Меню

2 . 2024

Новые синтетические противовирусные пептиды. Проектирование, получение, физико-химический анализ, изучение активности

Резюме

Введение. В настоящее время высока потребность в поиске новых перспективных средств для терапии инфекций, вызванных респираторными вирусами. Значительная доля таких инфекций, в том числе приводящих к опасным для жизни осложнениям, вызывается респираторно-синцитиальным вирусом человека (РСВ). Синтетические пептиды активно разрабатываются и испытываются в качестве потенциальных противовирусных лекарственных средств. В частности, они могут быть использованы для разработки новых средств для лечения РСВ-инфекции. При создании новых пептидов с предполагаемой противовирусной активностью особое значение имеет рациональное проектирование их структур и изучение физико-химических свойств для определения корреляции между структурой и активностью.

Цели исследования - создать и экспериментально подтвердить структуры новых синтетических противовирусных пептидов, изучить их активности против РСВ.

Материал и методы. Структуры пептидов были составлены на основе анализа структур лигандов нуклеолина - клеточной мишени РСВ, а также на основе более ранних работ авторского коллектива. Пептиды были получены методом твердофазного синтеза, качественно охарактеризованы с помощью масс-спектрометрии, количественно охарактеризованы с помощью автоматического элементного анализа, их чистота была определена зонным капиллярным электрофорезом. Противовирусные свойства определяли в культуре клеток in vitro. Цитотоксичность определяли с помощью MTT-теста.

Результаты. Все полученные пептиды обладали выраженными противовирусными свойствами. Предполагается, что наибольший эффект достигается при комбинации в структуре пептида ароматических и катионогенных аминокислотных остатков, в частности Y, F, R, K, O. Противовирусными свойствами обладали как разветвленные пептиды, так и линейные. Положительный совокупный номинальный заряд пептида и/или выраженная амфипатичность способствовали проявлению противовирусных свойств. Данные структурные свойства характерны для противовирусных, клеточно-проникающих и противомикробных пептидов, в том числе природных.

Заключение. Показана эффективность примененной методологии при разработке новых эффективных синтетических противовирусных пептидов; приведены закономерности, наблюдаемые между строением пептидов и их активностью.

Ключевые слова:синтетические пептиды; противовирусные пептиды; катионные пептиды; дендримерные пептиды; респираторно-синцитиальный вирус; фармацевтическая разработка

Для цитирования: Шатилов А.А., Шатилова А.В., Сапрыгина Л.В., Бабихина М.О., Тимотиевич Е.Д., Ковчина В.И., Андреев С.М., Смирнов В.В., Кудлай Д.А., Шиловский И.П., Хаитов М.Р. Новые синтетические противовирусные пептиды. Проектирование, получение, физико-химический анализ, изучение активности. Иммунология. 2024; 45 (2): 162-170. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-2-162-170

Финансирование. Исследование выполнено в рамках государственного задания "Спрей-23" при финансовой поддержке Федерального медико-биологического агентства. Публикация результатов исследования в открытой печати разрешена.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Шатилов А.А.; сбор и обработка материала - Шатилов А.А., Шатилова А.В., Бабихина М.О., Сапрыгина Л.В., Тимотиевич Е.Д., Ковчина В.И.; статистическая обработка - Шатилова А.В., Тимотиевич Е.Д., Ковчина В.И.; написание текста - Шатилов А.А., Шатилова А.В., Сапрыгина Л.В.; редактирование - Шатилов А.А., Шатилова А.В., Андреев С.М., Смирнов В.В., Кудлай Д.А., Шиловский И.П., Хаитов М.Р.

Введение

Респираторные вирусы, в частности вирус гриппа, респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) и риновирусы - это наиболее распространенные инфекционные патогены. РСВ относится к наиболее распространенным возбудителям инфекций. Он представляет особую угрозу для новорожденных и детей младшего возраста: в 0,5 % случаев госпитализированные умирают. Особенно тяжело РСВ-инфекция протекает у пациентов с бронхиальной астмой и с иммунодефицитами [1].

Несмотря на десятилетия исследований, безопасной и эффективной вакцины против РСВ не получено. Недостаточно эффективны используемые в терапии РСВ-инфекций препараты рибавирина и интерферона. Высокую эффективность в клинических исследованиях показали средства на основе моноклональных антител, такие как паливизумаб, однако они очень дороги, в связи с чем в настоящее время продолжается разработка новых средств терапии [2].

