Исследование фармакокинетики нового противоопухолевого препарата CAR-CEA на модели экспериментальных животных

• Боженко Владимир Константинович
• Шкопоров Андрей Николаевич
• Шишкин Александр Михайлович
• Киселева Яна Юрьевна
• Кулинич Татьяна Михайловна
• Кудинова Елена Александровна
• Аминулла Камилла Гуламовна
• Ранджит Раджеш
• Солодкий Владимир Алексеевич

Резюме

Введение. Одним из направлений адоптивной иммунотерапии рака является использование Т-лимфоцитов, экспрессирующих химерный антигенный рецептор (CAR) для лечения гемобластозов и солидных опухолей. Генетической модификации лимфоцитов можно достичь путем трансдукции ретровирусных генов, что приводит к конститутивной экспрессии CAR в Т-клетках, либо путем электропорации плазмиды/мРНК, что приводит к временной экспрессии иммунорецепторов, сводя к минимуму риск потенциальной аутоагрессии и нарушений в геноме. Мы разработали препарат CAR-CEA, который представляет собой лимфоциты, модифицированные путем электропорации плазмидной ДНК, кодирующей CAR, направленный против раково-эмбрионального антигена (РЭА, carcinoembryonic antigen, CEA)

Цель исследования - изучить фармакокинетику CAR-CEA при его однократном внутривенном введении экспериментальным животным и оценить период полувыведения препарата.

Материал и методы. Исследование проводили на модели экспериментальных животных (мыши линии B6D2F1). Препарат CAR-CEA получали, трансфецируя лимфоциты мышей плазмидой 3C1-3g электропорацией, и вводили внутривенно в дозе 10⁶ клеток на животное. Количество CAR-CEA в клетках крови, тканях легких, селезенки и тимуса оценивали методом полимеразной цепной реакции по содержанию плазмидной ДНК. Оценку параметров фармакокинетики CAR-T проводили в 14 временных точках (30 мин - 30 сут).

Результаты. Максимальная концентрация плазмидной ДНК CAR-CEA в цельной крови мышей была определена через 30 мин после введения и составляла 125 ± 29 пг/мл. Далее концентрация снижалась экспоненциально. Время полувыведения составляло 105 ± 7 ч. CAR-CEA показал способность циркулировать в кровотоке до 1 мес. Наиболее значительное и длительное накопление препарата наблюдалось в селезенке.

Заключение. Результаты нашего доклинического исследования показывают, что CAR-CEA может быть использован для анти-РЭА-терапии при условии повторных инъекций.

Ключевые слова: адоптивная иммунотерапия; химерный антигенный рецептор; электропорация; раково-эмбриональный антиген; фармакокинетика

Введение

Адоптивная иммунотерапия, основанная на введении пациенту аутологичных или гетерологичных лимфоцитов, модифицированных ex vivo, является сравнительно новым и перспективным подходом к лечению онкологических заболеваний. Генетическая модификация лимфоцитов состоит во введении в клетки рекомбинантной ДНК, что приводит к экспрессии на поверхности лимфоцитов химерных антигенных рецепторов (chimeric antigen receptor, CAR), специфичных к опухолевым антигенам [1, 2]. Альтернативно можно вводить рекомбинантную ДНК, кодирующую Т-клеточный рецептор [3, 4]. Преимущество CAR-технологии заключается в возможности ее использования для всех пациентов, независимо от совместимости по HLA-антигенам, а также в случае, когда опухоль уклоняется от воздействия цитотоксических Т-лимфоцитов вследствие снижения экспрессии молекул HLA [1].

CAR состоит из внеклеточного короткого трансмембранного домена и внутриклеточного домена [5]. Внеклеточный домен является распознающей частью и состоит из одноцепочечного вариабельного фрагмента иммуноглобулина scFv (single-chain Fv). Внутриклеточный домен включает одну (1-е поколение), две (2-е поколение) или три (3-е поколение) сигнальных последовательности, запускающие стимуляцию (CD3z) и костимуляцию (костимулирующие молекулы) лимфоцита при встрече с опухолевым антигеном. Генетический материал, кодирующий CAR, может быть введен в клетки с помощью ретровирусной трансдукции [2, 6], что приводит к конститутивной экспрессии CAR в Т-клетках, либо путем электропорации плазмиды/мРНК, что приводит к временной экспрессии иммунорецепторов, сводя к минимуму риск потенциальной аутоагрессии и нарушений в геноме.

