготовления БП: выведение специальных линий животных, нокаутных по α-Гал и N-ГНК, а также совершенствование и/или разработка новых способов обработки ксеноткани.

Использование нокаутных животных. Предполагается, что активация иммунного ответа на ксеногенные БП может быть значительно снижена при использовании имплантатов, изготовленных из тканей животных, не экспрессирующих основные ксеноантигены [7]. Таковыми, например, могут стать свиньи с двойным нокаутом по α-Гал и N-ГНК [39].

Потенциальная польза от использования тканей нокаутных животных для ксенобиопротезирования доказана результатами ряда оригинальных исследований. В частности, методом иммунофлюоресцентного анализа продемонстрировано, что при обработке сывороткой человека нативных и фиксированных глутаровым альдегидом (ГА) клапанов и перикарда, полученных от генетически модифицированных свиней линии GTKO/hCD46/NeuGcKO (с двойным нокаутом по α-Гал и N-ГНК, экспрессирующих белок CD46 человека, являющийся ингибитором рецептора комплемента), интенсивность окраски ксенотканей на антитела IgM и IgG оказывается сопоставима с таковой тканей человека [26]. В свою очередь, нативный и ГА-фиксированный биоматериал, взятый от свиней линии GTKO/hCD46, дефицитных только по α-Гал, при обработке сывороткой человека характеризуется более интенсивным окрашиванием на IgM и IgG, однако степень связывания антител с тканями таких животных оказывается значительно ниже по сравнению с тканями свиней дикого типа [26]. Еще одним доказательством меньшей иммуногенности ксеногенных БП, изготовленных из тканей свиней, нокаутных по α-Гал, служат результаты исследования in vivo на обезьянах [40]. Показано, что такие имплантаты не вызывают существенного увеличения продукции анти-Гал у прооперированных обезьян, тогда так при имплантации БП, изготовленных из тканей α-Гал-положительных свиней, у подопытных обезьян наблюдались высокие титры анти-Гал-антител на протяжении года после операции [40].

Несмотря на то что, вероятно, существует большое количество антигенов животных, против которых люди могут продуцировать антитела, генетическое удаление ключевых ксеноантигенов α-Гал и N-ГНК может защитить БП от интенсивного иммунного ответа. По-видимому, БП, изготовленные из тканей таких животных, все еще будут подвержены постепенному разрушению и кальцификации, однако потенциально эти процессы могут быть значительно замедлены [7]. Тем не менее, переход на массовое производство БП из тканей нокаутных животных в настоящее время невозможен в связи с их малым поголовьем и большими затратами на генную инженерию, что, однако, может измениться в будущем [7].

Химическая модификация ксеноткани. Для снижения антигенной активности и склонности к ферментативной деградации внеклеточного матрикса ксеноматериалы перед имплантацией подвергаются модификации специальными химическими агентами - консервантами. Консерванты образуют ковалентные связи с функциональными группами аминокислот, входящих в состав белков биологических тканей [41]. Одним из наиболее распространенных химических веществ, использующихся с этой целью в том числе в коммерчески доступных изделиях, является ГА [42]. ГА содержит две альдегидные группы, которые взаимодействуют с боковыми аминогруппами лизина, образуя имины (основания Шиффа) (рис. 3).

К преимуществам указанного способа консервации можно отнести высокую скорость реакции в стандартных условиях (комнатная температура, нейтральная среда, отсутствие органических растворителей, что позволяет избежать денатурации белковых структур), высокую селективность процесса, образование поперечных сшивок молекул коллагена, составляющих основу внеклеточного матрикса биологической ткани. В то же время, как было отмечено выше, результаты ряда исследований указывают на низкую способность ГА блокировать эпитоп α-Гал [8, 43], что обусловлено его углеводной природой (отсутствием в структуре аминогрупп, легкодоступных для связывания с альдегидными группами ГА).

Отмеченное некоторыми исследованиями [8] частичное снижение количества активных α-Гал-эпитопов в ГА-модифицированном ксеноматериале можно объяснить образованием нестабильных связей (полуацеталей) между альдегидными группами консерванта и гидроксильными группами антигенного олигосахарида (рис. 4).

Иммуногенность коммерческих образцов биопротезов клапанов сердца, консервированных ГА, по отношению к N-гликолилнейраминовой кислоте также подтверждена экспериментальными работами, где экспрессию в образцах идентифицировали с использованием IgG человека против N-ГНК [9]. N-ГНК относится к классу сиаловых кислот и, подобно α-Гал, не содержит потенциальных для связывания альдегидом первичных аминогрупп.