Одним из перспективных подходов к разработке средств терапии РСВ является использование пептидов, в том числе природных. К их основным преимуществам относятся широкий спектр противовирусного действия, биодеградация и низкая вероятность развития резистентности у возбудителей [3-5]. Однако к недостаткам таких пептидов можно отнести нестабильность и дороговизну получения, связанную со сложностью их структур.

Одно из возможных решений этих проблем - получение синтетических соединений - коротких фрагментов природных пептидов и белков, а также получение не встречающихся в природе пептидов с разнообразными модификациями боковых цепей аминокислот [6]. Для таких синтетических пептидов ранее была показана безопасность и эффективность применения в клинических испытаниях, например в качестве носителей нуклеиновых кислот в составе препарата МИР 19^® [7, 8].

Структуры потенциальных противовирусных синтетических пептидов могут основываться на известных лигандах нуклеолина, в частности на эндостатине, белке слияния РСВ, белках интиминовой группы [9-11]. Для этого, в свою очередь, необходим рациональный подход к проектированию таких пептидов и тщательный анализ их физико-химических свойств.

Для решения указанных проблем в рамках данной работы были спроектированы, получены, охарактеризованы и испытаны in vitro 5 синтетических пептидов с потенциальной противовирусной активностью.

Материал и методы

Проектирование и получение пептидов. Проектирование пептидов осуществлялось путем анализа структур нуклеолина, эндостатина и белка слияния РСВ. Использовались аминокислотные последовательности из базы данных UniProt. Для SA-37, SA-38 и SA-52 были составлены проекции Шиффера-Эдмундсона с использованием алгоритма HeliQuest [12]. Для анализа SA-52 ввиду невозможности работы алгоритма с орнитином и β-аланином использовались лизин и аланин соответственно.

Для синтеза использовались Fmoc-защищенные аминокислоты (Sigma, США; Iris, ФРГ), активатор - гидроксибензотриазолтетраметилурония гексафторофосфат (Iris, ФРГ), смола - H-Rink-Amide-Chemmatrix (Iris, ФРГ), растворитель - N,N-диметилформамид (ДМФА, Scharlau, ФРГ). Снятие Fmoc-защиты осуществлялось в среде 30 % раствора тетрагидропиррола (Кемстор, Россия) в ДМФА. Отщепление пептидов от смолы производилось ацидолизом концентрированной трифторуксусной кислотой (ТФУ, Carl Roth, ФРГ) в присутствии 1,2-этандитиола (Sigma, США) и тиоанизола (Fluka AG, ФРГ).

Очистка выполнялась методом градиентной ион-парной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием хроматографа Prominence (Shimadzu, Япония). Элюент А - 0,1 % раствор ТФУ в воде. Элюент Б - ацетонитрил (Fischer Scinetific, ФРГ). Сорбция осуществлялась при 95 % А / 5 % Б в течение 2 мин, десорбция - 95 % А → 30 % А / 5 % Б → 70 % Б в течение 23 мин, промывка - 30 % А / 70 % Б в течение 5 мин, уравновешивание - 30 %А → 95 % А / 70 % Б → 5 % Б в течение 5 мин. Детекция - фотометрическая (226 нм). Стационарная фаза - ODS-AQ-HG 20nm S-10um (YMC, Япония).

Структуры пептидов подтверждались методом масс-спектрометрии с матричной активационной лазерной десорбцией/ионизацией с использованием спектрометра Bruker Microflex LT (ФРГ). В качестве матрицы использовалась α-циано-4-гидроксикоричная кислота (Sigma, США).

После хроматографической очистки чистота всех пептидов определялась методом зонного капиллярного электрофореза (ЗКЭ, Капель-105М, Россия) на незаполненном капилляре в среде фонового электролита состава 0,05 М Трис (Helicon, Россия) в 0,1 М ортофосфорной кислоты (Sigma, США) в воде с фотометрической детекцией (226 нм), напряжение - (+)20 кВ при 20 °С. Ввод - гидродинамический (30 мбар, 3 с).

Количественное содержание пептидов определялось в весовых процентах методом элементного микроанализа (VELP EMA502, Италия). Калибровка - по сульфаниловой кислоте (VELP, Италия).