В настоящее время нами разрабатывается генно-терапевтическое средство CAR-CEA (ранее карплазмин [7]), предназначенное для лечения РЭА-позитивных опухолей человека (РЭА - раково-эмбриональный антиген, carcinoembryonic antigen, CEA; CEACAM5; CD66e). Препарат представляет собой аутологичные донорские лимфоциты, модифицированные с помощью электропорации плазмидной ДНК, кодирующей ген CAR, специфичный к РЭА. После введения плазмиды в условиях ex vivo на поверхности клеток экспрессируется продукт гена CAR-CEA. Распознающая часть CAR является фрагментом вариабельного участка моноклонального антитела 3С1, специфичного к домену A1B1 молекулы РЭА [8].

Как нами было показано ранее, лимфоциты, трансфецированные исследуемой плазмидой, избирательно поражают линии клеток, экспрессирующие РЭА (А549 и НСТ116) [8, 9], а также демонстрируют выраженную противоопухолевую активность in vivo на модели бестимусных мышей с РЭА-позитивной перевиваемой опухолью человека [7].

Важная задача доклинических исследований - оценка фармакокинетики нового препарата на лабораторных животных. При получении CAR-лимфоцитов методом электропорации плазмиды ее ДНК не интегрируется в геном клетки и последние могут иметь относительно короткое время жизни. Поэтому для выяснения динамики распределения и сохранности CAR-CEA в тканях организма реципиента нами была изучена фармакокинетика CAR-лимфоцитов после их однократного внутривенного введения мышам. В рамках доклинических исследований была изучена фармакокинетика CAR-CEA на модели экспериментальных животных (мыши линии B6D2F1) и определено время полувыведения препарата.

Материал и методы

Исследования проведены в соответствии с Федеральным законом № 61-ФЗ "Об обращении лекарственных средств" от 12.04.2010; ГОСТ 33044-2014 "Принципы надлежащей лабораторной практики GLP" от 01.108.2015; методическими указаниями по изучению фармакокинетики фармакологических веществ [10]. Исследование было одобрено независимым экспертным советом по медицинской этике Российского научного центра рентгенорадиологии (Москва, Россия).

Тестируемый препарат. Лимфоциты, модифицированные плазмидной ДНК 3C1-3g (Медгамал, Россия), Молекулярная формула плазмиды C₁₀₉₁₅₈H₁₃₇₁₄₃N₄₁₉₆₁O₆₇₁₆₄P₁₁₁₉₄ и молекулярная масса 3 458 337 Да. Плазмида 3C1-3g кодирует CAR 3-го поколения [11], состоящий из антиген-распознающего домена scFv (клон антитела 3C1); шарнирного участка CD8; трансмембранного домена CD28; костимулирующих доменов CD28, CD137 (4-1BB) и сигнального CD247 (ζ-цепь).

Получение CAR-CEA. Выделение суспензии мононуклеарных клеток крови мышей линии B6D2F1 проводили следующим образом: свежую кровь, взятую с помощью сердечной пункции у 40 животных (0,8-1 мл на животное) объединяли, обрабатывали антикоагулянтом (гепарин 500 МЕ/мл), добавляли двойной объем фосфатно-солевого буфера, рН 7,4 (ФСБ) и полученную суспензию наслаивали на раствор фиколла-урографина (плотность 1,090 г/см³, "ПанЭко", Россия) в объемном соотношении 2 : 1. Разделение клеток проводили центрифугированием в течение 40 мин при 400 g, после чего отбирали интерфазный слой. Клетки отмывали от фиколла в ФСБ дважды и осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 400 g. Трансфекцию проводили на приборе Nucleofector II (Amaxa Biosystemsс, Германия) с помощью набора "Mouse T Cell Nucleofector Kit" (Amaxa Biosystems, Германия) и программы X-100 для мышиных Т-клеток согласно инструкции производителя. Для трансфекции одного образца использовали 9 млн клеток и 5 мкг плазмиды 3C1-3g.