В то же время существуют и другие стабилизирующие биологическую ткань химические вещества, представляющие собой альтернативу ГА: эпоксисоединения [44], карбодиимиды [45], изоцианаты [46], генипин [47] и др. Однако, полноценных экспериментальных работ, посвященных валидному сравнению количественного содержания антигенов α-Гал и N-ГНК в ткани после модифицирования различными консервантами, в доступной литературе обнаружено не было. При этом увеличение анти-Гал IgM и IgG с течением времени после имплантации перикарда крупного рогатого скота (КРС) нокаутным мышам по результатам ранее проведенных исследований наблюдали как для образцов, фиксированных ГА, так и для образцов, фиксированных генипином [48]. В связи с этим можно сделать предположение о потенциальной неэффективности данного способа обработки в клинических условиях, что может перекрыть все позитивные результаты доклинических испытаний, однако такое утверждение требует экспериментального подтверждения.

На основании теоретических представлений о химических свойствах эпоксигрупп можно предположить большую склонность данного типа консервантов связывать гидроксигруппы ксеноантигенов, в частности α-Гал и N-ГНК. Потенциально этот метод стабилизации ксеноткани может способствовать более эффективному экранированию антигенов животных по сравнению с обработкой ГА (рис. 5) [49]. В то же время отсутствие экспериментальных работ, определяющих уровень содержания ксеноантигенов в ксеноматериале, обработанном эпоксидными соединениями, указывает на необходимость проведения полноценного исследования. Ввиду способности карбодиимидов активировать карбоксильные группы субстратов, данный тип консервантов теоретически обладает способностью снижать активность N-ГНК, что также требует практически обоснованного подтверждения.

Еще одним способом снижения иммунного ответа реципиента на ксеноимплантаты в настоящее время является децеллюляризация, в результате которой происходит освобождение биоматериала от клеточной составляющей, несущей ксеноантигены [50]. Децеллюляризация реализуется путем воздействия на биологическую ткань физическими методами, химическими детергентами и/или ферментативной обработкой, что в результате способствует разрушению клеточных компонентов [51]. При этом важно подобрать такие условия модифицирования, которые позволят сохранить внеклеточный матрикс (коллаген и эластин), определяющий как биомеханические свойства конечного устройства, так и его склонность к биодеградации. Группе исследователей удалось при использовании мягкого 0,1% раствора ионогенного детергента додецилсульфата (SDS) удалить из структуры ткани перикарда КРС эпитоп α-Гал, что авторы подтверждают данными иммунофлюоресцентного анализа после реакции с лектином BSI-B4 и антителом M86, а также сохранить внеклеточный компонент, что подтверждено данными анализа гистологии и физико-механических свойств [52]. Децеллюляризация комбинированным методом, основанном на замораживании-оттаивании образцов и воздействии того же 0,1% SDS, по результатам другого исследования, привела к значимому снижению количества эпитопа α-Гал в ткани свиньи при сохранении внеклеточной структуры [53]. При этом, по данным литературы, воздействие на нативные аортальные клапаны свиньи более концентрированным 1% раствором SDS (сроки обработки превышают тот же параметр для ранее описанных протоколов) не позволяет полностью удалить антиген α-Гал, хотя авторы отмечают значимое снижение количества эпитопа по сравнению с исходным уровнем [54]. Комбинированная обработка перикарда циклами замораживания и оттаивания, неионогенным детергентом Triton X-100 и дезоксихолатом натрия показала при качественной оценке гистохимическим методом полное отсутствие α-Гал и сохранение внеклеточного компонента ткани [50]. При этом, несмотря на данные литературы о весомом вкладе N-ГНК в общую антигенность ксеноматериалов [55, 56], в ходе литературного поиска не обнаружено исследовательских работ, изучающих влияние децеллюляризации на остаточное содержание сиаловых антигенов в ксенотканях, что, очевидно, связано с относительной недавним открытием этого антигена.

Также перспективным направлением по снижению антигенной активности ксенотрансплантатов является модифицирование исходного биоматериала α-галактозидазой. Значимое уменьшение уровня содержания эпитопа α-Гал было обнаружено в дермальных тканях свиньи, результаты подтверждены как данными иммунофлюоресцентного и иммуногистогимического анализа, так и с использованием метода количественной оценки [57]. Экспериментальные работы по изучению ксеноперикарда КРС методом имплантации α-Гал-дефицитным мышам показали значимо меньшие количества кальция в образцах, обработанных α-галактозидазой и децеллюризованных перед фиксацией ГА по сравнению с предварительно необработанными, что авторы объясняют снижением антигенности имплантата [58].