Цитотоксичность исследуемых пептидов изучали с помощью МТТ-теста на культуре клеток МА-104 (эмбриональная почка обезьяны) в диапазоне концентраций от 0,02 до 2,5 мг/мл. Для этого в 96-луночный планшет засевали 20 000 клеток/лунку в объеме 100 мкл полной среды ДМЕМ (10 % ЭТС, 300 мг/л L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 25 мМ HEPES) и культивировали при 37 °С в атмосфере 5 % СО₂. На следующий день в лунки вносили пептиды в различных концентрациях. Через сутки в клетки вносили 25 мкл раствора МТТ с концентрацией 4 мг/мл и культивировали 4 ч в тех же условиях. После этого в клетки добавляли лизирующий раствор (20 % SDS на воде с 0,01 M H₂SO₄). После полного лизиса клеток измеряли оптическую плотность при длинах волн 570 и 650 нм и на основе этих данных рассчитывали CC₅₀ (50 % цитотоксическая концентрация - концентрация тестируемого вещества, необходимая для гибели 50 % клеток).

Противовирусная активность. Для определения противовирусного действия пептидов была использована методология, примененная нами ранее в [13]. Вкратце, для тестирования противовирусной активности 13 мкл раствора пептида с концентрацией 0,5 мг/мл смешивали с вирусом в фосфатном буфере с pH = 7,4 (ФБ, ПанЭко, Россия) и выдерживали при комнатной температуре в течение 2 ч; конечная концентрация пептида в суспензии была 26 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля вместо пептида с вирусом соинкубировали ФБ соответствующего объема. После выдержки смеси вирус/пептид осуществляли титрование вируса на монослое клеток МА-104. Для этого клетки МА-104 предварительно (за день до эксперимента) засевали в 96-луночный планшет в количестве 20 000 клеток/лунку в 100 мкл полной среды ДМЕМ. После культивирования в течение ночи непосредственно перед титрованием клетки промывали 200 мкл физиологического раствора и вносили в лунки 100 мл бессывороточной среды ДМЕМ (600 мг/л L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина, 25 мМ HEPES). Далее осуществляли 10-кратное титрование смеси пептид/РСВ и выдерживали планшет в течении 2 ч при 37°С в атмосфере 5 % СО₂. Этого времени достаточно для прикрепления вириона к рецепторам клеток-мишеней и инициации процесса слияния и последующей инфекции. Далее среду в клетках заменяли с бессывороточной на сывороточную ДМЕМ и культивировали сутки в тех же условиях с последующей заменой на бессывороточную среду ДМЕМ. Далее планшет с клетками культивировали при 37 °С в атмосфере 5 % СО₂ в течение 3 сут и оценивали ингибирование образования синцитиев с помощью световой микроскопии. Для количественной оценки противовирусного эффекта определяли титр вируса по методу Спирмена-Кербера; данные представлены в процентном отношении титров вируса между клетками, культивированными с выдержанным с испытуемым веществом вирусом, и клетками, культивированных с выдержанным с ФБ-вирусом (отрицательный контроль). Контрольные препараты: положительный контроль - моноклональные антитела против белка слияния РСВ "MA1-7290" (Invitrogen, США), отрицательный контроль - ФБ.

Статистический анализ данных. Статистическую обработку выполняли с помощью программного обеспечения Statistica 8 (StatSoft Inc., США). Статистическую значимость различий оценивали при помощи непараметрического критерия Краскела-Уоллиса. Отличия принимались значимыми при р ≤ 0,05.

Результаты

Проектирование и получение пептидов

Структуры полученных пептидов приведены в табл. 1. Все пептиды были успешно получены по приведенной методологии, о чем свидетельствуют данные масс-спектрометрии, подтвердившие структуры пептидов, и данных ЗКЭ о чистоте пептидов, также приведенные в табл. 1.

Согласно проекциям, приведенным на рис. 1, можно сделать вывод о значительных различиях в структурах SA-37, SA-38 и SA-52.

Пептид SA-32 является дендримерным, имеет 8 N-концов, представленных катионогенными остатками аргинина, ядро с гидрофобностью, повышенной присутствием остатков тирозина, и гидрофобный C-конец. Для SA-32 предполагается склонность к образованию мицелл за счет описанных участков, сильно разнящихся в полярности. Номинальный заряд (+16) означает, что молекула пептида может быть акцептором 16 протонов.

Структура SA-37 основана на потенциальном α-спиральном кластере 1622-1639 человеческого коллагена 18-го типа. Этот участок входит в состав эндостатина - лиганда нуклеолина. Эндостатин является протеолитическим фрагментом коллагена и нативным цитостатиком организма человека. Номинальный заряд: (+2); номинальная гидрофобность <H>: 0,207; гидрофобный момент (показатель амфипатичности спирали; чем ближе значение к 1,000, тем выше амфипатичность, чем ближе к 0,000, тем ниже) <µH>: 0,360.