Трансфецированные клетки культивировали в чашках Петри для адгезивных культур в полной ростовой питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10 % фетальной сыворотки эмбрионов коров ("ПанЭко", Россия), 2 мМ L-глутамина, 50 Ед/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США). Посевная концентрация составляла 2 млн кл/мл. Лимфоциты стимулировали к пролиферации добавлением 50 Ед/мл ИЛ-2 (НПК "Биотех", Россия), 2 мкг/мл ФГА ("ПанЭко").

После 24 ч инкубации клетки центрифугировали при 400 g в течение 15 мин, промывали в ФСБ и ресуспендировали в том же буфере до достижения концентрации 5 млн клеток/мл. Качество препарата лимфоцитов контролировали микроскопически, состав клеточной популяции определяли при помощи гематологического анализатора "Адвия-60" (Bayer HealthCare LLC, США). Препарат содержал 95-96 % лимфоцитов с жизнеспособностью 70 % и был использован для исследования фармакокинетики на мышах.

Исследование фармакокинетики CAR-CEA. Исследование фармакокинетики проводилось на 42-х мышах линии B6D2F1. Препарат сингенных лимфоцитов, трансфецированных плазмидой 3C1-3g, вводили в хвостовую вену в количестве 0,2 мл в дозе 1 млн клеток. Стандартное питание животные получали через 2 ч после начала эксперимента. Для изучения фармакокинетики забор крови и образцов тканей проводили по временному графику, представленному в таблице. На каждую временную точку брали 3 экспериментальных животных.

Животных выводили из эксперимента методом передозировки эфирного наркоза. После вскрытия грудной и брюшной полости кровь шприцем забирали из полости сердца в пробирки, содержащие 50 мкл 6 % раствора ЭДТА, оценивали объем. Для получения образцов плазмы часть крови центрифугировали дважды - 5 мин при 250 g, супернатант отбирали и центрифугировали повторно 10 мин при 2500 g, оценивали объем и замораживали. Для получения образцов клеток крови 1 мл крови центрифугировали в течение 5 мин при 250 g, осадок замораживали.

При заборе фрагменты печени, легкие, селезенку и тимус взвешивали. Исследуемые образцы ткани массой 20-200 мг измельчали на более мелкие фрагменты в чашке Петри с добавлением 500 мкл ФСБ (pH 7,4). Измельченные ткани помещали в гомогенизатор Medimachine (Dako, Дания) с 1,5 мл ФСБ. Гомогенизацию проводили в течение 2 мин, после чего с клеточную суспензию помощью шприца извлекали, фильтровали через сито (50 мкм), добавляли 1 мл ФСБ и центрифугировали в течение 5 мин при 250 g. После удаления супернатанта к материалу осадка добавляли необходимый объем ФСБ. Анализ содержания ДНК плазмиды также проводили в пробе исходного препарата трансфецированных лимфоцитов мышей. Для этого аликвоты по 0,2 мл, содержащие 1 млн клеток, осаждали центрифугированием, удаляли супернатант, осадок замораживали и хранили при -20 °С до выделения ДНК.

Количественное определение препарата CAR-CEA методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Выделение ДНК из трансфецированных лимфоцитов, клеток крови, плазмы и тканей проводили с использованием набора "К-Сорб" ("Синтол", Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Выделенную ДНК хранили при -20 °С.