На основании анализа литературных данных можно сделать вывод о перспективности химического и ферментативного способов снижения антигенной активности ксеноматериалов, что в некоторых случаях может практически полностью избавить ткань от ксеноантигенов, при этом стоимость такого модифицирования окажется в несколько раз ниже по сравнению с использованием нокаутных животных.

Заключение

Протезирование клапанов сердца ксенобиопротезами может рассматриваться как одна из разновидностей ксенотрансплантации. По-видимому, механизмы отторжения и разрушения химически модифицированных тканей животных отчасти сходны с таковыми отторжения живых ксенотканей. Хотя в настоящее время нет исследований, однозначно указывающих на прямую связь между сохранением в ксенобиопротезах клапанов антигенов животных и развитием СДК, результаты множества исследований, приведенных в настоящей работе, указывают на правильность этой гипотезы.

Наиболее важным вопросом в рамках обсуждаемой темы является снижение иммуногенности химически стабилизированного ксенобиоматериала. Наиболее перспективным направлением в решении данной проблемы представляется совершенствование методов химической стабилизации и разработка способов дополнительной обработки ксенотканей, хотя для определения подходящих для этих целей химических агентов и способов их применения необходимы дополнительные фундаментальные исследования в области биохимии и иммунологии. Гипотетически использование нокаутных животных для производства биологических протезов может иметь большие преимущества, однако на данный момент эта стратегия труднореализуема и крайне затратна с экономической точки зрения.

Литература/References

1. Baumgartner H., Falk V., Bax J.J., De Bonis M., et al. 2017 ESC/EACTS Guidelines for the management of valvular heart disease. Eur. Heart J. 2017; 38 (36): 2739-91. doi: 10.1093/eurheartj/ehx391.

2. Nishimura R.A., Otto C.M., Bonow R.O., Carabello B.A., et al. 2017 AHA/ACC focused update of the 2014 AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: a report of the American College of Cardiology American Heart Association task force on clinical practice guidelines. Circulation. 2017; 135 (25): e1159-95. doi: 10.1161/CIR.0000000000000503.

3. Pibarot P., Dumesnil J.G. Prosthetic heart valves: selection of the optimal prosthesis and long-term management. Circulation. 2009; 119 (7): 1034-48. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.108.778886.

4. Manji R.A., Lee W., Cooper D.K.C. Xenograft bioprosthetic heart valves: past, present and future. Int. J. Surg. 2015; 23 (Pt B): 280-4. doi: 10.1016/j.ijsu.2015.07.009.

5. Capodanno D., Petronio A.S., Prendergast B., Eltchaninoff H., et al. Standardized definitions of structural deterioration and valve failure in assessing long-term durability of transcatheter and surgical aortic bioprosthetic valves: a consensus statement from the European Association of Percutaneous Cardiovascular Interventions (EAPCI) endorsed by the European Society of Cardiology (ESC) and the European Association for Cardio-Thoracic Surgery (EACTS). Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2017; 52 (3): 408-17. doi: 10.1093/ejcts/ezx244.

6. Schoen F.J., Levy R.J. Calcification of tissue heart valve substitutes: progress toward understanding and prevention. Ann. Thorac. Surg. 2005; 79 (3): 1072-80. doi: 10.1016/j.athoracsur.2004.06.033.

7. Manji R.A., Ekser B., Menkis A.H., Cooper D.K. Bioprosthetic heart valves of the future. Xenotransplantation. 2014; 21 (1): 1-10. doi: 10.1111/xen.12080.

8. Naso F., Gandaglia A., Bottio T., Tarzia V., et al. First quantification of alpha-Gal epitope in current glutaraldehyde-fixed heart valve bioprostheses. Xenotransplantation. 2013; 20 (4): 252-61. doi: 10.1111/xen.12044.

9. Reuven E.M., Leviatan Ben-Arye S., Marshanski T., Breimer M.E., et al. Characterization of immunogenic Neu5Gc in bioprosthetic heart valves. Xenotransplantation. 2016; 23 (5): 381-92. doi: 10.1111/xen.12260.