Пептид SA-38 представляет собой фрагмент белка слияния РСВ. Представление о потенциальной активности данного пептида основывается на предположении о большей скорости его взаимодействия с клеточным нуклеолином, чем у полноценного белка слияния, что должно приводить к блокированию рецептора. Белок слияния РСВ имеет несколько форм существования, из них с нуклеолином связывается первичная - F0. В своем составе F0 имеет суперспираль на участке 91-114, которая, как установлено, используется для связи с нуклеолином. Номинальный заряд: (+1); <H>: 0,210; <µH>: 0,229.

Структура SA-51 основана на последовательности SA-40, о свойствах которого ранее докладывалось в [14, 15]. Основные отличия SA-51 от SA-40 - отсутствие остатков цистеина, что, предполагается, повышает его окислительную стабильность, а также ввод в структуру остатков β-аланина, выполненный с целью повышения устойчивости пептида к ферментативному гидролизу. SA-51 имеет 2 катионогенных N-конца и гидрофильный C-конец; в середине его структуры присутствуют катионогенные остатки лизина и гидрофобные остатки валина и фенилаланина, создающие локальную амфипатичность. Номинальный заряд: (+9).

Пептид SA-52 содержит остатки непротеиногенных аминокислот - орнитина и β-аланина. При своей схожести с остатками лизина остатки орнитина примечательны склонностью к формированию компактных и ригидных α-спиралей, что достигается за счет укороченной боковой цепи орнитина. Следует отметить, что орнитин является нативной для организма человека аминокислотой. Номинальный заряд: (+6); <H>: 0,011; <µH>: 0,063. Можно предположить, что SA-52 является достаточно гидрофильным пептидом, и для его гипотетической спирали не характерна амфипатичность. У его проекции не выделяются гидрофобная и гидрофильная стороны.

Пептид AB-30 обладает аминокислотной последовательностью (YKKIRVRLS)₂KYAS, он использовался в исследовании противовирусной активности, где не обладал значительным эффектом, в качестве отрицательного контроля.

Цитотоксичность

График зависимости доли выживших клеток от концентрации добавленных пептидов приведен на рис. 2. Значения CC₅₀ для всех пептидов приведены в табл. 2 и, кроме такового для SA-32, были > 2,5 мг/мл, что свидетельствует о низкой цитотоксичности.

Противовирусная активность

Для всех пептидов была продемонстрирована значительная противовирусная активность, она приведена на рис. 3 и в табл. 2. Все пептиды превосходили или были равны по данному показателю с препаратом моноклональных антител.

Для учета различия образцов использованных солей пептидов в количественном содержании оснований пептидов их количества в образцах были определены методом автоматического элементного анализа и приведены в табл. 3. На основании этих значений, а также данных об ингибировании формирования синцитиев РСВ из табл. 2 по уравнению (1) была рассчитана удельная противовирусная активность полученных пептидов (далее - pA), также представленная в табл. 3 в виде десятичного логарифма отношения остаточной жизнеспособности вируса к количеству основания пептида:

где pA - удельная противовирусная активность, A - процент ингибирования формирования синцитиев РСВ, ν - количество основания пептида в нМоль.

Обсуждение

Наиболее токсичным для клеток оказался пептид SA-32. Предполагается, что SA-32 также наиболее устойчив к ферментативному гидролизу: такое свойство для пептидных дендримеров известно из литературы [16], а также из ранее описанных нами экспериментов [13]. Увеличенный период полужизни может влиять на проявление отложенной цитотоксичности.

В то же время все пептиды, кроме AB-30, продемонстрировали значительную активность против РСВ. Наиболее активным пептидом также является SA-32. Исследованные пептиды можно разделить на 3 группы: катионные разветвленные - AB-30, SA-32 и SA-51, нейтральные амфифильные - SA-37 и SA-38 и единственный катионный гидрофильный SA-52. На основе полученных данных можно сделать вывод, что значительный вклад в противовирусное действие пептидов вносят катионогенные остатки лизина, орнитина и аргинина, а также ароматические остатки фенилаланина и тирозина. Можно предположить, что прочие аминокислоты в составе пептидов не оказали однозначного влияния на противовирусную активность.

Для лучшего сравнения активности пептидов мы рассчитали и использовали значения pA (см. табл. 3). Активность возрастает в ряду: SA-52 → SA-37 → SA-38 → SA-51 → SA-32. По рассчитанным значениям pA можно сделать вывод о том, что в действительности катионный гидрофильный пептид SA-52 обладает наименьшей противовирусной активностью. При этом различия между наиболее цитотоксичным SA-32 и вторым по противовирусной активности нетоксичным SA-51 оказываются несколько более значительными, чем в табл. 2.