Для постановки реакции ПЦР в реальном времени использовали готовые реакционные смеси "ПЦР-Микс" ("Синтол", Россия). ПЦР-пробы объемом 15 мкл содержали 0,2 мкМ прямого (hCAR3G-F1) и обратного (hCAR3G-R1) праймеров (5′-CTGTGATTTCTGGGTGCTGG-3′и 5′-TAATGCTTGCGGGTGGGT-3′, соответственно), 0,2 мкМ зонда hCAR3G-TP1 (FAM-TGGTCGTTGGTGGAGTCCTGGCTT-BHQ1) и 5 мкл образца ДНК. Для проведения ПЦР использовали следующий режим: инкубация 5 мин при 95 ºС, далее 40 циклов 94 ºС 15 с, 60 ºС 60 с. В качестве калибровочных образцов использовали 10-кратные разведения плазмиды 3C1-3g (с концентрацией от 0,4 пг/мл до 0,4 мкг/мл), содержащие 25 нг/мкл ДНК тимуса теленка в качестве фоновой ДНК. ПЦР проводили в амплификаторе CFX96 (Bio-Rad, США). Анализ кривых амплификации, определение пороговых циклов и абсолютных значений концентрации целевой ДНК в пробах проводили с использованием стандартного программного обеспечения (CFX Manager, Bio-Rad).

Оценка фармакокинетических показателей. Для описания фармакокинетики препарата CAR-CEA, в крови и тканях использовали следующие показатели (в условных обозначениях, принятых в литературе [12]):

k_e - константа элиминации (ч^-1);

Cmax - максимальная концентрация (мкг/мл);

AUC - полная площадь под кривой (ч × мкг/мл);

Cl - общий клиренс (мл/ч/кг);

Vd - кажущийся объем распределения (мл);

t_1/2 = 0,693 / k_e - период полувыведения (ч).

Показатели Cmax и k_e оцениваются из вида кривой концентрации. Исходные формулы для расчета остальных показателей следующие:

AUC= ∫С(t)dt. (1)

Cl = D / AUC. (2)

Vd = D / Cmax, (3)

где D - введенная доза препарата.

Статистический анализ. Статистический анализ полученных данных проводили с применением программного статистического пакета Statistica v10 (StatSoft, США). Для анализа всех данных применена описательная статистика: подсчитаны средние арифметические значения, стандартные отклонения и стандартные ошибки среднего. Кинетические кривые анализировали с применением сглаживания и аппроксимации [12].

Результаты

Для исследования фармакокинетики препарата CAR-CEA мы провели анализ распределения плазмиды 3C1-3g в тканях реципиента во времени после однократного внутривенного введения CAR-CEA мышам линии B6D2F1. Как показал ПЦР-анализ препарата, однократная доза CAR-CEA содержит 32,1 ± 6,3 нг плазмидной ДНК. Распределение плазмиды в тканях представлено на рис. 1. В тканях легкого и тимуса максимальные значения накопления препарата регистрируются через 30 мин после введения (44,7 ± 0,7 и 24,4 ± 2,7 пг/г ткани соответственно). Затем концентрация препарата в тканях легкого начинает быстро снижаться, опускаясь до 6 % от его максимального значения уже на 2-е сутки. В тимусе элиминация происходит медленнее, опускаясь до 9 % от максимальной концентрации только на 8-е сутки. В тканях селезенки наблюдается более значительное накопление препарата и его элиминация происходит медленнее: максимальные значения накопления препарата регистрируются через 30 мин-1 ч после введения (71,0-71,4 пг/г ткани), после чего концентрация постепенно снижается, достигая 10 и 7 % от максимального значения на 3-и и 4-е сутки соответственно. В ткани печени не наблюдается значимого накопления препарата (5,7 ± 1,1 пг/ г ткани через 30 мин после введения), а ко 2-м суткам после введения происходит практически полная элиминация препарата из ткани печени.