10. Joziasse D.H., Oriolb R. Xenotransplantation: the importance of the Galα1,3Gal epitope in hyperacute vascular rejection. Biochim. Biophys. Acta. 1999; 1455 (2-3): 403-18. doi: 10.1016/S0925-4439(99)00056-3.

11. Huai G., Qi P., Yang H., Wang Y. Characteristics of α-Gal epitope, anti-Gal antibody, α1,3 galactosyltransferase and its clinical exploitation (review). Int. J. Mol. Med. 2016; 37 (1): 11-20. doi: 10.3892/ijmm.2015.2397.

12. Macher B.A., Galili U. The Galalpha1,3Galbeta1,4GlcNAc-R (alpha-Gal) epitope: a carbohydrate of unique evolution and clinical relevance. Biochim. Biophys. Acta. 2008; 1780 (2): 75-88. doi: 10.1016/j.bbagen.2007.11.003.

13. Buhler L., Friedman T., Iacomini J., Cooper D.K. Xenotransplantation-state of the art - update 1999. Front. Biosci. 1999; 4: D416-32. PMID: 10209058.

14. Cooper D.K. Xenoantigens and xenoantibodies. Xenotransplantation. 1998; 5 (1): 6-17. doi: 10.1111/j.1399-3089.1998.tb00003.x.

15. Galili U. Anti-Gal: an abundant human natural antibody of multiple pathogeneses and clinical benefits. Immunology. 2013; 140 (1): 1-11. doi: 10.1111/imm.12110.

16. Hamanova M., Chmelikova M., Nentwich I., Thon V., et al. Anti-Gal IgM, IgA and IgG natural antibodies in childhood. Immunol. Lett. 2015; 164 (1): 40-3. doi: 10.1016/j.imlet.2015.02.001.

17. Ng P.S., Bohm R., Hartley-Tassell L.E., Steen J.A., et al. Ferrets exclusively synthesize Neu5Ac and express naturally humanized influenza A virus receptors. Nat. Commun. 2014; 5: 5750. doi: 10.1038/ncomms6750.

18. Hayakawa T., Aki I., Varki A., Satta Y., et al. Fixation of the human-specific CMP-N-acetylneuraminic acid hydroxylase pseudogene and implications of haplotype diversity for human evolution. Genetics. 2006; 172 (2): 1139-46. doi: 10.1534/genetics.105.046995.

19. Hurh S., Kang B., Choi I., Cho B., et al. Human antibody reactivity against xenogeneic N-glycolylneuraminic acid and galactose-α-1,3-galactose antigen. Xenotransplantation. 2016; 23 (4): 279-92. doi: 10.1111/xen.12239.

20. Salama A., Evanno G., Harb J., Soulillou J.P. Potential deleterious role of anti-Neu5Gc antibodies in xenotransplantation. Xenotransplantation. 2015; 22 (2): 85-94. doi: 10.1111/xen.12142.

21. Zhu A., Hurst R. Anti-N-glycolylneuraminic acid antibodies identified in healthy human serum. Xenotransplantation. 2002; 9 (6): 376-81. PMID: 12371933.

22. Barone A., Benktander J., Whiddon C., Jin C., et al. Glycosphingolipids of porcine, bovine, and equine pericardia as potential immune targets in bioprosthetic heart valve grafts. Xenotransplantation. 2018; 25 (5): e12406. doi: 10.1111/xen.12406.

23. Barone A., Benktander J., Teneberg S., Breimer M.E. Characterization of acid and non-acid glycosphingolipids of porcine heart valve cusps as potential immune targets in biological heart valve grafts. Xenotransplantation. 2014; 21 (6): 510-22. doi: 10.1111/xen.12123.

24. Lee W., Hara H., Cooper D.K., Manji R.A. Expression of NeuGc on pig heart valves. Xenotransplantation. 2015; 22 (2): 153-4. doi: 10.1111/xen.12162.

25. Konakci K.Z., Bohle B., Blumer R., Hoetzenecker W., et al. Alpha-Gal on bioprostheses: xenograft immune response in cardiac surgery. Eur. J. Clin. Invest. 2005; 35 (1): 17-23. doi: 10.1111/j.1365-2362.2005.01441.x.

26. Lee W., Long C., Ramsoondar J., Ayares D., et al. Human antibody recognition of xenogeneic antigens (NeuGc and Gal) on porcine heart valves: could genetically modified pig heart valves reduce structural valve deterioration? Xenotransplantation. 2016; 23 (5): 370-80. doi: 10.1111/xen.12254.