Амфипатичные пептиды SA-37 и SA-38, в свою очередь, отличаются друг от друга аминокислотным составом и расположением аминокислот в структуре: SA-37 имеет более равнозначные гидрофильную и гидрофобную стороны гипотетической спирали, чем SA-38, для спиральной формы которого характерно преобладание гидрофильной стороны над гидрофобной. Мы полагаем, что именно эти различия приводят к ощутимой разнице между pA(SA-37) и pA(SA-38), - первый пептид близок по этому значению к SA-52, в то время как второй - к разветвленному SA-51. На наш взгляд, данные пептиды могут быть в дальнейшем использованы в разработке потенциальных противовирусных пептидных средств.

Выводы

1. Были успешно спроектированы, получены и проанализированы 5 новых синтетических противовирусных пептидов с высокой активностью против РСВ in vitro.

2. Разветвленные катионные пептиды обладают большей активностью в отношении РСВ, чем линейные.

3. Амфипатичность линейных пептидов вносит вклад в активность против РСВ, но не является обязательным для этого качеством.

4. Величина положительного заряда линейных пептидов в диапазоне (+1) - (+9) не вносит существенного вклада в активность против РСВ.

5. Длина амидной цепи вносит некоторый вклад в активность против РСВ. Противовирусные свойства обнаруживаются у 13-членного пептида, но удельная активность более длинных линейных пептидов (17 и 25 остатков) выше.

6. Активностью против РСВ обладают пептиды, содержащие остатки аргинина, лизина, орнитина, фенилаланина и тирозина, при этом расположение тирозина на N-концах, вероятно, отрицательно сказывается на активности AB-30, в то время как тирозин в середине цепи разветвленного пептида SA-32 не препятствует проявлению им значительных противовирусных свойств.

7. Содержание гидрофобных аминокислотных остатков в структуре пептида не коррелирует с его активностью против РСВ напрямую.

Литература

1. Geoghegan S., Erviti A., Caballero M.T., Vallone F., Zanone S.M., Losada J.V., Bianchi A., Acosta P.L., Talarico L.B., Ferretti A., Grimaldi L.A., Sancilio A., Dueñas K., Sastre G., Rodriguez A., Ferrero F., Barboza E., Gago G.F., Nocito C., Flamenco E., Perez A. R., Rebec B., Ferolla F.M., Libster R., Karron R.A., Bergel E., Polack F.P. Mortality due to respiratory syncytial virus. Burden and risk factors. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2017; 195 (1): 96-103. DOI: https://doi.org/10.1164/rccm.201603-0658OC

2. Langedijk A.C., Bont L.J. Respiratory syncytial virus infection and novel interventions. Nat. Rev. Microbiol. 2023; 21 (11): 734-49. DOI: https://doi.org/10.1038/s41579-023-00919-w

3. Currie S.M., Findlay E.G., McFarlane A.J., Fitch P.M., Böttcher B., Colegrave N., Paras A., Jozwik A., Chiu C., Schwarze J., Davidson D.J. Cathelicidins have direct antiviral activity against respiratory syncytial virus in vitro and protective function in vivo in mice and humans. J. Immunol. 2016; 196 (6): 2699-710. DOI: https://doi.org/10.4049/jimmunol.1502478

4. Mulder K.C.L., Lima L.A., Miranda V.J., Dias S.C., Franco O.L. Current scenario of peptide-based drugs: the key roles of cationic antitumor and antiviral peptides. Front. Microbiol. 2013; 4: 321. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2013.00321

5. Wegzyn C., Toh L.K., Notario G., Biguenet S., Unnebrink K., Park C., Makari D., Norton M. Safety and effectiveness of palivizumab in children at high risk of serious disease due to respiratory syncytial virus infection: a systematic review. Infect. Dis. Ther. 2014; 3 (2): 133-58. DOI: https://doi.org/10.1007/s40121-014-0046-6

6. Aravinda S., Shamala N., Roy R.S., Balaram P. Non-protein amino acids in peptide design. J. Chem. Sci. 2003; 115: 373-400. DOI: https://doi.org/10.1007/bf02708230