Концентрация препарата CAR-CEA в клетках крови заметно превышает его накопление в органах и остается значительной в течение 1 нед после инъекции (рис. 2). Экспериментальные данные по накоплению препарата в цельной крови, представленные на рис. 2, были аппроксимированы экспоненциальной функцией и использованы для вычисления основных фармакокинетических показателей препарата CAR-CEA. Максимальная концентрация в цельной крови (C_max) наблюдалась через 30 мин после введения - 124,8 ± 29,5 пг/мл. Период полувыведения (t_1/2) составил 104,9 ± 7,0 ч, площадь под кривой "концентрация-время" (AUC) - 17 405,3 ± 1399,2 пг × ч/мл, кажущийся объем распределения (Vd) - 257,3 ± 12,0 мл, общий клиренс (Сl) - 1,9 ± 0,2 мл/ч. Через 3 нед уровень плазмиды в крови составлял 8,9 ± 1,8 пг/мл, а через 4 нед - 5,9 ± 0,3 пг/мл. Следует отметить, что концентрация плазмиды, определенная в плазме крови через 30 мин после введения CAR-лимфоцитов, составляла 40,1 ± 0,9 пг/мл и падала до 0 на 2-е сутки эксперимента. Учитывая отсутствие плазмиды в плазме крови начиная со 2-х суток эксперимента, можно утверждать, что вся плазмида, определенная в образцах цельной крови, связана с циркулирующими лимфоцитами.

Обсуждение

В настоящее время наиболее распространенным методом модификации лимфоцитов является их трансдукция с помощью ретровирусных векторов [6]. В этом случае происходит интеграция генетического материала, переносимого вектором, в геном клетки. Поэтому при стимуляции антигеном такие клетки пролиферируют, сохраняя интегрированную ДНК, что обеспечивает постоянную экспрессию химерного рецептора. Как правило, для исследования фармакокинетики трансдуцированных CAR-лимфоцитов их вводят животным с перевитой опухолью, результатом чего является их последующая экспансия и накопление в опухолевом очаге [13]. Такой способ модификации лимфоцитов приводит в ряде случаев к злокачественной трансформации CAR-Т-лимфоцитов [14]. Поэтому, по нашему мнению, получение CAR-лимфоцитов трансфекцией плазмидной ДНК методом электропорации обладает рядом преимуществ, в частности - это самый быстрый и дешевый способ получения CAR-лимфоцитов, а также отсутствует вероятность инсерционного мутагенеза и активации онкогенов.

Следует также отметить, что постоянная антигенная стимуляция CAR-лимфоцитов клетками опухоли в организме реципиента приводит к "цитокиновому шторму" (неконтролируемому выбросу лимфокинов), который трудно купировать. В этом случае временная экспрессия химерного рецептора Т-лимфоцитами, полученными методом электропорации, в сочетании с возможностью их дозирования и дробного введения, позволяет контролировать лечение и смягчить побочные эффекты терапии, в отличие от трансдукции, при которой лимфоциты способны к пролиферации и длительной экспрессии СAR.

В свете вышеизложенного исследование параметров фармакокинетики CAR-CEA в организме после однократного внутривенного введения чрезвычайно актуально. Наши данные показывают, что полученные трансфекцией CAR-лимфоциты имеют ограниченное время циркуляции в кровотоке: период их полувыведения составляет 4-5 дней. Как нами было установлено ранее на модели бестимусных мышей с перевитой человеческой опухолью HCT116, введение CAR-лимфоцитов с интервалом в 1 нед приводит к очевидному терапевтическому эффекту: 7 инъекций, выполняемых еженедельно, обеспечили 80 % выживаемость мышей при 100 % смертности в контрольной группе [7]. На основе новых данных можно предположить, что сокращение интервала между инъекциями до 4-5 дней могло бы привести к более выраженному терапевтическому эффекту.

Таким образом, наши результаты показывают, что CAR-лимфоциты до 1 мес персистируют в кровотоке, а это делает возможным их применение в противоопухолевой терапии. Поддержание высокого уровня циркулирующих CAR-лимфоцитов в течение длительного времени, очевидно, потребует их повторных инъекций через определенные промежутки времени. Оптимизация дозы CAR-CEA в повторных инъекциях с учетом ответа реципиента на их введение позволит снизить вероятность такого осложнения, как "цитокиновый шторм", которое часто наблюдается при введении долгоживущих лимфоцитов, трансдуцированных лентивирусами.