27. Bloch O., Golde P., Dohmen P.M., Posner S., et al. Immune response in patients receiving a bioprosthetic heart valve: lack of response with decellularized valves. Tissue Eng. Part A. 2011; 17 (19-20): 2399-405. doi: 10.1089/ten.TEA.2011.0046.

28. Mangold A., Szerafin T., Hoetzenecker K., Hacker S., et al. Alpha-Gal specific IgG immune response after implantation of bioprostheses. Thorac Cardiovasc Surg. 2009; 57 (4): 191-5.

29. Park C.S., Park S.S., Choi S.Y., Yoon S.H., et al. Anti alpha-gal immune response following porcine bioprosthesis implantation in children. J. Heart Valve Dis. 2010; 19 (1): 124-30. PMID: 20329498.

30. Human P., Zilla P. Inflammatory and immune processes: the neglected villain of bioprosthetic degeneration? J. Long Term Eff. Med. Implants. 2001; 11 (3-4): 199-220. PMID: 11921664.

31. Jin R., Greenwald A., Peterson M.D., Waddell T.K. Human monocytes recognize porcine endothelium via the interaction of galectin 3 and alpha-GAL. J. Immunol. 2006; 177 (2): 1289-95. PMID: 16818789.

32. Nair V., Law K.B., Li A.Y., Phillips K.R., et al. Characterizing the inflammatory reaction in explanted Medtronic Freestyle stentless porcine aortic bioprosthesis over a 6-year period. Cardiovasc. Pathol. 2012; 21 (3): 158-68. doi: 10.1016/j.carpath.2011.05.003.

33. Sakaue T., Nakaoka H., Shikata F., Aono J., et al. Biochemical and histological evidence of deteriorated bioprosthetic valve leaflets: the accumulation of fibrinogen and plasminogen. Biol. Open. 2018, 7 (8). pii: bio034009. doi: 10.1242/bio.034009.

34. Shetty R., Pibarot P., Audet A., Janvier R., et al. Lipid-mediated inflammation and degeneration of bioprosthetic heart valves. Eur. J. Clin. Invest. 2009; 39 (6): 471-80. doi: 10.1111/j.1365-2362.2009.02132.x.

35. Manji R.A., Hara H., Cooper D.K. Characterization of the cellular infiltrate in bioprosthetic heart valves explanted from patients with structural valve deterioration. Xenotransplantation. 2015; 22 (5): 406-7. doi: 10.1111/xen.12187.

36. Stein P.D., Wang C.H., Riddle J.M., Magilligan D.J. Jr. Leukocytes, platelets, and surface microstructure of spontaneously degenerated porcine bioprosthetic valves. J. Card. Surg. 1988; 3 (3): 253-61. PMID: 2980025.

37. Cho H.J., Cho H.J., Kim H.S. Osteopontin: a multifunctional protein at the crossroads of inflammation, atherosclerosis, and vascular calcification. Curr. Atheroscler. Rep. 2009; 11 (3): 206-13. PMID: 19361352.

38. Arsalan M., Walther T. Durability of prostheses for transcatheter aortic valve implantation. Nat. Rev. Cardiol. 2016; 13 (6): 360-7. doi: 10.1038/nrcardio.2016.43.

39. Lutz A.J., Li P., Estrada J.L., Sidner R.A., et al. Double knockout pigs deficient in N-glycolylneuraminic acid and galactose α-1,3-galactose reduce the humoral barrier to xenotransplantation. Xenotransplantation. 2013; 20 (1): 27-35. doi: 10.1111/xen.12019.

40. McGregor C.G., Kogelberg H., Vlasin M., Byrne G.W. Gal-knockout bioprostheses exhibit less immune stimulation compared to standard biological heart valves. J. Heart Valve Dis. 2013; 22 (3): 383-90. PMID: 24151765.

41. Dunn R.M. Cross-linking in biomaterials. Plast. Reconstr. Surg. 2012; 130 (5 Suppl. 2): 18S-26S. doi: 10.1097/PRS.0b013e31825efea6.

42. Migneault I., Dartiguenave C., Bertrand M.J., Waldron K.C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 2004; 37 (5): 790-6, 798-802. doi: 10.2144/04375RV01.

43. Naso F., Gandaglia A., Iop L., Spina M., et al. Alpha-Gal detectors in xenotransplantation research: a word of caution. Xenotransplantation. 2012; 19 (4): 215-20. doi: 10.1111/j.1399-3089.2012.00714.x.