7. Хаитов М.Р., Никонова А.А., Шиловский И.П., Кожихова К.В., Кофиади И.А., Гудима Г.О., Вишнякова Л.И., Никольский А.А., Ковчина В.И., Тимотиевич Е.Д., Юмашев К.В., Смирнов В.В., Маерле А.В., Козлов И.Б., Шатилов А.А., Шатилова А.В., Андреев С.М., Колоскова О.О., Кузнецова Н.А., Васина Д.В., Никифорова М.А., Рыбалкин С.П., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Мартынов А.И., Берзин И.А., Гущин В.А., Ковальчук А.В., Борисевич С.В., Скворцова В.И. МИР 19^® - первый в мире специфический противовирусный препарат для лечения COVID-19: разработка и доклинические исследования. Иммунология. 2023; 44 (3): 270-90. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-3-270-290

8. Хаитов М.Р., Никонова А.А., Кофиади И.А., Шиловский И.П., Смирнов В.В., Елисютина О.Г., Гудима Г.О., Маерле А.В., Шатилов А.А., Шатилова А.В., Андреев С.М., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Латышева Т.В., Ильина Н.И., Мартынов А.И., Рабдано С.О., Рузанова Э.А., Савельев Н.С., Плетюхина Ю.В. Сафи А.С., Ратников В.А., Горелов В.П., Кащенко В.А., Кучеренко Н.Г., Умарова И.А., Москалева С.С., Фабричников С.В., Зуев О.В., Павлов Н.Б., Крючко Д.С., Берзин И.А., Горячев Д.В., Меркулов В.А., Шипулин Г.А., Юдин С.М., Трухин В.П., Валента Р., Скворцова В.И. Результаты I и II фазы клинических исследований препарата МИР 19^®. Иммунология. 2023; 44 (3): 291-316. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2023-44-3-291-316

9. Sinclair J.F., O’Brien A.D. Intimin types α, β, and γ bind to nucleolin with equivalent affinity but lower avidity than to the translocated intimin receptor. J. Biol. Chem. 2004; 279 (32): 33751-8. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M401616200

10. Song N., Ding Y., Zhuo W., He T., Fu Z., Chen Y., Song X., Fu Y., Luo Y. The nuclear translocation of endostatin is mediated by its receptor nucleolin in endothelial cells. Angiogenesis. 2012; 15 (4): 697-711. DOI: https://doi.org/10.1007/s10456-012-9284-y

11. Watanabe T., Hirano K., Takahashi, A. Yamaguchi K., Beppu M., Fujiki H., Suganuma M. Nucleolin on the cell surface as a new molecular target for gastric cancer treatment. Biol. Pharm. Bull. 2010; 33 (5): 796-803. DOI: https://doi.org/10.1248/bpb.33.796

12. Gautier R., Douguet D., Antonny B., Drin G. HELIQUEST: a web server to screen sequences with specific α-helical properties. Bioinformatics. 2008; 24 (18): 2101-2. DOI: https://doi.org/10.1093/bioinformatics/btn392

13. Kozhikhova K.V., Shilovskiy I.P., Shatilov A.A., Timofeeva A.V., Turetskiy E.A., Vishniakova L.I., Nikolskii A.A., Barvinskaya E.D., Karthikeyan S., Smirnov V.V., Kudlay D.A., Andreev S.M., Khaitov M.R. Linear and dendrimeric antiviral peptides: Design, chemical synthesis and activity against human respiratory syncytial virus. J. Mat. Chem. B. 2020; 13 (8): 2607-17. DOI: https://doi.org/10.1039/C9TB02485A

14. Кожихова К.В., Андреев С.М., Успенская Д.В., Шатилова А.В., Турецкий Е.А., Шатилов А.А., Лушникова А.А., Вишнякова Л.И., Шиловский И.П., Смирнов В.В., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Суперкатионные пептидные дендримеры как векторы для доставки нуклеиновых кислот в клетки млекопитающих. Иммунология. 2022; 43 (3): 320-32. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-3-320-332

15. Шатилов А.А., Шатилова А.В., Миславский О.В., Черченко Н.Г., Сапрыгина Л.В., Бабихина М.О., Смирнов В.В., Хаитов М.Р. Оценка эффективности применения поликатионных дендримерных пептидов в качестве ковалентных адъювантов рекомбинантного аллергена пыльцы березы rBet v 1. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. 2023; 22S6: 102-3. DOI: https://doi.org/10.15829/1728-8800-2023-6S

16. Sommer P., Fluxa V.S., Darbre T., Reymond J. Proteolysis of peptide dendrimers. Chembiochem. 2009; 10 (9): 1527-36. DOI: https://doi.org/10.1002/cbic.200900060