Литература

1. June C.H., O’Connor R.S., Kawalekar O.U. et al. CAR T cell immunotherapy for human cancer. Science. 2018; 359 (6382): 1361-5. DOI: https://doi.org/10.1126/science.aar6711

2. Филиппова Ю.Г., Кузнецова М.С., Шевченко Ю.А., Терещенко В.П., Фишер М.С., Курилин В.В., Пашкина Е.А., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотип и эффекторные функции GD2-специфичных CAR-T-клеток in vitro. Иммунология. 2022; 43 (5): 525-35. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-525-535

3. Zhang J., Wang L. The Emerging World of TCR-T Cell Trials Against Cancer: A Systematic Review. Technol. Cancer Res. Treat. 2019; 18: 1533033819831068. DOI: https://doi.org/10.1177/1533033819831068

4. Кузнецова М.С., Терещенко В.П., Шевченко Ю.А., Фишер М.С., Курилин В.В., Алсаллум А., Алрхмун С., Акахори Я., Шику Х., Сенников С.В. Фенотипические и функциональные особенности генерированных in vitro TCR-Т-клеток, специфичных к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1. Иммунология. 2022; 43 (5): 536-47. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2022-43-5-536-547

5. Dotti G., Gottschalk S., Savoldo B. et al. Design and development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing T cells. Immunol. Rev. 2014; 257 (1): 107-26. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12131

6. Okuma A. Generation of CAR-T Cells by Lentiviral Transduction. In: Mammalian Cell Engineering. (Kojima R. ed). Methods in Molecular Biology Springer US: New York, NY; 2021; 3-14. DOI: https://doi.org/10.1007/978-1-0716-1441-9_1

7. Боженко В.К., Шишкин А.М., Шкопоров А.Н. и др. Исследование подавления роста опухоли, экспрессирующей раково-эмбриональный антиген, новым высокотехнологичным препаратом карплазмин (CAR-T-терапия) у мышей линии Balb/c nude. Успехи молекулярной онкологии. 2023; 10 (1): 79-86. DOI: https://doi.org/10.17650/2313-805X-2023-10-1-79-86

8. Боженко В. К., Кудинова Е. А., Шкопоров А. Н., Лебедин Ю.С., Кулинич Т.М., Шишкин А.М. Мономолекулярный химерный Т-клеточный рецептор к раково-эмбриональному антигену. Патент РФ RU2652955 C1 (Заявка 2015155637 от 24.12.2015; ФГБУ РНЦРР Минздрава России).

9. Bozhenko V.K., Shramova E.I., Shishkin A.M., Ivanov A.V., Khokhlova E.V., Lebedin Y.S., Shkoporov A.N. Characteristics of new monomolecular chimeric T-cell receptors to carcinoembryonic antigen. Bull. Exp. Biol. Med. 2013; 156 (1): 165-71. DOI: https://doi.org/10.1007/s10517-013-2302-2

10. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва : Медицина, 2005. 826 с. ISBN: 5225042198

11. Katiyar V., Chesney J., Kloecker G. Cellular Therapy for Lung Cancer: Focusing on Chimeric Antigen Receptor T (CAR T) Cells and Tumor-Infiltrating Lymphocyte (TIL) Therapy. Cancers. 2023; 15 (14): 3733. DOI: https://doi.org/10.3390/cancers15143733

12. Пиотровский В.К. Метод статистических моментов и интегральные модельно-независимые параметры фармакокинетики. Фармак. и токсикол. 1986; (5): 118-27.

13. Lu Y.J., Chu H., Wheeler L.W., et al. Preclinical Evaluation of Bispecific Adaptor Molecule Controlled Folate Receptor CAR-T Cell Therapy With Special Focus on Pediatric Malignancies. Front. Oncol. 2019; 9: 151. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2019.00151

14. FDA Investigating CAR-Related T-cell Malignancies. Cancer Discov. 2024; 14 (1): 9-10. DOI: https://doi.org/10.1158/2159-8290.CD-NB2023-0091

Материалы данного сайта распространяются на условиях лицензии Creative Commons Attribution 4.0 International License («Атрибуция - Всемирная»)