44. Sato M., Hiramatsu Y., Matsushita S., Sato S., et al. Shrinkage temperature and anti-calcification property of triglycidylamine-crosslinked autologous tissue. J. Artif. Organs. 2014; 17 (3): 265-71. doi: 10.1007/s10047-014-0768-y.

45. Everaerts F., Torrianni M., Hendriks M., Feijen J. Quantification of carboxyl groups in carbodiimide cross-linked collagen sponges. J. Biomed. Mater. Res. A. 2007; 83 (4): 1176-83. doi: 10.1002/jbm.a.31398.

46. Vasudev S.C., Chandy T., Sharma C.P., Mohanty M., et al. Effects of double cross-linking technique on the enzymatic degradation and calcification of bovine pericardia. J. Biomater. Appl. 2000; 14 (3): 273-95. doi: 10.1177/088532820001400305.

47. Chang Y., Tsai C.C., Liang H.C., Sung H.W. In vivo evaluation of cellular and acellular bovine pericardia fixed with a naturally occurring crosslinking agent (genipin). Biomaterials. 2002; 23 (12): 2447-57. PMID: 12033592.

48. Lim H.G., Choi S.Y., Yoon E.J., Kim S.H., et al. In vivo efficacy of alpha-galactosidase as possible promise for prolonged durability of bioprosthetic heart valve using alpha1,3-galactosyltransferase knockout mouse. Tissue Engineering Part A. 2013; 19 (21-22): 2339-48. doi: 10.1089/ten.tea.2013.0062.

49. Kumar A., Sundararaghavan V., Browning A.R. Study of temperature dependence of thermal conductivity in cross-linked epoxies using molecular dynamics simulations with long range interactions. Modelling Simul. Mater. Sci. Eng. 2014; 22 (2): 025013. doi: 10.1088/0965-0393/22/2/025013.

50. Li N., Li Y., Gong D., Xia C., et al. Efficient decellularization for bovine pericardium with extracellular matrix preservation and good biocompatibility. Interact Cardiovasc. Thorac. Surg. 2018; 26 (5): 768-76. doi: 10.1093/icvts/ivx416.

51. Bracey D.N., Seyler T.M., Jinnah A.H., Lively M.O., et al. A decellularized porcine xenograft-derived bone scaffold for clinical use as a bone graft substitute: a critical evaluation of processing and structure. J. Funct. Biomater. 2018; 9 (3). doi: 10.3390/jfb9030045.

52. Heuschkel M.A., Leitolis A., Roderjan J.G., Suss P.H., et al. In vitro evaluation of bovine pericardium after a soft decellularization approach for use in tissue engineering. Xenotransplantation. 2019; 26 (2): e12464. doi: 10.1111/xen.12464.

53. Wu L.C., Kuo Y.J., Sun F.W., Chen C.H., et al. Optimized decellularization protocol including α-Gal epitope reduction for fabrication of an acellular porcine annulus fibrosus scaffold. Cell Tissue Bank. 2017; 18 (3): 383-96. doi: 10.1007/s10561-017-9619-4.

54. Helder M.R.K., Stoyles N.J., Tefft B.J., Hennessy R.S., et al. Xenoantigenicity of porcine decellularized valves. J. Cardiothorac. Surg. 2017; 12 (1): 56. doi: 10.1186/s13019-017-0621-5.

55. Paul A., Padler-Karavani V. Evolution of sialic acids: implications in xenotransplant biology. Xenotransplantation. 2018; 25 (6): e12424. doi: 10.1111/xen.12424.

56. Naso F., Gandaglia A. Different approaches to heart valve decellularization: a comprehensive overview of the past 30 years. Xenotransplantation. 2017; 25 (1): e12354. doi: 10.1111/xen.12354.

57. Gao H.W., Li S.B., Sun W.Q., Yun Z.M., et al. Quantification of α-Gal antigen removal in the porcine dermal tissue by α-galactosidase. Tissue Eng. Part C Methods. 2005; 21 (11): 1197-204. doi: 10.1089/ten.tec.2015.0129.

58. Kim M.S., Lim H.G., Kim Y.J. Calcification of decellularized and alpha-galactosidase-treated bovine pericardial tissue in an alpha-Gal knock-out mouse implantation model: comparison with primate pericardial tissue. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2016; 49 (3): 894-900. doi: 10.1093/ejcts/ezv189.